JPH11511013A - 哺乳類アポトーシス抑制性蛋白質遺伝子ファミリー、プライマー、プローブおよび検出法 - Google Patents

哺乳類アポトーシス抑制性蛋白質遺伝子ファミリー、プライマー、プローブおよび検出法

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JPH11511013A JP9508277A JP50827797A JPH11511013A JP H11511013 A JPH11511013 A JP H11511013A JP 9508277 A JP9508277 A JP 9508277A JP 50827797 A JP50827797 A JP 50827797A JP H11511013 A JPH11511013 A JP H11511013A
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Abstract

(57)【要約】 哺乳類IAPポリペプチドをコードする実質的に純粋なDNA、実質的に純粋なポリペプチド、およびアポトーシスを抑制するために細胞および動物においてIAPポリペプチドを発現させるよう該DNAを使用する方法について開示する。また、IAPファミリーの特徴を有する保存領域、ならびにほかのIAP遺伝子の同定および単離のためのプライマーおよびプローブについても開示する。さらに、アポトーシスが関与する疾患および障害を治療するための方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳類アポトーシス抑制性蛋白質遺伝子ファミリー、プライマー、 プローブおよび検出法 発明の背景 本発明はアポトーシスに関する。 細胞の死滅には2つの一般的な様式がある。最もよく認識されている様式は壊 死によるものであり、これは通常は細胞のホメオスタシスを破壊するのに十分な 重度の損傷によって引き起こされる。典型的には、細胞の浸透圧が乱され、その 結果として細胞が膨張し、続いて破裂する。細胞内容物が周囲の組織空間に漏出 した場合には、しばしば炎症反応が引き続いて起こる。 細胞が死滅する第2の一般的な様式は、アポトーシスまたはプログラム細胞死 と呼ばれる。アポトーシスは非常に迅速に起こるため、検出が難しい場合が少な くない。これは、幅広いさまざまな生物的過程におけるアポトーシスの関与が、 ごく最近になるまで認識されなかった理由の説明となると思われる。 アポトーシス経路は、進化の過程を通じて高度に保存されており、胚発生、ウ イルスの病原性、癌、自己免疫疾患および神経変性疾患において重要な役割を果 たしている。例えば、過剰なアポトーシスは、AIDS、アルツハイマー病、パーキ ンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、色素性網膜炎および他の網膜疾患、骨 髄異形成症候群（再生不良性貧血など）、アルコール中毒症などの中毒性肝障害 、ならびに虚血性損傷（例えば、心筋梗塞、脳卒中および再潅流障害など）を引 き起こしたり、その一因となる場合がある。逆に、アポトーシス性反応の不全は 、特に濾胞性リンパ腫、p53を介した癌（p53-mediated carcinoma）およびホル モン依存性腫瘍などの癌、エリテマトーデスおよび多発性硬化症などの自己免疫 疾患、ならびにヘルペスウイルス、ポックスウイルスおよびアデノウイルスなど に起因するウイルス感染症の発生に関係するとされている。 HIV-1に感染した患者では、マイトジェンまたはスーパー抗原による刺激に成 熟CD4+Tリンパ球が反応してアポトーシスを生じる。しかし、これらの細胞の大 多数はウイルスには感染しない。したがって、HIV感染の初期に免疫系のこの極 めて重要な部分が破壊される原因は不適切な抗原誘発性アポトーシスであると考 えられ る。 バキュロウイルスは、昆虫細胞がウイルスに感染した場合に通常ならば起こる はずのアポトーシスを抑制することからアポトーシス蛋白質抑制因子と呼ばれて いる蛋白質をコードする。これらの蛋白質は、他のウイルス蛋白質とは独立した 様式で作用すると考えられている。バキュロウイルスのIAP遺伝子は、DNA結合に 直接関与すると推定されているリングジンクフィンガー様モチーフ（RZF）、お よびBIRドメインと呼ばれる70アミノ酸反復モチーフ（バキュロウイルスIAP反復 部）からなる2つのN端ドメインを含む。 発明の概要 一般に、本発明は、哺乳類IAPポリペプチドをコードするゲノム、cDNAまたは 合成DNA分子などの実質的に純粋なDNA分子を特徴とする。このDNAは、ベクター 内に、哺乳類、酵母もしくは細菌などの細胞内に、またはトランスジェニック動 物もしくはその胚内に組み込まれたものでもよい。好ましい態様において、この DNA分子はマウス遺伝子（例えば、m-xiap、m-hiap-1またはm-hiap-2）またはヒ ト遺伝子（例えば、xiap、hiap-1またはhiap-2）である。最も好ましい態様にお いて、IAP遺伝子はヒトIAP遺伝子である。その他のさまざまな好ましい態様にお いて、細胞は形質転換細胞である。関連した局面において、本発明は、アポトー シスを通常起こす能力を有する組織、すなわちアポトーシスの導入または抑制の いずれかによって損傷を受ける組織において発現する、またはそのような組織に 送達されるIAPポリペプチドをコードする導入遺伝子を含むトランスジェニック 動物を特徴とする。さらにもう1つの態様において、本発明は、本明細書で提供 されるBIRドメインおよびRZFドメインを含むIAPポリペプチドの断片をコードす るDNAを特徴とする。 特殊な態様において、本発明は、図1〜6に示した配列またはその断片と実質的 に同一なDNA配列を特徴とする。もう1つの局面において、本発明は、本明細書で 説明するDNAによってコードされるRNAも特徴とする。好ましくは、このRNAはmRN Aである。別の態様において、このRNAはアンチセンスRNAである。 もう1つの局面において、本発明は、図1〜6に示したIAPアミノ酸配列の1つと 実質的に同一な配列を有する実質的に純粋なポリペプチドを特徴とする。 第2の局面において、本発明は、アポトーシスを起こす能力を有する細胞内でI AP遺伝子を発現する能力を有するプロモーターを含む実質的に純粋なDNAを特徴 とする。好ましい態様において、このIAP遺伝子はxiap、hiap-1またはhiap-2で ある。最も好ましくは、この遺伝子はヒトまたはマウスの遺伝子である。hiap-2 をコードする遺伝子は、図3に示したような完全長の遺伝子でも、または図3の枠 で囲まれた配列が欠失した変異体などの切断型変異体でもよい。 好ましい態様において、プロモーターはIAP遺伝子に固有のプロモーターであ る。また、転写および翻訳に関する調節領域は、好ましくはIAP遺伝子に固有の ものである。もう1つの態様において、本発明は、遺伝子組換え細胞系およびト ランスジェニック動物を提供する。本発明の遺伝子組換え細胞は、好ましくはそ のアポトーシス反応が改変された細胞である。好ましい態様において、この遺伝 子組換え細胞は、線維芽細胞、神経細胞、リンパ球、グリア細胞、胚幹細胞また は昆虫細胞である。最も好ましくは、ニューロンは運動ニューロンであり、リン パ球はCD4+T細胞である。 もう1つの局面において、本発明は、IAPポリペプチドをコードする導入遺伝子 を有する遺伝子組換え細胞の作製を含む、アポトーシス抑制の方法を特徴とする 。この導入遺伝子は、発現を可能とするような様式で細胞のゲノムに組み込まれ る。さらに、細胞内での発現のレベルはアポトーシスを抑制するのに十分である 。 関連した局面において、本発明は、少なくとも1つのIAP遺伝子のコピーが増え るような形でゲノム内に挿入された（変異型または野生型）、またはゲノム内の 少なくとも1つのIAP遺伝子がノックアウトされたトランスジェニック動物、好ま しくは哺乳動物、より好ましくは齧歯類、最も好ましくはマウスを特徴とする。 このトランスジェニック動物は、用いた構築物およびゲノム改変の性質に応じて 、増加または減少した量のIAPポリペプチドを発現すると考えられる。例えば、I APの全体または一部をコードする核酸分子を用いてIAP遺伝子中にノックアウト 変異を生じるように操作することによって、対応するIAPポリペプチドの全体ま たは一部の発現が低下した動物が作製される。これに対して、好ましくは活性の ある調節性およびプロモーター性の要素の制御下において、IAP遺伝子の全体ま たは一 部の外因性コピーをゲノム中に挿入することは、対応するIAPポリペプチドの発 現の増強をもたらすと考えられる。 もう1つの局面において、本発明は、細胞からのゲノムDNAの調製物を用いての IAP遺伝子またはその一部（これは9ヌクレオチド長を超え、好ましくは18ヌクレ オチド長を超える）との接触により、細胞内のIAP遺伝子を検出する方法を特徴 とする。IAP遺伝子およびゲノムDNAは、HIAP-1、HIAP-2またはXIAPポリペプチド をコードするDNAとの同一性が少なくとも50％であるDNA配列のハイブリダイゼー ション（およびその結果としての検出）を可能とする条件下において接触させら れる。 もう1つの局面において、本発明はIAPポリペプチドを産生する方法を特徴とす る。この方法には、IAPポリペプチドの全体または一部をコードするDNA（これは 細胞内で発現するための位置に置かれている）を有する細胞の提供、DNAの発現 を可能とする条件下における細胞の培養、およびIAPポリペプチドの単離が含ま れる。好ましい態様において、IAPポリペプチドは、構成的または誘導可能なプ ロモーターの制御下にあるDNAによって発現される。本明細書で説明する通り、 プロモーターは異種プロモーターであってもよい。 もう一つの局面において、本発明は実質的に純粋な哺乳類IAPポリペプチドを 特徴とする。好ましくは、このポリペプチドは、図1〜4のいずれか1つに示され たアミノ酸配列の全体またはその断片と実質的に同一なアミノ酸配列を含む。最 も好ましくは、このポリペプチドは、XIAP、HIAP-I、HIAP-2、M-XIAP-1またはM- HIAPのポリペプチドである。また、BIRドメイン（RZFは含まない）、RZFドメイ ン（BIRドメインは含まない）、および本明細書で提供される少なくとも1つのBI Rドメインを有するRZFドメイン、の1つまたはそれ以上を含む断片も本発明の一 部である。 もう1つの局面において、本発明は、アポトーシスを調節する能力を有する組 換え哺乳類ポリペプチドを特徴とする。このポリペプチドは、本明細書で定義す るように、少なくとも1つのリングジンクフィンガードメインおよびBIRドメイン を含む。好ましい態様において、本発明は、(a)実質的に純粋な1つのポリペプチ ド、および(b)そのポリペプチドをコードする1つのオリゴヌクレオチドを特徴と す る。このポリペプチドがリングジンクフィンガードメインを含む場合には、この リングジンクフィンガードメインは以下の配列と一致する配列を有すると考えら れる：Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Lys-Xaa3 -Cys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe-Xaa1-Pro-Cys-Gly-His-Xaa 1-Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Pro-Xaa1- Cys、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2はGluまたはAsp、Xaa3はValまた はIleである（配列番号：1）；また、ポリペプチドは少なくとも1つのBIRドメイ ンを含み、BIRドメインは以下の配列を有すると考えられる：Xaa1-Xaa1-Xaa1-Ar g-Leu-Xaa1-Thr-Phe-Xaa1-Xaa1-Trp-Pro-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa2-Xaa1-Xaa1- Xaa1-Xaa1-Leu-Ala-Xaa1-Ala-Gly-Phe-Tyr-Tyr-Xaa1-Gly-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-V al-Xaa1-Cys-Phe-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Trp-Xaa1-Xaa1-Xaa 1-Asp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Pro-Xaa1-Cys-Xaa1 -Phe-Val、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2は任意のアミノ酸であって も欠失していてもよい（配列番号：2）。 さまざまな好ましい態様において、このポリペプチドは少なくとも2つ、また はより好ましくは少なくとも3つのBIRドメインを有し、RZFドメインは図6に示し たIAP配列の1つを有し、BIRドメインは図5に示したBIRドメインから構成される 。その他の好ましい態様において、BIRドメインは、RZFドメインと比較して蛋白 質のアミノ末端に位置しており、RZFドメインはポリペプチドのカルボキシル末 端またはその近傍に位置している。 もう1つの局面において、本発明は、(a)DNAの試料を提供する段階、(b)IAP性 疾患抵抗性遺伝子の保存領域との配列相同性を有する1対のオリゴヌクレオチド を提供する段階、(c)ポリメラーゼ連鎖反応を介したDNA増幅に適した条件下にお いて、1対の該オリゴヌクレオチドと細胞DNA試料とを混合する段階、および(d) 増幅されたIAP遺伝子またはその断片を単離する段階、を含む方法に従って単離 されたIAP遺伝子を特徴とする。 好ましい態様において、増幅は逆転写ポリメラーゼ連鎖反応、例えばRACE法を 用いて実施される。もう1つの局面において、本発明は、(a)DNAの調製物を提供 する段階、(b)IAP遺伝子の保存領域との相同性を有する、検出可能な標識がなさ れ たDNA配列を提供する段階、(c)ヌクレオチド配列の同一性が50％またはそれ以上 である遺伝子が検出できるようなハイブリダイゼーション条件下において、DNA 調製物と検出可能な標識がなされたDNA配列とを接触させる段階、および(d)検出 可能な標識とのその会合によりIAP遺伝子を同定する段階、を含む方法に従って 単離されたIAP遺伝子を特徴とする。 もう1つの局面において、本発明は、(a)細胞試料を提供する段階、(b)形質転 換により細胞試料へ候補IAP遺伝子を導入する段階、(c)細胞試料内において候補 IAP遺伝子を発現させる段階、および(d)その反応によってIAP遺伝子が同定され るよう改変されたアポトーシス反応をその細胞試料が呈するか否かを判定する段 階、を含む方法に従って単離されたIAP遺伝子を特徴とする。 もう1つの局面において、本発明は、(a)細胞DNAの調製物（例えば、ヒトゲノ ムまたはcDNAライブラリー（アポトーシスを起こす細胞種から単離されたcDNAラ イブラリーなど）からのもの）を提供する段階、(b)IAP遺伝子の保存領域との相 同性を有する、検出可能な標識がなされたDNA配列（例えば、本発明の方法によ って調製されたもの）を提供する段階、(c)ヌクレオチドの配列の同一性が50％ またはそれ以上である遺伝子を検出できるようなハイブリダイゼーション条件下 において、細胞DNAの調製物と検出可能な標識がなされたDNA配列とを接触させる 段階、および(d)検出可能な標識との会合によりIAP遺伝子を同定する段階を含む 、細胞内のIAP遺伝子を同定する方法を特徴とする。 もう1つの局面において、本発明は、(a)組換えライブラリーを提供する段階、 (b)ヌクレオチドの配列の同一性が50％またはそれ以上である遺伝子を検出でき るようなハイブリダイゼーション条件下において、該ライブラリーと、本発明の PCR法に従って産生された検出可能な標識がなされた遺伝子断片とを接触させる 段階、および(c)検出可能な標識との会合によりIAP遺伝子を単離する段階を含む 、組換えライブラリーからIAP遺伝子を単離する方法を特徴とする。もう1つの局 面において、本発明は、(a)細胞組織の試料を提供する段階、(b)形質転換により 該細胞試料へ候補IAP遺伝子を導入する段階、(c)細胞試料内において候補IAP遺 伝子を発現させる段階、および(d)アポトーシスにおける変化（すなわち、調節 など）によってIAP遺伝子が同定される、細胞試料がアポトーシスの抑制を示す か否かの決 定を含む、IAP遺伝子を同定する方法を特徴とする。好ましくは、この細胞試料 は、アポトーシスについてアッセイが可能と考えられる細胞種である（例えば、 T細胞、B細胞、神経細胞、バキュロウイルスに感染した昆虫細胞、グリア細胞、 胚幹細胞、および線維芽細胞）。候補IAP遺伝子は例えばcDNA発現ライブラリー から入手したものであり、アッセイされる反応はアポトーシスの抑制である。 もう1つの局面において、本発明は、哺乳動物におけるアポトーシスを抑制す る方法であって、(a)アポトーシスを起こしやすい細胞へ少なくとも1つのIAPポ リペプチドをコードするDNAを提供する段階であって、そのDNAが細胞のゲノムに 組み込まれて細胞内で発現するための位置に置かれており、IAP遺伝子が遺伝子 の制御された発現に適した調節配列の制御下にあり、そのIAP導入遺伝子がIAP導 入遺伝子を欠く細胞と比較してアポトーシスを抑制するのに十分なレベルで発現 するようなDNAを提供する段階、を含む方法を特徴とする。ゲノム内に組み込ま れるDNAは、IAPポリペプチドの全体または一部をコードするものでもよい。それ は、例えば、1つのリングジンクフィンガーおよび1つまたはそれ以上のBIRドメ インをコードするものでもよい。これに対して、それは、リングジンクフィンガ ーのみ、または1つもしくはそれ以上のBIRドメインのみのいずれかをコードする ものでもよい。当業者には、望ましくないアポトーシスを抑制するためにIAPポ リペプチドが直接投与されてもよいことが認識されると思われる。 関連した局面において、本発明は、IAP遺伝子またはその断片を含む導入遺伝 子がゲノムに組み込まれた細胞を作製することによってアポトーシスを抑制する 方法を特徴とする。このIAP遺伝子は、IAP遺伝子の構成的発現を提供するプロモ ーターの制御下にある位置に置かれてもよい。または、IAP導入遺伝子は、環境 刺激によって調節されるような遺伝子の発現を可能とするプロモーターの制御下 にある位置に置かれてもよい。例えば、IAP遺伝子は、組織特異的もしくは細胞 種特異的なプロモーターを用いて、または化学的信号もしくは試薬などの外来性 信号もしくは外来性因子の導入によって活性化されるプロモーターによって発現 されてもよい。好ましい態様において、この細胞は、リンパ球、神経細胞、グリ ア細胞または線維芽細胞である。その他の態様において、それはHIVに感染した ヒト、または神経変性疾患、虚血性損傷、中毒性肝障害もしくは骨髄異形成性症 候群に罹 患した哺乳動物の細胞である。 関連した局面において、本発明は、アポトーシス抑制量のIAPポリペプチドを 提供することによって哺乳動物におけるアポトーシスを抑制する方法を提供する 。IAPポリペプチドは完全長のポリペプチドであってもよく、本明細書に記載す るその断片の1つであってもよい。 もう1つの局面において、本発明は、IAPファミリー蛋白質と特異的に結合する 精製抗体を特徴とする。このような抗体は、IAPポリペプチドの同定のための任 意の標準的な免疫検出法において用いることができる。好ましくは、この抗体は XIAP、HIAP-1またはHIAP-2と特異的に結合する。さまざまな態様において、この 抗体は、他のIAPポリペプチドと反応してもよく、1つまたは少数のIAPポリペプ チドに特異的であってもよい。抗体はモノクローナル抗体でもポリクローナル抗 体でもよい。好ましくは、抗体はIAPポリペプチドの1つのみと特異的に反応し、 例えばマウスおよびヒトのxiapとは反応するが、他の哺乳動物種のhiap-1または hiap-2とは反応しない。 本発明の抗体はさまざまな方法によって調製することができる。例えば、ポリ クローナル抗体の産生を誘発させるために、動物にIAPポリペプチドまたはその 抗原性断片を投与してもよい。または、本明細書で記載するように使用される抗 体は、ハイブリドーマ技術を用いて調製されるモノクローナル抗体であってもよ い（例えば、Kohlerら、Nature 256:495、1975；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6 :511、1976；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6:292、1976；Hammerlingら、モノク ローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ（Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridoma）、Elsevier、NY、1981）。本発明は、ヒトもしくはマウスのIAPポリ ペプチドまたはその断片と特異的に結合する抗体を特徴とする。特に本発明は「 中和」抗体を特徴とする。「中和」抗体とは、IAPポリペプチドの任意の生物活 性、特にIAPがアポトーシスを抑制する能力を阻害する抗体を意味する。中和抗 体は、IAPポリペプチドがポリペプチドを阻害する能力を、好ましくは50％、よ り好ましくは70％、最も好ましくは90％またはそれ以上低下させると考えられる 。中和抗体の評価には、本明細書で説明するものを含め、アポトーシスの任意の 標準的なアッセイを用いることができる。 本来のモノクローナルおよびポリクローナルの抗IAP抗体のほかに、本発明は 、さまざまな遺伝的に操作された抗体、ヒト化抗体ならびにF(ab')2、Fab'、Fab 、FvおよびsFv断片を含む抗体断片を特徴とする。抗体は、当技術分野で公知の 方法によってヒト化することができ、例えば所望の結合特異性を有するモノクロ ーナル抗体を商業的にヒト化することができる（Scotgene、Scotland；Oxford M olecular、Palo Alto、CA）。また、トランスジェニック動物で発現されるよう な完全なヒト抗体も本発明の特徴である（Greenら、Nature Genetics 7:13〜21 、1994）。 ラドナー（Ladner）（米国特許第4,946,778号および第4,704,692号）は、単一 ポリペプチド鎖抗体を調製する方法を記載している。ワード（Ward）ら（Nature 341:544〜546，1989）は、重鎖可変領域の調製物を記載しており、高い抗原結 合親和性を有するそれらを「単一領域抗体」と命名している。マッカファーティ ー（MacCafferty）ら（Nature 348:552〜554，1990）は、完全な抗体V領域がfd バクテリオファージの表面に提示され、このファージが抗原と特異的に結合し、 ファージのごく一部（100万個のうち1個）をアフィニティクロマトグラフィーの 後に単離することができることを示している。ボス（Boss）ら（米国特許第4,81 6,397号）は、免疫グロブリン、および単一宿主細胞において少なくとも重鎖お よび軽鎖の可変領域を含んでおり免疫機能を有するその断片を産生するためのさ まざまな方法を記載している。キャビリー（Cabilly）ら（米国特許第4,816,567 号）はキメラ抗体を調製するための方法を記載している。 もう1つの局面において、本発明は、アポトーシスを調節する化合物を同定す るための方法を特徴とする。この方法は、IAPポリペプチドを発現する細胞の提 供、その細胞と候補化合物との接触、およびIAP遺伝子の発現の観測を含む。IAP 遺伝子の発現レベルにおける変化により、アポトーシスを調節する化合物が存在 することが示される。この化合物はアポトーシスの抑制因子でも増強因子でもよ い。さまざまな好ましい態様において、この細胞は、線維芽細胞、神経細胞、グ リア細胞、リンパ球（T細胞またはB細胞）または昆虫細胞であり、その発現が観 測されるポリペプチドは、XIAP、HIAP-1、HIAP-2、M-XIAP、M-HIAP-1またはM-HI AP-2（すなわち、ヒトまたはマウス）である。 関連した局面において、本発明は、相互作用トラップ（interaction trap）技 術、およびおとり（bait）の要素としてIAPポリペプチドまたはその断片を用い てアポトーシスを調節する化合物を検出する方法を特徴とする。好ましい態様に おいて、アポトーシスの調節因子として試験される化合物はポリペプチドでもあ る。 もう1つの局面において、本発明は、IAP核酸プローブまたは抗体を用いて、細 胞増殖性疾患、またはそのような疾患の易発症性（increased likelihood）を診 断するための方法を特徴とする。好ましくは、この疾患は癌である。最も好まし くは、この疾患は、前骨髄球性白血病、Hela型癌、慢性骨髄性白血病（好ましく はxiapまたはhiap-2に関連したプローブを用いる）、リンパ芽球性白血病（好ま しくはxiapに関連したプローブを用いる）、バーキットリンパ腫（好ましくはhi ap-1に関連したプローブを用いる）、結腸直腸腺癌、肺癌および悪性黒色腫（好 ましくはxiapプローブを用いる）からなる群より選択される。好ましくは診断は 、発現または活性が2倍に増強することによって示され、より好ましくは、発現 または活性が少なくとも10倍に増強することによってなされる。 当業者には、哺乳類IAPまたはその断片（本明細書で説明するようなもの）が 、治療的組成物における活性成分として機能すると考えられることが認識される と思われる。この組成物は、それに含まれるIAPまたは断片に応じて、アポトー シスを調節し、それによってアポトーシスの障害によって引き起こされる任意の 状態を治療するために用いることができると考えられる。 このほか、IAP依存的な抗アポトーシス経路の負の調節因子を細胞に投与する ことによって、該細胞においてアポトーシスが誘導されるとも考えられる。この 負の調節因子は無制限的に、リングジンクフィンガーを含むIAPポリペプチド、 およびリングジンクフィンガーを含むが少なくとも1つのBIRドメインを欠失した IAPポリペプチドであってもよい。または、以上の2つのポリペプチドなどのIAP ポリペプチドをコードする遺伝子を投与することによって、細胞にアポトーシス を誘導させることもできる。さらにもう1つの方法では、負の調節因子は、IAPポ リペプチドと特異的に結合する精製抗体またはその断片であってもよい。例えば 、この抗体は、少なくとも1つのBIRドメインを含むがリングジンクフィンガード メイン は欠失したIAPポリペプチドの約26KDaの切断産物と結合するものでもよい。また 、負の調節因子はIAPアンチセンスmRNA分子であってもよい。 以上に概要を示した通り、アポトーシスを調節するために、IAP核酸またはIAP ポリペプチドを用いることができる。さらに、アポトーシスを調節するための医 薬品の製造において、IAP核酸またはIAPポリペプチドを用いることもできる。 「IAP遺伝子」とは、その他の細胞内または細胞外送達法によって提供された 場合に細胞または組織においてアポトーシスを調節する（抑制する、または増強 する）ことのできる、少なくとも1つのBIRドメインおよびリングジンクフィンガ ードメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子を意味する。好ましい態様 において、IAP遺伝子は、図1〜4に示した少なくとも一つのIAPアミノ酸コード配 列またはその一部とのヌクレオチド配列との同一性が約50％またはそれ以上であ る遺伝子である。好ましくは、同一性を評価する配列の領域は、少なくとも1つ のBIRドメインおよびリングジンクフィンガードメインをコードする領域である 。哺乳類IAP遺伝子は、任意の哺乳動物の供給源から単離されたヌクレオチド配 列を含む。好ましくは、この哺乳動物はヒトである。 「IAP遺伝子」という用語は、アポトーシスを調節する能力によって特徴づけ られるアポトーシス抑制性遺伝子ファミリーのあらゆるメンバーを包含すること を意味する。IAP遺伝子は、本明細書に記載するIAPのメンバー（すなわち、ヒト またはマウスのxiap、hiap-1およびhiap-2からのBIRまたはリングジンクフィン ガードメイン）の中の1つの保存領域の少なくとも1つとのアミノ酸配列の同一性 が少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、最も好ましくは少なくとも50％ であるポリペプチドをコードするものであってよい。IAP遺伝子ファミリーの代 表的なメンバーには、無制限的にヒトおよびマウスのxiap、hiap-1およびhiap-2 の遺伝子が含まれる。 「IAP蛋白質」または「IAPポリペプチド」とは、IAP遺伝子によってコードされ るポリペプチドまたはその断片を意味する。 「BIRドメイン」とは、以下の共通配列のアミノ酸配列を有するドメインを意味 する：Xaa1-Xaa1-Xaa1-Arg-Leu-Xaa1-Thr-Phe-Xaa1-Xaa1-Trp-Pro-Xaa2-Xaa1-Xa a1-Xaa2-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Leu-Ala-Xaa1-Ala-Gly-Phe-Tyr-Tyr-Xaa1-G ly-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Val-Xaa1-Cys-Phe-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1 -Xaa1-Trp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1 -Xaa1-Pro-Xaa1-Cys-Xaa1-Phe-Val、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2 は任意のアミノ酸であっても欠失していてもよい（配列番号：2）。好ましくは 、この配列は、本明細書でxiap、hiap-1およびhiap-2に関して提供されるBIRド メインの1つと実質的に同一である。 「リングジンクフィンガー」または「RZF」とは、以下の共通配列のアミノ酸配 列を有するドメインを意味する：Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa 1-Xaa1-Xaa1-Cys-Lys-Xaa3-Cys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe- Xaa1-Pro-Cys-Gly-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1 -Xaa1-Xaa1-Cys-Pro-Xaa1-Cys、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2はGlu またはAsp、Xaa3はValまたはIleである（配列番号：1）。 好ましくは、この配列は、本明細書中でヒトまたはマウスのxiap、hiap-1およ びhiap-2に関して提供されるRZFドメインと実質的に同一である。 「アポトーシスを調節する」または「アポトーシスを変化させる」とは、特定 の細胞集団において、当該行為を行わなかった場合と比べて、アポトーシスを起 こす細胞数が増加または減少することを意味する。好ましくは、この細胞集団に は、T細胞、神経細胞、線維芽細胞、または一定の実験条件においてアポトーシ スを起こすことが知られているその他のあらゆる細胞系（例えば、バキュロウイ ルスが感染した昆虫細胞）が含まれる。所与のアッセイにおいてIAPまたは調節 性化合物によって提供される調節の程度がさまざまに異なりうることは認識され ると思われるが、当業者には、IAPまたはIAPを調節する化合物が同定されるアポ トーシスのレベルにおける統計学的に有意な変化を判定することが可能である。 「アポトーシスを抑制する」とは、処置を施していない対照と比べてアポトー シスを起こす細胞数がいくらか減少することを意味する。好ましくは、この減少 は少なくとも25％、より好ましくはこの減少は50％であり、最も好ましくは、こ の減少は100％である。 「ポリペプチド」とは、グリコシル化またはリン酸化などの翻訳後修飾の有無 にかかわらず、2つ以上のアミノ酸からなるあらゆる鎖を意味する。 「実質的に同一」とは、参照アミノ酸配列または核酸配列との相同性が少なく とも50％、好ましくは85％、より好ましくは90％、最も好ましくは95％であるポ リペプチドまたは核酸を意味する。ポリペプチドについては、比較する配列の長 さが一般に、少なくとも16アミノ酸、好ましくは少なくとも20アミノ酸であり、 より好ましくは少なくとも25アミノ酸であり、最も好ましくは35アミノ酸である 。核酸については、比較する配列の長さが一般に、少なくとも50ヌクレオチド、 好ましくは少なくとも60ヌクレオチドであり、より好ましくは少なくとも75ヌク レオチドであり、最も好ましくは110ヌクレオチドである。 配列の同一性は、典型的には配列解析ソフトウェアを用い、デフォルト設定の パラメータにした条件で測定される（例えば、Genetics Computer Group、Unive rsity of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison ，WI 53705のSequence Analysis Software Packageなど）。このソフトウェア・ プログラムは、種々の置換、欠失、およびその他の修飾に関する相同性の程度を 割り当てることにより、類似した配列を比較するものである。保存的置換には、 一般に以下の各群内における置換が含まれる：グリシン、アラニン、バリン、イ ソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタ ミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チ ロシン。 「実質的に純粋なポリペプチド」とは、天然の状態で付随している成分から分 離されたポリペプチドを意味する。典型的には、ポリペプチドは、天然の状態で 伴っている蛋白質および天然の有機分子を除いた割合が重量にして少なくとも60 ％であれば実質的に純粋である。好ましくは、ポリペプチドは、重量にして少な くとも75％、より好ましくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも99％純 粋なIAPポリペプチドである。実質的に純粋なIAPポリペプチドは、例えば、天然 の供給源（例えば、線維芽細胞、神経細胞、またはリンパ球）からの抽出、IAP ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現、または蛋白質の化学合成によって 得ることができる。純度は、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルア ミドゲル電気泳動またはHPLC解析などの任意の適当な方法を用いて測定すること ができる。 蛋白質は、天然の状態で付随している汚染物質から分離されている場合に、天 然の状態で伴う成分を実質的に含まない。このため、化学的に合成された蛋白質 、または天然に由来する細胞と異なる無細胞系において産生された蛋白質は、天 然の状態で伴う成分を実質的に含まないと考えられる。したがって、実質的に純 粋なポリペプチドには、真核生物に由来するが大腸菌またはその他の原核生物に おいて合成されたものも含まれる。「実質的に純粋なDNA」とは、本発明のDNAが 由来する生物体の天然のゲノムにおいて、その遺伝子の近傍に位置する遺伝子を 含まないDNAを意味する。従って、この用語には、例えば、ベクター、自律複製 性プラスミドもしくはウイルス、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA に組み込まれる組換えDNA、またはその他の配列から独立した分離分子（例えば 、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されたcDNAまたはゲノム もしくはcDNAの断片）として存在する組換えDNAが含まれる。また、付加的なポ リペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAもこれ に含まれる。 「形質転換細胞」とは、その内部（またはその前駆細胞の内部）に、組換えDN A技術の手段によって、（本明細書で用いるように）IAPポリペプチドをコードす るDNA分子が導入された細胞を意味する。 「導入遺伝子」とは、操作によって細胞内に挿入され、その細胞から発生する 生物体のゲノムの一部となる、DNAのあらゆる断片を意味する。このような導入 遺伝子には、トランスジェニック生物体に対して、部分的にまたは完全に異種由 来（すなわち、外来性）である遺伝子が含まれてもよく、または生物体の内因性 遺伝子と相同な遺伝子を示していてもよい。 「トランスジェニック」とは、操作によって細胞に挿入され、その細胞から発 生する生物体のゲノムの一部となったDNA配列を含むあらゆる細胞を意味する。 本明細書で用いるように、トランスジェニック生物体は一般にトランスジェニッ ク哺乳動物（例えば、ラットまたはマウスなどの齧歯類）であり、DNA（導入遺 伝子）は操作によって核ゲノム内に挿入される。 「形質転換」とは、外来分子を細胞に導入するためのあらゆる方法を意味する 。リポフェクション、リン酸カルシウム沈澱法、レトロウイルス投与、電気穿孔 、および遺伝子銃による形質転換は、用いることができる教示例のごく一部であ る。例えば、遺伝子銃による形質転換は、高速で射出されたタングステンまたは 金の粒子などの微小弾丸を用いて、細胞に外来分子を導入する方法である。この ような高速射出法は、本来はヘリウム、圧縮空気、および火薬を原動力とする技 術を無制限的に含む圧力性射出に由来する。遺伝子銃による形質転換は、細胞内 小器官（例えば、ミトコンドリアおよび葉緑体）、細菌、酵母、真菌、藻類、動 物組織、および培養細胞を無制限的に含む非常にさまざまな種類の細胞および完 全な組織に対する形質転換またはトランスフェクションに適用することができる 。 「発現のための位置に置かれた」とは、DNA分子が、その配列の転写および翻 訳を指向する（すなわち、例えばIAPポリペプチド、組換え蛋白質またはRNA分子 の産生を促進するような）DNA配列と隣接した位置に置かれていることを意味す る。 「レポーター遺伝子」とは、その発現をアッセイすることができる遺伝子を意 味する。このような遺伝子には、グルクロニダーゼ（GUS）、ルシフェラーゼ、 クロラムフェニコールトランスアセチラーゼ（CAT）およびβ-ガラクトシダーゼ が無制限的に含まれる。 「プロモーター」とは、転写を指向するのに十分な最小の配列を意味する。ま た、本発明では、細胞種特異的、組織特異的、または外来性の信号もしくは因子 によって誘導可能である点で制御可能であるプロモーター依存的遺伝子発現を引 き起こすために十分なそれらのプロモーター要素も含まれる。このような要素は 、本来の遺伝子の5'もしくは3'領域に位置していてもよい。 「機能的に結合した」とは、ある遺伝子と1つまたはそれ以上の調節配列とが 、適当な分子が調節配列に結合した時に遺伝子発現が可能となるような様式で連 結していることを意味する（例えば、転写活性化蛋白質は調節配列と結合してい る）。 「保存領域」とは、IAPファミリーのメンバーの2つまたはそれ以上の間（例え ば、ヒトHIAP-1、HIAP-2およびXIAPの間）でアミノ酸配列の同一性が少なくとも 30％、好ましくは50％、最も好ましくは70％であるような、6個またはそれ以上 の連続したアミノ酸からなるあらゆる連続部分を意味する。好ましい保存領域の 例 は（枠で囲まれた、または明示された配列として）図5〜7ならびに表1および2に 示し、無制限的にBIRドメインおよびリングジンクフィンガードメインを含む。 「検出可能な標識がなされた」とは、例えば、オリゴヌクレオチドプローブも しくはプライマー、遺伝子もしくはその断片、またはcDNA分子などの、ある分子 の存在を示したり同定するためのあらゆる手段を意味する。分子に検出可能な標 識をする方法は、当業者には周知であり、放射性標識（例えば、32Pまたは35Sな どの放射性同位元素を用いる）および非放射性標識（例えば、フルオレセイン標 識などの化学発光標識）を無制限的に含む。 本明細書で核酸に関して用いる「アンチセンス」とは、その長さとは無関係に 、遺伝子のコード鎖に対して相補的な核酸配列を意味する。 「精製抗体」とは、天然の状態で伴っている蛋白質および天然の有機分子を除 いた割合が、重量にして少なくとも60％である抗体を意味する。好ましくは、こ の調製物は、重量にして少なくとも75％、より好ましくは90％、最も好ましくは 少なくとも99％の抗体、例えばIAP特異的抗体である。精製抗体は、例えば、組 換えによって産生された蛋白質または保存モチーフのペプチドおよび標準的手法 を用いるアフィニティクロマトグラフィーによって得ることができる。 「特異的に結合する」とは、ある蛋白質を認識して結合するが、蛋白質が通常 含まれる試料、生物試料中のその他の分子は実質的に認識せず結合もしない抗体 を意味する。 本発明のその他の特徴および利点は、その好ましい態様に関する以下の詳細な 説明、および請求の範囲から明らかになると思われる。 図面の簡単な説明 図1は、ヒトxiapのcDNA配列（配列番号：3）およびXIAPポリペプチド配列（配 列番号：4）である。 図2は、ヒトhiap-1のcDNA配列（配列番号：5）およびHIAP-1ポリペプチド配列 （配列番号：6）である。 図3は、ヒトhiap-2のcDNA配列（配列番号：7）およびHIAP-2ポリペプチド配列 （配列番号：8）である。hiap-2-Δ変異体で欠失している部分は枠で囲んだ。 図4は、マウスxiapのcDNA配列（配列番号：9）およびコードされるマウスXIAP ポリペプチド配列（配列番号：10）である。 図5は、マウスhiap-1のcDNA配列（配列番号：39）およびコードされるマウスH IAP-1ポリペプチド配列（配列番号：40）である。 図6は、マウスhiap-2のcDNA配列（配列番号：41）およびコードされるマウスH IAP-2ポリペプチド配列（配列番号：42）である。 図7は、IAP蛋白質のBIRドメインのアライメント（配列番号：11および14〜31 ）を図示したものである。 図8は、ヒトIAPポリペプチドのアライメントを、diap、cp-iapおよびIAP共通 配列とともに図示したものである（配列番号：4、6、8、10、12および13）。 図9は、IAP蛋白質のリングジンクフィンガードメインのアライメントを図示し たものである（配列番号：32〜38）。 図10は、ヒト組織におけるヒトhiap-1およびhiap-2のmRNAの発現を示したノー ザンブロットの写真である。 図11は、ヒト組織におけるヒトhiap-2のmRNAの発現を示したノーザンブロット の写真である。 図12は、ヒト組織におけるヒトxiapのmRNAの発現を示したノーザンブロットの 写真である。 図13Aおよび13Bは、HIV感染T細胞におけるアポトーシス性DNAラダー(ladder) およびRT-PCR産物をhiap-1およびhiap-2に特異的なプローブを用いて示したアガ ロースゲルの写真である。 図14A〜14Dは、XIAP、HIAP-1、HIAP-2、bcl-2、smnおよび6-mycによるアポト ーシスの抑制を描いたグラフである。 図15A〜Bは、表示したcDNA構築物による一時的遺伝子導入および引き続いて血 清除去を行った後の生存CHO細胞の比率を描いた棒グラフである。 図16A〜16Bは、表示したcDNA構築物による一時的遺伝子導入および引き続いて メナジオン（図16A＝10μM メナジオン、図16B＝20μM メナジオン）曝露を行っ た後の生存CHO細胞の比率を描いた棒グラフである。 図17は、ラジ（Raji）、ラモス（Ramos）、B-3およびジヨーエ（Jiyoye）細胞 ならびに正常胎盤から得たRNAからのhiap-1特異的プライマーを用いて増幅したc DNA断片を含むアガロースゲルの写真である。 図18は、ジャーカットおよび星状細胞腫細胞から抽出し、抗XIAP抗体を用いて 染色した蛋白質を含むウェスタンブロットの写真である。一連のマーカー蛋白質 の位置およびサイズを示した。 図19は、実施例XIIに記載した処置に続いてジャーカット細胞から抽出した蛋 白質を含むウェスタンブロットの写真である。ブロットは、ウサギポリクローナ ル抗XIAP抗体によって染色した。レーン1は陰性対照、レーン2は抗Fas抗体、レ ーン3は抗Fas抗体およびシクロヘキシミド、レーン4はTNF-α、レーン5はTNF-α およびシクロヘキシミドを示す。 図20は、抗Fas抗体への曝露に続いてヒーラ（Hela）細胞から抽出した蛋白質 を含むウェスタンブロットの写真である。ブロットは、ウサギポリクローナル抗 XIAP抗体によって染色した。レーン1は陰性対照、レーン2はシクロヘキシミド、 レーン3は抗Fas抗体、レーン4は抗Fas抗体およびシクロヘキシミド、レーン5はT NF-α、レーン6はTNF-αおよびシクロヘキシミドを示す。 図21A〜21Bは、ウサギポリクローナル抗XIAP抗体によって染色したウェスタン ブロットの写真である。蛋白質は、抗Fas抗体への曝露の直後、1、2、3、5、10 および22時間後にヒーラ細胞（図21A）およびジャーカット細胞（図21B）から抽 出した。 図22Aおよび22Bは、抗CPP32抗体（図22A）またはウサギポリクローナル抗XIAP 抗体（図22B）によって染色したウェスタンブロットの写真である。蛋白質は、 抗Fas抗体への曝露の直後、3時間後または7時間後にジャーカット細胞から抽出 した。総蛋白のほかに細胞質および核抽出物も示した。 図23は、インビトロXIAP切断アッセイの産物に対する電気泳動後のポリアクリ ルアミドゲルの写真である。 詳細な説明 I ．IAP遺伝子およびポリペプチド アポトーシスを調節する新たなクラスの哺乳類蛋白質（IAP）、およびこれら の蛋白質をコードする遺伝子が発見されている。IAP蛋白質は1つのリングジンク フィンガードメイン（RZF；図9）、ならびに図7および8に枠で囲んだ共通配列を 示 し、表1および2に配列ドメインの一覧を挙げることによって定義したBIRドメイ ンが少なくとも1つ存在することによって特徴づけられる。新規なIAP遺伝子およ び蛋白質の例として、ヒトIAP（HIAP-1、HIAP-2およびXIAP）ならびに新規なマ ウスアポトーシス抑制因子であるXIAPのcDNA配列およびアミノ酸配列を提供した 。哺乳類IAPファミリーのほかのメンバー（他の種からの相同体および変異型配 列を含む）を、標準的なクローニング技法ならびに本明細書で提供し、当技術分 野では公知である保存アミノ酸配列、プライマーおよびプローブを用いて単離し てもよい。さらにIAPには、以下でさらに説明するような、リングジンクフィン ガーを欠いた蛋白質も含まれる。 *各位置は図1〜4に示した位置と対応させて示した。 *各位置は図1〜4に示した位置と対応させて示した。 哺乳類IAPファミリーが認識されたことにより、非常に新たなパターンの蛋白 質構造がもたらされた。このパターンの認識に伴って、既知の相同配列を有する が機能は不明であった蛋白質を、推定上のアポトーシス抑制因子として分類する ことが可能になった。今日ではdiapと呼ばれている1つのショウジョウバエ遺伝 子はこのような仕方で分類された（配列情報についてはジェンバンク寄託番号（ Genbank Accession Number）M96581および図6を参照）。これらの蛋白質が種を 超えて保存されていることは、アポトーシスのシグナル伝達経路が進化過程を通 じて保存されてきたことを示す。 IAP蛋白質は、数多くの疾患過程または障害の一部として生じるアポトーシス を抑制するために用いることができると思われる。例えば、IAPポリペプチドま たはIAPポリペプチドをコードする核酸を、AIDS、神経変性疾患、虚血性損傷、 中毒性肝障害および骨髄異形成症候群の一部として生じるアポトーシスの治療ま たは予防のために投与することが可能と考えられる。また、IAPポリペプチドを コードする核酸はアポトーシスの抑制のためにも提供されうると考えられる。 II ．IAP遺伝子のクローニング A ．xiap アポトーシスに関与するヒト遺伝子を探索した結果、アポトーシスを抑制する ことが知られる2種のバキュロウイルス遺伝子であるCpIAPおよびOpIAP（Clemら 、 Mol．Cell Biol．14:5212〜5222、1994；Birnbaumら、J．Virol．68:2521〜8、1 994）の保存RZFドメインと高い相同性を示す、X連鎖性配列タグ部位（X-linked sequence tag site）（STS）がジェンバンク（GenBank）データベースにあるこ とが同定された。このSTSによるヒト胎児脳ZapII cDNAライブラリー（Stratagen e，La Jolla，CA）のスクリーニングによって、xiap（X連鎖性アポトーシス抑制 蛋白質遺伝子の略）の同定およびクローニングがなされた。このヒト遺伝子は1. 5kbのコード配列を有し、そこに3つのBIRドメイン（Crookら、J．Virol．67:216 8〜74、1993；Clemら、Science 254:1388〜90、1991；Birnbaumら、J．Virol．6 8:2521〜8、1994）および1つのジンクフィンガーを含む。xiapに関するノーザン ブロット解析により、7kbを超える大きさのメッセージ（mRNA）が存在し、それ がさまざまな組織、特に肝臓および腎臓で発現していることが明らかになった（ 図12）。転写物のサイズが大きいことは、5'および3'非翻訳領域が長いことを反 映する。 B ．ヒトhiap-1およびhiap-2 hiap-1およびhiap-2の遺伝子のクローニングは、全xiapコード領域を含むプロ ーブによるヒト肝臓ライブラリー（Stratagene Inc.，La Jolla，CA）の厳密性 の低い条件（最終洗浄は40℃の2X SSC、10％SDSを用いて実施した；図2および3 ）でのスクリーニングによって実施した。また、BIRドメインの一部を含む発現 配列タグ（expressed sequence tag）（EST；GenBank寄託番号（Accession No. ）T96284）に由来するプローブを用いて、hiap-1およびhiap-2の遺伝子の独立し た検出も行った。EST配列はポリメラーゼ連鎖反応によってまず単離した。その 際にはテンプレートとしてcDNAライブラリーを用い、EST特異的プライマーを用 いて増幅した。続いて、DNA増幅由来（ampliderive）プローブを用いて、完全長 のhiapコード配列に関してヒト肝臓cDNAライブラリーをスクリーニングした。引 き続いて、hiap-2配列は含むが、おそらくは選択的mRNAスプライシングのために 1つのエクソンを欠失していると思われる第3のDNAを検出した（図3の枠で囲まれ た領域を参照）。ノーザンブロット解析によってアッセイしたヒト組織における hiap-1およびhiap-2の発現を図8および9に示した。 C ．m-xiap xiapのcDNAプローブを用いて、マウス胚λgt11 cDNAライブラリー（Clontech ，Palo Alto，CA）およびマウスFIX IIゲノムライブラリーのスクリーニングを 行うことにより、14種のcDNAおよび2種のゲノムのクローンをそれぞれ同定した 。一部が重複する12種のマウスクローンを用いて、8.0kbにわたるcDNAコンティ グを構築した。塩基配列解析により、約1.5kbのコード配列の存在が明らかにな った。このマウス遺伝子m-xiapは、ヒトXIAPとの間で開始メチオニン、終止コド ン、3つのBIRドメインおよびRZFドメインの箇所およびその周囲において著しい 相同性を有するポリペプチドをコードする。ヒト遺伝子の場合と同じく、このマ ウス相同体は長い5'および3'UTRを含んでおり、それによって7〜8kbの長さに及 ぶ転写物が産生されると考えられる。 m-xiapの配列および制限地図に関する解析を行うことにより、m-xiapの構造お よびゲノムの構成がさらに明らかに示された。エクソンのマッピングおよびエク ソン-イントロン境界部の定義のためには、サザンブロット解析および逆PCR法（ Grodenら、Cell 66:589〜600）を使用することができる。 例えば大腸菌などの細菌発現系を用いて、得られたm-xiap融合蛋白質に対する 抗血清を産生させることができる。結果として得られた抗血清は、マウス体内に おけるm-xiapの空間的および時間的発現の解析のためにノーザンブロット解析と ともに用いることが可能である。 D ．m-hiap-1およびm-hiap-2 ヒトhiap-1およびhiap-2の配列をプローブとして用いて、m-xiapの場合と同じ 一般的な様式で、hiap-1およびhiap-2のマウスでの相同体のクローニングおよび シークエンシングを行った。m-hiap-1およびm-hiap-2のクローニングにより、本 明細書で提供する技法および分子生物学の分野における当業者に公知である技法 を用いて、異なる種からの相同体を単離することが可能と思われることがさらに 示された。 III ．ほかのIAP遺伝子の同定 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）およびDNAハイブリダイゼーションなどの標準的 な技法を用いて、ほかのヒトIAP遺伝子および他の種におけるそれらの相同体の クローニングを行うことが可能と思われる。厳密性の低い条件でxiap、hiap-1お よ びhiap-2に特異的なプローブとハイブリダイズさせたヒトゲノムDNAのサザンブ ロットから、その他の既知のヒトIAP配列に対応するバンドのほかに、既知のIAP 配列とは対応しない付加的なバンドがあることが明らかになった。したがって、 厳密性の低いハイブリダイゼーションを用いて、ほかのIAP配列を容易に同定す ることができると考えられる。付加的な遺伝子のクローニングに用いることがで きると思われる、マウスならびにヒトのxiap、hiap-1およびhiap-2に特異的なプ ライマーの例を表5に示した。 IV ．IAP活性の特徴分析および細胞内局在に関する試験 推定上のIAPがアポトーシスを調節する能力は、その中でアポトーシスの変化 を検出することができるインビトロ系において規定することができる。完全長ま たは切断型のIAPのcDNAを載せた哺乳類の発現構築物を、CHO、NIH 3T3、HL60、R at-1またはジャーカット細胞などの細胞系に導入することができる。さらに、SF 21昆虫細胞を用いてもよく、この場合にはIAP遺伝子は好ましくは昆虫の熱ショ ックプロモーターを用いて発現させられる。遺伝子導入の後には、血清除去また はスタウロスポリン、メナジオン（これはフリーラジカルの形成を介してアポト ーシスを誘導する）もしくは抗Fas抗体の適用を含む標準的な方法によってアポ トーシスを誘導することができる。対照として、アポトーシスを起こすように誘 導される細胞と同じ条件下において細胞を培養し、これには遺伝子導入を行わな いか、IAP挿入物を含まないベクターによる遺伝子導入を行った。それぞれのIAP 構築物が発現した際にアポトーシスを抑制する能力は、細胞の生存指標、すなわ ち生存している遺伝子導入細胞と生存している対照細胞との比を算出することに よって定量化することができる。これらの実験は、アポトーシス抑制活性の存在 に関する確認を可能とするほか、以下に説明するように、IAPの機能性領域の決 定に用いることもできる。また、これらのアッセイは、IAPの発現を介してアポ トーシスを調節する化合物を同定するために、ほかの化合物の適用と併用して実 施することもできる。 A ．完全長IAP構築物によるトランスフェクション後の細胞の生存、 およびアポトーシスの誘導 さまざまなアポトーシス抑制アッセイを実施することによって得た結果の具体 例を図14Aから14Dに示した。例えば、6種の構築物のうち1種による遺伝子導入を 行い、引き続いて血清除去を行った後のCHO細胞の生存の様子を図14Aに示した。 以下の組換えプラスミドのうち1つを2μg用いるとともにリポフェクターセ（Lip ofectace（登録商標））を用いて細胞に遺伝子導入を施した：pCDNA36myc-xiap （xiap）、pCDNA3-6myc-hiap-1（hiap-1）、pCDNA3-6myc-hiap-2（hiap-2）、pC DNA3-bcl-2（bcl-2）、pCDNA3-HA-smn（smn）およびpCDNA3-6myc（6-myc）。xia p、hiap-1およびhiap-2のORFのPCR増幅およびpCDNA3（Invitrogen）へのクロー ニングを可能とするためにオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。それぞれ の構築物に改変を施してペプチド配列MEQKLISEEDL［（配列番号：＿）］の6回反 復物をコードする合成mycタグを組み込み、これによってモノクローナル抗myc抗 血清（Eganら、Nature 363:45〜51、1993）を介したmyc-IAP融合蛋白質の検出が 可能となるようにした。3シリーズ分の細胞系の試料を24穴皿に入れて無血清培 地で5回洗い、実験の間は無血清条件を維持した。トリパンブルーを排出した細 胞、すなわち生きている細胞を、血清除去の直後、24時間、48時間および72時間 後に血球算定板を用いて算定した。生存率は最初の生存細胞数に対する比率とし て算出した。この実験ならびに図14Bおよび14Dに提示した実験に関して表示した 生存細胞の比率は、3回に分けて実施した3つの別々の実験での平均±平均偏差を 表す。 遺伝子導入（上記の6種の構築物のそれぞれ1種による）およびメナジオンへの 曝露の後のCHO細胞の生存率を図14Bに示した。細胞を24穴皿に播いた後、一晩増 殖させ、続いて20μMメナジオン（Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO）に1.5 時間曝露させた。3シリーズ分の試料をメナジオンへの曝露時および24時間後に 採取し、トリパンブルーの排出によって生存率を評価した。 遺伝子導入（上記の6種の構築物のそれぞれ1種による）およびスタウロスポリ ンへの曝露の後のRat-1細胞の生存率を図14Cに示した。Rat-1細胞に遺伝子導入 を施した後、800μg/mlのG418を含む培地中に2週間置いて選択した。この細胞系 を、5時間にわたるスタウロスポリン誘発性アポトーシス（1μM）に対する抵抗 性に関して評価した。スタウロスポリンへの曝露から24時間後にトリパンブルー の排出によって生存細胞を算定した。表示した生存細胞の比率は、2回の実験で の平均±平均偏差を表す。 Rat-1細胞系は、これらの細胞に上記の6種の構築物のそれぞれによる遺伝子導 入を施した後のメナジオンに対する抵抗性を試験する目的にも用いた（図14D） 。細胞を10μMメナジオンに1.5時間曝露させ、18時間後に生存細胞数を算定した 。 B ．完全長および部分的IAP構築物による遺伝子導入後の細胞生存率の比較 XIAP、HIAP-1およびHIAP-2を含むヒトIAPが細胞死に対する防御をもたらす機 序を調べるために、(1)完全長のIAP cDNA（上記のもの）、(2)BIRドメインをコ ードするがRZFはコードしないIAP遺伝子の一部、または(3)RZFをコードするがBI RドメインはコードしないIAP遺伝子の一部、のいずれかを含む発現ベクターを構 築した。ヒーラ、ジャーカットおよびCHO細胞系における一時的または安定的発 現により、ヒトおよびマウスのxiapまたはm-xiapを検討した。遺伝子導入後には 、血清除去、メナジオンの適用、または抗Fas抗体の適用によってアポトーシス が誘導された。続いて上記のようにトリパンブルー排出によって細胞死を評価し た。遺伝子導入の効率に関する対照として、細胞にβ-gal発現構築物による同時 遺伝子導入を施した。典型的には、首尾よく遺伝子導入がなされたのは細胞の約 20％であった。 CHO細胞に一時的遺伝子導入を施した場合には、完全長のxiapまたはm-xiapのc DNAを含む構築物によってもたらされた細胞死の防御はわずかであった（図15A） 。これに対して、BIRドメインのみをコードした構築物（すなわち、RZFドメイン を含まないもの）による遺伝子導入を受けたCHO細胞の生存率は、血清除去から7 2時間後では著明に高値であった。さらに、BIRドメインを発現している細胞の大 部分は96時間後にも生存しており、この時点では対照、すなわち遺伝子導入を受 けていない細胞培養物には生存細胞は残っておらず（図15Aの「CHO」参照）、ベ クターのみ、すなわちcDNA挿入物を含まないものによる遺伝子導入を受けた細胞 の中で生存していたものは5％未満であった（図15Aの「pcDNA3」参照）。いずれ のBIRドメインの欠失によっても、血清除去から72時間以内の対照レベルに対し ての生存CHO細胞の比率の低下に反映されるように、アポトーシス抑制の完全損 失がもたらされた（図15B；72時間後における「xiapΔ1」（XIAP（配列番号：4 ）のアミノ酸89〜497をコードする）、「xiapΔ2」（XIAP（配列番号：4）のア ミノ酸246〜497をコードする）および「xiapΔ3」（XIAP（配列番号：4）のアミ ノ酸342 〜497をコードする）を参照）。 G418による選択下において数カ月維持された遺伝子導入CHO細胞の安定プール （stable pool）に対して10μMメナジオンを2時間曝露させることにより、アポ トーシスを起こすように誘導した。検討したCHO細胞は、(1)完全長m-xiapのcDNA （miap）、(2)完全長xiapのcDNA（xiap）(3)完全長bcl-2のcDNA（Bcl-2）、(4)m -xiapの3つのBIRドメインをコードする（しかしRZFはコードしない）cDNA（BIR ）、および(5)m-xiapのRZFをコードする（しかしBIRドメインはコードしない）c DNA（RZF）、による安定的な遺伝子導入を受けたものである。非遺伝子導入細胞 （CHO）またはベクターのみによる遺伝子導入を受けた細胞（pcDNA3）を本実験 における対照として用いた。10μMメナジオンへの曝露の後に、遺伝子導入細胞 をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗い、メナジオンを含まない培地中にてさら に24時間培養した。細胞死は、上記のようにトリパンブルー排出によって評価し た。非遺伝子導入細胞およびベクターのみによる遺伝子導入を受けた細胞ともに 24時間の生存試験期間の後に生存していたのは10％未満であった。RZFを発現し ている細胞に関して有意に優れた経過は認められなかった。しかし、完全長のm- xiap、xiapまたはbcl-2の発現、およびBIRドメインの発現によって細胞の生存率 は高まった（図16A）。メナジオンの濃度を10μMから20μMに高めた場合（その 他のすべての実験条件は10μMメナジオンを適用した際と同じにした）には、BIR ドメインのcDNA構築物を発現した生存CHO細胞の比率は、完全長のm-xiapまたはb cl-2のいずれかを発現した生存細胞の比率よりも高かった（図16B）。 C ．発現されたRZFおよびBIRドメインの細胞下局在の分析 上記の細胞死に関するアッセイから、RZFがIAPの抗アポトーシス機能の負の調 節因子として作用する可能性が示された。RZF、およびおそらくはその他のIAPド メインが、その調節性作用を発揮する1つの仕方は、その産物がアポトーシス経 路において機能する遺伝子の発現を変化させることによると考えられる。 発現されたRZFおよびBIRドメインの細胞下配置が核内調節因子としての役割と 一致しているか否かを判定するために、COS細胞に以下の4種の構築物による一時 的遺伝子導入を施し、発現されたポリペプチドの位置を免疫蛍光顕微鏡によって 調べた：(1)配列番号：4の497個のアミノ酸全部をコードするpcDNA3-6myc-xiap 、 (2)マウスxiap（配列番号：10）の497個のアミノ酸全部をコードするpcDNA3-6my c-m-xiap、(3)m-xiap（配列番号：10）のアミノ酸1〜341をコードするpcDNA3-6m yc-mxiap-BIR、(4)m-xiap（配列番号：10）のアミノ酸342〜497をコードするpcD NA3-6myc-mxiap-RZF。細胞をマルチウェル組織培養スライド上にて12時間増殖さ せた後に固定し、メタノールによる透過化処理を行った。用いた構築物（本試験 および細胞死アッセイにおいて使用）には、N末端にヒトMycエピトープタグによ るタグ付加を施した。このため、FITCを共役させた抗Mycモノクローナル抗体お よびヤギ抗マウス二次抗体を用いて、一時的遺伝子導入を受けたCHO細胞におけ る発現産物の位置を調べることができると考えられた。完全長のXIAPおよびMIAP は細胞質に位置しており、核周辺領域で特に発現が顕著であった。RZFドメイン をコードする（しかしBIRドメインはコードしない）構築物を発現する細胞の場 合にも同じ配置パターンが認められた。しかし、BIRドメイン（RZFは含まない） を発現する細胞は主に核の染色を呈した。BIRドメインの構築物によって発現さ れた蛋白質は、核への移行のさまざまな段階にあると考えられた。 以上の観察は、以下に説明するように、抗Fas抗体（これはアポトーシスの強 力な誘導因子である）によって処理したT細胞内ではXIAPが切断され、そのN端領 域が核に移動しているとの事実と一致する。 D ．付加的なアポトーシスアッセイの例 アポトーシスアッセイの具体例は以下の参考文献でも提供されている。リンパ 球におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：リ（Li）ら 、「非感染リンパ球における、HIV-1 Tat蛋白質によるアポトーシスの誘導（Ind uction of apoptosis in uninfected lymphocytes by HIV-1 Tat protein）」、 Science 268:429〜431；ジベリーニ（Gibellini）ら、「Tatを発現するジャーカ ット細胞は、急性ヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）の感染を含むさまざまなア ポトーシス刺激に対する抵抗性の増加を示す（Tat-expressing Jurkat cells sh ow an increased resistance to different apoptotic stimuli，including acu te human immunodeficiency virus-type 1）」、Br．J．Haematol．89:24〜33、 1995；マーチン（Martin）ら、「インビトロでのヒトCD4+T細胞のHIV-1への感染 ．これらの細胞における特異なアポトーシス誘導（HIV-1 infection of human C D4+ T cells in vitro．Differential induction of apoptosis in these cells ）」、J．Immunol．152:330〜42、1994；テライ（Terai）ら、「HIV-1に急性感 染した培養Tリンパ芽球における細胞死の機序としてのアポトーシス（Apoptosis as a mechanism of cell death in cultured T Lymphoblasts acutely infecte d with HIV-1）」、J．Clin．Invest．87:1710〜5、1991；デイン（Dhein）ら、 「APO-1/(Fas/CD95)11を介した自己分泌T細胞の自殺（Autocrine T-cell suicid e mediated by APO-1/(Fas/CD95)11）」、Nature 373:438〜441、1995；カチキ ス（Katsikis）ら、「Fas抗原刺激はヒト免疫不全ウイルス感染者におけるTリン パ球の著明なアポトーシスを誘発する（Fas antigen stimulation induces mark ed apoptosis of T lymphocytes in human immunodeficiency virus-infected i ndividuals）」、J．Exp．Med．1815:2029〜2036、1995；ウェステンドープ（We stendorp）ら、「HIV-1 Tatおよびgp120による、CD95を介したアポトーシスに対 するT細胞の感作（Sensitization of T cells to CD95-mediated apoptosis by HIV-1 Tat and gp120）」、Nature 375:497、1995；デロッシ（DeRossi）ら、Vi rology 198:234〜44、1994。 線維芽細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている： フォスベック（Vossbeck）ら、「ラット線維芽細胞に対するTGF-βの直接的な形 質転換作用（Direct transforming activity of TGF-beta on rat fibroblast） 」、Int．J．Cancer 61:92〜97、1995；ゴルッピ（Goruppi）ら、「NIH3T3線維 芽細胞のS期誘導に関与するc-mycドメインの精査（Dissection of c-myc domain s involved in S phase induction of NIH3T3 fibroblasts）」、Oncogene 9:15 37〜44；フェルナンデス（Fernandez）ら、「正常およびHa-ras形質転換C3Hマウ ス胚線維芽細胞の腫瘍壊死因子に対する感受性の差異：抵抗性細胞におけるbcl- 2、c-mycおよびマンガンスーパーオキシドジスムターゼの誘導（Differential s ensitivity of normal and Ha-ras transformed C3H mouse embryo fibroblasts to tumor necrosis factor: induction of bcl-2，c-myc，and manganese supe roxide dismutase in resistant cells）」、Oncogene 9:2009〜17、1994；ハリ ントン（Harrington）ら、「線維芽細胞におけるc-Myc誘発性アポトーシスは特 異的サイトカインによって阻害される（c-Myc-induced apoptosis in fibroblas ts is inhibited by specific cytokines）」、EMBO J．13:3286〜3295、1994；イトウ （Itoh）ら、「アポトーシスに必要な新規な蛋白質ドメイン．ヒトFas抗原の変 異分析（A novel protein domain required for apoptosis．Mutational analys is of human Fas antigen）」、J．Biol．Chem．268:10932〜7、1993。 神経細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：メ リノ（Melino）ら、「組織トランスグルタミナーゼおよびアポトーシス：ヒト神 経芽腫細胞を用いたセンスおよびアンチセンス遺伝子導入試験（Tissue transgl utaminase and apoptosis: sense and antisense transfection studies with h uman neuroblastoma cells）」、Mol．Cell．Biol．14:6584〜6596、1994；ロー ゼンバウム（Rosenbaum）ら、「低酸素誘発性の培養細胞のプログラム細胞死に 関する証拠（Evidence for hypoxia-induced，programmed cell death of cultu red neurons）」、Ann．Neurol．36:864〜870、1994；サトウ（Sato）ら、「bcl -2による細胞死の防止の結果としてのPC12細胞の神経分化（Neuronal different iation of PC12 cells as a result of prevention of cell death by bcl-2） 」、J．Neurobiol．25:1227〜1234、1994；フェラーリ（Ferrari）ら、「N-アセ チルシステインのD-およびL-立体異性体は神経細胞のアポトーシス性細胞死を防 止する（N-acetylcysteine D- and L-stereoisomers prevents apoptosis death of neuronal cells）」、J．Neurosci．1516:2857〜2866、1995；タレー（Tall ey）ら、「ヒト神経細胞における腫瘍壊死因子α誘発性アポトーシス：抗酸化剤 N-アセチルシステインならびに遺伝子bcl-2およびcrmaによる防御（Tumor necro sis factor alpha-induced apoptosis in human neuronal cells: protection b y the antioxidant N-acetylcysteine and the genes bcl-2 and crma）」、Mol ．Cell．Biol．1585:2359〜2366、1995；タレーら、「ヒト神経細胞における腫 瘍壊死因子α誘発性アポトーシス：抗酸化剤N-アセチルシステインならびに遺伝 子bcl-2およびcrmaによる防御（Tumor Necrosis Factor Alpha-Induced Apoptos is in Human Neuronal Cells: Protection by the Antioxidant NAcetylcystein e and the Genes bcl-2 and crma）」、Mol．Cell．Biol．1585:2359〜2366、19 95；ウォルキンショー（Walkinshaw）ら、「L-DOPAによるカテコールアミン作働 性PC12細胞におけるアポトーシスの誘導．パーキンソン病の治療との関連（Indu ction of apoptosis in catecholaminergic PC12 cells by L-DOPA．Implication for the treatment of Parkinson's disease）」、J．Clin．Invest．95:2458〜2464 、1995。 昆虫細胞におけるアポトーシスに関するアッセイは以下に開示されている：ク レム（Clem）ら、「昆虫細胞の感染期間におけるバキュロウイルス遺伝子による アポトーシスの防止（Prevention of apoptosis by a baculovirus gene during infection of insect cells）」、Science 254:1388〜90、1991；クルーク（Cr ook）ら、「ジンクフィンガー様モチーフを有するアポトーシス抑制性バキュロ ウイルス遺伝子」、J．Virol．67:2168〜74、1993；ラビザデー（Rabizadeh）ら 、「バキュロウイルスp35遺伝子の発現は哺乳類神経細胞死を抑制する（Express ion of the baculovirus p35 gene inhibits mammalian neural cell death）」 、J．Neurochem．61:2318〜21、1993、バーンバウム（Birnbaum）ら、「Cys/His 配列モチーフを有するポリペプチドをコードする核多角体病ウイルスからのアポ トーシス抑制性遺伝子（An apoptosis inhibiting gene from a nuclear polyhe drosis virus encoding a polypeptide with Cys/His sequence motifs）」、J ．Virol．68:2521〜8、1994；クレムら、「バキュロウイルス遺伝子p35およびIA Pによるプログラム細胞死の制御（Control of programmed cell death by the b aculovirus genes p35 and IAP）」、Mol．Cell．Biol．14:5212〜5222、1994。 V ．トランスジェニック動物の作出 IAP遺伝子の特徴分析によって、相同組換えによってIAPノックアウト動物モデ ルを作り出すために必要な情報が提供される。好ましくは、このモデルは哺乳動 物であり、最も好ましくはマウスである。同じく、標準的な組換え技法に従って ゲノム内に1つまたはそれ以上のIAP配列を組み込むことによってIAPを過剰産生 する動物モデルを作製することができると考えられる。 ノックアウトモデルの作出に用いられる置換型のターゲティングベクター（ta rgeting vector）は、例えば129/Sv（Stratagene Inc.，LaJolla，CA）などのマ ウス系統からの同質遺伝子のゲノムクローンを用いて構築することができる。こ のターゲティングベクターを、電気穿孔法によって適切な由来を有する胚幹（ES ）細胞の系列に導入することにより、著しく切断された形態のIAPを保持するES 細 胞系が作製されると考えられる。キメラ型ファウンダーマウスを作製するには、 標的となる細胞系に対してマウス胞胚期胚を注入するとよい。ヘテロ接合性の子 孫を交雑させることによってホモ接合が得られる。ノックアウトマウスによって 、IAP依存的な経路を介してアポトーシスを調節する治療的化合物のスクリーニ ングを行うためのインビボでの手段が提供されると考えられる。 VI ．IAP蛋白質の発現 IAP遺伝子は原核生物および真核生物の両方の細胞種において発現すると考え られる。IAPがアポトーシスを増悪させることによってそれを調節する場合には 、その蛋白質は誘導可能なプロモーターの制御下において発現されることが望ま しいと考えられる。 一般に、本発明によるIAPは、適切な発現ベクター内に配置されたIAPをコード するcDNA断片の全体または一部を有する適切な宿主細胞の形質転換によって産生 することが可能である。 分子生物学の分野における当業者は、組換え蛋白質を産生させるためにさまざ まに異なる種類の発現系を用いうることを理解すると考えられる。厳密にどの宿 主細胞を用いるかは本発明にとって本質的ではない。IAP蛋白質の産生には、原 核生物の宿主（大腸菌など）を用いてもよく、真核生物の宿主（例えば、ビール 酵母菌、Sf21細胞などの昆虫細胞、もしくはCOS-1、NIH 3T3またはヒーラ（Hela ）細胞などの哺乳類細胞）を用いてもよい。これらの細胞は、例えばアメリカン タイプカルチャーコレクション（American Type Culture Collection）、Rockvi lle、MDなどから広く入手可能である。アウスユーベル（Ausubel）ら、分子生物 学の最近のプロトコール（Current Protocols in Molecular Biology） （John W iley & Sons，New York，1994）も参照されたい。形質導入の方法および発現用 媒介物（expression vehicle）の選択は、選択される宿主系に依存すると考えら れる。形質転換および遺伝子導入の方法は、例えばアウスユーベルら（前記）に 記載されており、発現用媒介物は、例えばクローニングベクター：実験マニュア ル（Cloning Vector: A Laboratory Manual） （P．H．Pouwelsら、1985，Supp． 1987）に提供されているものから選択してもよい。 好ましい発現系の一つは、例えばクローンテク（Clontech）社から入手可能な ベクターであるpBacPAK9を用いるバキュロウイルス系である。必要に応じてこの 系を、例えばエヴァン（Evan）ら（Mol．Cell．Biol．5:3610〜3616，1985）に 記載されたmycタグ付加法などのその他の蛋白質発現法と併用して用いてもよい 。 または、安定的な遺伝子導入がなされた哺乳類細胞系によってIAPを産生させ ることもできる。哺乳類細胞の安定的な遺伝子導入に適した数多くのベクターは 広く入手することができ、例えばパウエル（Pouwel）ら（前記）に記載があり、 このような細胞系を構築する方法も同様である（例えばAusubelら（前記）を参 照）。1つの例においては、IAPをコードするcDNAを、ジヒドロ葉酸レダクターゼ （DHFR）遺伝子を含む発現ベクター内にクローニングする。このプラスミドの組 み込み、すなわちIAPをコードする遺伝子の宿主細胞の染色体への組み込みが起 こったものは、細胞培養液に0.01〜300μMメソトレキセートを添加することによ って選択される（Ausubelら、前記に記載された方法による）。この優性選択法 は大部分の細胞種において可能である。組換え蛋白質の発現は、導入された遺伝 子のDHFRを介した増幅によって増強させることができる。 遺伝子増幅を行う細胞系の選別の方法は、アウスユーベル（Ausubel）ら（前 記）に記載されている。このような方法には一般に、培地中のメソトレキセート の量を徐々に増加させていく持続培養が含まれる。最も使用される頻度の高いDH FR含有性の発現ベクターは、pCVSEII-DHFRおよびpAdD26SV(A)（Ausubelら、前記 に記載）である。上記の宿主細胞、または好ましくはDHFR欠損CHO細胞系（例え ば、CHO DHFR-細胞、ATCC寄託番号CRL 9096など）は、安定的な形質移入がなさ れた細胞系またはDHFRを介した遺伝子増幅に関するDHFRによる選択を行うために 最も好ましいものである。 いったん組換え蛋白質が発現されれば、例えばアフィニティクロマトグラフィ ーなどを用いてそれを単離する。1つの例においては、本明細書に説明した方法 によって産生されたものなどの抗IAP抗体をカラムに結合させ、それを用いてIAP を単離することができる。アフィニティクロマトグラフィーの前に行うIAPを含 有する細胞の溶解および分画化は、標準的方法に従って実施する（例えば、Ausu belら、前記を参照）。いったん単離されれば、必要に応じて、この組換え蛋白 質を例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC；例えば、フィッシャー（Fisher ）、生 化学および分子生物学における実験テクニック（Laboratory Techniques In Bio chemistry And Molecular Biology） 、WorkおよびBurdon編、Elsevier，1980を 参照）などによってさらに精製することができる。 本発明のポリペプチド、特にIAPの短い断片は、化学合成によっても生成する ことができる（例えば、固相ペプチド合成（Solid Phase Peptide Synthesis） 第2版、1984に記載されている方法による。The Pierce Chemical Co.，Rockford ，IL）。ポリペプチドの発現および精製に関するこれらの一般的な技法は、本明 細書に記載したように、有用なIAP断片またはその類似体の産生および単離に用 いることもできる。 VII ．抗IAP抗体 IAP特異的抗体を作製するために、IAPコード配列（すなわち、アミノ酸180〜2 76）を、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST；Smithら、Gene 67:31〜40、 1988）とのC端融合体として発現させることができる。この融合蛋白質は、グル タチオン-セファロースビーズ上にて精製し、グルタチオンによって溶出させ、 トロンビンによって切断し（操作によって作成した切断部位において）、ウサギ を首尾よく免疫化するために必要な程度まで精製することができる。一次免疫化 はフロイント完全アジュバントによって実施することができ、その後の免疫化は フロイント不完全アジュバントを用いて実施することができる。抗体価の観測は 、GST-IAP融合蛋白質のトロンビン切断IAP断片を用いるウェスタンブロットおよ び免疫沈降分析によって行う。免疫血清には、CNBr-セファロースを連結したIAP 蛋白質を用いてアフィニティ精製を行う。抗血清の特異性は、一連の非関連GST 蛋白質（GSTp53、Rb、HPV-16 E6およびE6-APを含む）およびGST-トリプシン（既 知の配列を用いるPCRによって作製されたもの）を用いて決定する。 GST融合蛋白質に対する代替的または付属的な免疫原として、例えばIAPの比較 的ユニークな親水性領域に対応するペプチドを作製し、導入したC端リジンを介 してキーホールリンペット・ヘモシアニン（KLH）と連結させることもできる。 これらのペプチドのそれぞれに対する抗血清をBSAと共役させたペプチド上で同 様にアフィニティ精製し、ペプチド共役体を用いるELISAおよびウェスタンブロ ット法、ならびに発現したIAPをGST融合蛋白質として用いるウェスタンブロット 法および 免疫沈降法によって特異性を検討する。 または、上記のIAPおよび標準的なハイブリドーマ技術を用いてモノクローナ ル抗体を作製することもできる（例えば、Kohlerら、Nature 256: 495、1975；K ohlerら、Eur．J．Immunol．6: 511、1976；Kohlerら、Eur．J．Immunol．6: 29 2、1976；Hammerlingら、モノクローナル抗体およびT細胞ハイブリドーマ（Mono clonal Antibodies and T Cell Hybridomas） 、Elsevier，New York，NY，1981 、Ausubelら、前記を参照）。いったん産生されたモノクローナル抗体を、ウェ スタンブロット法または免疫沈降分析によって（Ausubelら、前記に記載された 方法による）、IAPの特異的認識に関して検討することもできる。 1つまたはそれ以上のBIRドメインを含む（しかしリングジンクフィンガードメ インは含まない）または1つのリングジンクフィンガードメインを含む（しかしB IRドメインは含まない）本明細書に記載されたものなどのIAPまたはIAPの断片を 認識する抗体は、本発明において有用であると考えられる。それらは例えば、IA Pの発現レベルを観測するためのイムノアッセイ、または哺乳動物によって産生 されるIAPもしくはIAP断片の細胞下配置を決定するために用いることができる。 本明細書で説明する26kDaのIAP切断産物（少なくとも１つのBIRドメインを含む ）を抑制する抗体は、望ましくない増殖を起こしている細胞におけるアポトーシ スの誘導に特に有用であると考えられる。 好ましくは、本発明の抗体は、高度に保存された領域内に位置しておらず、ジ ェームソン（Jameson）およびウルフ（Wolf）のアルゴリズム（CABIOS 4: 181， 1988）を用いてペプチド構造プログラム（Genetics Computer Group Sequence A nalysis Package，Program Manual for the GCG Package，Version 7，1991）に よって示される基準などによる解析などで抗原性を有する可能性が高いと考えら れるIAP配列を用いて産生される。具体的には、すべてのIAPのBIR1とBIR2との間 に見いだされるこれらの領域は以下の通りである：hiap-1のアミノ酸99からアミ ノ酸170まで、hiap-2のアミノ酸123からアミノ酸184まで、およびxiapまたはm-x iapのアミノ酸116からアミノ酸133まで。これらの断片は、PCRなどの標準的手法 によって作製し、pGEX発現ベクターにクローニングすることができる（Ausubel ら、前記）。融合蛋白質は大腸菌で発現され、アウスユーベル（Ausubel）ら（ 前記 ）に記載されたように、グルタチオンアガロースアフィニティマトリックスを用 いて精製される。IAPに対して非特異的または低親和性の結合を示す抗血清が得 られる可能性を極めて少なくするためには、それぞれの蛋白質について2種類ま たは3種類の融合体を作製し、それぞれの融合体を少なくとも2匹のウサギに注入 する。抗血清は、一連の連続注入、好ましくは少なくとも3回のブースター注入 によって産生される。 VIII ．IAP蛋白質の発現を調節する分子の同定 IAPのcDNAの単離により、IAPの発現を増強または低下させる分子の同定も容易 となる。1つの手法においては、候補となる分子を、IAP mRNAを発現する細胞を 含む培地に種々の濃度で添加する。続いてIAPの発現を、例えばハイブリダイゼ ーション用プローブとしてIAPのcDNAまたはcDNAの断片を用いる標準的なノーザ ンブロット分析（Ausubelら、前記）によって測定する（表5も参照のこと）。候 補分子の存在下におけるIAPの発現レベルを、その他のすべての因子（例えば細 胞種および培養条件など）を同一にした候補分子の非存在下におけるIAPの発現 レベルと比較する。 その代わりに、IAPを介したアポトーシスに対する候補分子の影響を、IAP特異 的抗体（例えば、本明細書で説明するIAP抗体）を用いるウェスタンブロット法 または免疫沈降法などの標準的な蛋白質検出法とともに上記の一般的な手法を用 いることによって、翻訳のレベルで測定してもよい。 IAPのレベルを調節する化合物は、精製されたもの、もしくは実質的に精製さ れたものでも、または細胞からの抽出物または上清などの化合物の混合体の1つ の成分であってもよい（Ausubelら、前記）。化合物の混合体の1つのアッセイで は、化合物プール（例えば、HPLCまたはFPLCなどの標準的な精製法によって作成 されたもの）のサブセットの大きさを段階的に小さくしていきながら、IAPの発 現を調節する単一の化合物または効力のある最小数の化合物が示されるまで、IA Pの発現の検討を続ける。 化合物を、それがIAPのアポトーシス抑制活性を調節する能力に基づいてスク リーニングすることもできる。この手法では、候補化合物の存在下におけるアポ トーシスの程度と、その非存在下におけるアポトーシスの程度とを同一条件下で 比 較する。さらにまた、候補化合物のプールを用いてスクリーニングを開始し、そ こから1つまたはそれ以上の有用な調節性化合物を段階的なやり方で単離しても よい。アポトーシス活性は、例えば、本明細書で説明するものなどの任意の標準 的アッセイ法によって測定することができる。 IAPの活性を調節する化合物を検出するためのもう1つの方法は、ある任意のIA Pポリペプチドと物理的に相互作用する化合物をスクリーニングすることである 。これらの化合物は、当業者に周知の相互作用トラップ発原系を適合させること によって検出された。これらの系は、転写活性化アッセイを用いて蛋白質の相互 作用を検出することができ、ギュリス（Gyuris）ら（Cell 75: 791-803，1993） およびフィールド（Field）ら（Nature 340: 245-246，1989）にその概ねが記載 されており、Clontech社（Palo Alto，CA）から商業的に入手可能である。さら に、特許協力条約刊行物（PCT Publication）・国際公開公報第95/28497号には 、相互作用トラップアッセイが記載されており、そこではアポトーシスに関与す る蛋白質がBcl-2との相互作用を利用して検出される。IAPと相互作用する蛋白質 およびその他の化合物を同定するために、同様の方法を用いることもできる。 IAPを介した細胞死の調節因子として機能する化合物または分子には、細胞抽 出物、哺乳動物の血清、または哺乳類細胞を培養していた増殖培地に存在するよ うなペプチドおよび非ペプチド分子を含めてもよい。 IAPの発現またはIAPの活性の増強を促進する分子は、本発明において特に有用 と考えられる。このような分子は、例えば、IAPの細胞レベルを高め、それによ ってアポトーシスを抑制するIAPポリペプチドの能力を引き出す治療薬として用 いることができると思われる。 IAP活性を低下させる化合物（例えば、IAP遺伝子の発現またはポリペプチド活 性の低下による）は、細胞増殖を低下させるために用いることもできる。これは 、腫瘍（以下の表3参照）または他の細胞増殖性疾患の治療に有用と考えられる 。 *レベルは(+)によって示し、非癌対照細胞系からのRNAのノーザンブロットと比 較したRNAレベルのおおよその増加を示す。1つの+は増加の推計値が少なくとも1 倍であることを示す。 上記の方法によって、IAP遺伝子の発現またはポリペプチド活性を効果的に調 節することが見いだされた分子を、さらに動物モデルで検討してもよい。それら がインビボの状況でも引き続いてうまく機能する場合には、それらを、必要に応 じてアポトーシスの抑制または増強のいずれかのための治療薬として用いること ができると考えられる。 IX ．IAPによる治療 IAP遺伝子の発現レベルはアポトーシスのレベルと相関関係にある。このため 、IAP遺伝子には抗アポトーシス性の遺伝子治療における用途も見いだされる。 特に、機能性IAP遺伝子は、神経変性疾患の経過においてアポトーシスを起こす 神経細胞、リンパ球（すなわちT細胞およびB細胞）または虚血によって損傷を受 けた細胞の維持のために用いることができると考えられる。 治療的なIAP遺伝子構築物のための遺伝子移入到達系としては、アポトーシス に関与すると考えられる細胞（例えば上皮細胞）に対する親和性を有する、レト ロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、 ま たはその他のウイルスベクターを用いることができる。この目的に使用すること ができる多数のベクターは公知である（Miller，Human Gene Therapy 15-14，19 90; Friedman，Science 244:1275-1281，1989; EglitisおよびAnderson，BioTec hniques 6:608-614，1988; TolstoshevおよびAnderson，current opinion in Bi otechnology 1;55-61，1990; Sharp，The Lancet 337:1277-1278，1991; Cornet taら、Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322，1987; Ande rson，Science 22-:401-409，1984; Moen，Blood Cells 17:407-416，1991; Mil lerら、Biotechniques 7:980-990，1989; Le Gai La Salleら、Science 259:988 -990，1993; およびJohnson，Chest 107:77S-83S，1995）。レトロウイルスベク ターは特に開発が進んでおり、臨床の場でも使用されている（Rosenbergら、N． Engl．J．Med 323:370，1990; Andersonら、米国特許第5,399,346号）。そのま まではアポトーシスを起こすと予想される細胞内に治療的DNAを導入するために 、非ウイルス的手法を用いることもできる。例えば、リポフェクション（Felgne rら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:7413，1987; Onoら、Neurosci．Lett．11 7:259，1990; Brighamら、Am．J．Med．Sci．298:278，1989; Staubingerら、Me th．Enz．101:512，1983）、アシアロソヌコイド-ポリリジン抱合（Wuら、J．Bi ol．Chem．263:14621，1988; Wuら、J．Biol．Chem．264:16985，1989）、また は、好ましさは落ちるが、外科的状況下におけるマイクロインジェクション（Wo lffら、Science 247:1465，1990）によって、神経細胞またはT細胞にIAPを導入 することもできる。 上記の適用方法のいずれについても、治療的なIAP DNA構築物は、好ましくは アポトーシス現象が予想される部位に対して適用される（例えば注入による）。 しかし、アポトーシス現象が予想される部位の近傍の組織、またはアポトーシス が起こると予想される細胞に供給される血管に対してそれを適用してもよい。 上記の構築物において、IAP cDNAの発現は任意の適したプロモーターによって 指向させることができ（例えば、ヒト・サイトメガロウイルス（CMV）、シミア ンウイルス40（SV40）またはメタロチオネインのプロモーター）、任意の適切な 哺乳類調節要素によって調節することができる。例えば、必要であれば、IAPを 発現させるために、神経細胞、T細胞またはB細胞における遺伝子発現を優先的に 指向 することが知られているエンハンサーを用いてもよい。使用するエンハンサーは 、その発現が組織または細胞に特異的であると特徴づけられたものを無制限に含 む。または、IAPゲノムのクローンを治療的構築物として用いる場合（例えば、 上記のIAP cDNAとのハイブリダイゼーションによって単離した後）には、コグネ イト調節配列、または、必要であれば、上記の任意のプロモーターもしくは調節 要素を含む異種供給源に由来する調節配列を介して調節することもできる。 あまり好ましくはないが、IAPの遺伝子治療は、アポトーシスを起こすと予想 される細胞への、IAP mRNAまたはアンチセンスIAP mRNAの直接投与によって達成 される。このmRNAは任意の標準的手法によって作製および単離されたものでよい が、高効率プロモーター（例えばT7プロモーター）の制御下にあるIAP cDNAを用 いるin vivo転写によって最も容易に産生される。悪性腫瘍細胞へのIA PmRNAの 投与は、上記の直接的な核酸投与の方法のいずれによっても実施することができ る。 理想的には、任意の遺伝子治療の手法によるIAP蛋白質の産生は、少なくとも 非罹患細胞における正常なIAPの細胞内レベルと等しいIAPの細胞内レベルをもた らすと考えられる。IAPを介した任意の遺伝子治療の手法による治療は、より伝 統的な治療法と併用することができる。 本発明の範囲内にあるもう1つの治療的手法には、組換えIAP蛋白質の、アポト ーシス現象が予想される部位への直接的（例えば注入による）または全身的（例 えば、任意の従来の組換え蛋白質の投与法）のいずれかによる投与が含まれる。 IAPの用量は、個々の患者のサイズおよび健康状態を含む多くの因子に依存する が、一般的には何らかの薬学的に許容しうる製剤の形で成人に対して1日当たり0 .1mgから100mgの範囲で投与される。X ．IAPポリペプチド、IAP遺伝子またはIAPの合成もしくは機能の調節因子の投与 IAPの蛋白質、遺伝子または調節因子は、1回量を含む形で、薬学的に許容しう る希釈液、担体または賦形剤中に含めて投与することができる。過剰なアポトー シスによって引き起こされる疾患に罹患した患者に対するIAPポリペプチドの投 与に適した製剤または組成物を提供するために、従来の薬学的行為を用いてもよ い。投与は患者に症候が現れる前に行ってもよい。投与経路には任意の適切なも のを採用することができ、例えば投与は、非経口的、静脈内、動脈内、皮下、筋 肉 内、頭蓋内、眼窩内、眼部、脳室内、関節包内、髄腔内、槽内、腹腔内、鼻腔内 、エアロゾルまたは経口投与であってもよい。治療的製剤は液性溶液または懸濁 液の形態をとることもでき、経口投与用であれば製剤は錠剤またはカプセル剤の 形態をとることもでき、鼻腔内投与用であれば粉末剤、点鼻薬またはエアロゾル 剤の形態をとることもできる。 製剤を製造するための当技術分野において周知の方法は、例えば、「レミント ン薬学」（Reminton's Pharmaceutical Sciences）に記載されている。非経口投 与用の製剤は、例えば、賦形剤、滅菌水もしくは生理食塩水、ポリエチレングリ コールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレ ンを含むことができる。化合物の放出の制御のために、生体適合性で生分解性の ラクチド重合体、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン- ポリオキシプロピレン共重合体を用いてもよい。その他の利用可能と考えられる IAP調節性化合物の非経口的送達系には、エチレン-酢酸ビニル共重合体の粒子、 浸透圧性ポンプ、埋め込み可能な注入系およびリポソームが含まれる。吸入用の 製剤は、例えばラクトースなどの賦形剤を含んでも、もしくは例えばポリエチレ ン-9-ラウリルエーテル、グリココール酸塩およびデオキシコール酸塩などを含 む水性溶液であってもよく、または点鼻剤の剤形として投与するための油性溶液 、またはゲルであってもよい。 必要に応じて、IAPの蛋白質、遺伝子または調節性化合物による処置を、自己 免疫疾患に対する外科手術、ステロイド療法または化学療法、AIDSに対する抗ウ イルス療法および虚血性損傷に対する組織プラスミノーゲンアクチベーター（TP A）などのより伝統的な治療法と併用してもよい。 XI ．アポトーシスの変調が関与する状態の検出 IAPのポリペプチドおよび核酸には、アポトーシスのレベルの異常が関与する 状態の検出または観測における診断的用途も見いだされる。例えば、IAPポリペ プチドの発現の低下は、ヒトにおけるアポトーシスの亢進と関連している可能性 がある（以下のXIIを参照）。したがって、IAP産生レベルの低下または上昇は、 有害な状態の徴候を提供する可能性がある。IAPの発現レベルは、任意の標準的 な技法によってアッセイすることができる。例えば、生物試料（生検材料など） におけ るIAPポリペプチドの発現は標準的なノーザンブロット分析によって観測しても よく、PCRによる補助も可能である（例えば、Ausubelら、前記およびPCR Techno logy ：DNA増幅の原理および応用（Principles and Applications for DNA Ampli fication） 、H.A．Ehrlich編，Stcokton Press，NY；Yapら、Nucl．Acids．Res ．19:4294、1991を参照）。 または、ミスマッチ検出法を用いて、患者から採取した生物試料を、IAP配列 における1つまたはそれ以上の変異に関して分析することもできる。一般にこれ らの技法には、患者の試料から得た核酸のPCR増幅、および引き続いて行われる ハイブリダイゼーションの変化、電気泳動ゲル移動の異常、ミスマッチ結合蛋白 質を介した結合もしくは切断、または直接的な核酸塩基配列の決定のいずれかに よる変異（すなわちミスマッチ）の同定が含まれる。変異型IAPの検出を容易に するためにこれらの任意の技法を用いることができ、それぞれは本技術分野にお いて周知である。特殊な技法の例は、オリタ（Orita）ら、Proc．Natl．Acad．S ci．USA 86:2766〜2770、1989；シェフィールド（Sheffield）ら、Proc．Natl． Acad．Sci．USA 86:232〜236に無制限的に記載されている。 さらにもう1つの手法では、生物試料中のIAP蛋白質の検出または観測のために イムノアッセイが用いられる。IAPポリペプチドのレベルの測定には、任意の標 準的なイムノアッセイ形式（例えば、ELISA、ウェスタンブロット法またはRIA） において、IAP特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を用いること もできる。これらのレベルは野生型IAPのレベルと比較され、IAP産生に低下がみ られれば、アポトーシスの亢進が関与する状態であることが示される。イムノア ッセイの例は例えばアウスユーベル（Ausubel）ら、前記に記載されている。IAP の検出のために免疫組織化学的な技法を用いてもよい。例えば、患者から組織試 料を採取し、切片化して、抗IAP抗体および任意の標準的な検出系（例えば、西 洋ワサビペルオキシダーゼと共役させた二次抗体を含むもの）を用いてIAPの有 無に関して染色することもできる。このような技法に関する一般的な指導は、例 えばバンクロフト（Bancroft）およびスティーブンス（Stevens）（組織学的テ クニックの理論および実践（Theory and Practice of Histological Techniques ）、Churchill Livingstone、1982）およびアウスユーベルら（前記）に見いだ すことができ る。 1つの好ましい例では、IAP蛋白質の産生の評価（例えば、免疫学的技法または 蛋白質切断試験（Hogerrorstら、Nature Genetics 10:208〜212、1995））に始 まり、より微妙なIAPの変異（例えば点変異）を同定するように設計された核酸 に基づく検出法も含む、複合的な診断法を使用することができる。上記の通り、 当業者には多数のミスマッチ検出アッセイが利用可能であり、任意の好ましい技 法を用いることが可能である。IAPにおける変異としては、IAPの発現の消失また はIAPの生物活性の消失のいずれかを引き起こすものを検出することができる。 この複合的な診断法の変法では、任意の適切なプロテアーゼアッセイ系（例えば 上記のもの）を用いて、IAPの生物活性がプロテアーゼ活性として測定される。 ミスマッチ検出アッセイによって、不適切なアポトーシスによってもたらされ るIAPを介した疾患素因を診断する機会も提供される。例えば、IAPの変異に関し てヘテロ接合性である患者は何ら臨床症状を示さないものの、1つまたはそれ以 上の種類の神経変性性、脊髄形成異常性または虚血性の疾患を発症する可能性は 正常例よりも高いと考えられる。この診断を受けた場合、患者は有害な環境因子 （例えば、紫外線照射または化学的突然変異誘発物質）に対する曝露を最小限に し、自らの医学的状態を慎重に監視する（例えば、頻回の身体検査を通じて）よ うに予防策を講じると考えられる。この種のIAPの診断手法を、出生前スクリー ニングにおいてIAPの変異を検出するために用いることもできる。上記のIAP診断 アッセイは、その内部でIAPが通常発現される任意の生物試料（例えば、生検試 料、または体液もしくは組織）を用いて実施することができる。被験試料に関す るこれらの供給源を用いて、変異型IAP遺伝子の同定に関するアッセイを行うこ ともできる。 または、特にIAPに関連した変性疾患に対する素因を診断する一環として、IAP の変異を、任意の細胞からのDNA試料を用いて、例えばミスマッチ検出法によっ て検討することもできる。好ましくは、このDNA試料は分析に先立ってPCR増幅に かけられる。 癌の診断法および予後判定法としてのIAP遺伝子の有用性を示すために、ヒト 癌細胞系複数組織ノーザンブロット（Clontech，Palo Alto，CA; #7757-1）をプ ロ ーブ標識した。このノーザンブロットの各レーンには、以下の8種の異なるヒト 細胞系からのポリA+RNAが約2μg含まれている：(1)前骨髄球性白血病 L-60、(2) ヒーラ（Hela）細胞 S-3、(3)慢性骨髄性白血病 K-562、(4)リンパ芽球性リンパ 腫 MOLT-4、(5)バーキットリンパ腫ラジ（Raji）、(6)結腸直腸腺癌 SW480、(7) 肺癌 A549、および(8)悪性黒色腫 G361。対照として、ヒト複数組織ノーザンブ ロット（Clontech，Palo Alto，CA; #7759-1）のプローブ標識も行った。このノ ーザンブロットには、以下の8つの異なるヒト組織からのポリA+RNAが約2μg含ま れている：(1)脾臓、(2)胸腺、(3)前立腺、(4)精巣、(5)卵巣、(6)小腸、(7)大 腸、および(8)末梢血白血球。 ノーザンブロットには以下のものを連続的にハイブリダイズさせた：(1)xiap コード領域に対する1.6kbのプローブ、(2)3'非翻訳領域に対応する375bpのhiap- 2特異的プローブ、(3)hiap-2と交差反応する、hiap-1のコード領域に対数RZFド メイン1.3kbのプローブ、(4)bcl-2のコード領域に由来する1.0kbのプローブ、(5 )製造者によって提供されたβ-アクチンに対するプローブ。ハイブリダイゼーシ ョンは、製造者の意見に従って50℃で一晩実施した。ブロットには室温の2X SSC 、0.1％SDSによる15分間の洗浄を2回行い、続いて50℃の2X SSC、0.1％SDSによ る洗浄を行った。 検討した癌細胞系のすべてにおいて、非癌対照組織からの試料と比較してIAP の発現の増加が示された（表3）。xiapの発現は、ヒーラ（S-3）、慢性骨髄性白 血病（K-562）、結腸直腸腺癌（SW480）および悪性黒色腫（G361）で特に高度で あった。hiap-1の発現はバーキットリンパ腫で著しく高度であり、結腸直腸腺癌 でも上昇が認められた。hiap-2の発現は、慢性骨髄性白血病（K-562）および結 腸直腸腺癌（SW480）で特に高度であった。Bcl-2の発現にアップレギュレーショ ンが認められたのはHL-60白血病細胞のみであった。 以上の観察から、抗アポトーシス性IAP遺伝子のアップレギュレーションは広 範にみられる現象であって、おそらくBcl-2のアップレギュレーションよりも高 い頻度で起こっていることが示唆された。さらに、アップレギュレーションは、 癌性細胞の形質転換状態の確立または維持のために必要であると考えられる。 上記の観察を追究するために、すなわちラジ・バーキットリンパ腫細胞系にお いてhiap-1が過剰発現されるように、複数のバーキットリンパ腫細胞系において RT-PCR分析を実施した。ラジ（Raji）、ラモス（Ramos）、EB-3およびジヨーエ （Jiyoye）細胞系の細胞、ならびに陽性対照として正常胎盤組織から全RNAを抽 出した。RNAを逆転写させ、以下のオリゴヌクレオチドの組を用いるPCRによって 増幅した： 5'-AGTGCGGGTTTTTATTATGTG-3'（配列番号：＿）および 5'-AGATGACCACAAGGAATAAACACTA-3'（配列番号：＿）、これらはhiap-1のcDNA断 片を選択的に増幅する。RT-PCRはパーキンエルマー480サーモサイクラー（Perki nElmer 480 Thermocycler）を用いて行い、以下のプログラムを35サイクル実施 した：94℃を1分間、50℃を1.5分間、および72℃を1分間。PCR反応産物をアガロ ースゲル上で電気泳動し、臭化エチジウムによって染色した。適切なサイズの増 幅されたcDNA断片は、バーキットリンパ腫の試料を含むすべてのレーンで明らか に可視化されたが、正常胎盤組織の試料を含むレーンでは認められず、テンプレ ートDNAを反応に加えなかった陰性対照を含むレーンでも認められなかった（図1 7）。 XII ．星状細胞腫細胞における26kDa切断産物の蓄積 A ．26kDa切断産物の同定 ジャーカット（Jurkat）細胞および星状細胞腫細胞に対して、50mM Tris-HCl （pH8.0）、150mM NaCl、1mM PHSF、1μg/ml アプロチニン、および5mMベンザミ ジン中にて超音波処理（×3回、4℃で15分間）を施すことにより、それらの細胞 から全蛋白抽出物を調製した。超音波処理の後、試料に5分間の遠心処理を行っ た（遠心管中にて14,000RPM）。10％SDS-ポリアクリルアミドゲルの各ウェルに 蛋白質20μgを載せて電気泳動を行い、標準的な方法によってPVDF膜に対するエ レクトロブロット法（electroblot）を行った。すでに記載した方法の通りにウ ェスタンブロット分析を実施した結果、星状細胞腫細胞系（CCF-STTG1）が、ア ポトーシスの誘因となるイベントがなかったにもかかわらず、抗xiap反応性の約 26kDaのバンドを大量に発現したことが明らかになった（図18）。実際に、この 細胞系が標準的なアポトーシス誘因に対して特に抵抗性を有するという特徴はす でに分析されている。 26kDaのxiap反応性バンドは以下の実験条件下でも認められた。ジャーカット 細 胞（形質転換ヒトT細胞系）は、抗Fas抗体（1μg/ml）への曝露によって誘導さ れてアポトーシスを起こした。ジャーカット細胞の同一培養物に対して以下のい ずれかを暴露させた：(1)抗Fas抗体およびシクロヘキシミド（20μg/ml）、(2) 腫瘍壊死因子α（TNF-α、1000 U/ml）または(3)TNF-αおよびシクロヘキシミド （20μg/ml）。投与開始から6時間後にすべての細胞を収集した。このほかに陰 性対照として、細胞を収集した後の抽出物に抗Fas抗体を添加した。細胞はSDS試 料緩衝液中に収集し、12.5％SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、標準 的な方法を用いてPVDF膜へのエレクトロブロッティングを行った。この膜に、１ ：1000としたウサギ抗XIAPポリクローナル抗体による免疫染色を1時間行った。1 5分間洗浄した後に、西洋ワサビペルオキシダーゼと共役させたヤギ抗ウサギ抗 体を室温で1時間適用した。非結合型の二次抗体を洗い流し、化学発光によるXIA P蛋白質の検出を実施した。このウェスタンブロットにより、非処置および処置 細胞の両方に完全長の55kDaのXIAP蛋白質が存在することが明らかになった。さ らに、アポトーシス性細胞の抽出物には約26kDaの新規なxiap反応性バンドも認 められたが、対照の非処置細胞の抽出物ではこれは認められなかった（図19）。 XIAPの切断は、ヒーラ（Hela）などの他の癌細胞系を含むさまざまな細胞種で 起こる。26kDaのXIAP切断産物の発現は、ヒーラ細胞では以下のようにして示さ れている。ヒーラ細胞に以下のいずれかの処置を行った：(1)シクロヘキシミド （20μg/ml）、(2)抗Fas抗体（1μg/ml）、(3)抗Fas抗体（1μg/ml）およびシク ロヘキシミド（20μg/ml）、(4)TNFα（1,000 U/ml）、または(5)TNFα（1,000 U/ml）およびシクロヘキシミド（20μg/ml）。処置開始から18時間後にすべての 細胞を収集した。上記の通りに細胞を収集した後の抽出物に抗Fas抗体を添加し た。ヒーラ細胞を収集し、ジャーカット細胞の試料からのxiap反応性バンドの可 視化に用いたものと同一の条件下でウェスタンブロットのプローブ標識を行った 。アポトーシス性細胞調製物では同じく26kDaのXIAPのバンドが認められた（図2 0）。さらに、XIAPの切断の度合いとアポトーシスの程度との間には正の相関が 認められた。ヒーラ細胞にシクロヘキシミドまたはTNFαのいずれかのみを投与 した場合にはわずかなアポトーシスが引き起こされたのみであり、切断産物はほ とんど認められなかった。細胞に抗Fas抗体を投与した場合には、より多量の切 断産物が明ら かに認められた。これらのデータは、XIAPが1種を超える細胞種において、1種を 超えるアポトーシス誘因に反応して切断されることを示している。 B ．発現の時間経過 ヒーラおよびジャーカット細胞に抗Fas抗体（1μg/ml）を投与して、投与の直 後または1、2、3、5、10もしくは22時間後のいずれかに収集することにより、26 kDa切断産物の蓄積に関する時間経過を検討した。上記の通りに、蛋白質抽出物 を調製してウェスタンブロット分析を実施した。検討した時間経過の範囲にわた って、26kDa切断産物の蓄積量は両方の種類の細胞で増加した（図21Aおよび21B ）。 C ．26kDaのXIAP切断産物の細胞下局在 26kDa切断産物の細胞下配置を決定するために、抗Fas抗体（1μg/ml）への曝 露によってジャーカット細胞がアポトーシスを起こすように誘導し、続いてその 直後、3時間後または6時間後に細胞を収集した。上記の通りに、それぞれの時点 で収集した細胞から全蛋白質抽出物を調製した。核および細胞質の細胞抽出物を 調製するために、アポトーシス性ジャーカット細胞を等張トリス（Tris）緩衝生 理食塩水（pH7.0）で洗い、細胞抽出緩衝液（50mM PIPES、50mM KCl、5mM EGTA 、2mM MgCl2、1mM DTTおよび20μMサイトカラシンB）中での凍結解凍を5回行う ことによって溶解した。核は遠心処理によってペレット化し、等張トリス緩衝液 （pH7.0）中に再懸濁させて-80℃で凍結した。抽出物の細胞質分画は、TA 100.3 ローターに入れて60,000RPMでの遠心処理をさらに30分間施した。上清を除去し 、-80℃で凍結した。核および細胞質の両方の分画の試料を12.5％SDS-ポリアク リルアミドゲル上に載せた後、PVDF膜へのエレクトロブロッティングを行った。 続いて、抗CPP32抗体（Transduction Laboratories Lexington，KY；図22A）ま たは上記のウサギ抗XIAP抗体（図22B）のいずれかを用いてウェスタンブロット 分析を実施した。 CPP32プロテアーゼを認識する抗CPP32抗体（YAMAまたはアポパイン（Apopain ）としても知られる）は、ほぼ独占的に細胞質分画中に分配された。55kDaのXIA P蛋白質は独占的にアポトーシス性細胞の細胞質中に位置しており、これは、正 常で健全なCOS細胞でXIAPが細胞質に位置することが免疫蛍光顕微鏡法によって 示した上記の研究の結果と一致する。これに対して、アポトーシス性ジャーカッ ト細胞 では、核分画に独占的に26kDa切断産物が位置していた。以上を総合すると、こ れらの観察から、XIAPの抗アポトーシス成分は26kDa切断産物であって、それは 核内に作用を及ぼすと考えられることが示唆される。 D ．XIAP蛋白質のインビトロでの切断、および切断産物の特徴分析 この一連の実験のために、プラスミドpcDNA3-6myc-XIAP、T7 RNAポリメラーゼ 、および一対の転写／翻訳キット（Promega）を製造者の指示に従って用いて、X IAP蛋白質にS35による標識を施した。セファデックス（Sephadex）G-50を用いる カラムクロマトグラフィーにより、放射性標識が施されたXIAP蛋白質を、取り込 まれなかったメチオニンから分離した。さらに、抗Fas抗体（1μg/ml）による処 置を3時間行った後、アポトーシス性ジャーカット細胞の抽出物を調製した。抽 出物を調製するために、細胞をTriton X-100緩衝液（1％ Triton X-100、25mM T ris HCl）中にて氷上に2時間置いて溶解し、続いて5分間のマイクロ遠心処理（m icrocentrifuge）を行った。可溶性抽出物を残した（これはTX100と表記した） 。細胞抽出緩衝液中にて凍結／解凍を行って細胞を溶解した。可溶性の細胞質分 画は別にまとめた（これはCEBと表記した）。CEB細胞質分画の調製物から得た核 ペレットは、Triton X-100緩衝液によって可溶化し、マイクロ遠心処理を行って 、主に核DNAを含む可溶性分画を残した（これはCEB-TX100と表記した）。可溶性 細胞抽出物は細胞をNP-40緩衝液によって溶解することによって調製し、続いて マイクロ遠心処理を5分間実施した（これはNP-40と表記した）。インビトロでの 切断は、それぞれの抽出物（CEB、TX-100、CEB-TX100およびNP-40）16μlを、イ ンビトロで翻訳されたXIAP蛋白質とともに37℃で7時間インキュベートすること によって実施した。TX100緩衝液またはCEB緩衝液のみを含む陰性対照も含めた。 蛋白質は10％SDS-ポリアクリルアミド上で分離し、乾燥させた後にX線フィルム に一晩露光させた。 XIAPのインビトロでの切断は、CEB抽出物では明らかであった。切断産物の分 子量の観測値は約36kDaであった（図23）。切断産物のサイズに10kDaの差があっ たことは、観察された産物が、mycエピトープの6つのコピー（10kDa）を含む組 換え蛋白質のアミノ末端に由来することを示している。このため、この切断産物 は少なくとも2つのBIRドメインを有しており、核内に位置していると考えられる 。 XIII ．HIVに感染した個体の治療 hiap-1およびhiap-2の発現は、HIVに感染したヒト細胞では著明に低下する。 さらに、この低下はアポトーシスに先行する。したがって、HIAP-1、HIAP-2、こ れらの蛋白質をコードする遺伝子、またはこれらの遺伝子をアップレギュレート する化合物の投与を、HIVに感染した患者におけるT細胞の消耗を予防するために 用いることができる。以下のアッセイを、hiap-1またはhiap-2の発現を変化させ 、同時にアポトーシスを予防する化合物をスクリーニングするために用いること もできる。 培養成熟リンパ球CD-4+T細胞系（H9、「a」と表記；CEM/CM-3、「b」と表記； 6T-CEM、「c」と表記；およびジャーカット、「d」と表記。いずれも図13Aおよ び図13B）をマイトジェンまたはHIV感染に曝露させた後、アポトーシスの徴候（ 図13A）およびhiap遺伝子の発現（図13B）に関して検討した。アポトーシスの存 在はゲル電気泳動上のDNAの「梯子状分布（laddering）」の出現によって示され 、遺伝子の発現はPCRによって評価された。正常の（感染もマイトジェン刺激も 受けていない）細胞から得た結果は、図13Aおよび13Bに「1」と表記した各レー ンに示した。PHA/PMA（フィトヘマグルチニン／ホルボールエステル）刺激から2 4時間後に得た結果は、「2」と表記した各レーンに示した。HIV IIIB株の感染か ら24時間後に得た結果は、「3」と表記した各レーンに示した。「M」は標準的DN Aマーカーを指す（図13Bにおける123bpのラダー、および図13AにおけるラムダHi ndIIIラダー（いずれもGibco-BRL））。アポトーシスの存在を示すDNAのラダー （Prigentら、J．Immunol．Methods、160:139〜140、1993）は、上記の試料から 得たDNAをアガロースゲル上で電気泳動して臭化エチジウム染色を施した場合に は明らかであった（図13A）。検討した4種のT細胞系のアポトーシスに対する感 受性およびその程度は、マイトジェン刺激およびHIV感染の後に変化した。 hiap遺伝子の発現を検討するために、培養細胞から全RNAを調製し、オリゴdT プライミングを用いて逆転写を行った。hiap-2a、hiap-2bおよびhiap-1を検出す るために、特異的プライマー（表5に示した）を用いるPCRによってRT cDNA産物 を増幅した。PCRは、パーキンエルマー480サーモサイクラー（PerkinElmer 480 thermocycler）を用いて行い、以下のプログラムを35サイクル実施した：94℃を 1分間 、55℃を2分間および72℃を1.5分間。RT-PCR反応産物を1％アガロースゲル上で 電気泳動し、臭化エチジウムで染色した。HIVの感染から24時間後では4種の細胞 系のすべてにおいてhiap-2の転写物は認められなかった。4種の細胞系のうち3種 （すべてH9以外）では、HIV感染後にhiap-1遺伝子も劇的にダウンレギュレート された。PHA/PMAマイトジェン刺激によってもhiap遺伝子の発現は低下するよう に思われ、これは特にhiap-2で強く、程度は落ちるがhiap-1でも認められた。こ れらの実験で得られたデータの概要を表5に示した。β-アクチンの発現は検討し たすべての細胞系で一貫して認められ、このことから、hiap遺伝子の発現の低下 はRT-PCRアッセイの欠陥によるものではないことが示された。 *それぞれのIAP遺伝子に関する図1〜4から決定されたヌクレオチドの位置 a hiap2aのPCR産物のサイズ b hiap2bのPCR産物のサイズ XIV ．蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）によるxiap、hiap-1 およびhiap-2の染色体Xq25および11q22-23への割り当て 蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（FISH）を用いてxiap、hiap-1お よびhiap-2の染色体上の位置を同定した。用いたプローブはプラスミドベクター 中にクローニングしたcDNAである：2.4kbのxiapクローンは1493bpのコード配列 、34bpの5'UTR（非翻訳領域）および913bpの3'UTRを含み、hiap-1のcDNAクロー ンは3.1kb長であって1812のコード配列および1300bpの3'UTRを含み、hiap-2クロ ーンは1856bpのコード配列および1200bpの5'UTRからなる。合計1μgのプローブD NAをニックトランスレーション（BRL）によってビオチン標識した。正常末梢血 培養物から調製した染色体展開物（chromosome spread）を70℃の50％ホルムア ルデヒド／2X SSC中に2分間置いて変性させ、続いて、2X SSC／70％ホルムアル デヒド／10％硫酸デキストランからなる溶液中にて、ビオチン標識したDNAプロ ーブと37℃ で18時間ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーションの後に展開物を2X SSC ／50％ホルムアルデヒドで洗い、続いて42℃の2X SSCで洗った。ビオチン標識し たDNAを、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）共役アビジン抗体および 抗アビジン抗体（ONCOR検出キット）により、製造者の指示に従って検出した。 染色体はヨウ化プロピジウムによって対比染色し、オリンパス（Olympus）BX60 間接蛍光顕微鏡を用いて検査した。染色体の同定のために、記録および標識され た分裂中期展開物を載せたスライドに脱染、脱水、乾燥、トリプシンによる30秒 間の消化、および4％ギムザ染色による2分間の染色を行った。染色体展開物の位 置を再び捉えて、画像を比較した。 上記のようにして、合計101個の分裂中期展開物をxiapプローブを用いて検討 した。分析した細胞の74％では、Xq25染色体の相同体の1つまたは両方のいずれ かに対称的な蛍光信号が認められた。hiap-1およびhiap-2のプローブで染色した 後に56個の細胞を分析したところ、検討した細胞の83％で11q22-23領域に対とな る信号が認められた。xiap遺伝子はXq25にマッピングされ、hiap-1およびhiap-2 遺伝子は11q22および11q23バンドの境界部にマッピングされた。 以上の実験により、xiap遺伝子の位置が染色体Xq25上にあることが裏づけられ た。これまでのところ、いずれの悪性腫瘍についてもバンドXq25が関与する高度 に一貫した染色体異常は報告されていない。しかし、この領域内の欠失は、伴性 劣性リンパ増殖症候群を含む多数の免疫系欠損症と関連している（Wuら、Genomi cs 17:163〜170、1993）。 小児白血病の50％を超える割合で、表現型とは無関係にバンド11q23の細胞遺 伝学的異常が同定されている（Martinez-Climetら、Leukemia 9:1299〜1304、19 95）。MLL遺伝子（混合連鎖白血病（mixed lineage leukemia）または骨髄系リ ンパ球性白血病；Ziemin Van der Poelら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:107 35〜10739）の再配列は、11q23の転座を有する症例の80％以上で検出されている が、MLL遺伝子以外の領域が明らかに再配列に関与している患者も報告されてい る（Kobayashiら、Blood 82:547〜551、1993）。このため、IAP遺伝子はBcl-2の パラダイムに従うと考えられ、したがって癌の形質転換において重要な役割を果 たすと考えられる。 XV ．予防的な抗アポトーシス療法 IAPの変異に関してヘテロ接合的である、またはIAPの変異を起こしやすい（そ の変異がIAPの生物活性の変調または消失をもたらさないものであっても）と診 断された患者、またはHIV陽性であると診断された患者には、疾患の表現型が現 れる前に上記の治療法のいずれかを投与することができると考えられる。例えば この治療法は、HIV陽性であるが現時点ではT細胞数の減少またはその他の明白な 徴候を有していない患者に対して提供されうる。特にIAPの発現またはIAPの生物 活性を増強させることが示された化合物は、任意の標準的な用量および経路の投 与（上記参照）によって投与することができると考えられる。または、IAP発現 構築物を用いる遺伝子治療を行って変性疾患の発症の前に細胞欠損の回復または 予防を行うこともできると考えられる。 本発明の方法は、例えばヒト、家庭内ペットまたは家畜などの任意の哺乳動物 において本明細書で説明した疾患の低減または診断に用いることができると思わ れる。非ヒト哺乳動物に治療または診断を受けた場合、使用したIAPのポリペプ チド、核酸または抗体は好ましくはその種に特異的である。 その他の態様 その他の態様において、本発明は、哺乳類IAPポリペプチド（図1〜6、配列番 号：1〜42）と実質的に同一な任意の蛋白質を含む。このような相同体は、その 他の実質的に純粋な天然の哺乳類IAP蛋白質のほか、対立遺伝子変異体、天然変 異体、誘導変異体、蛋白質をコードしておりかつ高度に厳密な条件、または好ま しさは落ちるが厳密性の低い条件（例えば、少なくとも40ヌクレオチド長のプロ ーブとともに40℃で2X SSCにより洗浄）において図1〜6のIAPのDNA配列（配列番 号：1〜42）とハイブリダイズするDNA配列、およびIAPを指向する抗血清と特異 的に結合する蛋白質を含む。また、この用語は、IAPの一部を含むキメラ蛋白質 を含む。 本発明はさらに、任意の天然のIAPの類似体を含む。類似体は天然のIAPとは、 アミノ酸配列の違い、翻訳後修飾のいずれかまたはその両方の点で異なる。一般 に本発明の類似体は、天然のIAPの配列の全体または一部と少なくとも85％、よ り好ましくは90％、最も好ましくは95％またはさらに99％の同一性を示す。比較 する配列の長さは、少なくとも15アミノ酸残基であり、好ましくは25アミノ酸残 基 、より好ましくは35アミノ酸残基を上回る。修飾には、インビボおよびインビト ロでのポリペプチドの化学的誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化、リ ン酸化、またはグリコシル化などが含まれる。このような修飾は、ポリペプチド の合成もしくはプロセッシングの間、または単離された修飾酵素による処置後に も起こる。また、類似体は、天然のIAPとは一次配列に変化を生じている点でも 異なる。これらには、天然型および誘導型の両方（例えば、Sambrook，Fritsch およびManiatis、分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A L aboratory Manual）第2版、CSH Press、1989またはAusubelら、前記に記載され た方法による、放射線照射もしくはエタンメチルスルホネート曝露によるランダ ム変異誘発または部位特異的変異誘発によって生じたもの）による遺伝的変異体 が含まれる。また、環状化ペプチド分子、および例えばD-アミノ酸またはβもし くはγアミノ酸などの非天然型もしくは合成アミノ酸などの、L-アミノ酸以外の 残基を含む類似体も含まれる。完全長のポリペプチドのほかに、本発明にはIAP の断片も含まれる。本明細書で用いる「断片」という用語は、少なくとも20個の 隣接アミノ酸、好ましくは30個の隣接アミノ酸、より好ましくは50個の隣接アミ ノ酸、最も好ましくは60から80個またはそれ以上の隣接アミノ酸を意味する。IA Pの断片は当業者に周知の方法によって作製することができるが、通常の蛋白質 プロセッシング（例えば、新生ポリペプチドからの生物活性に必要でないアミノ 酸の除去、または選択的mRNAスプライシングもしくは選択的蛋白質プロセッシン グ過程によるアミノ酸の除去）によって得られたものでもよい。 本発明による好ましい断片または類似体は、診断対象となる試料におけるIAP の核酸またはアミノ酸配列の特異的な検出を容易にするものである。この目的に 特に有用なIAP断片には、表2に示したアミノ酸断片が無制限的に含まれる。 請求内容は以下の通りである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３１Ｍ ６４３ ６４３Ｄ ６４３Ａ 38/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/68 33/50 Ｔ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/53 Ｄ 33/50 33/566 33/53 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｄ 33/566 Ｎ // Ａ６１Ｋ 39/395 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 リストン ピーター カナダ国 オンタリオ州 オタワ スミス 401 チルドレンズ ホスピタル オブ イースタン オンタリオ

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．IAPポリペプチドをコードする実質的に純粋な核酸。 ２．ポリペプチドが1つのリングジンクフィンガードメインと少なくとも1つのBI Rドメインとを含む、請求項1記載の核酸。 ３．ポリペプチドが少なくとも2つのBIRドメインを有する、請求項2記載の核酸 。 ４．ポリペプチドが少なくとも3つのBIRドメインを有する、請求項3記載の核酸 。 ５．ポリペプチドが少なくとも1つのBIRドメインを含むがリングジンクフィンガ ードメインは欠いている、請求項1記載の核酸。 ６．ポリペプチドが少なくとも2つのBIRドメインを有する、請求項5記載の核酸 。 ７．ポリペプチドが少なくとも3つのBIRドメインを有する、請求項6記載の核酸 。 ８．ポリペプチドが1つのリングジンクフィンガードメインを含むがBIRドメイン は欠いている、請求項1記載の核酸。 ９．核酸が哺乳動物のものである、請求項1記載の核酸。 10．哺乳動物がヒトである、請求項9記載の核酸。 11．DNAが、m-xiap遺伝子、m-hiap-1遺伝子またはm-hiap-2遺伝子を含む、請求 項9記載の核酸。 12．DNAが、xiap遺伝子、hiap-1遺伝子またはhiap-2遺伝子を含む、請求項10記 載の核酸。 13．核酸がゲノムDNAまたはcDNAである、請求項1記載の核酸。 14．図1もしくはその縮重変異体の配列を有し図1のアミノ酸配列をコードする、 図2もしくはその縮重変異体の配列を有し図2のアミノ酸配列をコードする、図3 もしくはその縮重変異体の配列を有し図3のアミノ酸配列をコードする、または 図4もしくはその縮重変異体の配列を有し図4のアミノ酸配列をコードする、実質 的に純粋なDNA。 15．図1、図2、図3または図4のDNA配列とのヌクレオチド配列の同一性が約50％ またはそれ以上である実質的に純粋なDNA。 16．図1、図2、図3または図4に示したDNA配列と実質的に同一な精製DNA配列。 17．DNAがポリペプチドの発現のための調節配列と機能的に結合しており、該調 節配列がプロモーターを含む、請求項1記載のDNA。 18．プロモーターが構成的プロモーターであるか、1つまたはそれ以上の外部因 子によって誘導可能であるか、または細胞種特異的である、請求項17記載のDNA 。 19．請求項1記載のDNAを含み、該DNAにコードされるペプチドの発現をベクター 含有細胞において指向する能力を有するベクター。 20．請求項1記載のDNAを含む細胞。 21．細胞死の過剰または不足によって引き起こされる疾患を有する患者の体内に 存在する、請求項20記載の細胞。 22．線維芽細胞、ニューロン、グリア細胞、昆虫細胞、胚幹細胞およびリンパ球 からなる群より選択される、請求項20記載の細胞。 23．請求項1記載のDNAを含むトランスジェニック細胞であって、該DNAが該トラ ンスジェニック細胞内で発現する、トランスジェニック細胞。 24．請求項20記載の細胞から作製されたトランスジェニック動物であって、該DN Aが該トランスジェニック動物の体内で発現する、トランスジェニック動物。 25．実質的に純粋な哺乳類IAPポリペプチドまたはその断片。 26．請求項5、請求項6、請求項7または請求項8記載の核酸によってコードされて いる、請求項25記載のポリペプチド。 27．図1、図2、図3または図4に示したアミノ酸配列と実質的に同一なアミノ酸配 列を含む、請求項25記載のポリペプチド。 28．哺乳動物のポリペプチドである、請求項25記載のポリペプチド。 29．ヒトのポリペプチドである、請求項25記載のポリペプチド。 30．M-XIAP、M-HIAP-1、またはM-HIAP-2である、請求項28記載のポリペプチド。 31．XIAP、HIAP-1、またはHIAP-2である、請求項29記載のポリペプチド。 32．生理学的に許容される担体中に処方されている活性成分として、請求項25記 載のIAPポリペプチドを含む治療的組成物。 33．活性成分が、請求項5、請求項6、請求項7または請求項8記載の核酸によって コードされるIAPポリペプチドである、請求項32記載の組成物。 34．アポトーシス抑制量のIAPポリペプチドを該細胞へ投与する段階を含む、細 胞におけるアポトーシスを抑制する方法。 35．細胞が哺乳動物の体内にある、請求項34記載の方法。 36．哺乳動物がヒトである、請求項35記載の方法。 37．ヒトが、HIV陽性であるか、またはAIDS、神経変性疾患、骨髄異形成症候群 もしくは虚血性損傷を有すると診断されている、請求項35記載の方法。 38．虚血性損傷が、心筋梗塞、脳卒中、再潅流障害、または中毒性肝障害によっ て引き起こされる、請求項37記載の方法。 39．哺乳動物におけるアポトーシスを抑制する方法であって、該哺乳動物の細胞 へIAPポリペプチドまたはその断片をコードする導入遺伝子を提供する段階を含 み、該導入遺伝子が該細胞内で発現のための位置に置かれている、方法。 40．導入遺伝子が、M-XIAP、M-HIAP-1またはM-HIAP-2をコードしている、請求項 39記載の方法。 41．哺乳動物がヒトである、請求項39記載の方法。 42．ポリペプチドが、XIAP、HIAP-1またはHIAP-2である、請求項41記載の方法。 43．哺乳動物が、HIV陽性であるかまたはAIDSを有する、請求項39記載の方法。 44．細胞がT細胞である、請求項43記載の方法。 45．T細胞がCD4+T細胞である、請求項44記載の方法。 46．哺乳動物が神経変性疾患を有する、請求項39記載の方法。 47．哺乳動物が虚血性損傷を有する、請求項39記載の方法。 48．虚血性損傷が、心筋梗塞、脳卒中、再潅流障害、または中毒性肝障害によっ て引き起こされる、請求項47記載の方法。 49．動物細胞におけるIAP遺伝子を検出する方法であって、請求項2記載のDNAま たは長さが約18ヌクレオチドを超えるその一部を、該動物細胞からのゲノムDNA 調製物と接触させる段階を含み、図1、図2、図3または図4の配列とのヌクレオチ ド配列の同一性が約50％またはそれ以上であるDNA配列を検出することができる 、方法。 50．以下の段階を含む、IAPポリペプチドを得るための方法： (a)細胞内で発現するための位置に置かれた、IAPポリペプチドをコードするDN Aを有する細胞を提供する段階、 (b)該DNAが発現するための条件下で該細胞を培養する段階、および (c)該IAPポリペプチドを単離する段階。 51．DNAが、1つまたはそれ以上の外部因子によって誘導可能なプロモーターをさ らに含む、請求項50記載の方法。 52．IAPポリペプチドが、XIAP、HIAP-1、HIAP-2、M-XIAP、M-HIAP-1またはM-HIA P-2である、請求項45記載の方法。 53．オリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRにより該IAP遺伝子またはその部 分を増幅させる段階であって、該プライマーが、 (a)それぞれ長さが13ヌクレオチド以上であり、 (b)それぞれが図1、図2、図3または図4のいずれかのヌクレオチド配列の1つの領 域の逆DNA鎖に対して相補的な領域を有し、かつ (c)増幅産物内に制限酵素切断部位を作成する能力を有する配列を選択的に含む ものである、段階と 該IAP遺伝子またはその部分を端利する段階とを含む、 xiap、m-xiap、hiap-1、m-hiap-1、hiap-2もしくはm-hiap-2と同一の配列を有す るIAP遺伝子またはその断片を単離する方法。 54．以下の配列を有するリングジンクフィンガードメインを含む実質的に純粋な ポリペプチド：Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys- Lys-Xaa3-Cys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe-Xaa1-Pro-Cys-Gly -His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-P ro-Xaa1-Cys、ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2はGluまたはAspであり 、Xaa3はValまたはIleである。 55．以下の配列のコピーを有する少なくとも1つのBIRドメインをさらに含む、請 求項54記載のポリペプチド：Xaa1-Xaa1-Xaa1-Arg-Leu-Xaa1-Thr-Phe-Xaa1-Xaa1- Trp-Pro-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Leu-Ala-Xaa1-Ala-Gl y-Phe-Tyr-Tyr-Xaa1-Gly-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Val-Xaa1-Cys-Phe-Xaa1-Cys-Xaa1 -Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Trp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa 1-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Pro-Xaa1-Cys-Xaa1-Phe-Val、ここでXaa1は任意の アミノ酸であり、Xaa2は任意のアミノ酸であっても欠失していてもよい。 56．少なくとも2つのBIRドメインを含む、請求項55記載のポリペプチド。 57．少なくとも3つのBIRドメインを含む、請求項56記載のポリペプチド。 58．請求項54記載のポリペプチドをコードする組換えIAP遺伝子。 59．以下の段階を含む、細胞からIAP遺伝子またはその断片を単離する方法： (a)細胞DNAの試料を提供する段階、 (b)IAP遺伝子の保存領域と相同な配列を有する1対のオリゴヌクレオチドを提 供する段階、 (c)ポリメラーゼ連鎖反応を介したDNA増幅に適した条件下において、該1対の オリゴヌクレオチドと該細胞DNA試料とを混合する段階、および (d)増幅された該IAP遺伝子またはその断片を単離する段階。 60．増幅が逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を用いて実施される、請求項59記載の方 法。 61．逆転写ポリメラーゼ連鎖反応がRACEである、請求項60記載の方法。 62．以下の段階を含む、哺乳類細胞におけるIAP遺伝子を同定する方法： (a)哺乳類細胞DNAの調製物を提供する段階、 (b)IAP遺伝子の保存領域との相同性を有する、検出可能な標識がなされたDNA 配列を提供する段階、 (c)ヌクレオチド配列の同一性が50％またはそれ以上である遺伝子が検出でき るようなハイブリダイゼーション条件下において、該細胞DNAの調製物と該検出 可能な標識がなされたDNA配列とを接触させる段階、および (d)該検出可能な標識との会合によりIAP遺伝子を同定する段階。 63．DNA配列が請求項53記載の方法に従って産生される、請求項62記載の方法。 64．以下の段階を含む、組換えDNAライブラリーからIAP遺伝子を単離する方法： (a)組換えDNAライブラリーを提供する段階、 (b)ヌクレオチド配列の同一性が50％またはそれ以上である遺伝子を検出でき るようなハイブリダイゼーション条件下において、該組換えDNAライブラリーと 、請求項49記載の方法に従って産生された検出可能な標識がなされた遺伝子断片 とを接触させる段階、および (c)該検出可能な標識との会合によりIAP遺伝子のメンバーを単離する段階。 65．以下の段階を含む、組換えDNAライブラリーからIAP遺伝子を単離する方法： (a)組換えDNAライブラリーを提供する段階、 (b)ヌクレオチド配列の同一性が50％またはそれ以上である遺伝子を検出でき るようなハイブリダイゼーション条件下において、該組換えDNAライブラリーと 、請求項49記載のいずれかの検出可能な標識がなされたオリゴヌクレオチドとを 接触させる段階、および (c)該検出可能な標識との会合によりIAP遺伝子を単離する段階。 66．Glu-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Lys-Xaa3-C ys-Met-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa3-Xaa1-Phe-Xaa1-Pro-Cys-Gly-His-Xaa1- Xaa1-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Cys-Ala-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Cys-Pro-Xaa1-Cy s（ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2はGluまたはAspであり、Xaa3はVal またはIleである）のリングジンクフィンガー配列と、 Xaa1-Xaa1-Xaa1-Arg-Leu-Xaa1-Thr-Phe-Xaa1-Xaa1-Trp-Pro-Xaa2-Xaa1-Xaa1-X aa2-Xaa2-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Leu-Ala-Xaa1-Ala-Gly-Phe-Tyr-Tyr-Xaa1-Gly-X aal-Xaa1-Asp-Xaa1-Val-Xaa1-Cys-Phe-Xaa1-Cys-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa 1-Trp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Asp-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa1-His-Xaa1-Xaa1-Xaa1-Xaa 1-Pro-Xaa1-Cys-Xaa1-Phe-Val（ここでXaa1は任意のアミノ酸であり、Xaa2は任 意のアミノ酸であっても欠失していてもよい）の配列を有する少なくとも1つのB IRドメイン配列とを含む、アポトーシスを抑制する能力を有する組換え哺乳類ポ リペプチド。 67．(a)細胞DNAの試料を提供する段階、 (b)IAP性疾患抵抗性遺伝子の保存領域と相同な配列を有する1対のオリゴヌク レオチドを提供する段階、 (c)ポリメラーゼ連鎖反応を介したDNA増幅に適した条件下において、該1対の オリゴヌクレオチドと該細胞DNA試料とを混合する段階、および (d)増幅された該IAP遺伝子またはその断片を単離する段階 を含む方法に従って単離されたIAP遺伝子。 68．(a)細胞DNAの調製物を提供する段階、 (b)IAP遺伝子の保存領域との相同性を有する、検出可能な標識がなされたDNA 配列を提供する段階、 (c)ヌクレオチド配列の同一性が50％またはそれ以上である遺伝子が検出でき る ようなハイブリダイゼーション条件下において、該細胞DNA調製物と該検出可能 な標識がなされたDNA配列とを接触させる段階、および (d)該検出可能な標識との会合により該IAP遺伝子を同定する段階 を含む方法に従って単離されたIAP遺伝子。 69．以下の段階を含む、IAP遺伝子を同定する方法： (a)哺乳類細胞の試料を提供する段階、 (b)形質転換により、該細胞試料へ候補IAP遺伝子を導入する段階、 (c)該細胞試料内において該候補IAP遺伝子を発現させる段階、および (d)アポトーシスのレベルの変化によってIAP遺伝子が同定される状況下で、該 試料が変化したレベルのアポトーシスを起こすか否かを判定する段階。 70．細胞試料が、リンパ球、線維芽細胞、昆虫細胞、グリア細胞、心筋細胞、胚 幹細胞およびニューロンからなる群より選択される、請求項69記載の方法。 71．候補IAP遺伝子がcDNA発現ライブラリーから得られる、請求項69記載の方法 。 72．(a)細胞試料を提供する段階、 (b)形質転換により、該細胞試料へ候補IAP遺伝子を導入する段階、 (c)該細胞試料内において該候補IAP遺伝子を発現させる段階、および (d)アポトーシスのレベルの低下によってIAP遺伝子が同定される状況下で、該 細胞試料が低下したレベルのアポトーシス反応を示すか否かを判定する段階 を含む方法に従って単離されたIAP遺伝子。 73．IAPファミリーのポリペプチドと特異的に結合する精製抗体。 74．(a)IAPポリペプチドを発現している細胞を提供する段階と、 (b)該遺伝子の発現レベルの変化からアポトーシスを調節する化合物の存在が示 されるような、該細胞と候補化合物とを接触させ、IAP遺伝子の発現をモニター する段階とを含む、アポトーシスを調節する化合物を同定する方法。 75．IAP遺伝子が、xiap、hiap-1、hiap-2、m-xiap、m-hiap-1またはm-hiap-2で ある、請求項74記載の方法。 76．細胞がリンパ球であって、IAPが、hiap-1およびhiap-2からなる群より選択 され、調節が、hiap-1またはhiap-2の発現の増強である、請求項74記載の方法。 77．哺乳動物におけるアポトーシス性疾患の存在、またはアポトーシスが関与す る疾患を発症する可能性が高いか否かに関して哺乳動物を診断する方法であって 、該哺乳動物から核酸試料を単離する段階と該核酸がIAPの変異を含むか否かを 判定する段階とを含み、該変異の存在によって、該哺乳動物がアポトーシス性疾 患を有すること、またはアポトーシスが関与する疾患を発症する可能性が高いこ とが示される、方法。 78．アポトーシス性疾患の存在、またはアポトーシス性疾患を発症する可能性が 高いか否かに関して哺乳動物を診断する方法であって、該哺乳動物からの試料に おけるIAP遺伝子の発現を測定する段階を含み、罹患していない動物の試料との 比較による該発現の変化によって、該哺乳動物がアポトーシス性疾患を有するこ と、またはアポトーシス性疾患を発症する可能性が高いことが示される、方法。 79．IAP遺伝子が、xiap、hiap-1、hiap-2、m-xiap、m-hiap-1またはm-hiap-2で ある、請求項77または78記載の方法。 80．遺伝子の発現が試料におけるIAPポリペプチドの量を解析することによって 測定される、請求項77または78記載の方法。 81．IAPポリペプチドが免疫学的方法または該試料におけるIAP RNAの量を解析す ることによって測定される、請求項80記載の方法。 82．アポトーシス性疾患の存在またはアポトーシス性疾患を発症する可能性が高 いか否かに関して哺乳動物を診断するためのキットであって、IAPポリペプチド と特異的に結合する実質的に純粋な抗体を含む、キット。 83．抗体のIAPポリペプチドとの結合を検出するための手段をさらに含む、請求 項82記載のキット。 84．アポトーシス抑制量の請求項8記載のポリペプチドを該細胞へ投与する段階 を含む、請求項34記載の方法。 85．IAP依存的な抗アポトーシス経路の負の調節因子を該細胞へ投与する段階を 含む、細胞においてアポトーシスを誘導する方法。 86．負の調節因子が、1つのリングジンクフィンガーを含むが少なくとも1つのBI Rドメインを欠失したIAPポリペプチドである、請求項85記載の方法。 87．細胞が、請求項8記載のIAPポリペプチドをコードする遺伝子によってトラン スフェクションされる、請求項85記載の方法。 88．負の調節因子が、IAPポリペプチドと特異的に結合する精製抗体またはその 断片である、請求項85記載の方法。 89．抗体がIAPポリペプチドの約26kDaの切断産物と特異的に結合し、該切断産物 が少なくとも1つのBIRドメインを含むがリングジンクフィンガードメインを欠失 している、請求項88記載の方法。 90．負の調節因子がIAPアンチセンスmRNA分子である、請求項85記載の方法。 91．アポトーシスの調節に用いるためのIAP核酸。 92．アポトーシスの調節に用いるためのIAPポリペプチド。 93．アポトーシスを調節するための医薬品の製造を目的とするIAPポリペプチド の使用。 94．アポトーシスを調節するための医薬品の製造を目的とするIAP核酸の使用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002512602A (ja) * 1997-02-13 2002-04-23 ユニバーシティー オブ オタワ 増殖性疾患の診断および治療のためのｉａｐ類およびｎａｉｐの検出および調節
US7638620B2 (en) 2002-03-27 2009-12-29 Aegera Therapeutics, Inc. Antisense IAP nucleobase oligomers and uses thereof
US7776552B2 (en) 1995-08-04 2010-08-17 University Of Ottawa Mammalian IAP gene family, primers, probes and detection methods
US8012944B2 (en) 2003-10-30 2011-09-06 Pharmascience Inc. Method for treating cancer using IAP antisense oligomer and chemotherapeutic agent

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030073159A1 (en) * 1992-05-11 2003-04-17 Human Genome Sciences, Inc. Human inhibitor of apoptosis gene 1
US5958771A (en) * 1998-12-03 1999-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of cellular inhibitor of Apoptosis-2 expression
US6087173A (en) * 1999-09-09 2000-07-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of X-linked inhibitor of apoptosis expression
AUPN727595A0 (en) * 1995-12-22 1996-01-18 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The Therapeutic compositions
GB9601108D0 (en) * 1996-01-19 1996-03-20 Univ Ottawa Neuronal apoptosis inhibitor protein (NAIP)
US8043835B1 (en) 1996-03-26 2011-10-25 Oncomedx, Inc. Methods for detecting and monitoring cancer using extracellular RNA
ES2347854T5 (es) * 1996-03-26 2014-07-24 Michael S. Kopreski Método que permite el uso de RNA extracelular extraído de plasma o suero para detectar, monitorizar o evaluar un cáncer
US7785842B2 (en) * 1996-03-26 2010-08-31 Oncomedx, Inc. Comparative analysis of extracellular RNA species
CA2222453C (en) 1996-04-26 2009-06-30 Universite D'ottawa/ University Of Ottawa Therapeutic and drug screening methods for the treatment and prevention of neuronal disease
US6511828B1 (en) 1996-05-31 2003-01-28 Arch Development Corporation Human and drosophila inhibitors of apoptosis proteins (IAPs)
US5840535A (en) * 1997-06-02 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. DNA encoding a zinc ring protein
WO1999062943A2 (en) * 1998-06-02 1999-12-09 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Novel molecules of the aip-related protein family and uses thereof
US6171821B1 (en) * 1998-07-24 2001-01-09 Apoptogen, Inc. XIAP IRES and uses thereof
US6472172B1 (en) 1998-07-31 2002-10-29 Schering Aktiengesellschaft DNA encoding a novel human inhibitor-of-apoptosis protein
US20090233276A1 (en) * 1998-09-22 2009-09-17 Oncomedx, Inc. Method Enabling the Use of Extracellular Ribonucleic Acid (RNA) Extracted from Plasma or Serum to Detect, Monitor or Evaluate Cancer or Premalignant Conditions
CN1301769A (zh) * 1999-12-29 2001-07-04 复旦大学 一种新的多肽——人的1atexin蛋白46和编码这种多肽的多核苷酸
EP1164374A1 (en) * 2000-06-16 2001-12-19 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Method for identifying apoptosis-modified proteins
AU2001266070A1 (en) * 2000-06-16 2001-12-24 Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. Method for identifying apoptosis-modified proteins
US20020164576A1 (en) * 2000-09-22 2002-11-07 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of Nrf2
US20030044803A1 (en) * 2000-09-22 2003-03-06 Pedersen Finn Skou Methods for diagnosis and treatment of diseases associated with altered expression of JAK1
US6673917B1 (en) 2000-09-28 2004-01-06 University Of Ottawa Antisense IAP nucleic acids and uses thereof
US6901173B2 (en) * 2001-04-25 2005-05-31 Lockheed Martin Corporation Scene-based non-uniformity correction for detector arrays
US20070098728A1 (en) * 2001-09-24 2007-05-03 Pedersen Finn S Novel compositions and methods in cancer
US20100159464A1 (en) * 2001-11-05 2010-06-24 Oncomedx, Inc. Method for Detection of DNA Methyltransferase RNA in Plasma and Serum
US7820132B2 (en) * 2001-12-14 2010-10-26 Alliance For Sustainable Energy, Llc Hot wire production of single-wall and multi-wall carbon nanotubes
US20060057109A1 (en) * 2002-03-25 2006-03-16 Waxman David J Method of using anti-apoptotic factors in gene expression
US20050233411A9 (en) * 2003-02-07 2005-10-20 Chunying Du Compositions and methods for cleaving IAP
WO2005017109A2 (en) * 2003-06-30 2005-02-24 Massachusetts Institute Of Technology Nucleic acids and polypeptides required for cell survival in the absence of rb
US7342093B2 (en) * 2004-07-23 2008-03-11 University Of Massachusetts Compounds that inhibit Hsp90 protein-protein interactions with IAP proteins
EP1807157A2 (en) 2004-10-22 2007-07-18 Neurologix, Inc. Use of apoptosis inhibiting compounds in degenerative neurological disorders
PL1889065T3 (pl) 2005-05-18 2013-12-31 Novartis Ag Metody diagnostyki i leczenia chorób posiadających składnik autoimmunologiczny i/lub zapalny
SG10201407457UA (en) 2006-05-16 2014-12-30 Pharmascience Inc Iap bir domain binding compounds
MX340870B (es) 2010-02-12 2016-07-27 Pharmascience Inc Compuestos de unión del dominio de repetición de inhibidores de proteínas de apoptosis de baculovirus.
KR101215201B1 (ko) 2010-07-21 2012-12-26 단국대학교 산학협력단 Ｘｉａｐ 단백질을 포함하는 허혈성 질환을 치료 또는 예방하기 위한 조성물
US20140127438A1 (en) 2012-11-08 2014-05-08 Robert L. Sherman, Jr. Stabilized high-density polyethylene composition with improved resistance to deterioration and stabilizer system

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5665550A (en) * 1990-10-19 1997-09-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois-Urbana Genes and genetic elements associated with sensitivity to chemotherapeutic drugs
WO1994008003A1 (en) * 1991-06-14 1994-04-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDE INHIBITION OF THE ras GENE
US5594076A (en) * 1991-09-24 1997-01-14 The Pennsylvania Research Foundation Hydrodegradable polyesters
US6265157B1 (en) 1991-12-03 2001-07-24 Allegheny University Of The Health Sciences Compositions and methods for detecting altered COL1A1 gene sequences
US20030073159A1 (en) * 1992-05-11 2003-04-17 Human Genome Sciences, Inc. Human inhibitor of apoptosis gene 1
WO1996035703A1 (en) 1995-05-11 1996-11-14 Human Genome Sciences, Inc. Human inhibitor of apoptosis gene 1
WO1994006814A1 (en) * 1992-09-14 1994-03-31 The General Hospital Corporation Ikaros: a t cell pathway regulatory gene
US6087173A (en) 1999-09-09 2000-07-11 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of X-linked inhibitor of apoptosis expression
US5958772A (en) 1998-12-03 1999-09-28 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of cellular inhibitor of apoptosis-1 expression
US5958771A (en) 1998-12-03 1999-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of cellular inhibitor of Apoptosis-2 expression
US5718883A (en) * 1993-04-14 1998-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Transgenic animal model for autoimmune diseases
US5691179A (en) * 1993-08-26 1997-11-25 Washington University Cell death regulators
US5624803A (en) * 1993-10-14 1997-04-29 The Regents Of The University Of California In vivo oligonucleotide generator, and methods of testing the binding affinity of triplex forming oligonucleotides derived therefrom
US5801154A (en) * 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5510239A (en) * 1993-10-18 1996-04-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
EP0770129B1 (en) * 1994-01-18 2005-11-23 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
AU2290195A (en) * 1994-04-13 1995-11-10 La Jolla Cancer Research Foundation Interaction of proteins involved in a cell death pathway
HUT76099A (en) 1994-05-10 1997-06-30 Immulogic Pharma Corp Compositions and treatment for multiple sclerosis
JP3944654B2 (ja) 1994-10-18 2007-07-11 ザ ユニバーシティー オブ オタワ 神経細胞アポトーシスの抑制タンパクとその遺伝子配列、並びに脊髄性筋萎縮症の原因となる当該遺伝子の突然変異
BR9509438A (pt) 1994-10-25 1997-12-23 Immulogic Pharma Corp Composições e tratamento para a esclerose múltipla
AU4695296A (en) 1995-01-06 1996-07-24 Immulogic Pharmaceutical Corporation Compositions and methods for treating rheumatoid arthritis
US5770690A (en) * 1995-06-27 1998-06-23 Neurex Corporation Bax omega protein and methods
US5877021A (en) 1995-07-07 1999-03-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. B7-1 targeted ribozymes
US5919912A (en) * 1995-08-04 1999-07-06 University Of Ottawa Mammalian IAP antibodies and diagnostic kits
US6156535A (en) 1995-08-04 2000-12-05 University Of Ottawa Mammalian IAP gene family, primers, probes, and detection methods
US6187557B1 (en) 1995-08-08 2001-02-13 Tularik Inc. c-IAP1 and c-IAP2: inhibitors of apoptosis
AU6692996A (en) 1995-08-08 1997-03-05 Tularik Inc. Inhibitors of apoptosis
US5834216A (en) * 1995-09-06 1998-11-10 Arch Development Corporation Screening methods for the identification of inducers and inhibitors of programmed cell death (apoptosis)
AUPN727595A0 (en) * 1995-12-22 1996-01-18 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The Therapeutic compositions
US5605022A (en) * 1995-12-26 1997-02-25 Nci Building Systems, Inc. Vented closure
GB9601108D0 (en) 1996-01-19 1996-03-20 Univ Ottawa Neuronal apoptosis inhibitor protein (NAIP)
US6133437A (en) 1997-02-13 2000-10-17 Apoptogen, Inc. Modulation of IAPs for the treatment of proliferative diseases
US6194190B1 (en) * 1996-06-24 2001-02-27 Takara Shuzo Co., Ltd. Amino-terminal deblocking enzyme
WO1998022131A2 (en) 1996-11-15 1998-05-28 University Of Ottawa Modulators of ovarial apoptosis related to iap
US5994076A (en) * 1997-05-21 1999-11-30 Clontech Laboratories, Inc. Methods of assaying differential expression
US6228603B1 (en) 1997-05-22 2001-05-08 The Burnham Institute Screening assays for agents that alter inhibitor of apoptosis (IAP) protein regulation of caspase activity
CA2225187A1 (en) * 1997-07-14 1999-01-14 Universite D'ottawa/ University Of Ottawa Xaf genes and polypeptides: methods and reagents for modulating apoptosis
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
AU1080899A (en) 1997-10-14 1999-05-03 Nadine A. Tatton Methods for increasing schwann cell survival
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
US6171821B1 (en) 1998-07-24 2001-01-09 Apoptogen, Inc. XIAP IRES and uses thereof
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
EP1117391A2 (en) * 1998-10-09 2001-07-25 L. Sai Latha Shankar Methods for treating multiple sclerosis
US6187657B1 (en) * 1999-03-24 2001-02-13 Advanced Micro Devices, Inc. Dual material gate MOSFET technique
KR20000065690A (ko) 1999-04-08 2000-11-15 박종구 반응 특이성 및 안정성을 개선시킨 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, 안티센스 ｄｎａ 및 그 제조방법
US5998148A (en) * 1999-04-08 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of microtubule-associated protein 4 expression
US6395771B1 (en) 2000-05-31 2002-05-28 Dabur Research Foundation Paclitaxel derivatives for the treatment of cancer
US6673917B1 (en) * 2000-09-28 2004-01-06 University Of Ottawa Antisense IAP nucleic acids and uses thereof
US20020119168A1 (en) * 2001-02-20 2002-08-29 Rudnic Edward M. Therapeutic agent delivery
KR100397275B1 (ko) * 2001-03-08 2003-09-17 주식회사 웰진 단방향성 안티센스 ｃＤＮＡ 라이브러리 구축을 통한 신규대규모 유전자 검색 및 기능 분석 시스템
US20040005593A1 (en) 2002-03-06 2004-01-08 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Novel method for delivery and intracellular synthesis of siRNA molecules
WO2003080638A2 (en) 2002-03-27 2003-10-02 Aegera Therapeutics, Inc. Antisense iap nucleobase oligomers and uses thereof
EP1469070A1 (en) 2003-04-15 2004-10-20 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Livin-specific siRNAs for the treatment of therapy-resistant tumors
CN1918175A (zh) * 2003-09-29 2007-02-21 托皮根药品公司 治疗包括炎症状况的疾病的寡核苷酸组合物和方法
US8012944B2 (en) 2003-10-30 2011-09-06 Pharmascience Inc. Method for treating cancer using IAP antisense oligomer and chemotherapeutic agent
US6946917B2 (en) * 2003-11-25 2005-09-20 Texas Instruments Incorporated Generating an oscillating signal according to a control current

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7776552B2 (en) 1995-08-04 2010-08-17 University Of Ottawa Mammalian IAP gene family, primers, probes and detection methods
JP2002512602A (ja) * 1997-02-13 2002-04-23 ユニバーシティー オブ オタワ 増殖性疾患の診断および治療のためのｉａｐ類およびｎａｉｐの検出および調節
US7638620B2 (en) 2002-03-27 2009-12-29 Aegera Therapeutics, Inc. Antisense IAP nucleobase oligomers and uses thereof
US8012944B2 (en) 2003-10-30 2011-09-06 Pharmascience Inc. Method for treating cancer using IAP antisense oligomer and chemotherapeutic agent

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