JPH11511981A - 核酸配列における塩基の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 特定塩基が核酸配列の特定位置に存在するか否かの判定方法。該方法は、以下の工程：（ａ）固体支持体上に固定化された形態で、研究されるべきである配列の一本鎖試料（「試料配列」）を準備し、（ｂ）該試料配列にプライマーをハイブリダイズさせて、３'側の特定位置にすぐ隣接している該試料の塩基に該プライマーの３'末端の塩基をハイブリダイズさせ、（ｃ）特定塩基が該位置に存在する場合、試料配列の特定位置に対応する位置でプライマーの伸長単位を提供することができる標識部分を用いて伸長条件下で該プライマーを処理し（ここで、伸長条件は、プライマーの伸長が、標識部分による別の伸長による以外に試料配列の特定位置を超えて継続しないような条件である）、（ｄ）支持体を洗浄して未反応標識部分および他の試薬を除去し、次いで、（ｅ）プライマーにおける標識部分の取り込みについて試験することからなる。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸配列における塩基の同定 本発明は、核酸配列における塩基の同定に関する。さらに詳しくは、本発明は 、特定の塩基が核酸配列における特定の位置に存在するか否かを判定するための 方法に関する。本発明の特定の用途は、遺伝子に突然変異が存在するか否かを判 定する際である。 現在、多くの病状が患者の遺伝子で生じた少なくとも１つの突然変異の結果と して生じることがよく確立されている。該突然変異は、例えば、トランケートし たｍＲＮＡの形成を生じ、次いで、正しくないアミノ酸を有するタンパク質の形 成を生じる結果、該タンパク質が正しくない機能を有するかまたは全く機能を有 しなくなる欠失である。別には、該突然変異は、大規模な挿入（例えば、ウイル ス配列の導入）もしくは進化による小規模な挿入またはＤＮＡポリメラーゼ誤読 の結果としての単一または多重のヌクレオチドの導入である。突然変異の別の例 は、遺伝暗号内の特定部位での塩基変化の結果である点突然変異である。 遺伝子の突然変異により生じる病状の例としては、ゴーシェ、嚢胞性線維症な らびにαおよびβサラセミアが挙げられる。かかる疾患を生じる突然変異の多く が知られており、したがって、患者由来のＤＮＡを検査して病状を生じる突然変 異がＤＮＡ中に存在するか否を判定することにより、患者が特定の病状に罹患す るか、または罹患し易いかを判定することが可能である。これは、特異的な塩基 が、ある遺伝子配列の特定位置に存在するか否かを判定することを含む。 かかる検査法の例は、WO-A-9009455（Geneco）に開示されており、ここでは、 研究されるべきである塩基の３'側で遺伝子配列にプライマーをハイブリダイズ し、該プライマーは、検出要素または分離要素を取り込むものである。次いで、 伸長反応を行い、その結果、特定の塩基が存在する場合、該プライマーを、研究 している配列の特異的塩基に対して（のみ）伸長させる。研究下の配列の特異的 塩基に相補的である伸長したプライマーの塩基は、検出要素および／または分離 要素を取り込み、その結果、伸長したプライマーは、全体として検出要素および 分離要素の両方を取り込む。次いで、伸長したプライマーの分離要素の存在によ り、該プライマーは、初期配列から変性され、分離要素に対して親和性を有する 部分を有する固体支持体に暴露される。次いで、該支持体を処理して、該支持体 上に固定化された標識プライマーの存在（または不在）を判定する。該標識が検 出される場合（のみ）、これは、研究下の配列の特定位置に特異的塩基が存在し たという確認である。 該プライマーの親和性分離の必要性は、これがプロセスにさらなる工程を導入 し、結果として自動化の可能性を制限するので、Geneco明細書に開示されている 技術の欠点である。単一および多重の両方の突然変異の自動化の要求は、同時に 、技術の汎用化を非常に増大させるであろう。これは、前記方法では容易には行 われない。 したがって、本発明の目的は、前記欠点を未然に防ぐか緩和することである。 本発明によると、特定塩基が核酸の特定位置に存在するか否かの判定方法であ って、以下の工程： （ａ）固体支持体上に固定化された形態で、研究されるべきである配列の一本 鎖試料（「試料配列」）を準備し、 （ｂ）該試料配列にプライマーをハイブリダイズさせて、３'側の特定位置に すぐ隣接している該試料の塩基に該プライマーの３'末端の塩基をハイブリダイ ズさせ、 （ｃ）特定塩基が該位置に存在する場合、試料配列の特定位置に対応する位置 でプライマーの伸長単位を提供することができる標識部分を用いて伸長条件下で 該プライマーを処理し（ここで、伸長条件は、プライマーの伸長が、標識部分に よる別の伸長による以外に試料配列の特定位置を超えて継続しないような条件で ある）、 （ｄ）支持体を洗浄して未反応標識部分および他の試薬を除去し、 次いで、 （ｅ）プライマーにおける標識部分の取り込みについて試験すること からなることを特徴とする判定方法が提供される。 かくして、本発明方法は、特定塩基が試料核酸の特定位置に存在するか否かを 判定するために用いられる。該塩基が該位置に存在する場合、標識は、工程(ｃ) の結果として産生されるプライマー伸長産生物に取り込まれる。工程（ｅ）によ り検出されるように、該標識の存在により、特定塩基が研究下の位置に存在した ことが確認される。該検出は、試料配列にハイブリダイズしたプライマーを用い て、またはその変性後に行われる。いずれの場合にも、未反応標識部分による妨 害は、全てのかかる未反応標識部分（または他の試薬）を検出工程前に確実に除 去する工程（ｄ）の洗浄工程により回避される。本発明方法は、分離要素の伸長 プライマーへの取り込みおよび次の支持体上に伸長プライマーを固定化するアフ ィニティ工程の必要性を回避する。したがって、本発明は、自体、容易に自動化 される。 標識部分は、例えば、試料配列の特定位置の塩基に相補的な塩基を取り込んで いるジデオキシヌクレオチドである。特定塩基が試料配列の特定位置に存在する 場合にのみ、そのままでプライマーの伸長が生じるであろうし、ジデオキシヌク レオチドが伸長反応を停止させるので、該伸長は、それ以上は続かないであろう 。次いで、該プライマーにおける標識種の存在により、明らかに、特定位置での 特定塩基の存在が確認される。ジデオキシヌクレオチド（または伸長反応を停止 させる他の種）を用いる代わりに、判定される塩基に相補的な塩基を取り込んで いる標識ヌクレオチドを用いることが可能である。この結果、同一の塩基が（５ '側に）あった場合には特定位置の塩基を超えてプライマーが伸長する。しかし ながら、この場合、標識は、特定塩基が特定位置にあった場合にはプライマー伸 長産生物に取り込まれ、伸長プライマーにおける余分の標識の存在は、該工程を 妨害しない。 標識は、第２の標識を導入させるビオチン、フルオロフォア、酵素、化学発光 性標識または同様の基であってもよい。 試料核酸は、多くの方法で準備される。しかしながら、試料核酸が固体支持体 に共有的に結合しているのが非常に好ましい。これは、以下の方法を用いて行わ れる。 該方法は、患者から得られた核酸の試料（「初期核酸」）を用いて始められる であろう。固体支持体は、まず、該支持体に５'末端により共有的に結合された オリゴヌクレオチドを用いて準備されるであろう。これらのオリゴヌクレオチド は、初期核酸の鎖における配列に相補的であろう。一本鎖形態の鎖を準備するこ とにより、該支持体上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイズされ、これにより 、初期核酸の鎖を捕獲してもよい。洗浄して未ハイブリダイズ物質を除去した後 、伸長反応を行って、鋳型として捕獲された初期核酸を用いてオリゴヌクレオチ ドを伸長させる。次いで、初期核酸を変性し、支持体を洗浄して、本発明方法を 行う試料核酸としてその固定化された一本鎖コピーを離脱させる。もちろん、こ の場合、試料核酸は、初期核酸に相補的であると認識されるであろう。したがっ て、初期核酸における特定位置に特定塩基があるか否かを判定するためには、該 塩基の相補体が試料核酸における対応する位置に存在するかを判定することが必 要である。 初期核酸の量が比較的少ない場合、WO-A-93/13220（Tepnel）およびWO-A-95/3 3073（Tepnel）に開示されている方法を用い、これにより、支持体に共有的に結 合された試料核酸の多数の鎖を生産して、できる限り、本発明方法で用いるため の試料核酸の増加した量を生産する。 別法としては、固体支持体に、まず、３'末端により固体支持体へ共有的に結 合されたオリゴヌクレオチドを提供することが可能である。この場合、初期核酸 は、再度オリゴヌクレオチド上に捕獲されるが、この場合、それ自体、試料核酸 として用いられる。 好ましくは、固体支持体は、５０〜２００(より好ましくは、１００〜２００) のサイズを有する粒子からなる。核酸が共有的に結合される粒子および方法の特 に好ましい例は、WO-A-93/13220に開示されている。 粒子は、例えばWO-A-93/13220に開示されているような、試薬が容易に導入さ れ排出されるフロースルーカラム（flow-through column）中に準備されるのが 好ましい。 本発明の展開において、該方法は、数種類のヌクレオチドが試料核酸の特定位 置に存在するか否かを判定するために用いられる。 本発明は、さらに、単に添付図面を参照して、一例により説明されるであろう 。 図１は、本発明の方法による分析のための試料核酸の調製を示す。 図２は、本発明による方法の第１の具体例を示す。 図３は、本発明による第２の具体例を示す。 図４〜７は、実施例の方法および結果を示す。 図１は、図２および３を参照して以下にさらに詳細に説明するような本発明方 法において用いるための一本鎖核酸（試料核酸）を取り込んでいる固体支持体系 の製造を示す。 図１の方法は、 （ａ）支持体に５'末端により共有的に結合される複数の固定化オリゴヌクレ オチド２（１つだけ示す）を有する複数の特定支持体１（１つだけ示す）、なら びに （ｂ）特定の突然変異が存在するか否かを判定するために研究されるべきであ る一本鎖核酸３（ここで、該核酸３は、固定化オリゴヌクレオチド２に相補的な 領域を有する） で始まる。 図１の第一工程（工程（ａ））において、標準的な試薬および方法を用いて鎖 ３をオリゴヌクレオチド２にハイブリダイズする。洗浄して試薬および未ハイブ リダイズ物質を除去した後、ポリメラーゼ酵素ならびにｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄ ＣＴＰおよびｄＧＴＰの混合物を用いてオリゴヌクレオチド２を伸長する。伸長 鎖（鎖３に相補的である）を４と記す。次いで、初期鎖３を変性させ、支持体か ら洗浄して、試料核酸鎖として固定化鎖４を離脱させる。 今、鎖３が、例えば（例えば正常な配列における塩基と比較して）点突然変異 として特定位置で塩基Ａを取り込んだかを判定することが必要であると仮定する 。したがって、塩基ＴまたはＧが鎖４における対応する位置に取り込まれるかを 判定することが必要であり、この方法は、以下に概略記載する。 今、「野生型」鎖３から誘導された鎖４が配列^3' ＴＧＣＴＡＧ^5'を取り込んで あり、突然変異鎖３において、鎖４における対応する配列が^3' ＣＧＣＴＡＧ^5'で あると仮定する。したがって、下線を引いた塩基がＴまたはＣであるかを判定す ることが必要である。これは、図２に示した方法により行われる。 図２に示すように、プライマーの３'末端が塩基を判定しようとする鎖４にお けるその位置（＋で印を付けた）とすぐ隣接するようにプライマー５を鎖４にハ イブリダイズする。すなわち、プライマー５は、可能性のある突然変異点「＋」 から塩基１個下流（すなわち、３'側）にある領域について相同である。 次いで、支持体を洗浄して、試薬および未ハイブリダイズ物質を除去する。 今、ポリメラーゼ酵素と一緒に標識ｄＡＴＰ（^*ｄＡＴＰ）を固体支持体系に 添加する。該標識は、好ましくは、酵素標識である。伸長反応を行った後、固体 支持体系を洗浄する（鎖４にハイブリダイズしたプライマー５を離脱させる）。 図２のスキームでは、プライマー５が標識Ａ（すなわち、^*Ａ）により伸長され るように、配列４において「＋」を付した位置の塩基が実際にはＴであったと仮 定する。 次いで、検出方法を行って、標識ｄＴＴＰがプライマー５に取り込まれたかを 判定する。図２に示す方法について、結果は、陽性である。検出工程が陰性を呈 する場合、ポリメラーゼ酵素と一緒に標識ｄＧＴＰを支持体系に添加し、固定化 プライマーを用いて伸長反応を再度行う。系を洗浄した後、検出工程を繰り返し て、標識ｄＧＴＰが該プライマーに捕り込まれ、初期鎖３が突然変異体であった ことを確認する。 図２に引用記載した方法により、制御手段で単一点突然変異について検査する ことが可能になる。ゲル電気泳動法、ブロッティングまたは他の労働の激しい繊 細な方法を必要としない。さらに、コピー４は、安定であり、繰り返し検査する ことができる。 該方法の展開は、図３に示され、１個以上の突然変異の存在（または不在）を 同時に判定するために用いられる。この場合、特定の突然変異が特定位置に存在 するかを判定するために、４個までのプライマーを同時に鎖４にハイブリダイズ する。一連のプライマーは、点突然変異またはフレームシフト変異の群に隣接す る領域に相補的である。それらは、また、挿入変異と相補的でもある。 図３の方法は、遺伝子配列の固定化された相補的コピーに対して行われる。 説明のために、図３に詳細に示される配列１０−１３のうちの１つの５'末端 にある４つまでの点突然変異の可能性のある存在を研究するためであると仮定す る。 再度、説明のために、４つの突然変異がｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰおよび ｄＧＴＰを組み合わせて使用して検出されると仮定する。 該方法の最初の工程（工程（ａ））では、プライマー１４−１７を関心のある 各配列にハイブリダイズさせる。各プライマーは、可能性のある点突然変異から 塩基１個下流（すなわち、３'側）にある領域について相同性である。 次いで、支持体を洗浄して、未ハイブリダイズプライマーおよび他の試薬を除 去する。 ここで、突然変異の１つが存在する場合に対応するプライマーが^*ｄＡＴＰに より伸長されるような伸長条件下で標識ｄＡＴＰ（すなわち、^*ｄＡＴＰ）をポ リメラーゼ酵素と一緒に支持体に添加する。次いで、該支持体を洗浄し、^*ｄＣ ＴＰ、^*ｄＧＴＰおよび^*ｄＴＴＰを用いて、該方法を逐次的に繰り返した。注目 すべき重要な点は、該ヌクレオチドの各々の標識がお互いに区別されていること である。 この方法の最後に、いずれのヌクレオチドが取り込まれたかを判定するために 支持体について検出工程を行う。該ヌクレオチドが別々に標識されていたので、 如何なる場合もいずれのヌクレオチドが取り込まれたかを判定するが可能である 。異なる標識は、例えば、異なる波長で吸着するフルオロフォアである。 ４つの標識ヌクレオチド全てが取り込まれた場合（図３に示すように）、これ は、４つの点突然変異が存在することを示す。３つ以下の突然変異が存在する場 合、異なる標識化のために、４つの標識ヌクレオチドのいずれが取り込まれたか を判定することができる。したがって、突然変異のいずれが存在するかを言うこ とができる。 図３は、４つの突然変異が各々別のヌクレオチドに対応するという理想化され たケースを示す。２つ以上の突然変異が同一ヌクレオチドであった場合、該ヌク レオチドに対応する突然変異がどの程度多く配列中に存在したかを、いずれか１ つのヌクレオチドについて得られた検出シグナルの強度から判定することができ るであろう。 実施例１ 該実験は、捕獲された２５７ｂｐ ＰＣＲフラグメント、２５７Ｏの伸長コピ ーにハイブリダイズしたプローブ（ＤＯＬ０２４）にビオチニル化ヌクレオチド を添加することを示す。捕獲および伸長は、２４量体オリゴヌクレオチドＤＯＬ ００６を担持している固体支持体上で行った。該フラグメントをこの支持体に捕 獲し、この伸長コピーを、Ａmpli Ｔaqポリメラーゼ（パーキン・エルマー （Ｐerkin Ｅlmer））および4つのデオキシリボヌクレオチドの混合物を用いて 支持体結合オリゴヌクレオチドの伸長を開始することにより作成した。該伸長産 生物を用いて、オリゴヌクレオチドＤＯＬ０２４（以下に示す）を捕獲した。 ＤＯＬ００６−5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA ＤＯＬ０２４Ｂ−5'(ビオチン)-CGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTT 該実験は、図４に示したハイブリッドが形成されるように、プローブが固相伸 長産生物の遠位（３'）末端に位置するように設計された。ＤＯＬ０２４プライ マーの配列は、ヌクレオチドｄＧが最初の５'塩基で取り込まれるようなもので ある。ビオチニル化ジデオキシＧＴＰを用いて、好結果の取り込みについて試験 し、一方、ビオチニル化デオキシＵＴＰを用いて、取り込みの特異性をチェック した。 方法 支持体（２mg）に２５７Ｏフラグメント（５００fmol）を導入し、フロースル ーカラムに配置した。該混合物を変性させた（９５℃、５分）後、捕獲した（３ ７℃、１０分）。洗浄して、取り込まれていないフラグメントを除去した後、１ ×ＰＣＲ緩衝液（ポリメラーゼ酵素を供給した）中のＡmpli Ｔaq ＤＮＡポリメ ラーゼ（２.５Ｕ／μＬ）および４つのデオキシリボヌクレオチド（各々０.２pm ol／ μＬ）の混合物を含有する伸長混合物を導入することにより、伸長を開始した。 伸長は、インキュベーション工程（７２℃、５分）の間に進み、その後、「メル ティング」および洗浄（３×９５℃、５分、次いで、８０μＬで洗浄）に付して 、支持体に結合した伸長コピーを離脱させることにより、捕獲フラグメントを除 去した(図４を参照)。該伸長コピーを、支持体上にＤＯＬ０２４(５００fmol)を 吸引し、捕獲する（３７℃、５分）ことによりプローブする。洗浄して未結合物 質を除去した後、１×ＰＣＲ緩衝液中でＡmpli Ｔaq ＤＮＡポリメラーゼ（２. ５Ｕ／μＬ）と一緒に研究下のヌクレオチド（２５pmol）を添加した。７２℃で ５分間のインキュベーションの間にヌクレオチドの取り込みを行った。広範囲に 洗浄して、取り込まれていない標識を除去した後、取り込まれた物質を、ストレ プトアビジンアルカリホスファターゼコンジュゲートの結合、次いで、ＡＭＰＡ Ｋアッセイを用いて分光光度検出法により検出した。対照は、第二プローブの捕 獲のレベルを判定するために、ヌクレオチドを添加しないＤＯＬ０２４Ｏと同一 レベルのビオチニル化捕獲プローブ（ＰＯＬ０２４Ｂ）の使用を含む。結果を図 ５に示す。 該図では、２５７Ｏの不在下または捕獲フラグメントの伸長の不在下で、ＤＯ Ｌ０２４Ｂによりシグナルがあまりまたは全く生じない。２５７Ｏの伸長は、Ｄ ＯＬ０２４Ｂの有意な捕獲を可能にする。ｄｄＧＴＰの非標識ＤＯＬ０２４Ｏへ の取り込みは、ＤＯＬ０２４Ｂ捕獲により生じたシグナルのほぼ半分のシグナル を生じる。「間違った」標識オリゴヌクレオチド（ｄＵＴＰ）の添加は、ｄｄＧ ＴＰ添加により生じたシグナルの半分未満のシグナルを生じる。 前記観察結果により導かれる検討結果は、鋳型として捕獲２５７Ｏフラグメン トを用いて、捕獲（支持体結合）オリゴヌクレオチドが伸長したということおよ び第二プローブがこれに結合することができるということである。さらに、５' ヌクレオチドのプローブへの取り込みは、配列特異的である。 実施例２ この実施例は、一本鎖核酸上の２つのプライマーの捕獲の可能性を示す。 ２４量体オリゴヌクレオチドＤＯＬ００６（以下を参照）を、粒子固体支持体 上でその５'により共有的に固定化した。 ２５７ｂｐ ＰＣＲフラグメント２５７Ｏをこの支持体上に捕獲し、Ａmpli Ｔ aqポリメラーゼ（パーキン・エルマー（Ｐerkin Ｅlmer)）および４つのデオキ シリボヌクレオチドの混合物を用いて、支持体結合オリゴヌクレオチドの伸長を 開始することにより、この伸長コピーを作成した。ビオチニル化オリゴヌクレオ チドＤＯＬ０２４Ｂおよび ＤＯＬ０３０Ｂ（以下に示す） ＤＯＬ００６−5'AGCGGATAACAATTTCACACAGGA ＤＯＬ０３０Ｂ−5'（ビオチン）-GGCGTAATCATGGTCATAGCTGTT ＤＯＬ０２４Ｂ−5'（ビオチン）-CGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTT を用いて、該伸長産生物を多様にプローブした。 該オリゴヌクレオチドは、２つの検出プローブが固相伸長産生物のいずれかの 末端にあるように設計して、形成されるべき図６に示された多様にプライムされ たハイブリッドを可能にする。 方法 ２５７Ｏフラグメント（５００pmol）を支持体（２mg）に導入し、これを、フ ロースルーカラムに配置した。該混合物を変性した（９５℃、５分）後、捕獲し た（３７℃、１０分）。洗浄して、取り込まれていないフラグメントを除去した 後、１×ＰＣＲ緩衝液（ポリメラーゼ酵素を供給した）中のＡmpli Ｔaq ＤＮＡ ポリメラーゼ（２.５Ｕ／μＬ）および４つのデオキシリボヌクレオチド（各々 ０.２pmol／μＬ）の混合物を含有する伸長混合物の導入により、伸長を開始し た。インキュベーション工程（７２℃、５分）の間に伸長が進行し、その後、「 メルティング」および洗浄（３×９５℃、５分、次いで、８０μＬでの洗浄）に 付して、支持体に結合した伸長コピーを離脱させることにより、捕獲フラグメン トを除去した。支持体上に検出プローブ５００pmool を吸引させ、捕獲する（３ ７℃、５分）ことにより、伸長コピーをプローブした。洗浄して、未結合物質を 除去した後、必要な場合には、第二プローブを同様の方法で厳密に捕獲した。次 いで、該カラムを完全に洗浄し、未結合プローブを、ストレプトアビジンアルカ リホスファターゼコンジュゲートの結合、次いで、ＡＭＰＡＫアッセイを用いる 分光光度検出法により検出した。 結果は、支持体結合オリゴヌクレオチドの伸長の不在下で両方の検出プローブ の添加により生じたシグナルがバックグラウンドと類似していることを示す図７ に示す。伸長を行った支持体結合オリゴヌクレオチドへの各検出プローブの添加 は、有意なシグナルを生じる。両方の検出プローブの添加は、同時に、個々の検 出オリゴヌクレオチドの添加により別々に生じたシグナルを超えるシグナルを生 じる。 前記観察結果から導かれた検討結果は、鋳型として捕獲２５７Ｏフラグメント を用いて捕獲（支持体結合）オリゴヌクレオチドが伸長したことおよび検出オリ ゴヌクレオチドがお互いに無関係にこの伸長産生物に結合することである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ， ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 特定塩基が核酸配列の特定位置に存在するか否かの判定方法であって、 以下の工程： （ａ）固体支持体上に固定化された形態で、研究されるべきである配列の一本 鎖試料（「試料配列」）を準備し、 （ｂ）該試料配列にプライマーをハイブリダイズさせて、３'側の特定位置に すぐ隣接している該試料の塩基に該プライマーの３'末端の塩基をハイブリダイ ズさせ、 （ｃ）特定塩基が該位置に存在する場合、試料配列の特定位置に対応する位置 でプライマーの伸長単位を提供することができる標識部分を用いて伸長条件下で 該プライマーを処理し（ここで、伸長条件は、プライマーの伸長が、標識部分に よる別の伸長による以外に試料配列の特定位置を超えて継続しないような条件で ある）、 （ｄ）支持体を洗浄して未反応標識部分および他の試薬を除去し、 次いで、 （ｅ）プライマーにおける標識部分の取り込みについて試験すること からなることを特徴とする判定方法。 ２． 標識部分が試料配列の特定位置の塩基と相補的な塩基を取り込んでいる ジデオキシヌクレオチドである請求項１記載の方法。 ３． 標識部分が判定される塩基と相補的な塩基を取り込んでいる標識ヌクレ オチドである請求項１記載の方法。 ４． 標識がビオチンである請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。 ５． 試料配列が固体支持体に共有的に結合している請求項１〜４のいずれか １項記載の方法。 ６． 共有的に結合した試料配列が、 核酸の試料（「初期核酸」）を準備し、 支持体に５'末端により共有的に結合されたオリゴヌクレオチドを有する固体 支持体を準備し、 初期核酸の鎖をオリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせ、 洗浄して、未ハイブリダイズ物質を除去し、 ハイブリダイズした初期核酸を鋳型として用いてオリゴヌクレオチドを伸長し 、 次いで、 初期核酸を変性させ、支持体から洗浄して、固定化した試料核酸を離脱させる ことにより得られた請求項５記載の方法。 ７． 固体支持体が５０〜２００ミクロンのサイズを有する粒子からなる請求 項１〜６のいずれか１項記載の方法。 ８． 粒子が、試薬が容易に導入され排出されるカラムに準備される請求項７ 記載の方法。