JPH11512433A - 熱ショックタンパク質−抗原複合体で感作した抗原提示細胞を用いる癌及び感染症の免疫療法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ペプチドおよび／または抗原成分に非共有結合で結合された熱ショックタンパク質からなる複合体を用いて感作したマクロファージおよび／または他の抗原提示細胞(APC)を投与することに基づいた、免疫応答を増強するための、並びに感染症および原発性もしくは転移性の新生物疾患を予防および治療するための、方法および組成物に関する。APC はhsp-ペプチドの複合体および／または抗原成分の存在下に in vitro でインキュベートされる。感作した細胞が、インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン−６および腫瘍壊死因子を含むがこれらに限らないサイトカインで処置したまたは処置してない患者に再注入される。

Description

【発明の詳細な説明】 熱ショックタンパク質−抗原複合体で感作した抗原提示細胞を用いる 癌及び感染症の免疫療法 本発明は米国政府の支援によってなされたものである（米国立衛生研究所認可 番号CA44786）。米国政府は本発明に対していくらかの権利を有する。 １．緒言 本発明は、熱ショックタンパク質(hsp)と抗原分子との非共有結合複合体で感 作したマクロファージを用いて、ヒトの原発性癌及び転移性癌並びに他の免疫性 疾患や感染性疾患を予防及び／または治療するための養子免疫療法の組成物及び 方法に関する。本発明の方法として養子免疫療法を実施する場合、抗原分子に非 共有結合で結合したhsp（hsp70、hsp90、gp96の単独または互いに組み合わせた もの含むが、これらに限定されるものではない）の組成物を用いてマクロファー ジを in vitro で感作し、患者へ注入して、腫瘍及び感染性因子に対する in vi vo での免疫応答を増強する。感染症及び癌に対する予防及び治療方法の実施に おいては、抗原分子と熱ショック／ストレスタンパク質(hsp)(hsp70、hsp90、gp 96の単独または互いに組み合わせたものを含むが、これらに限定されるものでは ない)との複合体を使用して、遺伝子毒性及び非遺伝子毒性因子、腫瘍並びに感 染に対する免疫応答を増強する。 ２．発明の背景 癌の養子免疫療法とは、抗腫瘍反応性を有する免疫細胞に直接的または間接的 に定着腫瘍の退縮を媒介させる目的で、該細胞を腫瘍担持宿主に投与する治療ア プローチをいう。リンパ球、特にＴリンパ球の輸注はこのカテゴリーに含まれ、 米国立癌研究所(NCI)の研究員により、末梢血リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球( TIL)、皮下リンパ小節の生検から得たＴ細胞培養物の自己再注入を利用して複数 のヒト癌の治療が行なわ れてきた（1987年９月１日発行のRosenberg，S.A.，U.S．Patent No.4,690,914; Rosenberg，S.A.ら,1988，N．England J．Med,319:1676-1680）。例えば、イン ターロイキン(IL)−２の存在下にて in vitro で増殖させた TIL を癌患者に養 子移入し、転移性メラノーマを有する選抜患者において腫瘍の退縮を達成してい る。IL-2下で増殖したメラノーマTIL は、主に特定の in vitro 抗腫瘍特性を有 する CD8⁺細胞である活性化Ｔリンパ球 CD3⁺HLA-DR⁺として同定されている。メ ラノーマ TIL 長期培養物の多くは、特定の MHC クラスＩ抗原受容体及びＴ細胞 抗原受容体に依存して自己の腫瘍を溶解する（Topalian，S.L.ら，1989，J．Imm unol．142:3714）。しかしながら、他の種類の腫瘍から誘導された TIL の研究 では、細胞傷害性または増殖性の抗腫瘍免疫特異性についてはごくわずかしか明 らかになっていない（Topalian，S.L．ら，1990，Important Advances in Oncol ogy，V.T．DeVita，S.A．Hellman及びS.A．Rosenberg編，J.B．Lippincott，Phi ladelphia，pp.19-41）。さらに、NCI グループによって提唱された高用量 IL-2 +活性化リンパ球を用いる治療は、その毒性［高熱、激しい悪寒、血圧降下、毛 細血管漏洩症(capillary leak syndrome)による内皮壁の損傷、及び不整脈や心 筋梗塞といった各種の有害な心臓系症状(adverse cardiac event)を含む］が顕 著であった(Rosenberg S.A.ら，1988，N．England J．Med．319:1676-1680)。 ２．１熱ショック／ストレスタンパク質hsp70、hsp90及びgp96の腫瘍特異的免疫 原性 Srivastava らは、メチルコラントレンにより誘発された近交マウスの肉腫に 対する免疫応答を示した（1988，Immunol．Today9:78-83）。これらの研究にお いて、これらの腫瘍のそれぞれ異なる免疫原性を引き起こす分子は、96kDaの細 胞表面糖タンパク質（gp96）および84〜86kDaの細胞内タンパク質と同定される ことが判明した（Srivastava，P.K.ら，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA83:3 407-3411; Ullrich，S． J.ら，1986，Proc．Natl．Acad．Sci．USA83:3121-3125）。ある特定の腫瘍から 単離されたgp96またはp84/86でマウスを免疫すると、そのマウスは、その特定の 腫瘍に対しては免疫されたが、抗原的に異なる腫瘍に対しては免疫されなかった 。gp96およびp84/86をコードする遺伝子の単離および特徴づけから、それらの間 の有意な相同性が示され、gp96およびp84/86は、それぞれ、同じ熱ショックタン パク質の小胞体およびサイトゾルの等価体であることが示された（Srivastava， P.K.ら，1988，Immunogenetics28:205-207; Srivastava，P.K.ら，1991，Curr． Top．Microbiol．Immunol.167:109-123）。さらに、hsp70は、それが単離された 腫瘍に対する免疫は惹起するが、抗原的に異なる腫瘍に対する免疫は惹起しない ことが示されている。しかしながら、ペプチドが枯渇したhsp70は、その免疫原 性活性を失うことが判明した（Udono，M.およびSrivastava，P.K.，1993，J．Ex p．Med.178:1391-1396）。これらの観察は、これらの熱ショックタンパク質は、 それら自体が免疫原性なのではなく、癌に対して特異的な免疫を惹起する抗原性 ペプチドの担体であることを示唆している（Srivastava，P.K.，1993，Adv．Can cer Res.62:153-177）。 ２．２免疫応答に関与する細胞 免疫系の細胞は、多能性幹細胞より、２つの主要な分化系統、即ち、a)リンパ 球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞）を産生するリンパ系統、及びb)食 細胞（単球、マクロフアージ及び好中球）並びに他の補助細胞（抗原提示細胞、 血小板、肥満細胞及び内皮細胞）を産生する骨髄系統を経て生じる(Roitt I，Br ostoff J.及びMale D.編，1993,Immunology，Ch．11，Mesby London)。 骨髄系統では、多能性幹細胞は、顆粒球、赤血球、単球及び巨核球のもととな り得るコロニー形成単位(CFU)を生成する(CFU-GEMM)。顆粒球及び単球をさらに 成熟させるには、インターロイキン−３と顆粒球−マクロファージ−コロニー刺 激因子(GM-CSF)が必要である。従って、末梢 血白血球中に存在する単球は、in vitro で GM-CSF にて活性化することが可能 であり、マクロファージとなることができる(Grandstein，K.H.ら，1986，Scien ce 232:506-508)。他のサイトカイン（例えば、IL-1、IL-4及びIL-6）は単球が マクロファージへ分化するのを促進する(Clark S.C.及び Kamen R.，1987，Scie nce 236:1229-1237)。 従って、マクロファージは骨髄で骨髄系幹細胞から生じる。マクロファージは 単球として血液中を循環し、他の組織のうち肝臓、脾臓及び肺において最終的な 分化を行い成熟組織マクロファージとなる。マクロファージは主要なエフェクタ ー細胞であると考えられており、Ｔ−リンパ球及びＮＫ細胞等の白血球も細胞媒 介性細胞傷害性の一部を担う。 ３．発明の概要 本発明は、抗原分子に非共有結合で結合した熱ショックタンパク質(hsp)の複 合体で感作したマクロファージ及び／または他の抗原提示細胞(APC)を含む組成 物、並びにこのような組成物を製剤学的に許容し得る担体に含ませて、癌または 感染症に罹患しているヒトに投与することを含む方法を提供するものである。マ クロファージを感作するのに適した複合体を構成する好適な hsp としては、hsp 70、hsp90及びgp160またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定さ れるものではない。hsp と抗原分子を含む複合体で感作されたこのような細胞を 、本明細書では「hsp-感作」細胞という。 本発明は、宿主の免疫能力及び免疫エフェクター細胞の活性を増強させること により、癌及び感染症の養子免疫療法を行なう方法を含む。hsp で感作したマク ロファージ及び他の抗原提示細胞(APC)（例えば、樹状細胞及びＢ細胞（Ｂリン パ球））を用いる養子免疫療法は、腫瘍細胞及び／または抗原成分に対する特異 免疫を誘発し、この場合、腫瘍塊の退縮または免疫性疾患もしくは感染症の治療 を促進する。 本発明は、本発明の養子免疫療法を用いる癌、感染症及び免疫性疾患の予防方 法も含む。 別の態様では、該方法は、場合によっては、生物学的応答変更因子（例えば、 インターフェロン(IFN)−α、IFN-γ、インターロイキン(IL)−２、IL-4、IL-6 、腫瘍壊死因子(TNF)または他のサイトカイン増殖因子等のサイトカイン）を投 与することをさらに含む。 ４．図面の簡単な説明 図１：N1 細胞より誘導した gp96 調製物で感作した PEC は、Kb-拘束性(Kb-r estricted)かつ CD8媒介性の様式で VSV-特異的細胞傷害性Ｔ−リンパ球(CTL)に よって認識される。EL4細胞より誘導した gp96 をパルスした PEC は認識されな い。（A）C57BL/6マウスからの Pristane-誘導PEC(1×10⁴)とC57BL/6マウスから の VSV ペプチド特異的 CTL(5×10⁴)及び VSV ペプチド特異的 CTL(5×10⁴)を、 N1細胞またはEL4細胞から誘導した gp96(2または10μg/ml)の存在下、96ウェル Ｕ底プレート中で37℃にて一緒に培養した。24時間後、上清を回収し、WEHI164 細胞を用いる細胞傷害性アッセイによりTNF-α産生を測定した。WEHI164細胞を 平底96ウェルプレートに播種した(2,500/ウェル)。連続希釈した PEC-CTL混合培 養物の上清を添加した。対照として、別のウェル中でγ-TNF-αを WEHI164 と共 に培養した。４時間37℃で培養した後、50μlMTT(1mg/ml)を加え、４時間インキ ュベートし、次いで100μlのプロパノール-0.05M HCl を添加した。O.D.(590nm) を直ちに測定した。WEHI164細胞の50％が殺傷される試料濃度を希釈点と比較し て計算した。（B）gp96-感作マクロファージが CTL アッセイにおいて標的とし て作用する能力を試験した。PEC(5×10⁶/ml)を、Nl細胞（黒丸）またはEL4細胞 （白丸）から誘導した gp96(10μg/ml)、あるいは陽性対照として VSVヌクレオ キャプシドK^bエピトープペプチド(10μM)（黒三角）で２時間37℃にてパルスし （培地対照（白三角））、次いで⁵¹Crで1.5時間標識した。これらの細胞を、VSV -特異的 CTL を用いる４時間⁵¹Cr-放出アッセイにおいて標的として使用した。 （C）抗 CD4 mAb(GK1.5)腹水症（白丸）、抗 CD8 mAb(YTS1694)（黒四角）、抗 H-2K^b mAb(Y3)（黒丸）、 抗 H-2D^b mAb(B22.249)（白三角）（American Type Culture Collection，Washi ngton，D.C.より入手）またはRPMI対照（＊）を、エフェクター細胞及びNl gp96 でパルスした⁵¹Cr-標識 PEC と同時にCTL アッセイに添加した(E/T 比＝10)。 図２：メチルコラントレン(Meth)-A-誘発腫瘍細胞 1×10⁵細胞でチャレンジし た５群のマウスにおける平均腫瘍直径として測定される腫瘍増殖。各群のマウス には下記の処理を行なった。Ａ．緩衝溶液の皮下注射；Ｂ．肝臓組織から誘導し た gp96-ペプチド複合体９μgを含む皮下注射；Ｃ．正常な肝臓から誘導した gp 96-ペプチド複合体９μgで感作した 5×10⁶腹腔浸出細胞(PEC)の腹腔内注射（肝 臓 gp96＋PEC）；Ｄ．Meth A 腫瘍細胞から誘導した gp96-ペプチド複合体９μg を含む皮下注射；Ｅ．Meth A 腫瘍細胞から誘導した gp96-ペプチド複合体９μg で感作した 5×10⁶PECの腹腔内注射(Meth A gp96＋PEC)。 ５．発明の詳細な説明 本発明は、抗原分子に非共有結合で結合した熱ショックタンパク質(hsp)の複 合体で感作した抗原提示細胞(APC)を含む組成物、並びにこのような組成物を製 剤学的に許容し得る担体に含ませ、癌、感染症または免疫性疾患に罹患している 個体（好ましくはヒト）に投与することを含む治療及び予防方法に関するもので ある。APC は、当業界で公知の抗原提示細胞から選択することができる。例とし ては、マクロファージ、樹状細胞、Ｂリンパ球、及びこれらの組み合わせが挙げ られるが、これらに限定されるものではない。マクロファージが好ましい。マク ロファージ及び／または APC を感作するのに適した複合体を構成する好適な hs pとしては、hsp70、hsp90、gp96及びgp100またはこれらの組み合わせが挙げられ るが、これらに限定されるものではない。好適な態様では、感作細胞はヒト細胞 である。別の好適な態様では、細胞を感作するのに用いる複合体には、ヒトの h sp 及びヒトの抗原分子が含まれる。hsp-感作細胞は、患者に対して自己由来ま たは非自己由来（例えば、同種異 系）であり得る。 個体に対して自己由来である細胞の好適な使用では、養子免疫療法においてリ ンパ球、マクロファージまたは他の APC 等の自己免疫細胞を用いることにより 、主要な倫理上の問題（養子移入用の免疫細胞のドナーとして誰を選択すべきか の議論）が回避される。免疫細胞を得るために、正常な個体はもとより癌患者で あっても免疫することはできない。これは、不活化した抗原性腫瘍が、免疫され たドナーの個体中で増殖する危険があるためである。自己免疫細胞を用いること により回避される他の問題は、治療が成功しなかった際に致命症となり得る移植 片対宿主病である。 本発明の養子免疫療法は、hsp-抗原分子複合体と一緒にインキュベートするこ とによって免疫細胞の活性化を可能にし、腫瘍または感染性因子に対する in vi tro での反応性の測定を可能にする。この in vitro での追加免疫(boost)及び これに続くクローン選択及び／または増殖、並びに患者への注入により、有用な 治療／予防戦略が構成される。 本明細書中で用いる「抗原分子」とは、hsp が in vivo で内在的に会合して いるペプチド（例えば、感染細胞または前癌状態もしくは癌状態の組織において ）並びに外因性抗原／免疫原（即ち、hsp が in vivo で複合体を形成していな い）及び抗原性／免疫原性断片及びそれらの誘導体のことをいう。 本発明の実施において有用な熱ショックタンパク質（ストレスタンパク質とも 呼ぶ）は、以下のいずれかの基準を満たす任意の細胞性タンパク質から選択する ことができる。これは、細胞がストレスのある刺激に暴露された時、その細胞内 濃度が増加するタンパク質であり、これは他のタンパク質またはペプチドに結合 することができ、これはアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）または低ｐＨの存在下で 結合したタンパク質またはペプチドを放出することができ、または、これは、上 記のいずれかの性質を有する任意の細胞性タンパク質と少なくとも３５％の相同 性を示すタンパク質である。 同定された最初のストレスタンパク質は、熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）で ある。その名前が示すように、ｈｓｐは、熱ショックに応答して細胞により合成 される。今日まで、分子量に基づき、３つの大きなファミリーのｈｓｐが同定さ れている。このファミリーは、ｈｓｐ６０、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ９０と呼ばれ、 番号は、ストレスタンパク質のおよその分子量（キロダルトン）を反映する。こ れらのファミリーの多くのメンバーは、他のストレスのある刺激（例えば、栄養 不足、代謝破壊、酸素ラジカル、および細胞内病原体による感染、があるが、こ れらに限定されない）に応答して誘導されることがわかった（Welch，May 1993 ，Scientific American 56-64; Young，1990，Annu．Rev．Immunol．8: 401-420 ; Craig，1993，Science 260: 1902-1903; Gething ら、1992，Nature 355: 33- 45;およびLindquistら、1988，Annu．Rev．Genetics 22: 631-677を参照された い、これらの開示内容は参考のため本明細書に組み込まれる）。これらの３つの ファミリーのすべてに属するｈｓｐ／ストレスタンパク質は、本発明の実施に使 用できると考えられる。 主要なｈｓｐは、ストレスを受けた細胞中で高レベルで蓄積されるが、ストレ スを受けていない細胞では低レベルないし中レベルで存在する。例えば、誘導性 の高い哺乳動物のｈｓｐ７０は、通常の温度では検出できないが、熱ショックを 受けた細胞では最も活発に合成されるタンパク質の１つになる（Welch ら、1985 ，J．Cell．Biol．101：1198-1211）。これに対して、ｈｓｐ９０およびｈｓｐ ６０タンパク質は、すべてではないがほとんどの哺乳動物の細胞中で通常の温度 で豊富に存在し、熱によりさらに誘導される（Lai ら、1984，Mol．Cell．Biol ．4: 2802-10; van Bergen en Henegouwen ら、1987，Genes Dev．1: 525-31） 。 熱ショックタンパク質は現存する最も高度に保存されたタンパク質の中にある 。例えば、DnaK、E.coli からの hsp70 は表皮剥離物(excoriate)からの hsp70 タンパク質と約50％のアミノ酸配列同一性を有す る(Bardwell ら，1984，Proc.Natl.Acad.Sci．81:848-852)。また、hsp60 ファ ミリーおよび hsp90 ファミリーは同様に高レベルのファミリー内保存を示す(Hi ckey ら，1989，Mol.Cell.Biol．9: 2615-2626; Jindal，1989，Mol.Cell.Biol ．9:2279-2283)。加えて、hsp60 ファミリー、hsp70 ファミリーおよびhsp90 フ ァミリーは、例えば、35％より大きいアミノ酸同一性を有する配列中のストレス タンパク質に関係するタンパク質を含むが、その発現レベルはストレスにより変 化しないことが発見された。それ故、本明細書に使用されるストレスタンパク質 の定義は、細胞中の発現レベルがストレスに満ちた刺激に応答して増進される３ 種のファミリーの構成員と少なくとも35％〜55％、好ましくは55％〜75％、最も 好ましくは75％〜85％のアミノ酸同一性を有する、その他のタンパク質、突然変 異タンパク質、これらの類似体、および変異体を含むことが意図されている。こ れらの３種のファミリーに属するストレスタンパク質の精製が以下に記載される 。 本発明に従って、APC を感作するために使用される hsp-抗原分子複合体は、 １分子の hsp と哺乳類において免疫応答を誘導できる１分子を含むいかなる複 合体を含んでもよい。抗原性／免疫原性分子は hsp と非共有結合で会合する。 好適な複合体は、hsp-60ペプチド複合体、hsp70-ペプチド複合体、hsp-90ペプチ ド複合体などがあるがこれらに限られるものではない。ここで、hsp-ペプチド複 合体は in vivo に存在し、細胞から単離されるものである。特定の実施態様に おいては、複合体は、真核細胞の小胞体中に存在する、gp96 と呼ばれ、細胞質 の hsp90群に関連する hsp を含んでなる。 hsp は患者にとって同種異系であり得るが、好適な実施態様においては、hsp は投与された患者由来である。hsp および／または抗原分子は天然の源から精製 するか、化学的に合成するかまたは組み換え技術を用いて産生することができる 。 本発明は、宿主の免疫エフェクター細胞の免疫担当能を高めることによる、癌 、感染症および免疫学的障害に対する養子免疫療法ための方 法を包含する。マクロファージと他の APC、例えば、樹状細胞と B細胞、感作 h sp と抗原分子を用いた養子免疫療法は、それぞれ、腫瘍細胞および／または感 染因子に対する特異的免疫を（抗原分子の同一性に依存して）誘導し、腫瘍の容 積の縮小および／または感染性疾患の退行を生じさせる。 本発明の hsp 複合体感作マクロファージおよび／または APC による養子免疫 に応答する癌には、ヒト肉腫および癌腫、例えば、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉 腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リン パ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸 癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗 腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細 胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌 、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、 髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏 突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病（例えば、急 性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病、骨 髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）；慢性白血病(慢性骨髄性(顆粒 球性)白血病および慢性リンパ性白血病)；および真性赤血球増加症、リンパ腫( ホジキン病および非ホジキン病)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクロ グロブリン血症、およびＨ鎖病が含まれるが、これらに限定されるものではない 。 本発明はまた、ある容器中に外因性の抗原分子に非共有結合で結合した hsp からなる複合体を含んでなるキットを提供する。このキットは、第２の容器中に ヒトの APC をさらに含んでもよい。 5.1. APC 感作用複合体 本明細書に記載した方法に従い、hsp または MHC 抗原と内因的に複合体を形 成する免疫原性分子または抗原分子と複合体を形成した hsp で APC を感作し、抗原分子として使用することができる。例えば、異なる腫瘍特異 的抗原（例えば、チロシナーゼ、gp100、メラン-A(melan-A)、gp75、ムチン等） およびウイルスタンパク質に対して応答する細胞障害性 T 細胞の応答を刺激す るようなペプチドを調製してもよい。このようなウイルスタンパク質としては、 免疫不全症ウイルスＩ型（HIV-I）、ヒト免疫不全症ウイルスII型(HIV-II)、A型 肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、インフルエンザ、水痘ウイ ルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型（HSV-I）、単純ヘルペスウ イルスII型（HSV-II）、牛疫、ライノウイルス、エコウイルス、ロタウイルス、 RSV(respiratory syncytial virus)、パピローマウイルス、パポバウイルス、サ イトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス(hunta virus)、コクサッキーウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイル スおよびポリオウイルスなどのタンパク質が含まれるが、これらに限定されるも のではない。抗原分子が in vivo で hsp と非共有結合で複合体を形成したペプ チドである実施態様においては、この複合体は細胞から単離され得るものである か、または、hsp および抗原分子各々の精製調製物から in vitro で産生され得 るものである。 別の特定の実施態様においては、癌（例えば、各種の腫瘍）の抗原または感染 因子の抗原（例えば、ウイルス抗原、細菌抗原等）は、天然の源から精製して得 るか、化学的に合成するか、または非共有結合でhsp と複合体を形成させるなど の以下に示すような in vitro の手順により、遺伝子組み換えによって得ること ができる。 使用される hsp-抗原分子複合体が in vivo で細胞中にて産生される実施態様 においては、5.1.1〜5.1.3節以下に記載したような典型的な精製手順を採用する ことができる。また、in vitro で hsp と複合体を形成することによって抗原分 子を使用しようとする実施態様では、このような使用のために hsp を内因性の hsp-ペプチド複合体から、ATP の存在下または低 pH で精製する（または化学的 に合成するか組み換え技術 で産生する）ことができる。本明細書に記載のプロトコルを使用して、hsp-ペプ チド複合体、または hsp のみを、例えば、組織、単離された細胞などのあらゆ る真核細胞、または予め選択された細胞内病原体に感染した不死化真核細胞系、 腫瘍細胞または腫瘍細胞系から単離してもよい。 5.1.1. hsp70- ペプチド複合体の調製および精製 hsp70-ペプチド複合体の精製は既に記載されている。例えば、Udonoら，1993 ，J.Exp.Med．178:1391-1396を参照のこと。限定ではなく例として示される、使 用し得る操作は以下のとおりである。 最初に、腫瘍細胞を５mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH7、150mM NaCl、２mMCa Cl₂、２mM MgCl₂および１mM フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)からな る１×溶解緩衝液３倍容中に懸濁する。次に、>99 ％の細胞が顕微鏡試験により 測定して溶解されるまで、ペレットを氷の上で音波処理する。音波処理の別法と して、細胞を機械剪断により溶解してもよく、このアプローチでは細胞を典型的 には 30mM 重炭酸ナトリウム pH7.5、１mM PMSF 中に再度懸濁し、氷の上で20分 間インキュベートし、次に>95 ％の細胞が溶解されるまでダウンスホモジナイザ ー中で均一にする。 次に溶解産物を 1,000g で10分間にわたって遠心分離し、非破壊細胞、核およ びその他の細胞破砕物を除去する。得られた上澄みを 100,000g で90分間にわた って再度速心分離し、上澄みを回収し、次に２mM Ca²⁺および２mM Mg2+を含むリ ン酸緩衝塩水(PBS)で平衡化した Con A Sepharose と混合する。細胞が機械剪断 により溶解された時、上澄みをCon A Sepharose との混合の前に等容積の２×溶 解緩衝液で希釈する。次に上澄みを４℃で２〜３時間にわたって Con A Sepharo se に結合させる。結合できない物質を回収し、10mM Tris-酢酸pH7.5、0.1mM ED TA、10mM NaCl、１mM PMSF に対し 36 時間にわたって透析する（３回、毎回 10 0 倍容）。次に透析物を 17,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で20分間にわた って遠心分離する。次に得られた上澄みを回収し、 20mM Tris-酢酸pH7.5、20mM NaCl、0.1mM EDTAおよび15mM２−メルカプトエタノ ール中で平衡化した Mono Q FPLC カラムに負荷する。次にカラムを 20mM〜500m M NaCl 勾配で展開し、溶離した画分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリル アミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により分画し、適当な抗 hsp70 抗体（例えば、 StressGen からのクローン N27F3-4 からのもの）を使用してイムノブロッティ ングにより特性決定する。 抗 hsp70 抗体と強い免疫反応性の画分を貯溜し、hsp70-ペプチド複合体を硫 酸アンモニウム、詳しくは50％-70 ％硫酸アンモニウムカットで沈殿させる。次 に得られた沈殿を 17,000 rpm（SS34 Sorvall ローター）で遠心分離により回収 し、70％硫酸アンモニウムで洗浄する。次に洗浄された沈殿を可溶化し、残留硫 酸アンモニウムを Sephadex（登録商標）G25 カラム(Pharmacia)によるゲル濾過 により除去する。必要により、こうして得られた hsp70 調製物を上記のような Mono Q FPLC カラムにより再度精製し得る。 この方法を使用して、hsp70-ペプチド複合体を明らかに均一になるまで精製し 得る。典型的には、hsp70-ペプチド複合体 1mg が細胞／組織 1g から精製し得 る。 本発明はさらに、hsp70-ペプチド複合体の精製のための新規かつ迅速な方法に ついて記載する。この改良された方法では、固体基層に付着させた ADP（例えば 、ADP-アガロース）を用いるクロマトグラフィーが使用される。得られた hsp70 調製物は純度が高く、ペプチドが全くない hsp70 の収量もまた、約 10 倍以上 に増加する。また、ADP の代わりに加水分解されない ATP の類似体を用いるク ロマトグラフィーを、hsp70-ペプチド複合体を精製するためのクロマトグラフィ ーで使用することができる。ADP-アガロースクロマトグラフィーによる hsp70- ペプチド複合体の精製は、一例として以下のように行うことができるが、これに 限定されるものではない。すなわち、Meth A 肉腫細胞（5×10⁸個）を低張緩衝 液中でホモジナイズし、溶解物を 100,000g で90分間、4℃で遠心 した。上清を２つに分け、ADP-アガロースカラムまたは ATP-アガロースカラム にアプライした。カラムを緩衝液で２回洗浄し、各々３mM のADP または３mM の ATP で溶出した。溶出された画分を SDS-PAGE で分析した。いずれの場合でも 、明らかに均一な hsp70 調製物が得られた。しかしながら、各々の調製物をペ プチドの存在について試験したときに、ADP-結合／溶出 hsp70 調製物がペプチ ドと結合していることが見出されたが、ATP-結合／溶出 hsp70 調製物は結合し ていなかった。 5.1.2. hsp90- ペプチド複合体の調製および精製 限定ではなく例として示される、使用し得る操作は以下のとおりである。 最初に、腫瘍細胞を５mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7)、150mM NaCl、２mM Ca Cl₂、２mM MgCl₂および１mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)からな る１×溶解緩衝液３倍容中に懸濁する。次に、>99 ％の細胞が顕微鏡試験により 測定して溶解されるまで、ペレットを氷の上で音波処理する。音波処理の別法と して、細胞を機械剪断により溶解してもよく、このアプローチでは細胞を典型的 には 30mM 重炭酸ナトリウム pH7.5、１mM PMSF 中に再度懸濁し、氷の上で20分 間インキュベートし、次に>95 ％の細胞が溶解されるまでダウンスホモジナイザ ー中で均一にする。 次に溶解産物を 1,000g で10分間にわたって遠心分離して、非破壊細胞、核お よびその他の細胞破砕物を除去する。得られた上澄みを 100,000g で 90 分間に わたって再度遠心分離し、上澄みを回収し、次に２mM Ca²⁺および２mM Mg²⁺を含 む PBS で平衡化した Con A Sepharose と混合する。細胞が機械剪断により溶解 された時、上澄みを Con A Sepharose との混合の前に等容積の２×溶解緩衝液 で希釈する。次に上澄みを４℃で２〜３時間にわたって Con A Sepharose に結 合させる。結合できない物質を回収し、10mM Tris-酢酸pH7.5、0.1mM EDTA、10m M NaCl、1mM PMSF に対し 36時間にわたって透析する（３回、毎回100 倍 容）。次に透析物を 17,000 rpm（Sorvall SS34ローター）で20分間にわたって 遠心分離する。次に得られた上澄みを回収し、溶解緩衝液で平衡した Mono Q FP LC カラムに負荷する。次にタンパク質を200mM〜600mM NaCl の塩勾配で溶離す る。 次に溶離された画分を SDS-PAGEに より分画し、抗hsp90 抗体、例えば、3G3 （Affinity Bioreagents）を使用して、hsp90-ペプチド複合体を含む画分をイム ノブロッティングにより同定する。この操作を使用して、hsp90-ペプチド複合体 が明らかに均一になるまで精製し得る。典型的には、hsp 90-ペプチド複合体150 -200 μg が細胞／組織１gから精製し得る。 5.1.3. gp96- ペプチド複合体の調製および精製 限定ではなく例として示される、使用し得る操作は以下のとおりである。 腫瘍のペレットを 30mM 重炭酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)および1mMPMSF から なる緩衝液３倍容中に再度懸濁し、細胞を氷の上で20分間膨潤させる。次に>95 ％の細胞が溶解されるまで、細胞ペレットを氷の上でダウンスホモジナイザー中 で均一にする（ホモジナイザーの適当なクレアランスはそれぞれの細胞型に応じ て変化するであろう）。 溶解産物を 1,000g で10分間にわたって遠心分離して、非破壊細胞、核および その他の破砕物を除去する。次にこの遠心分離工程からの上澄みを 100,000g で 90 分間にわたって再度遠心分離する。gp96-ペプチド複合体が 100,000のペレ ットまたは上澄みから精製し得る。 上清から精製する場合、上清を同容量の 2X細胞溶解緩衝液で希釈し、次いで 4℃において、この上清を、2mM Ca²⁺および 2mM Mg²⁺を含有する PBS と平衡状 態にある Con A Sepharose と、２時間〜３時間混合する。この後、スラリーを カラムに充填し、OD₂₈₀がベースラインまで低下するまで 1X細胞溶解緩衝液で洗 浄する。次に、2mM Ca²⁺および 2mM Mg²⁺を含有する PBS に溶解したカラム床容 積の 1/3の量の 10% α-メチルマンノシド(α-MM)でカ／ラムを洗浄し、一枚のパラフィルムでカラム をシールし、37℃で 15 分間インキュベートする。次に、カラムを室温まで冷却 し、カラムの底からパラフィルムを除去する。カラム容積の５倍量のα-MM緩衝 液をカラムに供給し、溶出液を SDS-PAGE で分析する。典型的には、得られる物 質の純度は約 60%〜95%であるが、この純度は、細胞のタイプおよび使用した組 織対溶解緩衝液比に依存する。次に、このサンプルを、5mMリン酸ナトリウムを 含有する緩衝液(pH7)と平衡状態にある Mono Q FPLC カラム(Pharmacia)に供給 する。次に、0M〜1M NaCl濃度勾配を用いてタンパク質をカラムから溶離させる と、400mM〜550mM NaCl の範囲で gp96 画分が溶離する。 しかしながら、２つの追加工程を単独でまたは組合せて利用することにより、 この手順を変更し、見掛け上均一な gp96 ペプチド複合体が確実に形成されるよ うにしてもよい。一方の任意工程では、Con A 精製工程の前に硫酸アンモニウム を沈殿させ、他方の任意工程では、Con A 精製工程の後かつ Mono Q FPLC 工程 の前に DEAE-Sepharose 精製を行う。 第一の任意工程において、100,000g 遠心分離工程により得られた上清に硫酸 アンモニウムを添加することにより、50%硫酸アンモニウムの最終濃度となるよ うにする。氷水の入ったトレー中に配置されたビーカー中で溶液を穏やかに攪拌 しながら、硫酸アンモニウムをゆっくりと添加する。4℃において溶液を約 1/2 時間〜12時間攪拌し、得られた溶液を 6,000rpm で遠心分離する(Sorvall SS34 ロータを使用)。この工程で得られた上清を取り出し、硫酸アルミニウムを添加 して70%硫酸アルミニウム飽和液とし、6,000rpm で遠心分離する（Sorvall SS34 ロータを使用)。この工程で得られたペレットを回収し、70%硫酸アンモニウムを 含有する PBS 中に懸濁させてペレットを洗浄する。この混合物を 6,000rpm で 遠心分離し(Sorvall SS34ロータを使用)、2mM Ca²⁺およびMg²⁺を含有する PBS 中にペレットを溶解させる。15,00 0rpm で簡単な遠心分離を行って未溶解物質を除去する(Sorvall SS34ロータを使 用)。次に、この溶液を Con A Sepharose と混合し、先に述べた手順を繰り返す 。 第２の任意工程において、Con A カラムから溶離した gp96 含有画分をプール し、透析によりまたは好ましくは Sephadex G25 カラムを用いた緩衝液交換によ り、緩衝液を、5mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7、300mM NaCl)と交換する。緩衝 液を交換した後、溶液を、5mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7、300mM NaCl)と予 め平衡状態にある DEAE-Sepharose と混合する。このタンパク質溶液およびビー ズを１時間穏やかに混合し、カラムに注ぐ。次に、280nM における吸光度がベー スラインまで低下するまで、5mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7、300mM NaCl)を 用いて、カラムを洗浄する。次に、5倍容量の 5mM リン酸ナトリウム(pH7、700m M NaCl)を用いて、結合タンパク質をカラムから溶離させる。タンパク質含有画 分をプールし、5mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7)で希釈して塩濃度を 175mM ま で減少させる。次に、得られた物質を、5mM リン酸ナトリウム緩衝液(pH7)と平 衡状態にある Mono Q FPLC カラム(Pharmacia)にかけ、先に記載したように、Mo no Q FPLC カラム(Pharmacia)に結合したタンパク質を溶離させる。 しかしながら、当業者は、第２の任意工程を精製プロトコルに組入れることの 利点を普通の実験により評価できると考えられる。更に、任意工程のいずれかを 追加することの利点は出発原料の供給源に依存するであろうと考えられる。 gp96画分を 100,000gペレットから単離する場合、1%デオキシコレートまたは 1%オクチルグルコピラノシドのいずれかを含有する５倍容量の PBS(ただし、Mg^{2 +} および Ca²⁺は含まれない)中にペレットを懸濁させ、氷上で１時間インキュベ ートする。この懸濁液を 20,000g で30 分間遠心分離し、得られた上清を PBS の数種の変化体(この場合にも、Mg²⁺およびCa²⁺は含まれない)に対して透析を行 い、洗浄剤を除去する。透析液を 100,000g で90分間遠心分離し、上清を回収し 、この 上清にカルシウムおよびマグネシウムを添加してそれぞれ2mMの最終濃度となる ようにする。次に、未改良法または改良法のいずれかによりサンプルを精製し、 100,000g 上清から gp96-ペプチドを単離する。 この手順を用いて、見掛け上均一になるまで gp96-ペプチドを精製することが できる。1g細胞／組織から約 10μg〜20μgのgp96が単離される。感染性の疾患 感染性の疾患を有する患者の治療または感染性の疾患を予防することが望まし い別の実施態様では、上記の5.1.1〜5.1.3節で記載した方法を使用して、hsp-ペ プチド複合体を感染性の生物に感染した細胞（例えば、細胞系からまたは患者か ら得た細胞）から単離する。このような感染性の生物には、以下に詳細に記載す るように、ウイルス、細菌、原生動物、真菌、および寄生体が含まれるが、これ らに限定されるものではない。 5.1.4 Hsp またはMHC抗原の内因性複合体からの抗原分子の単離 抗原ペプチドおよび／または成分が内因性の、in vivo の hsp 複合体から、A TP の存在下でまたは低pH で溶出できることが発見された。これらの実験条件を 使用して、ペプチドおよび／または抗原性成分を、潜在的に有用な抗原決定基を 有する細胞から単離することができる。単離後、各抗原ペプチドのアミノ酸配列 を従来のアミノ酸配列決定の方法論を用いて決定してもよい。ついで、このよう な抗原分子を化学合成または組み換え法によって、in vitro で産生し、精製し 、hsp と複合体形成させることができる。 同様に、潜在的免疫原性ペプチドを当業界で周知の技術を用いてMHC-ペプチド 複合体から溶出させてもよい(Falk，K．et al.，1990 Nature 348:248-251; Ell iott，T.，et al.，1990，Nature 348:195-197; Falk，K.，et al.，1991，Natu re 351:290-296)。 こうして、潜在的免疫原性ペプチドまたは抗原性ペプチドを、引き続き抗原分 子として使用するために、内因性ストレスタンパク質−ペプチド複合体または内 因性 MHC-ペプチド複合体から、hsp に in vitro で複合体を形成させることに よって単離することができる。ペプチドおよび／または抗原性成分をこれらの複 合体のいずれかから単離するための典型的なプロトコルは、以下のようなもので ある。 5.1.4.1. ストレスタンパク質‐ペプチド複合体由来のペプチド ストレスタンパク質‐ペプチド複合体からペプチドを溶離させるために、２つ の方法が使用できる。一方の手法では、ATP の存在下でストレスタンパク質‐ペ プチド複合体をインキュベートする。他方の手法では、低 pH緩衝液中で該複合 体をインキュベートする。 簡単に述べれば、対象の複合体を Centricon 10 アセンブリ（Milllipore)に かけて遠心分離し、複合体にゆるく結合した低分子量物質を除去する。高分子量 画分は、取り出して SDS-PAGE で分析することができ、一方、低分子量画分は、 以下に示すように HPLC で分析することができる。ATP インキュベーションプロ トコルでは、高分子量画分中のストレスタンパク質−ペプチド複合体を、10mM A TP と共に室温で30分間インキュベートする。低pHプロトコルでは、ストレンタ ンパク質‐ペプチド複合体に酢酸またはトリフルオロ酢酸を添加して最終濃度を 10%(体積比)とし、室温でまたは熱湯浴中でまたはこれらの間の任意の温度で、 混合物を10分間インキュベートする(Van Bleek, et al.，1990，Nature 348:213 -216;および Li，et al.，1993,EMBO Journal 12:3143-3151を参照されたい)。 得られたサンプルは、先に述べたように、Centricon 10アセンブリにかけて遠 心分離する。高分子量画分を回収する。残存する高分子量ストレスタンパク質− ペプチド複合体を、ATP を用いてまたは低pHで再びインキュベートすると、残存 するペプチドを取り出すことができる。 得られた低分子量画分は、プールし、エバポレーションにより濃縮し、0.1%ト リフルオロ酢酸(TFA)に溶解する。次に、例えば、0.1%TFA と平衡状態にある VY DAC CTB 逆相カラムを用いて、溶解した物質を逆相高圧液体クロマトグラフィー (HPLC)T にかけて分別する。次に、0.1% TFA において 0%〜80%アセトニトリル の直線勾配を用いてカラムを展開することにより、約0.8ml／分の流速で結合物 質を溶離させる。ペプチドの溶離をOD₂₁₀によりモニタすることにより、ペプチ ドを含有する画分を回収することができる。 5.1.4.2. MHC- ペプチド複合体由来のペプチド MHC 分子からの有望な免疫ペプチドの単離は、当該技術分野で周知であるので 、本明細書中では詳述しない(Falk，et al.，1990,Nature 348:248-251; Rotzsc he，et al.，1990，Nature 348:252-254; Elliott，et al.，1990,Nature 348:1 91-197; Falk，et al.，1991，Nature 351:290-296; Demotz，et al.，1989，Na ture 343:682-684; Rotzsche，et al.，1990，Science 249:283-287を参照され たい)。これらの開示内容は、引用により本明細書中に含まれるものとする。 簡単に述べれば、MHC‐ペプチド複合体は、従来のイムノアフィニティ法によ り単離することができる。この場合、アセトニトリル中において、約0.1% TFA の存在下で複合体をインキュベートすることにより、ペプチドを MHC-ペプチド 複合体から溶離させることができる。先に記載したように、溶離したペプチドは 、逆相 HPLC により分別および精製を行うことができる。 溶離したペプチドのアミノ酸配列の決定は、当該技術分野で周知の手動または 自動アミノ酸配列決定法のいずれかにより行うことができる。有望な防御ペプチ ドのアミノ酸配列が決定された後、従来のペプチド合成または当該技術分野で周 知の他のプロトコルを用いて、このペプチドを所望の量で合成することができる 。 上述したように単離されたペプチドと同じアミノ酸配列を有するペ プチドは、Merrifield，1963，J．Am．Chem．Soc.，85:2149に記載の合成法と類 似の固相ペプチド合成により合成することができる。合成中、保護側鎖を有する N-α-保護アミノ酸は、C-末端が連結されて成長するポリペプチド鎖および不溶 性ポリマ支持体(すなわち、ポリスチレンビーズ)に少しずつ添加される。N-α- 脱保護アミノ酸のアミノ基と、ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの試薬と反 応させることにより活性化させた N-α-保護アミノ酸のα-カルボキシ基とを連 結することにより、ペプチドを合成する。遊離のアミノ基を活性化したカルボキ シル基に結合させるとペプチド結合が生成する。最も普通に使用される N-α-保 護基としては、酸反応活性を有する Boc および塩基反応活性を有する Fmoc が 挙げられる。 簡単に述べれば、まず最初に、C-末端 N-α-保護アミノ酸をポリスチレンビー ズに結合する。次にN-α-保護基を除去する。脱保護されたα-アミノ基を、次の N-α-保護アミノ酸の活性化したα-カルボキシレート基に連結する。所望のペプ チドが合成されるまで、この処理を繰り返す。次に、得られたペプチドを不溶性 ポリマ支持体から切り離し、アミノ酸側鎖の脱保護を行う。保護ペプチド断片を 縮合することにより、より長いペプチドを誘導することができる。適切な化学、 樹脂、保護基、保護アミノ酸、および試薬の詳細については、当該技術分野で周 知であるので、本明細書中では詳述しない(Atherton，et al.，1989,Solid Phas e Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press および Bodanszky，1 993,Peptide Chemistry，A Practical Textbook，2nd Ed.，Springer-Verlag を 参照されたい)。 得られたペプチドの精製は、ゲル浸透分取クロマトグラフィー、分配クロマト グラフィー、および／またはイオン交換クロマトグラフィーなどの従来の方法を 用いて行われる。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は、当該技術分野で周 知であるので、本明細書中では詳述しない。 5.1.5. 外因性抗原分子 抗原またはその抗原性部分は、hps との複合体を形成する抗原分子として使用 するために、当該技術分野で周知のものの中から選択することができるか、また はイムノアッセイにより、抗体または MHC 分子に結合できるか(抗原性)もしく は免疫応答が可能であるか(免疫原性)を調べることができる。抗体との結合を検 出することにより免疫原性または抗原性を調べるために、当該技術分野で周知の 種々のイムノアッセイを利用することができる。例えば、ラジオイムノアッセイ 、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、「サンドイッチ」イムノアッセイ、イムノ ラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、in vivo イ ムノアッセイ(例えば、コロイド金、酵素、またはラジオアイソトープ標識など を使用する)、ウエスタンブロット、免疫沈降反応、凝集アッセイ(例えば、ゲル 凝集アッセイ、血球凝集アッセイ)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プ ロテイン A アッセイ、免疫電気泳動アッセイなどの競合アッセイシステムおよ び非競合アッセイシステムが挙げられるが、これらに限定されるものではない。 １実施態様において、抗体結合の検出は、一次抗体上の標識を検出することによ り行われる。もう１つの実施態様において、二次抗体との結合または一次抗体に 対する試薬との結合を検出することにより、一次抗体の検出が行われる。更なる 実施態様において、二次抗体を標識化する。イムノアッセイにおいて結合を検出 するための多くの手段が当該技術分野で公知であり、これらが利用できるものと 考えられる。免疫原性を検出するための１実施態様において、標準的な方法(例 えば、in vitro 細胞毒性アッセイまたは in vivo 遅延型過敏症アッセイ)でＴ 細胞仲介反応を検定することができる。 また、抗原分子として使用するための有望な抗原またはその誘導体は、病原体 感染力の中和に対する抗原の寄与(こうした病原体による感染の治療または予防 が望まれる場合)(Norrby，1985，Summary，in Vaccines 85，Lerner，et al．(e ds.)，Cold Spring Harbor Labo ratory，Cold Spring Harbor，New York，pp.388-389)、型特異性または群特異 性、患者の抗血清または免疫細胞による認識、および／または抗体に特異的な抗 血清または免疫細胞の防護効果の出現、などの種々の判定基準により認識するこ とができる。更に、病原体に起因した疾患の治療または予防が望まれる場合、抗 原のコード化エピトープは、後になってまたは同じ病原体の様々な単離体中にお いて、抗原変異を少し示すかまたはまったく示さないことが好ましい。 好ましくは、癌の治療または予防が望まれる場合、既知の癌特異的抗原もしく は断片またはそれらの誘導体が使用される。例えば、こうした腫瘍特異的抗原ま たは腫瘍関連抗原としては、KS1/4全癌腫抗原(Perez and Walker，1990,J．Immu nol．142:3662-3667; Bumal，1988,Hybridoma 7(4):407-415)；卵巣癌抗原(CA12 5)(Yu，et al.，1991, Cancer Res．51(2):466-475)；プロスタン酸ホスフェー ト(Tailer, et al.，1990,Nucl．Acids Res．18(16):4928)；前立腺特異的抗原( Henttu and Vihko，1989,Biochem．Biophys．Res．Comm．160(2):903-910; Isra eli，et al.，1993，Cancer Res．53:227-2300)；メラノーマ関連抗原 p97(Esti n，et al.，1989,1 J．Natl．Cancer Inst. 81(6):445-446)；メラノーマ抗原 g p75(Vijayasardahl，et al.，1990，J．Exp．Med．17184):1375-1380)；高分子 量メラノーマ抗原(Natali，et al.，1987，Cancer 59:55-63)；および前立腺特 異的膜抗原が挙げられるが、これらに限定されるものではない。 特定の実施態様においては、ある腫瘍に特異的な抗原またはそれらの断片もし くは誘導体を hsp との複合体形成とそれに続く APC の感作のために選択する。 好ましくは、ウイルス性疾患の治療または予防が望まれる場合、既知のウイル スのエピトープを含有する分子が使用される。例えば、こうした抗原エピトープ は、肝炎 A 型ウイルス、肝炎 B 型ウイルス、肝炎 C 型ウイルス、インフルエ ンザウイルス、水痘ウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型(HSV -I)、単純ヘルペスウイルス II型(HSV-II)、牛疫ウイルス、リノウイルス、エコーウイルス、ロタウイルス、 呼吸シンシチアルウイルス、乳頭腫ウイルス、パポバウイルス、サイトメガロウ イルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイルス、コクサッキーウイ ルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、 ヒト免疫不全ウイルスＩ型(HIV-I)、およびヒト免疫不全ウイルスII型(HIV-II) などのウイルスから調製することができるが、これらに限定されるものではない 。好ましくは、細菌性感染症の治療または予防が望まれる場合、既知の細菌のエ ピトープを含有する分子が使用される。例えば、こうした抗原エピトープは、マ イコバクテリア、リケッチア、マイコプラズマ、ナイセリア、レジオネラなどの 細菌から調製することができるが、これらに限定されるものではない。 好ましくは、原生動物の感染を治療しまたは予防することが望ましい場合には 、既知の原生動物の抗原決定基を含む分子を抗原分子として使用する。例えば、 このような抗原決定基は、リーシュマニア、コクジディア(kokzidioa)、および トリパノソーマなどの原生動物から調製することができる。 好ましくは、寄生菌感染症の治療または予防が望まれる場合、既知の寄生菌の エピトープを含有する分子が使用される。例えば、こうした抗原エピトープは、 クラミジア、リケッチアなどの寄生菌由来のものであってもよいが、これらに限 定されるものではない。 5.2. ストレスタンパク質‐抗原分子複合体の in vitro 産生 hsp と、in vivo で hsp との内因的会合を起こすペプチドと、の複合体を利 用しない実施態様において、hsp と抗原分子との複合体が in vitro で産生され る。当業者には分かるであろうが、先に述べた手順で単離されたか、または化学 的に合成されたか、または組換えにより産生されたペプチドを、種々の自然精製 型または組換え型ストレスタンパク質を用いて in vitro で再構成すると、免疫 非共有結合スト レスタンパク質‐抗原分子複合体を形成することができる。この他、外因性の抗 原もしくは抗原／免疫断片またはこれらの誘導体と、ストレスタンパク質と、の 非共有結合型複合体を形成して、本発明の免疫療法用または予防用のワクチンに 利用することができる。ストレスタンパク質と抗原分子との非共有結合型複合体 を in vitro で形成するための好ましい具体的プロトコルについては、以下で述 べる。 複合体を形成する前に、hsp を ATP または低pHで前処理して、対象となる hs p と会合を起こす恐れのあるペプチドを除去する。ATP 法を利用する場合、Levy ，et al.，1991，Cell 67:265-274に記載されているように、アピラナーゼを添 加することにより、調製物から過剰の ATP を除去する。低pH法を利用する場合 、pH調節試薬を添加し、緩衝液を再調節して中性pHにする。 抗原分子(1μg)および前処理した hsp(9μg)を、抗原分子：ストレスタンパク 質のモル比が約5:1となるように混合する。次に、4℃〜45℃において、好適な結 合用緩衝液〔例えば、20mMリン酸ナトリウム(pH7.2)、350mM NaCl、3mM MgCl 2 、および 1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)を含有する緩衝液〕中 で15分〜３時間インキュベートする。調製物を Centricon 10アセンブリ(Millip ore)にかけて遠心分離し、未結合ペプチドを除去する。ペプチドとストレスタン パク質との会合は、SDS-PAGE により検定することができる。この方法は、内因 性 hsp‐ペプチド複合体の脱会合により得られたペプチドの MHC‐ペプチド複合 体から単離されたペプチドの in vitro 複合体形成を行うための好ましい方法で ある。 hsp70 とタンパク質などの外因性抗原分子との複合体を形成するための本発明 の他の好ましい実施態様において、5マイクログラム〜10マイクログラムの精製 hsp を、等モル量の抗原分子と共に、37℃において、pH7.5の20mMリン酸ナトリ ウム緩衝液、0.5M NaCl、3mMMgCl₂、および 1mM ADP から成る容積 100マイクロ リットルの溶液中で１時間インキュベートする。このインキュベーション混合物 を、リ ン酸緩衝食塩水で 1mlまで更に希釈する。 本発明のさらに他の態様において、ペプチドに対する gp96 または hsp90 複 合体を製造する好ましい方法は、0.5 M NaClおよび３nM MgCl₂を含有する 20mM リン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.5を含む緩衝液のごとき適当な緩衝液中で5-20分 間、60-65℃で、5-10マイクログラムの精製した gp96 または hsp90 を等モル量 または過剰量の抗原性ペプチドとインキュベーションする。このインキュベーシ ョン混合物を室温まで冷却し、必要なら１回またはそれ以上 Centricon 10アセ ンブリ（ミリポア社）により遠心分離して結合していないペプチドを除く。 複合体形成の後、得られた免疫原性ストレスタンパク質抗原分子複合体は、任 意に、例えば、下記の混合リンパ球標的細胞アッセイ(MLTC)を使用して、in vit ro で測定することが出来る。 5.2.1 ストレスタンパク質−ペプチド複合体の免疫原性の定量 精製されたストレスタンパク質−抗原分子複合体は、APC を感作するために使 用する前に、当業界で周知の混合リンパ球標的培養アッセイ(MLTC)を用いて免疫 原性について任意にアッセイすることができる。この手順は、全体としては任意 であるが、本発明を実施するためには必要でないと理解されるだろう。 一例として挙げれば、以下の方法を使用することができるが、本発明はこれに 限定されるものではない。簡単に記すと、マウスにストレスタンパク質ー原分子 複合体を皮下注射する。他のマウスには他のストレスタンパク質ーペプチド複合 体または本アッセイの陽性対照になる全感染細胞のどちらかを注射する。マウス は7-10日おいて２回注射する。最後の免疫化から10日経過後、脾臓を取り出して リンパ球を採取する。次いで、対象の複合体を発現した死細胞を得られたリンパ 球に添加して、in vitroでもう一度刺激してもよい。 例えば、８ ｘ 10⁶免疫脾臓細胞は、10%胎児ウシ血清含有 RPMI 培地３ ml 中４ ｘ 10⁴マイトマイシン C処理された、またはγ−照射（5-10,000 rads ）感染細胞（または必要なら適当な遺伝子でトランスフェクトした細胞）で刺激 してもよい。ある場合には、Ｔ細胞増殖因子の供給源として、33%二次混合リン パ球培養上清が培地に含まれていてもよい（Glasebrook，et al.，1980，J．Exp ．Med．151: 876参照）。免疫化後の一次細胞傷害性T細胞応答を試験するため、 脾臓細胞は刺激を与えないで培養してもよい。ある実験においては、免疫化マウ スの脾臓細胞は抗原性の異なる細胞で再度刺激して、細胞傷害性T細胞応答の特 異性を測定することもできる。 ６日後、４時間⁵¹Cr-放出アッセイで培養物の細胞傷害性について試験を行う( Palladino，et al.，1987，Cancer Res．47: 5074-5079，Blachere，et al.，19 93，J．Immunotherapy 14: 352-356参照)。このアッセイでは、混合リンパ球培 養物を標的細胞懸濁液に添加すると、異なるエフェクター対標的（E:T）比が得 られる（通常1:1〜40:1）。200 mCi ⁵¹Cr/ml含有培地中、37℃で１時間１ ｘ 10⁶ 個の標的細胞をインキュベーションすることによって、標的細胞は予め標識さ れる。標識後、細胞を３回洗浄する。各アッセイ点（E:T比）は3回行い、適当な 対照を添加して自発⁵¹Cr放出（リンパ球を添加しないでアッセイ）および100%放 出（界面活性剤で溶解した細胞）を測定する。細胞混合物を４時間インキュベー ションした後、200×g で５分間遠心分離して細胞をペレット化する。上清へ放 出された⁵¹Cr量をガンマカウンタで測定する。細胞傷害性%を、以下の式により 求めた cpm として測定する。 （試験サンプル−自発放出cpm）÷（総界面活性剤放出 cpm−自発放出cpm） MHC クラスＩカスケードをブロックするため、K-44ハイブリドーマ細胞（抗-M HCクラスＩハイブリドーマ）から得られた濃縮ハイブリドーマ上清を試験サンプ ルに添加して最終濃度を 12.5%にする。 5.3. マクロファージおよび抗原提示細胞の取得 マクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞など（しかし、これらに限定されない ）の抗原提示細胞は、好ましくは、Inaba，K.ら（1992，J．Exp．Med．176:1693 -1702）によって記載されているように、ヒト末梢血または骨髄由来の幹細胞お よび前駆細胞からの in vitro での産生によって得られる。 APCは、当業界で公知の各種の方法のいずれかにより得ることが可能である。 好ましい態様では、ヒト血液細胞から得たヒト・マクロファージが用いられる。 例えば（しかし、これに限定されないが）、マクロファージは以下のようにして 得ることが可能である。 単核細胞を、患者（好ましくは、治療すべき患者）の末梢血液からフィコール −ハイパック（Ficoll-Hypaque）勾配遠心分離により単離する。 組織培養皿を患者自身の血清または他のＡＢ＋ヒト血清でプレコーティングし 、37℃で１時間インキュベートする。非付着性の細胞をピペッティングにより除 去する。該皿に残った付着性の細胞に、冷たい(4℃)1mM EDTA（リン酸緩衝化食 塩水中）を添加し、該皿を室温で15分間放置する。細胞を回収し、RPMI緩衝液で 洗浄し、RPMI緩衝液に懸濁する。Inaba，Kら（1992，J．Exp．Med．176:1693-17 02）によって詳細に記載されているように、37℃でマクロファージ−コロニー刺 激因子（M-CSF）とインキュベートすることにより、増大した数のマクロファー ジが得られ；顆粒球−マクロファージ−コロニー刺激因子（GM-CSF）とインキュ ベートすることにより、増大した数の樹状細胞が得られる。 5.4. Hsp- 複合体によるマクロファージおよび抗原提示細胞の感作 APC を、抗原分子に非共有結合で結合した hsp と in vitro でインキュベー トすることによって、その複合体で感作する。このAPC を、hsp と抗原分子との 複合体と in vitro で37℃、15分〜24時間インキュベートすることによって、そ のhsp-複合体で感作する。例えば（しかし、これに限定されないが）、４×10⁷ 個のマクロファージを、１mlのプレーンなRPMI培地中で10μg／mlのgp96-ペプチ ド複合体または100μg／ml のhsp90-ペプチド複合体と37℃、15分〜24時間イン キュベートすることができる。患者へ注入するために、これらの細胞を３ 回洗浄し、（好ましくは無菌の）生理学的培地中に簡便な濃度（例えば、１×10⁷ 個／ml）で再懸濁する。好ましくは、感作APC を注入する患者は、該APC が元 々単離された患者である（自己由来の実施態様）。 場合によっては、例えば抗原特異的なクラスＩ-限定(class I-restricted)細 胞障害性Ｔリンパ球（CTL）を刺激する感作APC の能力は、下記の実施例６にお いて以下に記載されるように、CTLを刺激して腫瘍壊死因子を放出する能力、お よびこのようなCTLの標的として作用する能力によってモニターできる。 5.5. 感作APCの再注入 hsp-感作マクロファージおよび他のAPC を、慣用の臨床的操作によって上記患 者に全身的に（好ましくは、静脈内に）再注入する。これらの活性化細胞を、好 ましくは全身投与によって自己由来性の(auologous)患者に再注入する。患者は 、該患者の症状に応じて、通常約10⁶〜約10¹²個の感作マクロファージを受け取 る。幾つかのレジメ（投与計画）では、場合によっては、患者は適切な用量の生 物学的応答変更因子（例えばサイトカインIFN-α、INF-α、IL-2、IL-4、IL-6、 TNFまたは他のサイトカイン増殖因子が挙げられるが、それらに限定されない） をさらに受け取ることが可能である。 5.6. 標的感染症 本発明方法によって治療または予防できる感染症は、感染性因子によって引き 起こされる。感染性因子の例としては、ウイルス、細菌、かび、原虫、寄生虫を 挙げることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。 本発明方法によって治療または予防できるウイルス疾患の例としては、肝炎A 型、肝炎B型、肝炎C型、インフルエンザ、水痘、アデノウイルス、単純ヘルペス Ｉ型（HSV-I）、単純ヘルペスII型（HSV-II）、牛疫、リノウイルス、エコーウ イルス、ロタウイルス、呼吸シンシチアルウイルス、乳頭腫ウイルス、パポバウ イルス、サイトメガロウイルス、エキノウイルス、アルボウイルス、ハンタウイ ルス(huntaviras)、コクサッキーウイルス、おたふくかぜウイルス、麻疹ウイル ス、風疹ウイルス、ポリオウイルス、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（HIV- I）およびヒト免疫不全ウイルスII型（HIV-II）を挙げることができるが、本発 明はこれらだけに限定されるものではない。 本発明方法によって治療または予防できる細菌疾患は、細菌によって引き起こ される。細菌の例としては、マイコバクテリウム、リッケチア、マイコプラズマ 、ナイセリア、レジオネラを挙げることができるが、本発明はこれらに限定され るものではない。 本発明方法によって治療または予防できる原虫性疾患は、例えば、リーシュマ ニア、コクジジオア(kokzidioa)、トリパノソーマの原虫類によって引き起こさ れるが、本発明はこれらに限定されるものではない。 本発明方法によって治療または予防できる寄生虫性疾患は、例えば、クラミジ ア、リッケチアの寄生虫類によって引き起こされるが、本発明はこれらに限定さ れるものではない。 5.7. 標的癌 本発明方法によって治療または予防できる癌としては、以下の例を挙げること ができるが、ヒト肉腫、癌腫のような腫瘍に限定されるものではない。例えば、 線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、背索腫、血管肉腫、内 皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫、平 滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細 胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腫癌、 髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期 癌、ビルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神 経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、 血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽 細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽 球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性 （顆粒細胞性）白血病および慢性リンパ性白血病）；および真性多血球血症リン パ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュレームマ クログロブリン、並びにＨ鎖病を例示することができる。そのような癌の 具体例は、以下の節に記載されている。 特定の実施態様では、癌は転移性である。別の実施態様では、癌は腫瘍である 。別の特定の実施態様では、癌を有する患者は、hsp-感作APCが投与される前に 抗癌治療（例えば、化学療法照射）を受けているために、免疫抑制される。 5.7.1. 肝臓に転移した結腸直腸癌 1992年におよそ15万人のアメリカ人が結腸直腸癌であると診断された。そして 結腸直腸転移の結果６万人以上が死亡した。彼らが死亡したとき、結腸直腸癌患 者の80%に、肝臓を含む転移疾患があり、その患者の半分には他の（肝臓外の） 転移があるという証拠は見つからなかった。肝臓の最も転移性の腫瘍は、胃腸の 原発部から始まる。不幸にも、転移性肝病変の履歴は、重篤な予後を伴い、全身 的化学療法では有意の応答率を得ることができず、また生存期間を変えることは できなかった（Drebin，J.A.ら編，Current Therapy In Ocology，J.E．Niederh uber，B.C．Decker，Mosby編，1993，p.426）。 結腸直腸癌はまず局部的なリンパ節から門脈静脈性循環を通じて肝臓へ広がる 。肝臓は転移の最も一般的な内臓部位を代表している。結腸直腸癌患者が治療を 求めるに至る症状は、病変の解剖学的局在によって変わる。例えば、上行結腸に ある病変は潰瘍を引き起こすことが多い。この潰瘍は便通時に慢性的失血を起こ す。 根治的切除は侵襲性結腸直腸癌患者の治療には最大の効果をもたらす。手術の 前にはCEA 力価が測定される。放射線治療および化学療法は進行性結腸直腸癌患 者に適用される。化学療法剤(例えば、５-フルオロウラシル)を投与した結果は 様々であり、25%未満の患者が腫瘍塊の50%を超える退縮を経験している（Rchard s，第２版，F.ら，1986，J．Clin．Ocol．4:565）。 広範に広がった転移のある患者は生存に限界があり、このグループの患者には 全身化学療法はほとんど効果がない。さらに、全身投与化学療法は、種々の薬剤 に伴う重篤な毒性、例えば、重症の下痢、粘膜炎および/または脊髄抑圧などに よって制限されることが多い。肝臓放射線照射や全身化学療法、肝動脈結索、腫 瘍塞栓化、免疫療法などの他の治療方法もすべて検討されたが、大部分につ いては、患者の生存に効果があるとの証明は得られていない。 特定の実施態様では、本発明は、新生物疾患の進行を抑制するために、肝臓に 転移している結腸直腸癌に罹患している個体において腫瘍特異的免疫性を増強す るための組成物および方法を提供する。これらの新生物疾患を治療するための好 ましい方法は、ペプチド複合体に非共有結合で結合しているhsp で刺激されてい る自己由来のマクロファージの組成物を投与することを含んでなり、このことに より、腫瘍細胞に対する腫瘍特異的免疫が引き起こされる。特定の実施態様では 、本発明の hsp-刺激APC は、毒性を誘発することなしに、癌患者における肝臓 癌の増殖を抑制するのに用いられる。 さらに、本発明の方法の例として、hsp-刺激APC は、肝臓に転移している、ま たはしていない結腸直腸癌と診断された患者に静脈注射によって投与される。 5.7.2. 肝細胞癌腫 肝細胞癌腫は合衆国の老人に一般的な疾患である。多くの要因が肝細胞癌腫を 引き起こすが、この疾患は通常肝疾患既往症のある人に限られている。合衆国の 肝細胞癌腫患者のおよそ60-80%が肝硬変に罹っており、肝硬変のある患者の約4% は最終的に肝細胞癌腫になる（Niederhuber，J.E.編、1994，Current Therapy i n Oncology，B.C．Decker，Mosby）。肝疾患が遺伝的血色素症またはB型肝炎ウ イルス感染によって引き起こされた患者には、このリスクは高い（Bradbear，R. A.ら，1985，J．Natl．Cancer Inst．75: 81; Beasley，R.P.ら，1981，Lancet 2: 1129）。肝細胞癌腫に至る可能性をもつ硬変のその他の原因としては、アル コール乱用とメトトレキセートの慢性的投与により引き起こされた肝繊維症があ る。肝細胞癌腫の最も頻発する症状は、体重減少を伴う、右上腹部の四分一区分 または上腹部における痛覚塊の発現である。肝硬変患者において、腹水症、門脈 圧亢進症および比較的急激な臨床上の劣化は、肝細胞癌腫発症の前触れとなる。 ほとんどの場合、血清アミノトランスフェラーゼやアルカリフォスファターゼの 標準的肝機能テストにおいて、異常値が観察される。 肝臓のCTスキャンを用いることにより、肝細胞癌腫の解剖学的分布を調べるこ とができ、また経皮穿刺生検法のための方向づけを提供することができる。 肝細胞癌腫患者の約 70%は、上昇した血清アルファーフェトプロテイン濃度をも っており（Mclntire，K.R.ら，1975，Cancer Res．35:991）、その濃度は疾患の 程度と相関する。 根治的切除は、肝細胞癌腫患者の治療にはわずかの希望しかもたらさない。そ のような手術手順によれば、５年生存する比率は12-30%である。肝臓移植はより 若い患者の生存率を改善することができる。しかしながら、拡大した肝硬変多病 巣腫瘍パターンまたは適合ドナー臓器不足のために、ほとんどの患者はこの手術 を受けられない。静脈内ルートまたは肝動脈内カテーテルによって化学療法剤が 投与されている。そのような治療法は肝臓への放射線療法と併用されていること がある。ドキソルビシンまたは5-フルオロウラシルの全身投与治療を受けている 患者の中に、測定可能な腫瘍サイズの50%以上の退縮があったことが報告されて いる。しかしながら、化学療法は免疫抑制を誘発することが多く、腫瘍を完全に 消滅させることは稀であって、しかもその応答持続は短い。肝細胞癌腫患者の予 後は、肝硬変や肺または骨への転移とは相関していない。患者の平均生存率は、 わずか4〜6ケ月である。他の具体的態様において、新生物疾患の進行を阻止し最 終的にすべての前新生物細胞および新生物細胞を放射線で治療するために、本発 明は、結腸直腸癌患者の特異的免疫を高める組成物および方法を提供する。 5.7.3. 乳癌 本発明の他の具体的態様は、乳癌の治療に関する。アメリカ癌協会は、1992年 に18万人のアメリカ人女性が乳癌と診断され、４万６千人がその病に倒れたと推 定した（Niederhuber，J.E.編、Current Therapy in Oncology B.C．Decker，Mo sby，1993）。これにより、乳癌は、肺癌に次いで女性の癌死の第二番目の主要 原因となる。不穏なのは、1980年以来、3%の割合で乳癌が増え続けているという 状況である（Niederhuber，J.E.編、Current Therapy in Oncology B.C.Decker ，Mosby，1993）。現在行われている乳癌の治療としては、外科手術、放射線療 法、ホルモン療法および/または化学療法がある。ホルモンリセプターと疾患の 程度という乳癌の二大特徴を考慮することにより、どのようにホルモン療法と 標準用量化学療法とを併用して生存率を改善し、生活のクオリティを維持または 改善するかが決定される。乳癌患者における補助剤療法として、2-シクロフォス ファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン・メトトレキセート、5-フルオロウ ラシルおよび/またはロイコボリン（これらには限定されない）を併用した広範 囲にわたる多剤療法が使われている。具体的な一態様において、本発明は、女性 の前新生物および新生物哺乳細胞に対する特異的免疫を高める組成物および方法 を提供する。本発明はまた、乳癌を発症するリスクの高い女性における新生物細 胞の発生を予防する組成物および方法を提供し、さらに癌細胞の増殖と転移を阻 止する組成物および方法を提供する。これらの組成物は、単独で、あるいは相互 にまたは生物学的応答改変剤と組み合わせて適用することができる。 5.8. 自己由来の実施態様 癌の治療または予防のためのhsp-ペプチドの自己由来の複合体で刺激された自 己由来のAPCの使用に関する本発明の好ましい実施態様では、癌の免疫療法にと って最もやっかいな障害のうちの２つが回避される。その第１は、ヒトの癌が、 実験動物の癌のように、抗原性において異なるという可能性である。本発明の好 ましい実施態様では、hspは、該hspが誘導される癌細胞の抗原性ペプチドのシャ ペロンとして機能して、この障害を回避する。第２に、癌の免疫療法に対して現 在最もよく行われているアプローチでは、癌細胞系の CTL-認識エピトープの決 定が注目されている。このアプローチは、癌に対する細胞系およびCTL の利用可 能性を必要とする。これらの試薬は、非常に大部分のヒトの癌には利用不可能で ある。hspペプチドを含有する自己由来の複合体で刺激した自己由来のマクロフ ァージの使用に関する本発明の実施態様では、癌の免疫療法は、細胞系またはCT Lの利用可能性に依存せず、癌細胞の抗原性エピトープの決定も必要としない。 これらの利点により、自己由来の hsp-刺激APC は魅力的なものであり、かつ癌 に対する新規の免疫原がもたらされる。 5.9. 原発性および転移性新生腫瘍疾患の予防と治療 本発明によって提供される免疫療法が癌患者での使用に望ましい理由として、 数多くのものを挙げることができる。第一に、癌患者が免疫抑制状態にあれば、 麻酔を伴う手術、その後の化学療法は免疫抑制を悪化させる。また手術前の適切 な免疫療法によって、この免疫抑制は予防または逆方向に向かわせることができ る。これは、感染合併症を少なくし、傷の治癒を促進させる。第二に、術後の腫 瘍総量が最小化し、この状況下で免疫療法は最も効果をあげる可能性がある。第 三の理由は、手術時に腫瘍細胞が循環器に流しだされて、この時期に適用される 効果的な免疫療法がこれらの細胞を排除できるという可能性である。 特定の実施態様では、本発明の予防および治療方法は、手術前または手術後で の癌患者の免疫能力(immunocompetence)を増強して、癌細胞に対する腫瘍特異的 免疫性を低下させることに関し、その目的は癌の抑制であり、最終的な臨床的目 的は癌の完全な縮退および根絶である。 5.10. 養子免疫療法後の効果のモニタリング 新生物疾患の発症および進行に対する hsp-刺激APCによる免疫療法の効果は、 当業者にとって公知の方法によってモニターできる。その方法としては、a)細胞 性免疫の評価としての遅延型過敏症の測定、b)in vitro での細胞溶解性Ｔリン パ球の活性の測定、c)腫瘍特異的抗原［例えば、癌胎児性抗原(CEA)］のレベル の測定、d)コンピュータ連動断層撮影(CT)スキャン等の技術を用いた腫瘍の形状 (morphology)の変化の測定、e)危険性の高い個体における特定の癌に対する危険 性の想定生物学的マーカーのレベルの変化の測定、およびf)ソノグラムを用いた 腫瘍の形状の変化の測定が挙げられるが、それらに限定されない。 5.10.1. 遅延型過敏皮膚試験 遅延型過敏症皮膚試験は、全体的な免疫適格住および抗原に対する細胞住免疫 に非常な価値がある。一連の共通皮膚抗原に対する反応不能性は、アネルギーと 呼ばれる（Sato,T.，et al.，1995，Clin．Immunol．Pathol．74:35-43）。 皮膚試験を適正に行うには、抗原を４℃で滅菌保存し、遮光して使用直前に再 構成する技術が必要である。抗原の、皮下ではなく、皮内投与を確実にするには 、25または27ゲージが必要である。抗原を皮内投与して24および48時間後 最大の紅斑と硬結両方をルーラーで測定する。投与された抗原または抗原群に対 する活性低下を、より高濃度の抗原でテストすることによって、または状況があ いまいな場合には、中間試験を伴う反復試験によって、確認する。 5.10.2. 細胞溶解性T-リンパ球の in vitro 活性 フィコールハイパック遠心分離濃度勾配法によって単離した8×10⁶個の末梢血 由来T リンパ球を、10%ウシ胎児血清含有RPMI 培地３ml中、4×10⁴個のマイシン C で処理した腫瘍細胞を用いて再刺激する。いくつかの実験では、T 細胞増殖因 子源として、33％の二次混合リンパ球培養上清またはIL-2 を培地に加えてある 。 免疫後の細胞溶解性T-リンパ球の一次反応を測定するため、刺激剤である腫瘍 細胞なしで、T 細胞を培養する。他の実験では、抗原性の異なる細胞を用いてT 細胞を再刺激する。６日後、培養物の細胞毒性を、４時間の⁵¹Cr放出アッセイで 試験する。標的の自発的⁵¹cr放出は、20%未満のレベルになるべきである。抗MHC クラスＩブロッキング活性の場合は、W6/32ハイブリドーマの10倍濃縮上清を、 最終濃度が12.5%になるよう、その試験に添加する（Heike，M.，et al.，J．Imm unotherapy 15: 165-174）。 5.10.3. 腫瘍特異的抗原のレベル すべての腫瘍にユニークな腫瘍抗原を検出することは不可能であるが、多くの 腫瘍は正常細胞から識別できる抗原を出現する。モノクローナ抗体試薬によって 、抗原の生化学的特性決定と単離が可能になり、形質転換細胞の識別、および形 質転換細胞の細胞系統の特定抗原である。これらの抗原は胚形成中に発現される が、正常な成人組織には存在しないか、あっても検出は極めて困難である。プロ トタイプの抗原癌胎児性抗原（CEA）、胎児消化管に見出される糖タンパク質で ある。CEAはヒト結腸癌細胞にはあるが、正常な成人結腸細胞にはない。CEAが結 腸細胞から流れ出て血清中に見出される以上、もともと、この血清における抗原 の存在は結腸癌患者をスクリーニングするのに使うことが出来るのではないかと 考えられていた。しかしながら、膵臓癌や乳癌などの他の腫瘍患者にもまた、血 清CEAの上昇値がみられた。従って、治療中の癌患 者のGAレベルの下降および上昇をモニターすることは腫瘍の進行および治療の成 果を予測するのに有用であることがわかった その他のいくつかの胎児腫瘍性抗原もヒト腫瘍を診断しモニターするのに有用 であることがわかた。例えば、α-フェトプロテインは胎児肝および卵黄嚢細胞 により正常に分泌されるα-グロブリンであるが、肝癌および胚芽細胞腫瘍の患 者の血清中に存在し、これを疾患の現状を示す指標として利用することができる 。 5.10.4. コンピュータ連動断層撮影（ＣＴ）スキャン ＣＴは、癌の正確な病気分類のための技術の選択の機会を残している。ＣＴは 、転移の検出のための他の全ての画像化技術よりも感度が高く特異的であるとい うことが分かっている。 5.10.5. 推定的な生物学的マーカーの測定 特定の癌の危険度についての推定的な生物学的マーカーのレベルを、ペプチド 複合体に非共有結合的に結合したｈｓｐの効果を監視するために測定する。例え ば、前立腺癌に対する危険度が増大した個体において、血清前立腺特異抗原(PSA )をBrawer，M.K.，ら，1992，J．Urol．147:841-845及びCatalona，W.J.,ら，19 93，JAMA 270:948-958に記載された手法によって測定し；又は結腸直腸癌CEAに 対する危険度を有する個体において、第4.5.3節に記載したようにして測定し； そして乳癌に対する危険度が増大した個体において、エストラジオールの１６− α−ヒドロキシル化を、Schneider，J．ら，1982，Proc．Natl．Acad．Sci．ISA 79:3047-3051に記載された手法によって測定する。上記で引用した参考文献は 、参照により本明細書に含まれるものとする。 5.10.6 ソノグラム ソノグラムは、癌の正確な病気分類のための技術のもう一つの選択の機会を残 している。 ６．実施例： 外因性熱ショックタンパク質会合ペプチドは マクロファージのMHCＩ分子によって提示される 貧食細胞によるHSP-シャペロン化ペプチドの提示の可能性を、例えば水疱性口 炎ウイルス(VSV)感染した細胞株EL4細胞のようなVSVモデルを用いて直接テスト した。 6.1. 方法と材料 VSIのヌクレオキャプシドタンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクト したEL4細胞(Nl細胞)およびトランスフェクトされていないEL4細胞(陰性対照)か ら上記第５節に記載の方法に従って、gp96を明らかに均一に単離した。 0.2mlのプリスタンで誘導したC57BL/6マウス由来の腹腔滲出液細胞から、マク ロファージを調製した。 6.2. CTL によるTNF放出を刺激する感作マクロファージの能力 I×10⁴個のマクロファージを、96ウエルのＵ底プレート中、gp96(Nl 細胞また はEL4細胞由来;2もしくは10μg/ml)およびVSVペプチド特異的CTL(5×10⁴)の存在 下に37℃で培養した。24時間後、上清を集め、TNF-α生成物を WEHI164細胞を用 いる細胞毒性アッセイのバイオアッセイによって測定した。 WEHI164細胞(2.5×10²/ウエル)を、上述のようにして予め得ておいた連続希釈 の上清と一緒に共培養した。対照としての別のウエルで、α-TNF-αを WEHI164 細胞と一緒に培養した。37℃、4時間のインキュベーションの後、50μlの3-[4,5 −ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5−ジフィルテトラゾリウムブロミド(MTT)(SI GMA,St.Louis)(1mg/ml)を加え、さらに４時間インキュベートした。100μlのプ ロパノール−0.05M HCl 加え、直ぐに光学密度を590nm で測定した。WEHI14細胞 の50%の死滅が結果として生じた希釈点との比較によって、サンプル濃度を算出 した。 6.2.1. 結果 Nl細胞から単離した gp96で感作されたマクロファージはVSV特異的CTLによるT NF放出を刺激したが、EL4細胞から単離したgp96で感作されたものは刺激 されなかった(図１Ａ)． 6.3. CTL の標的として作用する感作マクロファージの能力 腹腔マクロファージ(5×10⁶)を、Nl 細胞もしくはEL4細胞由来のgp96(10μg/m l)、陽性対照としてのVSVヌクレオキャプシドK^bエピトープペプチド(10μM)、ま たは対照としての培養培地を用いて37℃で２時間感作した後、⁵¹Crで1.5時間標 識化した。これらの感作マクロファージを、VSV特異的CTLを用いる４時間の⁵¹Cr 放出アッセイで標的として使用した。 このCTLアッセイに、抗CD4mAb(CK1.5)、抗CD8mAb(YTS169.4)、抗H-2K^bmAb(Y3) 、抗H-2D^b mAb(B22.249)またはRPMI対照を、エフェクター細胞および、Nl細胞由 来gp96で感作した⁵¹Cr標識マクロファージと同時に添加した。 6.3.1. 結果 Nl細胞から単離したgp96で感作されたマクロファージは抗VSVCTLで溶解された が、EL4細胞由来のgp96で感作されたマクロファージは溶解されなかった（図１ Ｂ）。溶解は抗クラスＩMHC(Jb)および抗CD8抗体によって阻止されたが、抗クラ スＩMHC(D6)および抗CD4抗体によって阻止されなかった（図１Ｃ）。 したがって、Nl細胞から単離されたgp96分子はVSVのKb-エピトープをシャペロ ン化し、このエピトープはマクロファージの内因性提示経路に組み込まれる。 ７．実施例： 感作マクロファージの養子移入 7.1. 材料と方法 0.2mlのプリスタン(Sigma,St.Louis)を公称的に健康なBALB/cJマウスに腹腔内 投与した後３日目に、腹腔マクロファージを腹腔滲出液の遠心によって集めた。 腹腔滲出液細胞(PEC)またはマクロファージ(4×10⁷)をメチルコラントレン誘 導腫瘍または肝臓に由来のgp96−ペプチド複合体50μgを含むRPMI1ml中で37℃、 ３時間インキュベートした。次いで、マクロファージを３回洗浄し、RPMI培地中 １×10⁷/mlの濃度に再懸濁した。この懸濁液200μlを用いて以下の実験プロトコ ールに記載のようにマウスに腹腔内投与した。 7.2. メチルコラントレン(Meth A)誘発肉腫モデル ５つの群のマウスを以下の治療：ａ）緩衝溶液の皮下投与、ｂ）肝臓組織由来 のgp96−ペプチド複合体9μgの皮下投与、ｃ）正常肝臓由来のgp96−ペプチド複 合体で感作されたマクロファージまたはPEC5×10⁶の腹腔内投与、d)Meth A腫瘍細 胞由来のgp96−ペプチド複合体9μｇを含む皮下投与、およびｅ）Meth A腫瘍細 胞由来のgp96−ペプチド複合体で感作されたマクロファージまたはPEC5×10⁶の 腹腔内投与、にかけた。 上記の治療投与計画は２回行い、第２の注射の１週間後に1×10⁵個のMeth A腫 瘍細胞を皮内投与した。平均腫瘍直径を測定することによって、腫瘍の成長を監 視した。 7.3. 結果 Ａ群、Ｂ群およびＣ群、すなわち対照緩衝溶液または肝臓組織由来gp96を受容 したマウスにおいて腫瘍増殖は同等であった。gp96−ペプチド複合体で直接処置 したマウス（Ｄ）またはgp96−ペプチド複合体で感作したマクロファージで直接 処置したマウス（Ｅ）では、緩衝液対照または肝臓組織由来gp96を受容したマウ スと比較して腫瘍増殖が著しく抑制された(図２)。したがって、本明細書に記載 されるgp96−ペプチド複合体の直接的投与、またはgp96−ペプチド複合体で感作 したマクロファージおよび／または他のAPCを用いる養子療法は、広範囲の癌、 感染症または免疫学的障害に対する潜在的な適用可能性をもって癌の治療へのア プローチを示す。 本発明の範囲は、本明細書に記載の特定の実施態様によって制限されない。実 際、本明細書に記載のものに加えて本発明の種々の変更が、前述の記載および添 付の図面から当業者には明らかになるだろう。そのような変更は添付の請求の範 囲の範囲内に入ることが意図されている。 種々の刊行物が本明細書中で引用されたが、それらの開示の全体を参考として 本明細書に含めるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，Ｔ Ｔ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．癌をもつ個体を治療する方法であって、 (a) 感作有効量の、抗原分子に非共有結合で結合された熱ショックタンパ ク質からなる複合体を用いて、 in vitro で抗原提示細胞を感作し、そして (b) 感作された抗原提示細胞を治療に有効な量で個体に投与する、 各ステップを含んでなる方法。 ２．癌をもつ個体を治療する方法であって、抗原分子に非共有結合で結合された 熱ショックタンパク質からなる複合体を用いて in vitro で感作しておいた抗原 提示細胞を治療に有効な量で個体に投与することを含んでなる方法。 ３．前記個体がヒトである、請求項１に記載の方法。 ４．前記個体がヒトである、請求項２に記載の方法。 ５．抗原提示細胞が前記ヒトに由来するものである、請求項３に記載の方法。 ６．抗原提示細胞が前記ヒトに由来するものである、請求項４に記載の方法。 ７．抗原提示細胞が前記ヒトの同種異系に由来するものである、請求項３に記載 の方法。 ８．抗原提示細胞が前記ヒトの同種異系に由来するものである、請求項４に記載 の方法。 ９．前記の癌が繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫 、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユ ーイング腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺 癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺 癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精 上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱 癌、上皮癌、神経膠腫、神経膠星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞 腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽 細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレー ムマクログロブリン 血症、およびＨ鎖病よりなる群から選択される、請求項３または４に記載の方法 。 10．熱ショックタンパク質がhsp70、hsp90、gp96およびそれらの組合せよりなる 群から選択される、請求項３または４に記載の方法。 11．熱ショックタンパク質がhsp70である、請求項４に記載の方法。 12．熱ショックタンパク質がhsp90である、請求項４に記載の方法。 13．熱ショックタンパク質がgp96である、請求項４に記載の方法。 14．前記複合体が前記ヒト由来の腫瘍から単離される、請求項４に記載の方法。 15．前記複合体が前記ヒトの同種異系に由来する腫瘍から単離される、請求項４ に記載の方法。 16．インターフェロン−α、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、イ ンターロイキン−４、インターロイキン−６、および腫瘍壊死因子よリなる群か ら選択される有効量の生物学的応答変更因子を前記ヒトに投与することをさらに 含んでなる、請求項４に記載の方法。 17．治療に有効な量が10⁶〜10¹²個の細胞である、請求項４に記載の方法。 18．細胞を静脈内に投与する、請求項４に記載の方法。 19．前記複合体を前記個体の癌細胞から単離する、請求項４に記載の方法。 20．前記の抗原分子が外因性の抗原分子である、請求項４に記載の方法。 21．外因性の抗原分子が腫瘍抗原である、請求項20に記載の方法。 22．感染症の治療または予防を希望する個体の感染症を治療または予防する方法 であって、 (a) 感作有効量の、抗原分子に非共有結合で結合された熱ショックタンパ ク質からなる複合体を用いて、 in vitro で抗原提示細胞を感作し、そして (b) 感作された抗原提示細胞を治療に有効な量で個体に投与する、 各ステップを含んでなる方法。 23．感染症の治療または予防を希望する個体の感染症を治療または予防する方法 であって、抗原分子に非共有結合で結合された熱ショックタンパク質からなる複 合体を用いて in vitro で感作しておいた抗原提示細胞を治療に有 効な量で個体に投与することを含んでなる方法。 24．前記個体がヒトである、請求項22に記載の方法。 25．前記個体がヒトである、請求項23に記載の方法。 26．抗原提示細胞が前記ヒトに由来するものである、請求項24に記載の方法。 27．抗原提示細胞が前記ヒトに由来するものである、請求項25に記載の方法。 28．抗原提示細胞が前記ヒトの同種異系に由来するものである、請求項24に記載 の方法。 29．抗原提示細胞が前記ヒトの同種異系に由来するものである、請求項25に記載 の方法。 30．前記複合体を、感染症を引き起こす感染因子に感染した細胞から単離する、 請求項25に記載の方法。 31．前記細胞が前記ヒトに由来するものである、請求項30に記載の方法。 32．前記の抗原分子が外因性の抗原分子である、請求項25に記載の方法。 33．外因性の抗原分子が感染症を引き起こす感染因子の抗原である、請求項32に 記載の方法。 34．感染症がウイルス、細菌、真菌、寄生体または原生動物によって引き起こさ れる、請求項25に記載の方法。 35．熱ショックタンパク質がhsp70、hsp90、gp96およびそれらの組合せよりなる 群から選択される、請求項25に記載の方法。 36．抗原分子に非共有結合で結合された熱ショックタンパク質からなる複合体を 用いて in vitro で感作しておいた、治療に有効な量の感作抗原提示細胞を製剤 学的に許容される担体とともに含有する医薬組成物。 37．抗原提示細胞がヒト由来である、請求項36に記載の組成物。 38．熱ショックタンパク質がhsp70、hsp90、gp96およびそれらの組合せよりなる 群から選択される、請求項37に記載の組成物。 39．抗原分子（該抗原分子は外因性の抗原またはその抗原性もしくは免疫原性の 断片もしくは誘導体である）に非共有結合で結合された熱ショックタンパク質か らなる複合体を容器内に含有するキット。 40．第２の容器内にヒト抗原提示細胞をさらに含有する、請求項39に記載のキ ット。 41．癌の予防を希望する個体において癌を予防する方法であって、 (a) 感作有効量の、抗原分子に非共有結合で結合された熱ショックタンパ ク質からなる複合体を用いて in vitro で抗原提示細胞を感作し、そして (b) 感作された抗原提示細胞を治療に有効な量で個体に投与する、 各ステップを含んでなる方法。 42．癌の予防を希望する個体において癌を予防する方法であって、抗原分子に非 共有結合で結合された熱ショックタンパク質からなる複合体を用いて in vitro で感作しておいた抗原提示細胞を治療に有効な量で個体に投与することを含んで なる方法。 43．抗原提示細胞がマクロファージを含む、請求項３、４、６、24、25または42 に記載の方法。