JPH11511027A

JPH11511027A - Ｇｂ型肝炎ウィルス遺伝子型の検出

Info

Publication number: JPH11511027A
Application number: JP9510327A
Authority: JP
Inventors: マルホフ，アンソニー・エス; シモンズ，ジヨン・エヌ; バーケンメイヤー，ラリー; リアリー，トーマス・ピー; アーカー，ジエイムズ・シー; デサイ，スレシユ・エム; ムシヤワー，イサ・ケー; チヤルマース，ミシエル; ドースン，ジヨージ・ジエイ
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1995-08-14
Filing date: 1996-08-14
Publication date: 1999-09-28
Also published as: US5807670A; CA2228820A1; WO1997008531A2; WO1997008531A3; EP0845049A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＧＢ型肝炎ウィルスＣ．核酸に関するものであり、詳細には、ＧＢ型肝炎ウィルスＣの遺伝子型検出に使用するオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーに関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】ＧＢ型肝炎ウィルス遺伝子型の検出関連出願本願は、１９９５年８月１４日出願の米国仮出願６０／００２２６５号の恩恵を請求するものであり、該出願は１９９５年８月１４日出願の米国特許出願６０／００２２５５号に関係し、該出願は１９９５年６月７日出願の米国特許出願０８／４８０９９５号、１９９５年６月７日出願の米国特許出願０８／４７３４７５号および１９９５年４月６日出願の米国特許出願０８／４１７６２９号に関係し、それらの出願は１９９５年６月５日出願の米国特許出願０８／４２４５５０号の一部継続出願であり、該出願は１９９５年１月３０日出願の米国特許出願０８／３７７５５７号の一部継続出願であり、該出願は１９９４年１１月２３日出願の米国特許出願０８／３４４１８５号および１９９４年１１月２３日出願の米国特許出願０８／３４４１９０号の一部継続出願であり、これら出願はそれぞれ、１９９４年７月２９日出願の米国特許出願０８／２８３３１４号の一部継続出願であり、該出願は１９９４年５月１３日出願の米国特許出願０８／２４２６５４号の一部継続出願であり、該出願は１９９４年２月１４日出願の米国特許出願０８／１９６０３０号の一部継続出願であり、これら出願はいずれも、同一所有者によるものであり、各出願は引用によって本明細書に含まれるものである。発明の背景本発明は、ＧＢ型肝炎ウィルスに関するものであり、詳細には、ＧＢ型肝炎ウィルスの遺伝子型の検出に有用なオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブに関するものである。静脈投与薬使用者における急性の非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）肝炎の多発性発作、輸血後にＮＡＮＢＨを獲得した患者の明瞭な潜伏期間、チンパンジー交差免疫誘発実験の結果、感染チンパンジーの超微細構造的肝臓病理および推定病原体のクロロホルムに対する区別された耐性などの、いくつかの系統の疫学的・臨床検査的証拠から、複数の非経口伝染性のＮＡＮＢ型肝炎病原体の存在が示唆されている（J.L.Dienstag，Gastoenterology 85:439-462(1983); J.L.Dienstag，Gastoent erology 85:743-768(1983); F.B.Hollinger et al.，J.Infect.Dis. 142:400-40 7(1980); D.W.Bradley in F.Chisari，ed.，Advances in Hepatitis Research， Masson，New York，pp.268-280(1984)； D.W.Bradley et al.，J.Infect.Dis. 148:254-265(1983)）。現在、供血者検体におけるＣ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）抗体の検出によって、血液供給システムにおけるＮＡＮＢＨ感染血の７０〜８０％が排除されている。このように、ＨＣＶの検出によって、肝炎の伝染が完全に防止されているわけではない（H.Alter et al.，New Eng.I.Med. 321:1494-1500(1989)）。最近の刊行物では、別の肝炎病原体が輸血後肝炎（ＰＴＨ）およびＰＴＨに関連しない院外感染性の急性および／または慢性肝炎の原因であるか否かについての疑問も出されている。例えば、１９８８年〜１９９０年にフランスで行われた予報的臨床調査でモニタリングした患者１８１名中、調査担当者がＰＴＨであると認めた患者は計１８名であった。これら１８名の患者のうち１３名が、抗ＨＣＶ抗体、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）およびＨＣＶ核酸についての検査では陰性であった。著者らは、ＰＴＨの原因となる非Ａ非Ｂ非Ｃ病原体の重要性について考察している（V.Thiers et al.，J.Hepatology 18:34-39(1993)）。さらに、１９８５年〜１９８８年にドイツで行われた別の試験でモニタリングした患者１４７６名中、ＰＴＨの記録のある患者２２名は、ＨＢＶやＨＣＶによる感染とは関係がなかった（T.Peters et al.，J.Med.V irol. 39:139-145(1993)）。最近、臨床的に肝炎と診断された患者で検出された新たな科のフラビウィルスが報告されている。この新たな科のウィルスは、このウィルスに最初に感染した患者のイニシャルにちなんで「ＧＢ」ウィルスと命名された。これらのウィルスは、シモンズらによって報告されている(J.N.Simons et al.，Proc.Natl.Acad ． Sci．USA 92:3401-3405(1995); J.N.Simons et al.，Nature Medicine 1(6):564 -569(1995)）。現在、これらウィルスの臨床的・疫学的意義を明らかにするための研究が行われているところである。Ｃ型肝炎ウィルスで認められたように、遺伝子型には、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに疾患重度および地理的場所で多様性がある（例：G.Dawson et al.，″Recent Developments in the Molecular Biology of the Hepatitis Virus″in Current Hepatology，G.Gitnick，ed.，Mosby Publishers(1995、印刷中）参照）。そこで、ＨＧＢＶの遺伝子型の検出は、そのウィルスの臨床的・疫学的理解に役立ち得るものである。被験サンプルにおけるＨＧＢＶの検出は、ハイブリッド形成プローブとしてＤＮＡオリゴマーを利用するＤＮＡハイブリッド形成アッセイを使用することで、より容易に行うことができる。被験サンプル中に存在するＤＮＡ標的ヌクレオチドの量はごく微量である場合があることから、標的ＤＮＡは通常、増幅してから検出する。被験サンプルに存在し得る標的核酸配列を増幅・検出する方法は、当業界では公知である。そのような方法には、米国特許４６８３１９５号および４６８３２０２号(これらは引用によって本明細書に含まれる)に記載のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ＥＰ−Ａ−３２０３０８号に記載のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、欧州特許出願ＥＰ−Ａ−４３９１８２号および米国特許５４２７９３０号（これらは引用によって本明細書に含まれる）に記載のギャップＬＣＲ（ＧＬＣＲ）、国際特許出願ＷＯ９３／２０２２７号に記載の多重ＬＣＲ、ＮＡＳＢＡなどがある。これらの方法は、医学診断の分野ならびに遺伝学、分子生物学および生化学の分野において広く利用されている。ＨＧＢＶ感染が疑われる対象者の被験サンプルにおけるＨＧＢＶを検出することができるＨＧＢＶ由来のＤＮＡプローブおよびそのプローブを利用する試験キットを提供することが有益であると考えられる。そのようなプローブによって医学の分野では、急性および／または慢性のウィルス性肝炎をより正確に診断できるようになり、献血および臓器提供における非Ａ非Ｂ非Ｃ型肝炎を検出することで、より安全な血液および臓器を提供できるようになり、集団におけるＨＧＢＶの罹患率、ＨＧＢＶによって生じる疾患の疫学ならびに感染患者の予後についての理解を深めることができると考えられる。発明の概要本発明は、ＨＧＢＶ−Ｃ検出のための特有のプライマーを提供するものである。これらのプライマーは、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７および配列番号８７、ならびにこれらの相補配列である。本明細書に開示のプライマーは、ＨＧＢＶ−Ｃの存在を検出できるものであり、ＨＧＢＶ−ＡやＨＧＢＶ−Ｂとの反応性はない。本発明はさらに、被験サンプル中の標的ＨＧＢＶ−Ｃヌクレオチドの検出方法において、標的ＨＧＢＶヌクレオチドと１以上のオリゴヌクレオチドとを接触させる段階ならびに被験サンプル中の標的の存在を検出する段階を有してなる方法をも提供するものである。オリゴヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７および配列番号８７、ならびにこれらの相補配列から成る群から選択することができる。使用されるオリゴヌクレオチドはさらに、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６からなる群から選択することもできる。本発明はさらに、被験サンプル中のＧＢ−Ｃ型肝炎（ＨＧＢＶ −Ｃ）ウィルスの５’末端ｃＤＮＡの増幅方法であって、ランダムプライマーと被験サンプルを用いて逆転写を実施する段階、第１段階ＰＣＲにおけるセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーとして他のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することで得られるｃＤＮＡを増幅してＨＧＢＶ−Ｃの増幅ｃＤＮＡを得る段階、ならびに被験サンプル中のアンプリコン（増幅ｃＤＮＡ）の存在を検出する段階を有してなる方法をも提供するものである。センスプライマーとして使用される１以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号５１、配列番号５３および配列番号５６からなる群から選択することができる。アンチセンスプライマーとして使用される１以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７および配列番号８７からなる群から選択することができる。本発明はさらに、標的ＨＧＢＶ−Ｃを含むことが疑われる被験サンプル中の標的ＧＢ−Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＧＢＶ−Ｃ）を検出する方法であって、被験サンプルをセンスプライマーとしての１以上のＨＧＢＶ−Ｃオリゴヌクレオチドおよびアンチセンスプライマーとしての１以上のＨＧＢＶ−Ｃオリゴヌクレオチドとを接触させ、それを増幅して第１段階反応生成物を得る段階；次に、前記第１段階反応生成物を、先に使用した１以上のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチド（ただし、該第２のオリゴヌクレオチドは、使用した第１のオリゴヌクレオチドに対して３’の位置にあり、第１のオリゴヌクレオチドに対して逆のセンスのものである）と接触させる段階、ならびに次にＨＧＢＶ標的を検出する段階を有してなる方法をも提供するものである。第１段階のＰＣＲ反応は、センスプライマーとして配列番号５１、配列番号５６および配列番号５３からなる群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドを使用する段階ならびにアンチセンスプライマーとして配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７および配列番号８７からなる群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドを使用する段階を有してなることができる。次に、この第１段階ＰＣＲの生成物を、第２段階ＰＣＲ反応でさらに増幅することができ、第２段階ＰＣＲは、センスプライマーとして配列番号５６および配列番号５３からなる群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドを使用する段階ならびにアンチセンスプライマーとして配列番号５４、配列番号５５および配列番号５７からなる群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドを使用する段階を有してなる（ただし、第２のオリゴヌクレオチドは、使用した第１のオリゴヌクレオチドに対して３’の位置にあり、第１のオリゴヌクレオチドに対して逆のセンスのものである）。全ての方法における増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって行うことができる。これらの方法においては、被験サンプルを固相に付着させてから、上記で説明した方法の段階を行うことができる。さらに、これらの方法の検出段階は、測定可能な信号を発する検出可能・測定可能信号発生化合物（標識）を利用する段階を有することができる。さらに、標識を固相に付着させることができる。配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０を遺伝子型鑑別に使用して、本発明に従ってＧＡＰＬＣＲを行うこともできる。図面の簡単な説明図１Ａ〜図１Ｆは、ＨＧＢＶ−Ｃ分離株のヌクレオチド配置を示す図である。図２は、ＨＧＢＶ−Ｃの遺伝子型の系統樹を示す図である。発明の詳細な説明本発明は、総称して「ＧＢ型肝炎ウィルス」または「ＨＧＢＶ」と称される、非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎の原因となる病原体の新たに確認された遺伝子型の特性決定を行うものである。本発明は、ＨＧＢＶ遺伝子型を検出する方法、ＨＧＢＶの検出に有用なオリゴヌクレオチドならびにＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型を鑑別する上で有用なオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、ＨＧＢＶ遺伝子型の検出に使用できる試薬であって、約８以上のヌクレオチドのＨＧＢＶからのヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドプローブを含む試薬が好適な容器に入っているキットを提供するものである。本明細書で使用される「ＧＢ型肝炎ウィルス」または「ＨＧＢＶ」という用語は、ヒトにおいて非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎を起こすウィルス種、ならびにそれに由来する弱毒化株または欠陥を有する干渉粒子を総称するものである。それには、汚染した食品、飲料水などによって伝染する急性ウィルス性肝炎；ヒトからヒトへの接触（性交渉伝染、呼吸器経路および非経口的経路など）または静脈注射での薬物使用を介して伝染するＨＧＢＶによる肝炎などがあり得る。本明細書に記載の方法により、ＨＧＢＶ保菌者を確認することができる。個別には、ＨＧＢＶ分離株は具体的に、「ＨＧＢＶ−Ａ」、「ＨＧＢＶ−Ｂ」および「ＨＧＢＶ−Ｃ」と称される。本明細書に記載のように、ＨＧＢＶゲノムはＲＮＡを有する。ＨＧＢＶのヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列の分析から、このグループのウィルスは、Flaviridae科のものと類似のゲノム構成を有する。専らではないが主としてゲノム構成における類似点に基づいて、ウィルス分類学に関する国際委員会は、この科をフラビウィルス、ペスチウィルスおよびＣ型肝炎グループの３つの属から成るものとすることを推奨している。アミノ酸レベルでの類似性の研究により、ＧＢ型肝炎ウィルスのサブクローンが、低いものではあるが、Ｃ型肝炎ウィルスと若干配列が類似していることがわかっている。現在では、ＨＧＢＶ−ＣはＨＣＶの遺伝子型ではないことが明らかになっている（例：すでに引用によって本明細書に含まれている１９９５年４月６日出願の米国特許出願０８／４１７６２９号参照）。本明細書において「類似性」および／または「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間またはポリペプチド配列間の関連性の程度を説明するために使用される。アミノ酸配列の「類似性」および／または「同一性」を決定する方法は当業界で公知であり、例えばアミノ酸配列を直接測定して、それを本願で提供される配列と比較する方法；推定ＨＧＢＶのゲノム材料のヌクレオチド配列を決定し（通常はｃＤＮＡ中間体を介して）、そこにコードされているアミノ酸配列を決定して、相当する領域を比較する方法などがある。一般に、「同一性」という用語は、各ゲノムにおける適切な箇所での、ＨＧＢＶのヌクレオチド配列と別の株のヌクレオチド配列、あるいはＨＧＢＶのアミノ酸配列と別の株のアミノ酸配列の正確な一致を意味する。さらに、「類似性」という用語は、適切な部位における、ＨＧＢＶのアミノ酸配列と別の株のアミノ酸配列とが正確に一致し、それらのアミノ酸が同一であるか、または電荷もしくは疎水性などの類似の化学的および／または物理的性質を有することを意味している。ＧＡＰプログラムなどの市販のプログラム（Wisconsin Sequence Analy sis Package，Version 8 で、Genetics Computer Group，Madison，Wisconsin， 53711から入手可能）は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド配列間での同一性および類似性の両方を計算できる。２つの配列間の同一性および類似性を計算するための他のプログラムは当業界では公知である。さらに、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−ＢまたはＨＧＢＶ−Ｃの株を確認する上で、以下のパラメータを単独もしくは組み合わせて使用することができる。ＨＧＢＶ株は遺伝的に関連があると考えられていることから、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ −ＢまたはＨＧＢＶ−ＣとこれらＧＢ型肝炎ウィルスのいずれかの株との間のゲノムの全体的なヌクレオチド配列の同一性は約４５％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは８０％以上であることが予想される。さらに、ＨＧＢＶ株は遺伝的に関連があると考えられていることから、アミノ酸レベルでのＨＧＢＶ−ＡとＨＧＢＶ−Ａの株の間のゲノムの全体的なヌクレオチド配列の同一性は約３５％以上、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは８０％以上であることが予想される。さらに、複数の隣接する配列の組み合わせで得られる約１３以上のヌクレオチドの相当する隣接配列がある。さらに、ＨＧＢＶ株は遺伝的に関連があると考えられていることから、アミノ酸レベルでのＨＧＢＶ−ＢとＨＧＢＶ−Ｂの株の間のゲノムの全体的なヌクレオチド配列の同一性は約３５％以上、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは８０％以上であることが予想される。さらに、複数の隣接する配列の組み合わせで得られる約１３以上のヌクレオチドの相当する隣接配列がある。さらに、ＨＧＢＶ株は遺伝的に関連があると考えられていることから、アミノ酸レベルでのＨＧＢＶ−ＣとＨＧＢＶ−Ｃの株の間のゲノムの全体的なヌクレオチド配列の同一性は約３５％以上、好ましくは約４０％以上、より好ましくは約６０％以上、さらに好ましくは８０％以上であることが予想される。さらに、複数の隣接する配列の組み合わせで得られる約１３以上のヌクレオチドの相当する隣接配列がある。ＨＧＢＶｃＤＮＡなどの所定の配列またはＨＧＢＶゲノムに「誘導」ポリヌクレオチドとは、約６以上のヌクレオチド、好ましくは約８以上のヌクレオチド、より好ましくは約１０〜１２以上のヌクレオチド、さらに好ましくは約１５〜２０ヌクレオチドの配列からなるポリヌクレオチドであって、その所定のヌクレオチド配列の領域に相当する、すなわち類似しているかもしくは相補的であるものを指す。好ましくは、ポリヌクレオチドの起源となる領域の配列は、ＨＧＢＶゲノムに特有の配列と類似しているか、それに対して相補的である。配列が、ＨＧＢＶゲノムに特有の配列に対して相補的であるかまたはそれと類似しているか否かは、当業者には公知の方法によって決定することができる。例えば、データバンクにある配列との比較を一つの方法として用いて、所定の配列の独自性を決定することができる。配列の起源となる領域には、特異的エピトープをコードする領域、ならびに非翻訳領域および／または非転写領域などがあるが、これらに限定されるのものではない。誘導ポリペプチドは、必ずしもＨＧＢＶのヌクレオチド配列から物理的に誘導するものではないが、ポリヌクレオチドの起源となる領域における塩基配列から得られる情報に基づいた化学合成、複製または逆転写もしくは転写など（これらに限定されるものではない）の方法で得ることができる。さらに、所定の配列のものに相当する領域の組み合わせを、当業界で公知の方法で変えることで、所期の用途に一致したものとすることができる。本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかである、あらゆる長さのヌクレオチドの重合型のものを意味する。この用語は、分子の一次構造のみを指すものである。従ってこの用語には、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡが含まれる。それにはさらに、メチル化および／またはキャッピングによる修飾体、ならびにポリヌクレオチドの非修飾体も含まれる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、「オリゴ」および「プライマー」という用語は、本明細書では同義的に使用している。「ｃＤＮＡに相当する配列を有するＨＧＢＶ」とは、所定のＤＮＡにおける配列に類似しているか、またはそれに対して相補的であるポリペプチド配列をＨＧＢＶが有することを意味する。ｃＤＮＡに対する類似性または相補性の程度は、約５０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上である。相当する配列は、約７０ヌクレオチド以上、好ましくは約８０ヌクレオチド以上、さらに好ましくは約９０ヌクレオチド以上の長さのものである。ＨＧＢＶとｃＤＮＡとの間の対応は、当業界で公知の方法によって求めることができ、それには例えば、配列した材料と記載されているｃＤＮＡとの直接比較または一本鎖ヌクレアーゼによるハイブリッド形成および消化とそれに続く消化断片の大きさ測定などがある。「精製ウィルスポリヌクレオチド」とは、ほぼ遊離、すなわち、ウィルスポリヌクレオチドが自然に会合しているポリペプチドが約５０％未満、好ましくは約７０％未満、さらに好ましくは約９０％未満であるＨＧＢＶゲノムまたはそれの断片を指す。ウィルスポリヌクレオチドの精製方法は当業界で公知であり、それには例えば、カオトロピック試薬による粒子の破壊およびイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィーおよび密度による沈降によるポリヌクレオチドとポリペプチドの分離などがある。そこで、「精製ウィルスポリペプチド」とは、ほぼ遊離、すなわち、ウィルスポリペプチドが自然に会合している細胞成分を約５０％未満、好ましくは約７０％未満、さらに好ましくは約９０％未満含有するＨＧＢＶポリペプチドまたはそれの断片を意味する。精製方法は当業者には公知である。本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の分子鎖を指し、特定の長さの生成物を指すわけではない。そこで、ペプチド、オリゴペプチドおよび蛋白は、ポリペプチドの定義に含まれる。しかしながらこの用語は、例えば糖付加、アセチル化、リン酸化などのポリペプチドの発現後修飾を指すものではない。所定の核酸配列またはＨＧＢＶゲノムから誘導の「ポリペプチド」または「アミノ酸配列」とは、その配列または該配列の一部（その部分は、３〜５以上のアミノ酸、より好ましくは８〜１０以上のアミノ酸、さらに好ましくは１５〜２０のアミノ酸からなる）にコードされたポリペプチドのものと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または該配列にコードされたポリペプチドと免疫学的に同等であるポリペプチドを指す。本明細書に記載の「組換えポリペプチド」は、その起源または操作により、それが天然においてまたはライブラリの形で会合しているポリペプチドの全体または一部と会合していない、および／またはそれが天然において連結しているもの以外のポリヌクレオチドと連結しているゲノム、半合成または合成の起源の少なくとも一つのポリペプチドを意味する。組換えまたは誘導ポリペプチドは、ＨＧＢＶの所定の核酸配列から、またはＨＧＢＶゲノムから翻訳されるとは限らない。それはさらに、組換え発現系の化学合成または発現、あるいは突然変異ＨＧＢＶからの単離などの方法で得ることもできる。本明細書で使用の「合成ペプチド」という用語は、当業者には公知の方法によって化学的に合成できるあらゆる長さの重合体型アミノ酸を意味する。これらの合成ペプチドは、各種利用分野で有用である。単細胞体として培養される微生物またはより高等な真核細胞系を指す「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」および他のそのような用語は、組換えベクターその他の転移ＤＮＡの受容体として用いることができるか、用いられている細胞を指し、トランスフェクションされた元の細胞の第１代などがある。本明細書で使用されている「レプリコン」とは、細胞内の自立性ポリヌクレオチドレプリコン単位として挙動するプラスミド、染色体またはウィルスなどの遺伝子要素を意味する。すなわちそれは、それ自体の制御下で複製を行うことができる。「ベクター」とは、別のポリヌクレオチド部分が付加されて、例えば付加部分の複製および／または発現を行うレプリコンである。「制御配列」という用語は、連結しているコード配列の発現を行う上で必要であるポリヌクレオチド配列を指す。そのような制御配列の性質は、宿主微生物に応じて変わる。原核生物では、そのような制御配列には一般的に、プロモータ、リボソーム結合部位および終了信号などがあり、真核生物では、そのような制御配列には通常、プロモータ、終了信号および場合によってはエンハンサなどがある。そこで、「制御配列」とは少なくとも、発現を行う上でその存在が必要である全ての成分を含むものであり、さらには例えばリーダー配列などの存在が有利である別の成分を含み得るものである。「機能可能に連結」という用語は、記載の成分がそれの所期の形で機能できるような関係にある状況を指す。そこで、例えばコード配列に「機能可能に連結した」制御配列は、制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が行えるような形で連結している。「読み取り枠」または「ＯＲＦ」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の領域を指し、その領域は、コード配列の一部または全コード配列を代表することができる。「コード配列」とは、適切な調節配列の制御下にある場合、ｍＲＮＡに転写されるか、および／またはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’末端の翻訳開始コドンおよび３’ 末端の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列には、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチド配列などがあり得るが、それらに限定されるものではない。「免疫学的に確認可能な」という用語は、所定のポリペプチド、通常はＨＧＢＶ蛋白に存在し、それに対して独自であるエピトープおよびポリペプチドが存在することを指す。免疫学的同一性は、抗体結合および／または結合における競合によって決定することができる。その方法は当業者には公知であり、本明細書にも記載されている。エピトープの独自性は、エピトープをコードするポリヌクレオチド配列についての公知のデータバンク（例：GenBank）のコンピュータ検索、ならびに他の公知の蛋白とのアミノ酸配列比較によって決定することもできる。本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を意味する。恐らく、エピトープはそのエピトープに独自の空間配座に３つのアミノ酸を有することができる。一般にはエピトープは、そのようなアミノ酸５以上から成り、より通常には、それは８〜１０以上のアミノ酸から成る。空間配座を調べる方法は当業界では公知であり、例えばＸ線結晶解析および二次元核磁気共鳴などがある。本明細書で使用される「対象者」という用語は、脊椎動物、特には哺乳動物であり、家畜、競技用動物、霊長類およびヒトなどがあるが、これらに限定されるものではない。より詳細には、この用語は、タマリンおよびヒトを指す。ポリペプチドは、それが抗体と結合すれば、そのポリペプチドにある特異的エピトープの抗体認識により、抗体と「免疫学的に反応性」である。免疫学的反応性は、抗体結合によって、詳細には抗体結合の反応速度によって、および／または抗体が向かうエピトープを有する既知のポリペプチドを競合剤として用いた結合における競合によって決定することができる。ポリペプチドが抗体と免疫学的に反応性であるか否かを決定する方法は、当業界では公知である。本明細書で使用される「ＨＧＢＶエピトープを有する免疫原性ポリペプチド」という用語は、天然のＨＧＢＶポリペプチドまたはそれの断片、ならびに化学合成または組換え生物におけるポリペプチドの発現などの他の手段によって得られるポリペプチドを意味する。「形質転換」という用語は、挿入に使用される方法とは無関係に、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す。例えば、直接取り込み、形質導入またはｆ−交配などがある。外因性ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドなどの非組込型ベクターとして維持することができるか、あるいは別法として、宿主ゲノムに組み込むことができる。「処置」とは、予防および／または治療を指す。本明細書で使用される「プラス鎖」（または「＋」）という用語は、そのポリペプチドをコードする配列を有する核酸を指す。「マイナス鎖」（または「−」）という用語は、「プラス」鎖の配列に対して相補的な配列を有する核酸を指す。ウィルスの「陽性鎖ゲノム」とは、ＲＮＡかＤＮＡかを問わず、ゲノムが１本鎖であって、ウィルスポリペプチドをコードすることを意味している。「被験サンプル」という用語は、分析物の入手源である対象者の身体の構成要素を指す（対象とする抗体または対象とする抗原など）。これらの構成要素は、当業界では公知である。これらの被験サンプルは、本明細書に記載の本発明の方法によって試験することができる生体サンプルなどであり、白血球、血清、血漿、脳脊髄液、尿、リンパ液ならびに呼吸管、腸管および尿生殖路の各種外分泌液、涙、唾液、乳汁、白血球、骨髄腫などのヒトおよび動物の体液；培養上清などの生物液；固定化組織試料；固定化細胞検体などがある。「精製ＨＧＢＶ」は、ウィルスが通常会合している細胞構成成分から、ならびに感染組織に存在し得る他の種類のウィルスから単離されたＨＧＢＶの調整物である。ウィルス単離の方法は、当業者には明らかであり、例えば遠心およびアフィニティクロマトグラフィーなどがある。「ＰＮＡ」とは、本明細書で記載のアッセイなどの手順で利用して、標的の存在を決定することができる「ペプチド核酸類縁体」を指す。ＰＮＡは、ＲＮＡ標的またはＤＮＡを指向し得る中性の電荷を持つ部分である。例えば、本発明のＤＮＡプローブに代えてアッセイで使用されるＰＮＡプローブは、ＤＮＡプローブを使用する場合には達成できない利点を提供する。その利点には、製造性、大量標識、再現性、安定性、イオン強度変化に対する不感受性およびＤＮＡもしくはＲＮＡを利用する方法で起こる酵素分解に対する抵抗性などがある。これらのＰＮＡは、フルオレセイン、放射性ヌクレオチド、化学発光化合物などのような信号発生化合物で標識することができる。ＰＮＡまたはモルホリノ化合物などの他の核酸類縁体を、ＤＮＡまたはＲＮＡに代えてアッセイ法で使用することができる。ＤＮＡプローブを利用するアッセイが本明細書には記載されているが、アッセイ試薬に必要である場合および必要に応じて、適切な変化を加えて、ＲＮＡまたはＤＮＡに代えてＰＮＡもしくはモルホリノ化合物を用いることができる。「固相」（「固体支持体」）は当業者には公知であり、反応トレーのウエルの壁、試験管、ポリスチレンビーズ、磁性ビーズ、ニトロセルロース片、膜、ラテックス粒子などの微粒子、ヒツジ（または他の動物）赤血球、硬膜細胞などがある。「固相」は必須ではないが、当業者であれば選択可能である。そこで、ラテックス粒子、微粒子、磁性または非磁性ビーズ、膜、プラスチック管、微量定量ウェルの壁、ガラスもしくはシリコンのチップ、ヒツジ（または他の動物）赤血球および硬膜細胞がいずれも好適な例である。プローブを固相に固定化するための好適な方法には、イオン的、疎水的、共有結合的な相互作用などがある。本明細書で使用される「固相」とは、不溶性であるか、または後の反応によって不溶性とすることができる材料を指す。固相の選択は、捕捉試薬を引きつけて固定化する固有の能力を考慮して行うことができる。別法として、捕捉試薬を引きつけて固定化する能力を有する別の受容体を固相に保持させることができる。その別の受容体は、捕捉試薬自体または捕捉試薬に接合した帯電物質に関して反対の電荷を持つ帯電物質などがあり得る。さらに別の代替法として、受容体分子を、固相に固定化（付着）された、特異的結合反応によって捕捉試薬を固定化する能力を有する特異的結合要素とすることができる。受容体分子は、アッセイ実施前またはアッセイ実施時に、捕捉試薬を固相材料に間接的に結合させることができる。そこで、固相には例えば、プラスチック、誘導体化プラスチック、磁性または非磁性金属、試験管のガラスもしくはシリコン表面、微量定量ウェル、シート、ビーズ、微粒子、チップ、ヒツジ（または他の好適な動物）赤血球、硬膜細胞およびその他の当業者に公知の形状などがあり得る。固相がさらに、検出抗体が接近できるだけの有孔率および抗原を結合させるのに好適な表面親和性を有する好適な多孔性材料を有し得ることも想到され、本発明の範囲に含まれる。微孔性構造が通常は好ましいが、水和状態でゲル構造を持つ材料も使用することもできる。そのような有用な固体支持体には、寒天、アガロース、架橋アルギン酸、置換および架橋グアーガム、セルロースエステル（特に硝酸およびカルボン酸とのエステル）、混合セルロースエステルおよびセルロースエーテルなどの天然重合性炭水化物およびそれの合成的に変性、架橋または置換された誘導体；含窒素天然ポリマー；ビニルポリマーなどの好適な多孔性の構造を持って製造することができる合成ポリマー；硫酸バリウム、硫酸カルシウム、炭酸カルシウムなどのアルカリ土類金属およびマグネシウムの硫酸塩もしくは炭酸塩、アルカリ金属およびアルカリ土類金属、アルミニウムおよびマグネシウムの珪酸塩などの多孔性無機材料；クレー、アルミナ、タルク、カオリン、ゼオライト、シリカゲルまたはガラス（これらの材料は、上記のポリマー材料とともにフィルターとして使用することができる）などのアルミニウムもしくはシリコンの酸化物もしくは水和物；ならびに、すでに存在する天然ポリマー上で合成ポリマーの重合を開始することで得られるグラフト共重合体のような上記の種類のものの混合物もしくは共重合体などがある。これらの材料はいずれも、フィルム、シートまたはプレートなどの好適な形状で使用することができるか、あるいは紙、ガラス、プラスチックフィルムまたは織物などの適切な不活性担体にコーティングまたは結合もしくは積層させることができる。ニトロセルロースの多孔性構造は、非常に多様な試薬について優れた吸収性および吸着性を有する。ナイロン（登録商標）も同様の特性を有し、やはり好適である。上記のそのような多孔性固体支持体は好ましくは、厚さ約０．０１〜０．５ｍｍ、好ましくは約０．１ｍｍのシートの形状とすることが考えられる。孔径は広い範囲で変動し得るものであり、好ましくは０．０２５〜１５μｍ、特には０．１５〜１５μｍである。そのような支持体の表面は、支持体に対する抗原もしくは抗体の共有結合的結合を起こす化学的方法によって活性化することができる。しかしながら、抗原または抗体の不可逆的結合は通常、ほとんど解明されていない疎水的力による多孔性材料への吸着によって得られる。好適な固体支持体は、米国特許出願２２７２７２号にも記載されている。「指示薬」は、ＨＧＢＶについての特異的結合要素に接合（付着）した外部手段によって検出可能な測定可能信号を発生する能力を有し、その信号を発生する「信号発生化合物」（「標識」とも称される）を有するものである。本明細書で使用される「特異的結合要素」とは、特異的結合対の一方の要素である。すなわち、化学的もしくは物理的手段によって一方の分子が第２の分子に特異的に結合する２個の異なる分子である。ＨＧＢＶに対する特異的結合対の抗体要素である以外に指示薬は、ビオチンもしくは抗ビオチン、アビジンもしくはビオチン、炭水化物もしくはレクチン、相補的なヌクレオチド配列、エフェクタ分子もしくは受容体分子、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤もしくは酵素のようないずれかのハプテン−抗ハプテン系などの特異的結合対の一方の要素であることもできる。さらに、特異的結合対には、例えば分析物類縁体などの元の特異的結合要素の類縁体である要素などがあり得る。免疫反応性特異的結合要素は、サンドイッチアッセイでの場合のようなＨＧＢＶ、競争アッセイでの場合のような捕捉試薬、あるいは間接アッセイでの場合のような補助的特異的結合要素のいずれかに対して結合することができる組換えＤＮＡ分子によって形成されるものなどの、抗体もしくはそれの断片、抗原またはそれの断片、または抗体／抗原複合体があり得る。考えられる各種「信号発生化合物」（標識）には、色素原、酵素などの触媒、フルオレセインおよびローダミンなどの発光化合物、ジオキセタン，アクリジニウム、フェナントリジニウムおよびルミノールなどの化学発光化合物；放射性元素および直接視覚標識などがある。酵素の例としては、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼなどがある。特定の標識の選択は必須ではないが、標識はそれ自体でまたは１以上の別の物質と組み合わせて信号を発生することができる。標識は、例えば放射性同位元素、蛍光団、化学的発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光性微粒子などによって直接検出可能であるか、あるいは例えば特異的結合要素によって標識を間接的に検出することができる。直接標識には、その標識を検出できるようにするために、基質、誘発試薬、光など（これらに限定されるものではない）の追加成分が必要な場合があることは明らかである。間接標識を検出に使用する場合は、接合体と組み合わせて使用するのが普通である。「接合体」は代表的には、直接検出可能標識に付着もしくは結合した特異的結合要素である。接合体を合成するための結合化学は当業界では公知であり、例えば特異的結合要素の特異的結合性や標識の検出可能な性質を破壊しない化学的手段および／または物理的手段などがあり得る。本明細書で使用される「ハプテン」という用語は、抗体に結合することができるが、キャリア蛋白に結合していない限り抗体形成を誘導することはできない部分抗原または非蛋白結合要素を指す。ハプテンの例としては、ビオチン、アビジン、アダマンチンおよびカルバゾールなどがある。本明細書で使用される「分析物」とは、被験サンプル中に存在し得る検出対照の物質である。分析物は、天然の特異的結合要素が存在する物質（例：抗体）または特異的結合要素を得ることができる物質であることができる。そこで、分析物は、アッセイにおいて１以上の特異的結合要素に結合することができる物質である。「分析物」にはさらに、標的ヌクレオチド配列、ハプテン、抗体およびそれらの組み合わせなどの抗原性物質などもある。特異的結合対の要素としての内因子蛋白を使用したビタミンＢ１２の測定、葉酸結合蛋白の使用による葉酸の測定、または特異的結合対の要素としてのレクチンの使用による炭水化物の測定などの天然の特異的結合相手（対）によって、特異的結合対の要素として分析物を測定することができる。分析物には、蛋白、ペプチド、アミノ酸、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＰＮＡのヌクレオチド標的などがあり得る。ＥＰ公開０３２６１００号に相当する同時係属の米国特許出願１５０２７８号および米国特許出願３７５０２９号（ＥＰ公開番号０４０６４７３号）に記載の負に帯電したポリマーとの固定化可能な反応複合体を固定化するイオン捕捉法を用いる実施態様を、本発明に従って使用して、迅速な溶液相免疫化学反応を行うことができる。固定化可能な免疫複合体は、負に帯電した多価アニオン／免疫複合体と予め処理した正に帯電した多孔性基材との間のイオン性相互作用によって反応混合物の残りの部分から分離され、ＥＰＯ公開番号０２７３１１５号に相当する同時係属の米国特許出願９２１９７９号に記載のような化学発光信号測定で記載されているものなどの既報の各種信号発生系を用いて検出することができる。さらに、本発明の方法を、固相が微粒子（磁性または非磁性）を有してなる自動および半自動系などの微粒子技術を利用する系で使用することができる。そのような系としては、それぞれ公開ＥＰＯ出願ＥＰ０４２５６３３号およびＥＰ０４２４６３４号に相当する係属中の米国特許出願４２５６５１号および４２５６４３号に記載のものなどがある。分析物検出においては走査型プローブ顕微鏡測定（ＳＰＭ）も利用可能である。走査型プローブ顕微鏡測定、特に原子力顕微鏡測定では、捕捉相を固相に付着させ、走査型プローブ顕微鏡を利用して、固相の表面に存在し得る抗原／抗体複合体を検出する。走査トンネル型顕微鏡測定を用いることで、多くの免疫アッセイ系で抗原／抗体複合体の検出に通常は使用しなければならない標識の必要性がなくなる。そのような系は、係属中の米国特許出願６６２１４７号に記載されている。ＨＧＢＶ類のウィルスが、全てのＨＧＢＶウィルスに共通の合成、組換えまたは天然のプローブを使用することでアッセイで検出できることは、想到されるものであり、本発明の範囲に含まれるものである。さらに、ＨＧＢＶ−Ａ、ＨＧＢＶ−Ｂ、ＨＧＢＶ−Ｃまたはさらに他のＨＧＢＶウィルスからの各種エピトープを確認する各種の合成、組換えまたは天然のプローブをアッセイ形式で使用可能であり、それも本発明の範囲に含まれる。後者の場合、これらを一つの固相にコーティングすることができるか、あるいは各別個のプローブを、微粒子などの別個の固相にコーティングし、次にそれらを組み合わせて、プローブの混合物を得て、それを後にアッセイで使用することができる。アッセイ形式の各種変法は、当業者には公知であり、以下にそれについて考察する。本発明の試薬および方法は、ＨＧＢＶ感染対象者、すなわちタマリンまたはヒトの血漿、血清または肝臓ホモジネートに存在する非常に関連性の深い種類のヌクレオチド配列を提供することで可能となる。それは未感染対象者からのヒトおよびタマリンのゲノムＤＮＡに対してハイブリッド形成せず；この種類の配列のヌクレオチドは、ＨＧＢＶ感染対象者の肝臓（または肝臓ホモジネート）、血漿または血清のみに存在し；しかも、その配列は遺伝子バンク（GenBank；登録商標）にはないことから、この種類のヌクレオチド配列はヒトやタマリン起源のものではない。さらに、その種類の配列は、ＨＡＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＤＶおよびＨＥＶゲノム内にある配列と核酸レベルでの同一性をほとんど示さず、翻訳産生物としての同一性は低レベルであって、有意性はないと考えられる。ＨＧＢＶ感染ヒトからの感染性の血清、血漿または肝臓ホモジネートにはこれらのポリヌクレオチド配列があるが、未感染のヒトからの血清、血漿または肝臓ホモジネートにはこれらの配列はない。これらポリヌクレオチド配列の一部に感染した肝臓についてのノーザンブロッティング分析から、それらがウィルスゲノムと同様の大きさの大きいＲＮＡ転写物からの誘導のものであることがわかる。ＨＧＢＶ感染ヒトからの血清、血漿または肝臓ホモジネートはこのポリペプチドに結合する抗体を有するが、未感染ヒトからの血清、血漿または肝臓ホモジネートはこのポリペプチドに対する抗体を持たない。これらの抗体は、急性の非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎感染後の対象者において誘発される。これらの基準から、その配列はウィルス配列であり、該ウィルスは非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎を起こすか、その肝炎に関連しているものであると考えられる。この種類の核酸配列を利用できることで、ＨＧＢＶ感染による非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎の診断、ならびに供血者、提供血液、血液製品および対象者の感染についてのスクリーニングに有用なＤＮＡプローブおよびポリペプチドの構築が可能となる。例えばその配列から、例えばウィルス潜伏が疑われる被験者の血清におけるウィルスゲノムの有無の検出のためのハイブリッド形成プローブもしくはＰＣＲプライマーとして、あるいはウィルスの有無についての提供血液のスクリーニングに有用な、約８〜１０ヌクレオチドまたはそれより大きいＤＮＡオリゴマーを合成することができる。この種類の核酸配列によってさらに、ＨＧＢＶによる感染時に生じる抗体の有無を診断する試薬として有用なＨＧＢＶ特異的ポリペプチドの設計および生産を行うこともできる。それらの核酸配列からの誘導の精製ポリペプチドに対する抗体を使用して、感染対象者および血液におけるウィルス抗原を検出することもできる。これらの核酸配列によって、ＨＧＢＶに対するワクチンとして使用できる、さらには抗体を生産して次にそれを利用して疾病予防および／またはＨＧＢＶ感染対象者の治療に使用できるポリペプチドの設計および生産を行うこともできる。単離ＨＧＢＶ核酸配列の一定の部分を基礎として用いて、切り取りまたは合成によって、ＨＧＢＶゲノムとハイブリッド形成し、ウィルス病原体の確認、ウィルスゲノムのさらなる特性決定および罹患対象者におけるウィルスの検出に有用な約８以上のヌクレオチドのオリゴマーを得ることができる。ＨＧＢＶポリヌクレオチドに対する天然または誘導プローブは、ハイブリッド形成によって固有のウィルス配列を検出することができる長さである。６〜８ヌクレオチドは作業可能な配列であるが、１０〜１２ヌクレオチドの配列が好ましく、約２０ヌクレオチドのものが最も好ましい。これらの配列は好ましくは、異質性を持たない領域から誘導できるものである。これらのプローブは、自動オリゴヌクレオチド合成法などの通常の標準的方法を用いて得ることができる。ＨＧＢＶゲノムの固有の部分の相補配列は満足できるものである。プローブとして使用するには完全な相補配列が望ましい。ただし、断片が長くなるほど、それは不必要なものとなると考えられる。診断試薬として使用する場合、血液または血清などの分析対象の被験サンプルを処理して、それに含まれる核酸を抽出するようにすることができる。サンプルから得られる核酸に対しては、ゲル電気泳動その他の分子量分離法を行うことができるか、あるいは核酸サンプルについて分子量分離を行わずに、ドットブロッティングを行うことができる。次に、プローブを標識する。好適な標識およびプローブに標識を付着させる方法は当業界では公知であり、ニック翻訳もしくはキナーゼ処理、ビオチン、蛍光プローブおよび化学発光プローブによって組み込んだ放射性標識などがあるが、これらに限定されるものではない。これらの標識の多くの例が、本明細書に開示されている。次に、サンプルから抽出した核酸を、好適な過酷さを有するハイブリッド形成条件下に標識ラベルで処理する。プローブは、ＨＧＢＶゲノムに対して完全に相補的なものとすることができる。従って、擬陽性を防止するには、過酷さ（stringency）の高い条件が望ましいのが普通である。しかしながら、過酷さの高い条件は、異質性を持たないＨＧＢＶゲノムの領域に対してプローブが相補的である場合にのみ使用すべきである。ハイブリッド形成の過酷さは、温度、イオン強度、時間の長さおよびホルムアミドの濃度などの洗浄手順時の多くの要素によって決定されるものである（例：J. Sambrookの報告（上述）参照）。ハイブリッド形成は、多くの各種方法によって行うことができる。増幅は、例えばリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、Ｑ−βレプリカーゼ、ＮＡＳＢＡなどによって行うことができる。ＨＧＢＶゲノム配列は、例えば配列約１０²〜１０³個／ｍＬという比較的低レベルで感染対象者の血清に存在し得るものと考えられる。このレベルでは、ＬＣＲまたはＰＣＲなどの増幅法をハイブリッド形成アッセイで用いる必要がある場合がある。そのような方法は、当業界では公知である。例えば、「バイオブリッジ（Bio-Bridge）」系で末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼを用いて、非修飾３’−ポリ−ｄＴ尾部を核酸プローブ（Enzo Biochem Corp.）に付加する。このポリｄｔ尾部プローブを標的ヌクレオチド配列にハイブリッド形成し、次にビオチン修飾ポリＡにハイブリッド形成する。さらに、ＥＰ１２４２２１には、分析物を、酵素標識オリゴヌクレオチドに対して相補的な１本鎖ＤＮＡプローブに対してアニーリングし、得られた有尾部二体鎖を酵素標識オリゴヌクレオチドに対してハイブリッド形成するＤＮＡハイブリッド形成が記載されている。ＥＰ２０４５１０には、分析物ＤＮＡを、ポリ−ｄＴ−尾部などの尾部を有し、ポリＡ配列などのプローブの尾部にハイブリッド形成する配列を有する増幅因子配列を持ち、複数の標識鎖に結合することができるプローブと接触させるＤＮＡハイブリッド形成アッセイが記載されている。その方法では最初に、血清中の標的ＨＧＢＶ配列を配列約１０⁶個／ｍＬまで増幅することができる。これは、サイキらの報告(Saiki et al.,Nature 324:163(1986))に記載の方法に従って行うことができる。次に、当業界で公知の方法などのハイブリッド形成アッセイを用いて、増幅配列を検出することができる。プローブは、標識可能なプローブ核酸配列を含む診断キットに入れることができる。別法として、プローブを未標識として、標識用の成分をキットに入れることも考えられる。キットはさらに、例えばアッセイを行う上での基準および説明などの特定のハイブリッド形成プロトコールにおいて必要もしくは望ましい他の好適に入れた試薬および材料を加えることができる。本発明で利用することができる他の公知の増幅方法には、いわゆる「ＮＡＳＢＡ」または「３ＳＲ」法（PNAS USA 87:1874-1878(1990)に記載され、Nature: 3 50 (No.6313): 91-92(1991)で考察されている）およびＱ−βレプリカーゼなどがあるが、これらに限定されるものではない。蛍光in situハイブリッド形成（「ＦＩＳＨ」）は、本明細書に記載の試薬を利用して行うことができる。in situハイブリッド形成では、核酸ハイブリッド形成プロセスで形態的に未変化の組織、細胞または染色体を用いて、特定部分の遺伝子情報の存在と個々の細胞内でのそれの具体的位置を示す。それには細胞の均質化および標的配列の抽出は必要ないことから、細胞群における配列の正確な位置決定および分布が提供される。in situハイブリッド形成によって、それを含む細胞で濃縮されている対象配列を確認することができる。それによってさらに、対象配列を有する不均質細胞群で、細胞の種類および部分を確認することができる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、同じアッセイ試薬を用いて検出することができる。ＰＮＡまたはモルホリノ化合物をＦＩＳＨ法で利用して、増幅を行う必要なく標的を検出することができる。信号の増加が望ましい場合、複数の蛍光団を用いて信号を増加させることで、方法の感度を上げることができる。各種ＦＩＳＨ法が公知であり、それには、複数のオリゴヌクレオチドを用いる１段階法または従来の多段階法などがある。これらの種類の方法を、流動細胞計測法および画像解析などの各種手段によって自動化でき、それは本発明の範囲内である。本明細書に記載のアッセイでは、クローンを有するＨＧＢＶ核酸配列、またはそれらのクローンにおけるＨＧＢＶ核酸配列から誘導される複合核酸配列、あるいはそれらのクローンにおける核酸配列の起源であるＨＧＢＶから誘導される１個のウィルス抗原を利用することができる。あるいは、そのアッセイで、これら入手源から誘導されるウィルス抗原を組み合わせて使用することができる。そのアッセイではさらに、例えば、同じウィルス抗原に対する１個のモノクローナル抗体または各種ウィルス抗原に対する複数のポリクローナル抗体を使用することもできる。アッセイには、競合アッセイ、直接反応アッセイ、またはサンドイッチ型アッセイに基づくものなどがあり得るが、これらに限定されるものではない。アッセイでは、固相を用いることができるか、あるいは固相を使用しない免疫沈殿その他の方法を使用することができる。信号発生化合物として標識を利用するアッセイの例とその標識については、本明細書に記載されている。信号はさらに、係属中の米国特許出願６０８８４９号、同０７０６４７号、同４１８９８１号および同６８７７８５号に記載のような、ビオチンおよびアビジン、酵素標識またはビオチン抗ビオチン系によって増幅することもできる。ＨＧＢＶ核酸配列を用いて、ＨＧＢＶゲノムの配列についてのさらなる情報を得ることができ、ＨＧＢＶ病原体の確認・単離を行うことができる。そこで、この知見が、ＨＧＢＶゲノムの性質、ウィルス粒子の構造およびそれを構成している抗原の性質などのＨＧＢＶの特性決定に役立つことが想到される。次に、この情報により、ＨＧＢＶによって生じる非Ａ非Ｂ非Ｃ非Ｄ非Ｅ型肝炎の診断および／または治療に有用と考えられる、別のポリヌクレオチドプローブ、ＨＧＢＶゲノム由来のポリペプチド、ならびにＨＧＢＶエピトープに対する抗体を得ることができる。合成オリゴヌクレオチドは、ワーナー(Warner，DNA 3:401(1984))に記載の方法などの自動オリゴヌクレオチド合成装置を用いて得ることができる。所望に応じて、標準的な反応条件を用いて、³²Ｐ−ＡＴＰの存在下に、ポリヌクレオチドキナーゼで処理することで、合成鎖を³²Ｐで標識することができる。ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリから単離したものなどのＤＮＡ配列を、ゾラー（Zoller，Nucleic Acids Res. 10:6487(1982)）に従った部位指向性の突然変異誘発などの公知の方法によって修飾することができる。すなわち、修飾するＤＮＡを一本鎖配列としてファージに入れ、修飾すべきＤＮＡ部分と相補的で、それ自体の配列に所望の修飾部分を有する合成オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＤＮＡポリメラーゼによって二本鎖ＤＮＡに変換する。ファージの各鎖の複製物を含む形質転換細菌の培養物を寒天で平板培養して、溶菌斑を得る。理論的には、新たな溶菌斑の５０％が突然変異配列を有するファージを有し、残りの５０％が元の配列を有する。溶菌斑の複製物を、正しい鎖とのハイブリッド形成には好適であるが、未修飾配列とのハイブリッド形成には適さない温度および条件で、標識合成プローブにハイブリッド形成させる。ハイブリッド形成によって確認した配列を回収し、クローニングする。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）は、核酸またはその混合物に含まれる所望の核酸配列（標的）を増幅する方法である。ＰＣＲでは、１対のプライマーを過剰に用いて、標的核酸の相補鎖の外側末端でハイブリッド形成する。標的核酸を鋳型として用いて、ポリメラーゼによって各プライマーを延長する。得られた延長生成物自体が標的配列となり、最初の標的配列からの解離を受ける。次に、新たなプライマーをハイブリッド形成し、ポリメラーゼによる延長を行い、そのサイクルを繰り返して、標的配列分子の数を幾何的に上昇させる。ＰＣＲは、米国特許４６８３１９５号および４６８３２０２号に開示されている。ＬＣＲは、標的増幅の別機構である。ＬＣＲでは、２つのセンス（第１および第２）プローブおよび２つのアンチセンス（第３および第４）プローブを、標的に対して過剰に使用する。第１プローブが標的鎖の第１部分にハイブリッド形成し、第２プローブが標的鎖の第２部分にハイブリッド形成し、その第１および第２部分は、それら一次プローブが融合生成物に連結できるような配置になっている。さらに、第３（二次）プローブを第１プローブの一部にハイブリッド形成させることができ、第４（二次）プローブを同様の連結可能な形で第２プローブの一部にハイブリッド形成させることができる。標的が最初に２本鎖である場合、二次プローブは、第１の場合で標的相補配列にもハイブリッド形成する。センスおよびアンチセンスのプローブの融合鎖を標的配列から分離したら、連結して相補的な二次融合産生物を形成することができる第３および第４プローブとそれをハイブリッド形成させる。融合産生物は、標的またはそれの相補配列と機能的に等価である。ハイブリッド形成および連結のサイクルを繰り返すことで、標的配列の増幅が行われる。この方法は、引用によって本明細書に含まれるＥＰ−Ａ−３２０３０８に記載されている。ＬＣＲ法の他の態様が、引用によって本明細書に含まれるＥＰ−Ａ−４３９１８２に開示されている。ＨＧＢＶ−Ｃの検出に有用なオリゴヌクレオチドが提供される。そのオリゴヌクレオチドは、ＨＧＢＶ−Ｃの単離株を検出するが、ＨＧＢＶ−ＡやＨＧＢＶ−Ｂの単離株は検出しない。これらのプライマーは、配列番号５１、配列番号５３〜５７および配列番号８７と称する。配列番号２７〜配列番号３５と称する他のプライマーは、ＨＧＢＶ−Ｃの遺伝子型を分類するのに有用である。ＨＧＢＶ−Ｃ単離株のヌクレオチド配列研究の結果、これらの単離株がゲノムの５’末端付近にあるヌクレオチド配列に基づいて４以上の遺伝子型に分けられることが認められている。プライマーは、ＰＣＲなどの本明細書で前述した増幅法で有用である。遺伝子型間での識別を行うことができる他のプライマーはＰＣＲで使用することができるが、他のプライマーはＧＡＰＬＣＲで有用である。それらについては、以下の実施例に記載してある。そこで、これらのプライマーは、ＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型を検出する方法を提供するものである。以下に詳細に説明するように、ランダムヘキサマープライマーで逆転写することで５’末端ｃＤＮＡを得て、ＰＣＲ反応におけるセンスおよびアンチセンスプリマーとして他のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、そのｃＤＮＡを増幅した。このＰＣＲ反応の後に、第２段階ＰＣＲでセンスおよびアンチセンスプリマーとして他のプライマーを用いる増幅を行う場合もあった。以下に示すように本発明者らは、３９名の対象者から得た４６のＨＧＢＶ−Ｃ単離株を４つの遺伝子型に分類した。それらの遺伝子型は、最大で１７．４％という配列相違を示した。本明細書に記載のＨＧＢＶ−Ｃオリゴヌクレオチドは、被験サンプル中のＨＧＢＶ−Ｃ核酸の検出に有用である。ＨＧＢＶ−Ｃ単離株の遺伝子型決定は、予後研究ならびにヒトにおけるＨＧＢＶ−Ｃによって生じる疾患の予防および治療にも役立つ。以下、本発明を実施例によって説明するが、これら実施例は本発明の精神および範囲を説明するためのものであって、それらを限定するものではない。実施例実施例１：ＨＧＢＶ−ＣＲＮＡの検出米国特許出願０８／４７３４７５号（引用によってすでに本明細書に含まれているもの）に本発明者らが既報のように、ＨＧＢＶ−Ｃ特異的ＥＬＩＳＡの登場によって、静脈投与薬使用者、西アフリカの住民、志願供血者および非Ａ〜Ｅ型肝炎患者またはその危険性のある患者などの、いくつかのカテゴリのヒト群のそれぞれにおける免疫陽性血清の確認が可能となっている。これらの血清陽性対象者からの血清を、以下に簡単に説明するＲＴ−ＰＣＲアッセイによってＨＧＢＶ−Ｃウィルス血症について調べ、いくつかの血清検体がＨＧＢＶ−ＣウィルスＲＮＡについて陽性であることが認められた。増幅する鋳型との塩基対不一致を有する可能性のあるオリゴヌクレオチドプライマーで特異的産生物を増幅するための加熱サイクルプロトコールを用いる１回の増幅で、変性ＮＳ３オリゴヌクレオチドプライマー（配列番号８８および８９）を用いて、ＲＴ−ＰＣＲを実施した（Roux，Bio/Techniques 16:812-814(1994)）。具体的には、反応を４３回の加熱サイクルで行い（９４℃で２０秒間、５５℃からサイクルごとに０．３℃ずつ低下させながら３０秒間、７２℃で１分間）、次に１０サイクル行い（９４℃で２０秒間、４０℃で３０秒間、７２℃で１分間）、最後に７２℃で１０分間の延長を行った。アガロースゲル電気泳動によってＰＣＲ産生物を分離し、臭化エチジウムによる核酸の直接染色によってＵＶ照射で肉眼観察できるようにし、ハイボンド(Hybond)−Ｎ＋ナイロンフィルター(Amersham Life Sciences ，Arlington Heights，ILから市販）へのサザーン転移後にＧＢ −Ｃ（配列番号２６、位置４２４５〜４４３２）についての放射能標識プローブにハイブリッド形成した。上記で挙げた各群からの別の血清陽性対象者のＲＴ− ＰＣＲによる検査から、抗体の存在とウィルスＲＮＡの検出との間に相関が示された。その際、これら対象者中２６名からのＰＣＲ増幅産生物を、当業界では既報の方法に従って、ベクターｐＴ７Ｂｌｕｅにクローニングし、配列決定した。それぞれＨＧＢＶ−ＣＮＳ３ヘリカーゼ遺伝子の保存度の高い部分から誘導されたこれら配列の配置（すなわち、ＨＧＢＶ−Ｃのヌクレオチド４２７２〜４４０７、配列番号２６；長さ１３５ヌクレオチド）とその後の系統発生的分析からは、これら配列のサブタイプへの顕著な群分けは示されなかった（データは示していない）。系統発生的分析がＣ型肝炎ウィルスに適用されており、ＨＣＶ単離株間の変動性は、６つの等しく異なっている主要な配列のサブタイプを表すことが明らかになっている（例えば、Simmonds，P.et al.，J.Gen.Virol. 74:2391-2399(1993) およびSimmonds，P．et al.，J.Gen.Virol. 74:1053-1061(1994)参照）。この分析により、配列群間の進化距離に基づいて単離株を遺伝子型に分類したシモンズらの報告のように(Simmonds，P.et al.，Hepatology ，19:1321-1324(1994))、Ｃ型肝炎ウィルスについての命名システムが確立された。ＨＣＶの場合、個々のウィルス遺伝子型による感染が疾患の重度ならびにインターフェロン−２αなどの抗ウィルス薬による治療に対する反応性と相関している（例えば、Dawson，G，et al.，″Recent developments in the molecular biology of the hepatitis viruses″，Current Hepatology，G.Gitn ick(Ed).，St.Louis，Mo.，Mosby(1995)参照）。疾患の重度もしくは治療の結果と個々のＨＧＢＶ−Ｃサブタイプによる感染との相関について調べるためには、最初に、そのようなサブタイプが存在するか否かを明らかにする必要があった。しかしながら、その時点でＮＳ３配列の分析から得られたデータからは、遺伝子型の存在（本明細書に記載のように）については明らかにはなっておらず、それは、各単離株から得られる配列データの量が限られているためであった(すなわち、１３５個のみのヌクレオチド)。そこで、ＨＧＢＶ−Ｃ単離株間の発生系統的関係を正確に決定できるだけのデータを得ることを目的として実験を行って、各種ＨＧＢＶ−Ｃ単離株のＨＧＢＶ−Ｃゲノムの５’末端からの延長領域を増幅した。本明細書で上述のように、ＨＧＢＶ−ＣについてＲＴ−ＰＣＲ陽性であることがすでに明らかな対象者からの血清をＨＧＢＶ−ＣウィルスＲＮＡ源として用いた。具体的には、それぞれＨＧＢＶ−Ｃゲノムの５’末端付近ならびに推定Ｅ１遺伝子のＮ末端付近にある２個のオリゴヌクレオチドプライマーである配列番号５１（ｎｔｒＣ−Ｓ１）および配列番号５２（Ｇ１３１−Ｅ１ｗｂ２）を、当業界で公知の加熱サイクルプロトコールで、本明細書ですでに述べたように、当業界で公知の方法に従って得られた血清由来ｃＤＮＡ産生物について使用した。一部の実験では、ＨＧＢＶ−Ｃゲノムの５’末端から誘導された他のオリゴヌクレオチドプライマー（すなわち、ｎｔｒＣ−４Ｒ（配列番号５７）と組み合わせたｎｔｒＣ−Ｓ２（配列番号５３）およびｎｔｒＣ−４Ｒ（配列番号５７）と組み合わせたｎｔｒＣ−Ｓ１（配列番号５１））を、本明細書で詳述したＰＣＲ実験で使用して、ＨＧＢＶ−Ｃゲノムのより小さい領域の増幅を行った。これらのプライマーを用いて、ＨＧＢＶ−ＣＲＮＡ陽性であることがすでに明らかになっている対象者３９名から、４６個のＰＣＲ産生物（配列番号２〜６、配列番号９〜１１、配列番号１３〜２４、配列番号６０〜８６）（表１）を得た。これらの単離株のうちの４株は、Ｃ型肝炎ウィルス蛋白に対する抗体の存在について不確定と分類された対象者からのものであった。これら単離株中の２１株は、他の肝炎ウィルスによる感染が風土病である西アフリカ地域からの対象者からのものであった（これは、以下に示す表１中のＨＧＢＶ−Ｃゲノム（配列番号２６）からの相当する配列を含む）。これら単離株のうちの４株は、非Ａ〜Ｅ肝炎患者からのものであり、これら単離株中の５株は再生不良性貧血と診断された患者からのものであり、これら単離株中の６株は複数回の輸血を受けた対象者からのものであり、これら単離株中の３株は米国からの健常供血者からのものであり、これら単離株中の１株は静脈投与薬使用者（ＩＶＤＵ）からのものであり、これら単離株中の２株は東南アジアからの対象者２名からのものであった。これらの産生物を、細菌プラスミドｐＴＶＢｌｕｅにクローニングし、当業界で公知で方法に従って配列決定した。得られたＨＧＢＶ− Ｃ単離株を表１に示してあるが、これには単離株が得られた対象者についての説明もある。一部の場合で、１個の入手源から得られた複数の単離株について配列の分析を行った。具体的には、配列番号１６、２０および８４は再生不良性貧血と診断された１名の対象者から得て、配列番号２１および２２は複数回輸血対象者１名から得たものであり、配列番号６７および６８、６９および７０、７５および７６はそれぞれ、西アフリカからの対象者３名から得たものであった。ウィスコンシン配列解析パッケージ（バージョン８）のプログラムＰＩＬＥＵＰを用いて、これらの配列の配置を行い、図１Ａ〜図１Ｆにそれを示してある。図１Ａ〜１Ｆについて説明すると、配置の各位置での共通ヌクレオチドは、その位置に最も頻繁にある塩基によって決定した。共通ラインは必ずしも、「原型」ＧＢウィルスＣ単離株の共通配列を代表するとは限らない。図１Ａ〜１Ｆにおけるダッシュ（−）は、この図において「cons」として示してある共通ラインに示してあるものと同じ塩基を示している。塩基の欠失は、この図ではピリオド（．）で示してある。各単離株について、塩基は、共通ラインと異なる配置における位置でのみ示してある。単離株の増幅に使用したＰＣＲプライマーの配列は、この図の配置では示していない。ＰＨＹＬＩＰパッケージ（バージョン３．５ｃ、１９９３；J.Felsenstein 氏の好意により提供されたもの。Felsenstein，J.，Cladistics 5:164-166(1989 )参照。）のＤＮＡＤＩＳＴプログラムを用いて、配置されたヌクレオチド配列間の進化的距離を計算することで、これらのＧＢウィルスＣ配列（単離株）間の発生系統的関係を調べた。これらの距離計算値を用い、プログラムＦＩＴＣＨによって発生系統樹を構築した。配列間の距離をグラフ表示する木を、プログラムＤＲＡＷＧＲＡＭを用いてプロットし、図２に示してある。木の「根」は、表示上明瞭にするために、木の最も長い枝の中央点に任意に割り当てたが、図示した木には根はない。すなわち、この木における全ての配列に共通する祖先は明らかになっていない。この分析の結果から、少なくとも４つの明瞭なＧＢウィルスＣ単離株の遺伝子型があることがわかった。これらの個々の配列の関係を図２にグラフで示してある。これらの群のうちの２群、すなわち遺伝子型１および４は互いに、および他の２群すなわち遺伝子型２および３からかなり離れている。現在までのところ、ＨＧＢＶ−Ｃの遺伝子型１単離株は専ら、西アフリカからの対象者で認められており、元のＨＧＢＶ−Ｃ単離株を含んでいた。遺伝子型２および３単離株に属する配列は現在までのところ、具体的な地理的分布は示していない。疾患の状況または治療方法に関する完全な臨床情報は、配列を得たこれら対象者全員について得られているわけではない。そこで現在のところ、疾患の重度を感染性ＨＧＢＶ −Ｃ遺伝子型と相関させることができていない。臨床情報の収集を現在行っている。しかしながら、再生不良性貧血と診断された１名の患者がＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型２および３（配列番号１２、１６および６０）に感染していることが認められたことから、対象者によっては、複数の遺伝子型のＨＧＢＶ−Ｃに感染し得るという所見は興味深いものである。ＮＳ３および５’−末端領域の両方からの各種ＨＧＢＶ−Ｃ単離株に、非常に大きい配列の変動があることが認められた。非常に感受性は高いが、ウィルス核酸についてのＰＣＲに基づくアッセイは、オリゴヌクレオチドプライマーとウィルス鋳型の間の配列一致によって決まるものである。従って、ゲノムのＮＳ３領域および５’−末端部分からの配列（ＧＢＶ−Ｃ（配列番号５１）−Ｅ１ｗｂ２（配列番号５２）を増幅するのに使用したＰＲＣプライマーは全ての単離株で良好に保存されているとは限らなかった領域にあったことから、調べた全てのＨＧＢＶ−Ｃウィルス血症検体が、ここで用いたＲＴ−ＰＣＲアッセイによって検出されたわけではないと考えられる。ＨＣＶの５’未翻訳領域で認められているように（Cha et al.，J.Clin.Microbiol. 29:2528-2534(1991)）、ＨＧＢＶ−Ｃゲノムの保存度が非常に高い領域からのＰＣＲプライマーを利用することで、ＨＧＢＶ−Ｃウィルス血症検体のより正確な検出が可能となるものと仮定した。そこで、４６の単離株全てから得られた図１に示した配置配列を調べたところ、全ての単離株間で、非常の保存度の高いヌクレオチド配列の領域がいくつかあることが明らかになった。これらのＨＧＢＶ−Ｃの非常に保存度の高い領域から得られたプライマーｎｔｒＣ−Ｓ２（配列番号５３）、ｎｔｒＣ−Ａ１（配列番号５４）、ｎｔｒＣ−Ａ２（配列番号５５）、ｎｔｒＣ−３Ｆ（配列番号５６）およびｎｔｒＣ−４Ｒ（配列番号５７）を得て、ＨＧＢＶ−Ｃヘリカーゼ遺伝子からの変性プライマーに対するこれらの万能ＨＧＢＶ−Ｃプライマーの感受性および特異性を調べた。プライマーｎｔｒＣ−Ｓ１／ｎｔｒＣ−ａ１（配列番号５１／配列番号５４）およびｎｔｒＣ−Ｓ２／ｎｔｒＣ−ａ２（配列番号５３／配列番号５５）を独立のＰＣＲで用いるか、または枝分かれ型のＰＣＲ実験で組み合わせて用いた。プライマーｎｔｒＣ−３Ｆ／ｎｔｒＣ−４Ｒ（配列番号５６／配列番号５７）は、別個のＰＣＲで組み合わせて使用した。当業者には公知であるこれらのＰＣＲ増幅法は以下の通りであった。すなわち、２ｍＭＭｇＣｌ₂および１μＭプライマー（センスとアンチセンスの両方）を用い、前述の方法に従って得られた血清ｃＤＮＡ産生物について、以下のようにして第１回の増幅を行った。反応物に対して、変性−アニーリング −延長（９４℃、２０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、４５秒間）を３５〜４０サイクル行い、次に７２℃で１０分間の延長を行った。これらを終了した反応液を４℃に維持した。必要に応じて、完全枝分かれまたは半枝分かれ反応として行う第２回の増幅を、２ｍＭＭｇＣｌ₂、１μＭのセンスおよびアンチセンスプライマーならびに鋳型としての第１のＰＣＲ産生物４％を用いて行った。第２回の増幅では、第１回ＰＣＲで使用したものと同じ加熱サイクルプロトコールを用いた。ＰＣＲ産生物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、核酸を臭化エチジウムで直接染色することで、ＵＶ照射による肉眼観察ができるようにした。枝分かれＰＣＲ反応を行わなかった場合、１回のＰＣＲ増幅の産生物を、ハイボンド−Ｎ＋ナイロンフィルターに転移させ、次にＨＧＢＶ−Ｃについての放射能標識プローブにハイブリッド形成した。これらの実験から得られた結果から、前述のようなヘリカーゼ領域プライマーを使用することでＨＧＢＶ−ＣＲＮＡについて、検査によって血清が陽性であるとされていた３９名の対象者中３８名でＨＧＢＶ−ＣＲＮＡが存在することが確認された。本発明者らは、ＨＧＢＶ−Ｃ万能５’末端プライマーによる血清の検査で陰性であった対象者１名は、別の検体由来のアンプリコンもしくは別の対象者からのＨＧＢＶ−ＣＲＮＡ陽性血清による血清検体の汚染のため、最初にＮＳ３プライマーによる検出で陽性となったものと仮定した。しかしながら、これらのＨＧＢＶ− Ｃ単離株の非常に保存度の高い領域由来のプライマー対は、ＨＧＢＶ−Ｃウィルス血症を調べる方法および／またはそれを確認する方法として有用であることが明らかになっている。ＨＧＢＶ−Ｃゲノムの５’末端内の非常に保存度の高い領域由来のオリゴヌクレオチドのどれが、ＨＧＢＶ−ＣＲＮＡの検出に有用であるかを明らかにするため、各種センスプライマー（ｎｔｒＣ−Ｓ１（配列番号５１）、ｎｔｒＣ−３Ｆ（配列番号５６）、ｎｔｒＣ−Ａ１（配列番号５４）、ｎｔｒＣ−Ａ２（配列番号５５）、ｎｔｒＣ−４Ｒ（配列番号５７）、ｎｔｒＣ−５Ｒ（配列番号８７））でＲＴ−ＰＣＲ実験を行った。ＮＳ３ヘリカーゼ領域由来のＰＣＲプライマー（配列番号８８および８９を用い、上記に開示した増幅手順を行ったもの。データは示していない。）を用いたＧＢＶ−ＣＲＮＡについての検査で陽性であった市販血液の供血者１２名から得たヒト血清について、１１の異なる組み合わせのＨＧＢＶ−Ｃ５’末端センス／アンチセンスプライマーを用いることで再度検査した。すなわち、２ｍＭＭｇＣｌ₂および１μＭセンス・アンチセンスプライマーを用い、上記の方法に従って得られた血清ｃＤＮＡ産生物について増幅を行った。ＰＣＲ反応では、変性−アニーリング−延長（９４℃、２０秒間；５５℃、３０秒間；７２℃、４５秒間）を４０サイクル行い、次に７２℃で１０分間の延長を行った。これらを終了した反応液を４℃に維持した。増幅反応では、ＮＳ３変性プライマーを用いたこれら検体についての最初の検査で使用したｃＤＮＡの量の４０％のみを使用した。そこで、５’末端由来プライマーの有用性をＮＳ３変性プライマーと比較するため、以下に記載の方法に従って、ＮＳ３ヘリカーゼ遺伝子（配列番号８８および８９）由来のプライマーを用いて、ＨＧＢＶ−ＣＲＮＡについて、検体を並行して再検査した。ＮＳ３変性ＨＧＢＶ−Ｃプライマーによる増幅は、ルー（Roux，Bio/Techniques 16:812-814(1994)）に記載の方法に従って、鋳型とプライマーの間で塩基対不一致を有し得るＤＮＡ配列を増幅するための加熱サイクルプロトコールを用いて行った。具体的には、反応物について４３回の加熱サイクルを行い（９４℃、２０秒間；５５℃からサイクル当たり０．３ ℃低下させながら３０秒間；７２℃、１分間）、次に１０サイクル行い（９４℃、２０秒間；４０℃、３０秒間；７２℃、１分間）、７２℃で１０分間の最終延長を行った。ＰＣＲ産生物をアガロースゲル電気泳動によって分離し、核酸を臭化エチジウムで直接染色することで、ＵＶ照射による肉眼観察ができるようにした。次に核酸を、ハイボンド−Ｎ＋ナイロンフィルター（Amersham L ife Sciences，Arlington Heights，ILから市販）によって転移させ、次にＨＧＢＶ−Ｃについての適切な放射能標識プローブ（配列番号２６、位置１３〜６３１）にハイブリッド形成した。これらの実験の結果は表２Ａおよび２Ｂにまとめてある。結果から明らかなように、プライマー対ｎｔｒＣ−Ｓ１／ｎｔｒＣ−２Ａ（配列番号５１／配列番号５５）によって、臭化エチジウム染色によって決定された１２検体中の１１検体全て（表２Ａ）およびサザーンブロッティング分析によって決定された１２検体中の１２検体（表２Ｂ）において、ＨＧＢＶ−ＣＲＮＡが検出された。それとは対象的に、ｎｔｒＣ−３Ｆ／ｎｔｒＣ−４Ｒ（配列番号５６／配列番号５７）によって検出されたのは、臭化エチジウム染色によって決定された１２検体では４検体、サザーンブロッティング分析によって決定された１２検体では７検体のみであった。さらに、ＮＳ３由来ＨＧＢＶ−Ｃ変性プライマー（配列番号８８および配列番号８９）によって、臭化エチジウム染色によって決定された１２検体中の７検体およびサザーンブロッティング分析によって決定された１２検体中の８検体において、ＲＮＡが検出された。これらのデータは、全ての５’末端プライマーが、全てのＨＧＢＶ−Ｃ単離株間でヌクレオチド配列の高い保存度を示す領域から誘導されたものであったとしても、ＨＧＢＶ−Ｃウィルス血症の検出において、一部のＨＧＢＶ−Ｃ５’末端プライマー対が、他のものより感度が高い可能性のあることを示している。さらに、使用した条件下では、ＨＧＢＶ−ＣＮＳ３ヘリカーゼ由来のＰＣＲプライマーは、ＨＧＢＶ−Ｃ核酸検出のためのゲノムの５’末端由来のプライマーほど感受性が高くない可能性がある。表２Ａおよび２Ｂにはプライマー対を示してあり、それらの表において、Ｓ１は配列番号５１に相当し、Ｓ２は配列番号５３に相当し、５Ｒは配列番号８７に相当し、３Ｆは配列番号５６に相当し、Ａ１は配列番号５４に相当し、Ａ２は配列番号５５に相当し、４Ｒは配列番号５７に相当し、ＮＳ３は配列番号８８および８９に相当する。 ‡ｎｄは、未測定を意味する。 ‡ｎｄは、未測定を意味する。実施例２：ＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型１、２および３の区別的検出増幅反応でオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、以下のようにして、ＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型１または２または３の区別的検出を行う。これらのプライマーＨＧＢＶ−Ｃ−１ａ−ｓ１（配列番号２８）、ＨＧＢＶ−Ｃ−１ａ−ｓ２（配列番号３２）、ＨＧＢＶ−Ｃ−１ａ−ａ１（配列番号２７）、ＨＧＢＶ−Ｃ−１ａ −ａ２（配列番号３１）、ＨＧＢＶ−Ｃ−１ｂｃ−ｓ１（配列番号２９）、ＨＧＢＶ−Ｃ−１ｂｃ−ｓ２（配列番号３３）、ＨＧＢＶ−Ｃ−１ｂｃ−ａ１（配列番号３０）、ＨＧＢＶ−Ｃ −１ｂｃ−ａ２（配列番号３４）を増幅反応に用いることができ、その場合、各プライマーを上記の実施例１で挙げたセンスまたはアンチセンスプライマーの一つと、実施例１で示したＰＣＲプロトコールに従って対とする。「１ａ」の呼称を付けて上記に挙げたプライマーは、ＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型１について選択的であり、「１ｂ」の呼称を付けたプライマーはＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型２について選択的であり、「１ｃ」の呼称を付けたプライマーはＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型３について選択的である。特定のＨＧＢＶ−Ｃ単離株の遺伝子型は、アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウム染色によって肉眼観察できるようにした場合の、予想の大きさのＰＣＲ増幅産生物の有無によって決定される。さらに、ＨＧＢＶ− Ｃプライマー対の一つを用いて産生されるＰＣＲ増幅産生物の核酸配列を求めることで、遺伝子型を確認することができる。次に、求めた配列を、他のＨＧＢＶ −Ｃ単離株の相同領域からの配列と比較する。これは、当業界で公知の方法を用いた配列配置とその後の発生系統学的分析によって行われる。実施例３：ＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型のＧＡＰＬＣＲ検出ＨＧＢＶ−Ｃ配列内の領域の中には、単離株間で大幅に異なるものがあることを本発明者らは認めた。これらの配列を用いて、ＧＡＰ−ＬＣＲアッセイに使用してＨＧＢＶ−Ｃ遺伝子型１、２または３の構成要素間での識別を行うことができるオリゴヌクレオチドプライマーの構築を行った。すなわち、二重ギャップＬＣＲを以下のように、さらには引用によって本明細書にすでに含まれている米国特許５４２７９３０号に詳細に記載されている方法に従って行う。本明細書では、二重ギャップを「ＤＧｐ，ｑ」として表し、その場合「ｐ」は一方の鎖のギャップにおける塩基数を表し、「ｑ」は他方の鎖のギャップにおける塩基数を表す。そこで、好ましい二重ギャップの実施態様は、５ ’末端が連結に関与しする２個のプローブのそれぞれにおいて２個の塩基が失われているものであり、ＤＧ２，２と表記される。この好ましい実施態様においては、他方の２個のプローブの３’末端は重複せず、それらは標的鎖（およびそれの相補配列）における同じ点を末端とする。この方法について以下に説明する。８５℃での６５秒間のインキュベーションおよび５０℃での６５秒間のインキュベーションから成るサイクル３０〜５０回で、二重ギャップＬＣＲを行う。使用するオリゴヌクレオチドを、以下において、配列番号３５〜５０で表し、それらはＨＧＢＶ−Ｃの５’末端に特異的である。５０ｍＭＥＰＰＳ（ｐＨ７．８）、１００ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、１ｍＭＤＴＴ、１０ｍＭＮＨ₄Ｃｌ、１００μｍＮＡＤ、１０μｇ／ｍＬＢＳＡ、５×１０¹¹個の上記の各オリゴヌクレオチド、１μｍの２’−デオキシグアノシン５’三リン酸、０．５単位のサーマス（Thermus）ＤＮＡポリメラーゼ（Mol ecular Biology Resources，Inc.，「MBR」）および３４００単位のThermus the rmohilusＤＮＡリガーゼを含む緩衝液中で反応を行う。反応容量は５０μＬであり、各反応液を鉱油２５μＬで覆ってからサイクルを行う。増幅後、反応液をＩＭｘ（登録商標）希釈緩衝液（Abbott Laboratories，Abb ott Park，ILから市販）その他の好適な緩衝液で１：１希釈する。ＬＣＲ増幅産生物を、アボット(Abbott)ＩＭｘ（登録商標）自動免疫アッセイシステムを用いて行うサンドイッチ免疫アッセイによって検出する。実施例４：ＧＢＶ−Ｂの５’ＮＴＲにおける内部リボソーム導入部位ピコルナウィルスおよびペスチウィルスなどのいくつかの陽性鎖ＲＮＡウィルスは、大きい５’非翻訳領域（ＮＴＲ）を有する。これらの大きいＮＴＲは、内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）（Pellet ier and Sonenberg，Nature(London)334:320-325)として機能することで、キャップ非依存翻訳の開始を制御する。ＩＲＥＳは特異的ＲＮＡ構造を形成し、それによって、リボソームが導入され、キャップ依存型の翻訳開始に要求される細胞機構を用いることなく、ＲＮＡの翻訳を開始することができる。ＨＣＶの大きい５’ＮＴＲは、ＩＲＥＳを有することが明らかになっている（Wang et al.，J.V irol. ，67:3338-3344，1993）。ＧＢＶ−ＢとＨＣＶの５’ＮＴＲ間での配列保存が高レベルであることから、ＧＢＶ−ＢはＩＲＥＳを有し得ると考えられた。ＧＢＶ−ＢにおけるＩＲＥＳ機能を調べるため、このウィルスの５’ＮＴＲ末端を用いて、ウェッターら報告の（Whetter et al.，J.Virol.，68:5253-5263， 1994）ｐＬＵＣ−ＨＡＶ−ＣＡＴプラスミドにおけるＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）の５’ＮＴＲを置き換えた。プライマーとして配列番号５８（ＵＴＲ−Ｂ．１）および配列番号５９（ＮＴＲ−Ｂ−ａ１）を用いて、プラスミドクローンからＧＢＶ−Ｂの５’ＮＴＲを増幅した。すなわち、１μＭのプライマー、２ｍＭのＭｇＣｌ₂およびプラスミド約１０ｎｇを用いて、製造業者の説明に従って、パーキン・エルマーのＰＣＲキットを用いて、５０μＬのＰＣＲを設定した。この反応液について、２０サイクル（９４℃で２０秒間、５５℃で３０秒間および７２℃で３０秒間）を行い、次に７２℃で１０分間の最終延長を行った。次に、完了した反応液を４℃に維持した。この産生物を、当業界で報告されている方法に従ってフェノール：クロロホルムで抽出し、沈殿させた。既報の方法に従って(Sambrook et a l.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，198 9)、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸とともにインキュベーションすることで、アンプリタック（AmpliTaq；登録商標）ポリメラーゼによって加えられた３’末端アデノシン残基を、この産生物から除去した。加熱による失活後、当業界で既報の方法に従って、産生物をＸｂａＩで消化させ、ゲル精製した。精製産生物を、当業界で既報の方法に従って、ＨｉｎｄＩＩＩで切断しておいたｐＨＡＶ−ＣＡＴ１（Whetter et al.，J.Virol 68:5253-5263 ，1994）に連結し、クレノウ・ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸で末端を満し、加熱によって失活させ、ＸｂａＩによって消化させ、細菌アルカリホスファターゼで処理し、フェノール：クロロホルムで抽出し、沈殿させた。構築したプラスミドｐＧＢＢ−ＣＡＴ１を、当業界で既報の方法に従って、ＳａｃＩで消化させ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸で平滑末端とし、加熱により失活させ、ＮｏｔＩで消化させた。これらの反応から得られた１．３ｋｂｐの産生物を、当業界で既報の方法に従って、ゲル精製し、ＨｉｎｄＩＩＩで消化させておいたｐＬＵＣ−ＨＡＶ−ＣＡＴ（Whetter et al.，J.Virol 68:5253-5263，1994）に連結し、クレノウ・ポリメラーゼおよびデオキシヌクレオチド三リン酸で末端を満し、加熱によって失活させ、ＮｏｔＩによって消化させ、細菌アルカリホスファターゼで処理し、フェノール：クロロホルムで抽出し、沈殿させた。得られたプラスミドｐＬＵＣ−ＧＢＢ−ＣＡＴをインビトロでの転写−翻訳実験で使用して、ＩＲＥＳ機能について調べた。インビトロでの転写−翻訳アッセイを、プロメガ（Promega，Madison，WI）からのＴＮＴ（登録商標）Ｔ７結合網状赤血球溶解物系を用いて、製造業者の説明に従って行った。被験プラスミドは、ｐＬＵＣ−ＧＢＢ−ＣＡＴ（上述）、ｐＬＵＣ−ＨＡＶ−ＣＡＴ（Whetter et al.，J.Virol 68:5253-5263，1994からの陽性対照）およびｐＬＵＣ−Δ３５５−５３２（Whetter et al.，J.Virol 68 :5253-5263，1994からの陰性対照）であった。産生物（³⁵Ｓ−メチオニンで標識したもの）を、当業界で既報の方法に従って、１０％レムリ（Laemmli）ゲルに流した。ゲルを１０％メタノール、２０％酢酸で１０分間固定し、乾燥させ、スクリーン（PhosphoImager（登録商標）スクリーン、Molecular Dynamics，Sunny vale，CA）に露光させた。産生物を肉眼で観察できるようにした（PhosphoImage r（登録商標）によって）（データは示していない）。３つの反応のいずれにも、ルシフェラーゼ（プラスミドにおけるＬＵＣ遺伝子）について予想される大きさと一致する帯域があった。ｍＲＮＡの５’末端から始まる翻訳のレベルの尺度であるＬＵＣ発現は、３つの反応で同等であるように思われた。そこで、これら３つの反応液には、翻訳可能な形で等価な量のＲＮＡ鋳型が存在した。ｐＬＵＣ−ＨＡＶ−ＣＡＴ反応液およびｐＬＵＣ−ＧＢＢ−ＣＡＴ反応液には、クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ（プラスミドにおけるＣＡＴ遺伝子）について予想される大きさと一致する帯域もあった。この帯域は、ｐＬＵＣ−Δ３５５−５３２陰性対照には認められない。ＣＡＴ発現は、内部翻訳開始のレベルを測定するものである。ほぼ同等レベルのＣＡＴ発現が、ｐＬＵＣ−ＨＡＶ−ＣＡＴプログラム溶解物とｐＬＵＣ −ＧＢＢ−ＣＡＴプログラム溶解物において認められる。ＣＡＴ遺伝子の翻訳にはこのプラスミド構築物においてＩＲＥＳが存在することが要求されることから、ＧＢＶ−Ｂの５’ＮＴＲはその機能を提供しているはずである。従って、ＨＣＶ同様、ＧＢＶ−Ｂの５’ＮＴＲにはＩＲＥＳがある。ＧＢＶ−ＢにおけるＩＲＥＳについてさらに良好な特性決定を行うために、これらのプラスミドについてさらなる研究を、インビトロおよびインビボの両方で現在実施している。本発明は、添付の請求の範囲によってのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者シモンズ，ジヨン・エヌアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイスレイク、ノース・アリゲニー・ロード・738 (72)発明者バーケンメイヤー，ラリーアメリカ合衆国、イリノイ・60630、シカゴ、ウエスト・リーランド・5303 (72)発明者リアリー，トーマス・ピーアメリカ合衆国、ウイスコンシン・53142、ケノウシヤ、ワンハンドレツトセブンス・アベニユー・6820 (72)発明者アーカー，ジエイムズ・シーアメリカ合衆国、イリノイ・60030、ハイネスビル、ノース・ホワイト・テイル・ドライブ・359 (72)発明者デサイ，スレシユ・エムアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、アミイ・レイン・1408 (72)発明者ムシヤワー，イサ・ケーアメリカ合衆国、イリノイ・60030、グレイスレイク、アーバー・ブールバード・ 18790 (72)発明者チヤルマース，ミシエルアメリカ合衆国、イリノイ・60045、レイク・ビラ、ウエスト・リンデン・21924 (72)発明者ドースン，ジヨージ・ジエイアメリカ合衆国、イリノイ・60048、リバテイビル、サウス・ダイモンド・ロード・ 914

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号５１および該配列の相補配列であるオリゴヌクレオチド。２．配列番号５３および該配列の相補配列であるオリゴヌクレオチド。３．配列番号５４および該配列の相補配列であるオリゴヌクレオチド。４．配列番号５５および該配列の相補配列であるオリゴヌクレオチド。５．配列番号５６および該配列の相補配列であるオリゴヌクレオチド。６．配列番号５７および該配列の相補配列であるオリゴヌクレオチド。７．配列番号８７および該配列の相補配列であるオリゴヌクレオチド。８．被験サンプル中の標的ＨＧＢＶ−Ｃヌクレオチドを検出する方法であって、ａ．１以上のＨＧＢＶ−Ｃ特異的オリゴヌクレオチドもしくは該ヌクレオチドの相補配列と標的ＨＧＢＶヌクレオチドとを接触させる段階、ならびにｂ．被験サンプル中における標的の有無を検出する段階を有してなる方法。９．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７および配列番号８７ならびにこれら配列の相補配列からなる群から選択される請求項８に記載の方法。１０．前記オリゴヌクレオチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５および配列番号８６ならびにそれら配列の相補配列からなる群から選択される請求項８に記載の方法。１１．被験サンプル中の標的ＨＧＢＶ−Ｃヌクレオチドを検出する方法であって、ａ．配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７および配列番号８７ならびにこれら配列の相補配列から成る群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドと標的ＨＧＢＶヌクレオチドとを接触させる段階、ならびにｂ．被験サンプル中における標的の有無を検出する段階を有してなる方法。１２．段階（ａ）を行う前に、前記標的ＨＧＢＶ−Ｃヌクレオチドを固相に付着させる請求項８に記載の方法。１３．被験サンプル中のＧＢ型肝炎ウィルスの５’末端ｃＤＮＡを増幅する方法であって、ａ．ランダムプライマーを用いた逆転写を行う段階、ｂ．第１段階のＰＣＲにおけるセンスおよびアンチセンスプライマーとしてＨＧＢＶ−Ｃの他のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで、段階（ａ）から得られたｃＤＮＡを増幅して、増幅ｃＤＮＡを得る段階、ｃ．被験サンプル中のＨＧＢＶ−Ｃのアンプリコンの有無を検出する段階を有してなる方法。１４．前記段階（ｂ）の増幅をポリメラーゼ連鎖反応によって行う請求項１３に記載の方法。１５．段階（ａ）を行う前に、前記被験サンプルを固相に付着させる請求項１３に記載の方法。１６．前記検出段階が、測定可能信号を発生させることができる検出可能標識を利用する段階を有する請求項１３に記載の方法。１７．前記検出可能標識を固相に付着させる請求項１６に記載の方法。１８．被験サンプル中のＧＢ型肝炎ウィルスの５’末端ｃＤＮＡを増幅する方法であって、ａ．ランダムプライマーを用いた逆転写を行う段階、ｂ．第１段階のＰＣＲにおけるセンスおよびアンチセンスプライマーとして他のオリゴヌクレオチドプライマーを用いることで、段階（ａ）から得られたｃＤＮＡを増幅して増幅ｃＤＮＡを得る段階であって、前記センスプライマーが配列番号５１、５３および５６からなる群から選択され、前記アンチセンスプライマーが配列番号５４、５５、５７および８７からなる群から選択される段階、ｃ．被験サンプル中のアンプリコンの有無を検出する段階を有してなる方法。１９．前記段階（ｂ）の増幅をポリメラーゼ連鎖反応によって行う請求項１８に記載の方法。２０．段階（ａ）を行う前に、前記被験サンプルを固相に付着させる請求項１８に記載の方法。２１．前記検出段階が、測定可能信号を発生させることができる検出可能標識を利用する段階を有する請求項１８に記載の方法。２２．前記検出可能標識を固相に付着させる請求項１８に記載の方法。２３．標的ＨＧＢＶを有することが疑われる被験サンプルにおけるＨＧＢＶ− Ｃを検出する方法であって、ａ．センスプライマーとしての配列番号５１、配列番号５６および配列番号５３からなる群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドならびにアンチセンスプライマーとしての配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７および配列番号８７からなる群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドと前記被験サンプルを接触させ、同配列を増幅して第１段階の反応生成物を得る段階、ｂ．前記段階（ａ）の１以上のオリゴヌクレオチドと配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７および配列番号８７からなる群から選択される第２のオリゴヌクレオチドとを、前記第１段階の反応生成物と接触させる段階（ただし、第２のオリゴヌクレオチドは、使用される第１のオリゴヌクレオチドに対して３’の位置にあり、前記第１のオリゴヌクレオチドに対して反対のセンスのものである）、ｃ．前記ＨＧＢＶ標的を検出する段階を有してなる方法。２４．前記増幅をポリメラーゼ連鎖反応によって行う請求項２３に記載の方法。２５．段階（ａ）を行う前に、前記被験サンプルを固相に付着させる請求項２３に記載の方法。２６．前記検出段階が、測定可能信号を発生させることができる検出可能標識を利用する段階を有する請求項２３に記載の方法。２７．前記検出可能標識を固相に付着させる請求項２６に記載の方法。２８．配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９および配列番号５０ならびにそれら配列の相補配列からなる群から選択されるＧＡＰリガーゼ連鎖反応に有用なプライマー。２９．被験サンプル中のＨＧＢＶ−Ｃ標的を検出するのに有用な試験キットであって、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７および配列番号８７ならびにそれら配列の相補配列からなる群から選択される１以上のオリゴヌクレオチドの入った容器を有してなる試験キット。