【発明の詳細な説明】
短縮形ケモカインβ−８
発明の背景
本発明はケモカインベーター８（ｃｋβ−８）の短縮形をコードするポリペプ
チドおよびポリヌクレオチド配列に関する。特に、本発明はポリペプチドおよび
ポリヌクレオチドの使用、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の産生、お
よびポリペプチドの作用の抑制に関する。ケモカインは、相互分泌サイトカイン
とも称するが、構造および機能的に関連したサイトカインの亜科である。これら
の分子は小さく、誘発可能なプロ炎症タンパク質である。一般に、ケモカインは
アミノ酸レベルで２０ないし７５％の相同性を示し、２つのジスルフィド結合を
形成する４つの保存システイン残基により特徴づけられる。はじめの２つのシス
テイン残基の配列に基づいて、ケモカインは２つの亜科アルファとベータにに分
類されている。アルフ亜科においては、はじめの２つのシステインはアミノ酸に
より分離され、したがって、「Ｃ−Ｘ−Ｃ」亜科と称する。ベータ亜科において
は、２つのシステインは隣接する位置にあり、したがって、「Ｃ−Ｃ」亜科と称
する。１番目のシステインは３番目のシステインと、２番目は４番目とジスルフ
ィド結合を形成し、その結果、多くのケモカインについて類似した三次構造をも
たらす。構造的に、多くのケモカインがタンパク質加水分解プロセシングを受け
て、機能的に「成熟した」タンパク質を生じる。これは通常タンパク質のＮ−末
端部分で短いリーダー配列の開裂を含む。少なくとも１４の別個のα−ケモカイ
ンおよび１２のβ−ケモカインがタンパク質および／またはｃＤＮＡレベルで記
載されている。
相互分泌サイトカインは広範囲におよぶ機能を示す。重要な特徴の１つは、単
球、好中球、Ｔリンパ球、好塩基球、および線維芽細胞などの異なる細胞種の走
化性遊走を刺激する能力である。αおよびβ亜種は、その細胞標的選択性におい
ていくぶん異なる。αケモカインのほとんどは好中球、線維芽細胞、Ｔ細胞、お
よびＮＫ細胞を誘引する。β−ケモカインは主に単球およびＴリンパ球を誘引す
る。多くのケモカインはプロ炎症活性を有し、炎症反応中の多段階に関与する。
これらの活性は、ヒスタミン放出の刺激、リソソーム酵素およびロイコトリエン
放出、標的免疫細胞の内皮細胞への付着の増加、補体タンパク質の結合の増加、
顆粒球付着分子および補体レセプターの発現の誘発、および呼吸器系バーストを
包含する。その炎症における関与に加えて、他の活性を示すことが実証されてい
るケモカインもある。例えば、マクロファージ炎症タンパク質（ＭＩＰ−１）は
造血幹細胞増殖を抑制でき、血小板因子４（ＰＦ−４）は内皮細胞増殖の有力な
抑制物質であり、インターロイキン−８（ＩＬ−８）はケラチノサイトの増殖を
促進し、ＧＲＯは黒色腫細胞の自己分泌増殖因子である。ケモカインは多くの生
理学的状態および病気の状態、特に炎症性成分を有する状態に関与する。これら
は、リンパ球交換、傷の癒合、造血調整および免疫学的障害、例えばアレルギー
、喘息および関節炎を包含するが、これに限定されない。多くのケモカインは、
はじめは炎症性応答の産物として単離された。例えば、ＭＩＰ−１はもともとマ
クロファージにより産生される内毒素−誘発性プロ炎症サイトカインとして単離
された。この亜科の他の要素は、炎症誘発ならびにアミノ酸配列相同性に基づい
て同様に同定された。これは、完全長ならびに短縮形の本発明のＣｋβ−８オリ
ゴヌクレオチドを包含する。
発明の要約
本発明の一態様によると、ヒトＣｋβ−８の切断された形態である新規ポリペ
プチドの混合物、ならびにその生物学的に活性で診断上または治療上有用なフラ
グメント、類似体および誘導体が提供される。
本発明の他の態様によると、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡを包
含するこのようなポリペプチドならびにその生物学的に活性で、診断上または治
療上有用なフラグメント、類似体および誘導体をコードする単離された核酸分子
が提供される。
本発明のさらに別の態様によると、核酸配列を有する組換え原核および／また
は真核宿主細胞を前記タンパク質の発現を促進する条件下で培養し、続いて前記
タンパク質を回収することからなる組換え技術による、このようなポリペプチド
の産生法が提供される。
本発明のさらに別の態様によると、治療目的、例えば骨髄幹細胞を化学療法期
間中化学療法剤から保護するため、または傷の癒合を刺激するための、このよう
なポリペプチド、またはこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
の利用法が提供される。
本発明の別の態様によると、このようなポリペプチドに対する抗体が提供され
る。
本発明のさらに別の態様によると、このようなポリペプチドに対する拮抗物質
であって、このようなポリペプチドの作用を抑制するため、例えば再生不能性貧
血、せき髄形成異常症候群、喘息および関節炎を治療するために用いられるもの
が提供される。
本発明の他の態様によると、Ｃｋβ−８核酸配列と特異的にハイブリッド形成
をするのに十分な長さの核酸分子を含む核酸プローブも提供される。本発明のさ
らに別の態様によると、ポリペプチドの不十分な発現および過剰発現に関連する
病気を検出するため、およびこのようなポリペプチドをコードする核酸配列にお
ける突然変異を検出するための診断法が提供される。
本発明のさらに別の態様によると、このようなポリペプチド、またはこのよう
なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの、科学的研究、ＤＮＡの合成お
よびＤＮＡベクターの製造に関連したｉｎ ｖｉｔｒｏ目的、ヒトの病気の治療
についての治療法および診断法を開発する目的に関する研究試薬としての利用法
が提供される。
本発明のこれらのまた他の態様は本明細書の内容から当業者には明らかである
。
発明の詳細な記載
プロ炎症性「相互分泌」ケモカイン超科に構造的に関連したポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列は記載されている。完全長Ｃｋβ−８(１２０アミノ酸)をコー
ドするポリヌクレオチド配列は大動脈内皮ｃＤＮＡライブラリー由来であった。
本発明は長い形態の８２、７６、７５または７４Ｃ−末端アミノ酸だけを含むＣ
ｋβ−８の新規短縮形に関する。Ｎ−末端アミノ酸ならびに２１残基シグナルペ
プチド配列を開裂する。Ｃｋβ−８の長い形態に関しては、これらのクローン中
の最初の２つのシステイン残基は「Ｃ−Ｃ」となる隣接した位置にあるかまたは
ケモカインのベータ亜科である。このモチーフの存在により、これらは最初の２
つのシステイン残基がアミノ酸により分断されているケモカインの亜科（「ＣＸ
Ｃ」）と区別される。
成熟ポリペプチド（配列番号１、２、３および４）をコードするポリヌクレオ
チド配列は、ポリペプチドに結合した追加のコーディングおよび非コーディング
配列を含むＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ゲノムＤＮＡなどのいずれかの核酸形態で表さ
れる。さらに、アミノ酸コードの同義性のために、同じ成熟ポリペプチドをコー
ドするいずれのＤＮＡコーディング配列も本発明の範囲内であると考えられる。
いずれのこの配列の変異体型、対立遺伝子のものまたは天然に存在しないものも
包含される。本発明はさらに、タンパク質の細胞からの発現または分泌を助ける
かまたは細胞中のタンパク質を同定するためのマーカー（例えば、ＨＡタグ）と
して働くコーディング配列が同じリーディングフレーム内で他のＤＮＡ配列と融
合したポリヌクレオチドを包含する。
本発明はさらに記載した配列と少なくとも５０％、好ましくは７０％の配列同
一性でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列に関する。これらのポリヌク
レオチドは好ましくは成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能または活性を保持す
るポリペプチドをコードする。別法として、配列は、本発明の配列と同一性を有
し、ハイブリッド形成するが、活性を保持しない好ましくは５０塩基を有するポ
リヌクレオチドである。このような配列はプローブまたはＰＣＲプライマーとし
て用いられる。
本発明のポリペプチドは組換えポリペプチド、天然のポリペプチド、または合
成ポリペプチドであってもよい。これらのポリペプチドの誘導体は、１またはそ
れ以上のアミノ酸置換が存在するもの；１またはそれ以上のアミノ酸が置換基を
含有するもの；１またはそれ以上の成熟タンパク質が他の化合物と縮合している
もの；または別のアミノ酸が成熟タンパク質と縮合しているものである。
本発明のポリペプチドは好ましくは単離された形態で提供され、好ましくは均
質になるまで精製される。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、このベクターで
遺伝子操作された宿主細胞、および組換え技術による本発明のポリペプチドの産
生に関する。宿主細胞は本発明のベクター（クローニングまたは発現）で遺伝子
操作される。これらの細胞についてのプロモーターを活性化するため、形質転換
体を選択するため、または切断されたＣｋβ−８遺伝子を増幅するための培養条
件は、当業者には明らかである。
このポリヌクレオチド配列は、これらが宿主細胞中で複製可能で、生存可能な
かぎり、種々の発現ベクターのいずれかに包含される。発現ベクター中に挿入さ
れたポリヌクレオチド配列はｍＲＮＡ合成を行う適当なプロモーター（例えば、
ＬＴＲプロモーター）の制御下にある。発現ベクターはさらに、翻訳開始のため
のリボソーム結合部位、転写ターミネーター、転写を増加させるエンハンサーエ
レメント(例えば、ＳＶ４０後期エンハンサー)、および宿主中のベクターの維持
を確実にするための適当な選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性遺伝子）も
含有する。宿主細胞は、哺乳動物または昆虫細胞などの高等な真核性細胞、酵母
などの低級な真核細胞、または細菌などの原核細胞であり得る。この構築物の宿
主細胞中への導入は、種々のプロトコルにより行いうる。前記工程はすべて当業
者には明らかである。クローニング段階およびに宿主およびベクター選択は当業
界で周知である。[Ｓambrookら、モレキュラ・クローニング：ア・ラボラトリー
・マニュアル(Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual)、第２版、コール
ド・スプリング・ハーバー(Ｃold Ｓpring Ｈarbor,Ｎ.Ｙ)(１９８９)]。
タンパク質は適当なプロモーターの制御下で宿主細胞中で合成できる。無細胞
翻訳系も、本発明のＤＮＡ構築物由来のＲＮＡを用いたこのようなタンパク質の
産生に用いることができる。別法として、本発明のポリペプチドは通常のペプチ
ド合成器により合成できる。
適当な宿主株の形質転換またはトランスフェクションおよび宿主株の適当な細
胞密度までの増殖の後、選択したプロモーターを適当な手段（例えば、温度シフ
トまたは化学誘発）により誘発させ、細胞を更なる期間培養する。細胞を典型的
には遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破砕し、種々の方法
（例えば、クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ）により均質になるまで精製する。採
用した宿主細胞によって、ポリペプチドを何らかの方法で（例えば、グリコシル
化）修飾してもよい。本発明のポリペプチドはさらに最初のメチオニン残基も包
含する。
Ｃｋβ−８の長形は白血球の化学誘引物質であり、したがって種々の免疫調節
および炎症機能ならびに種々の病気の状態に用いられる。このタンパク質は造血
起源の組織において主に発現される。Ｃｋβ−８ポリペプチドの白血球に対する
重要な生物学的効果の一つは、Ｃａ＋＋予備の動員の刺激である。この動員は細
胞の機能的活性化に関与する。Ｃｋβ−８の４つの短縮形（配列番号１−４）を
含む混合物での分化したＥＯＬ−３細胞の刺激は量に応じて細胞内Ｃａ＋＋を即
時的に増加させる。個々に試験した場合、配列番号４を有する短縮形がもっとも
活性である。対照的に、Ｃｋβ−８の長形はＣａ＋＋の動員で短縮形のおよそ１
０００倍効力が低い。本発明の短縮形の効力は、化学療法中の化学療法剤からの
骨髄幹細胞の保護、白血病性細胞の除去、免疫応答の刺激、造血の調節、リンパ
球交換、乾癬、固体腫瘍の治療、耐性慢性および急性感染症に対する宿主防御の
向上、および傷癒合の刺激などを包含する（これに限定されない）このケモカイ
ンの治療用途の有効性に関与する。
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは研究試薬として、ＤＮＡの合
成およびＤＮＡベクターの製造において、またヒトの病気（例えば、未熟造血先
祖細胞の膨張において）の治療のための療法および診断法の開発の目的で用いら
れる。この切断されたＣｋβ−８ポリヌクレオチド配列のフラグメントも、高い
配列類似性を有する他の遺伝子を単離するためにハイブリダイゼーションプロー
ブとして用いられる。この種の実験に関する技術は当業者には公知である。
本発明はさらにこれらの配列の、核酸配列における突然変異の存在に関連した
病気または病気に対する感受性を検出するための診断法の一部としての使用に関
する。このような病気はケモカインポリペプチドの不十分な発現に関連する。例
えば、Ｃｋβ−８遺伝子中に突然変異を有する個体はＰＣＲなどの種々の技術に
よりＤＮＡレベルで検出される。ＤＮＡ配列の違いに基づく遺伝子試験は変性剤
を含むかまたは含まないゲル中でのＤＮＡフラグメントの電気泳動度の変化を検
出することにより行われる。特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーショ
ン、ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列化、ＲＦＬＰ分析、およびゲ
ノムＤＮＡのサザンブロッティングなどの方法により達成される。突然変異はさ
らに正常部位分析にっても検出できる。
本発明はまた、正常な対照組織サンプルと比べてのタンパク質の過剰発現は病
気の存在または病気に対する感受性、例えば腫瘍を検出するので、種々の組織に
おけるＣｋβ−８たんぱくのレベルの変化を検出する診断法に関する。宿主由来
のサンプルにおけるＣｋβ−８のレベルの検出に用いる分析法は当業者には周知
であり、放射線免疫検定法、競合性結合分析、ウェスタンブロット分析、ＥＬＩ
ＳＡ検定および「サンドウィッチ」検定を包含する。
本発明はケモカインポリペプチドに関するレセプターの同定法を提供する。レ
セプターをコードする遺伝子はリガンドパンニングおよびＦＡＣＳ選別を包含す
る当業者に公知の多くの方法により同定できる。
レセプター同定の別法は、標識したポリペプチドの細胞膜またはレセプター分
子を発現する抽出物に対するフォトアフィニティー結合を含む。標識した複合体
は単離でき、タンパク質のマイクロシーケンシングに付す。得られたアミノ酸配
列を、推定レセプターをコードする遺伝子を同定するためにｃＤＮＡライブラリ
ーをスクリーンするための１組の同義性オリゴヌクレオチドプローブをデザイン
するために用いる。
本発明は、本発明のケモカインポリペプチドに対する作用物質および拮抗物質
を同定するための化合物のスクリーン法を提供する。走化性は、これらのポリペ
プチドにより化学的に誘引された細胞を、細胞が通り抜けられるほどの大きさの
孔（５ｍｍ）を有するフィルターの上面に置くことにより分析する。有効な作用
物質または拮抗物質の溶液をボトムチャンバー中に入れ、一定期間にわたり細胞
が膜を通って遊走するかまたは遊走しないようにする。別法として、Ｃｋβ−８
の受容体を化合物の存在下で標識したポリペプチドとともにインキュベートする
。化合物のこの相互作用をブロックするかまたはポリペプチドの非存在下で受容
体と相互作用するかのいずれかの能力を測定できる。
有効な切断Ｃｋβ−８拮抗物質の例は、抗体、ポリペプチドと結合するオリゴ
ヌクレオチドまたは野生型ポリペプチドの受容体と結合するが生物学的活性を保
持しないポリペプチドを包含する。遺伝子発現を制御するのに用いるアンチセン
ス技術も有効な拮抗物質でありえる。前記技術の利用可能性は当業者には明らか
である。
拮抗物質は、珪肺症、サルコイドーシス、特発性肺線維症、特発性過好酸球増
加症候群、および内毒素ショックなどの、すべて本発明のポリペプチドの産生を
防止することによる感染症の治療に用いられる。拮抗物質はさらに、動脈壁中の
単球の浸潤を防止することによるアテローム性動脈硬化症の治療にも用いられる
。
拮抗物質はヒスタミンに媒介されるアレルギー反応および真皮を含む種々の免
疫学的障害の治療に用いられる。拮抗物質はさらに傷部分への単球の誘引を防ぐ
ことによる慢性および急性炎症の治療にも用いられる。これらはまた、病気にか
かった部位への単球の流入を防ぐことによる、炎症性肺疾患、一般的炎症、およ
び慢性関節リウマチの治療にも用いられる。
拮抗物質はさらに再生不能性貧血またはせき髄形成異常症候群における骨髄不
全の患者の治療にも用いられる。これらはまた、喘息およびアレルギーならびに
喘息肺の特徴である上皮下基底膜線維症の治療にも用いられる。
ケモカインポリペプチドおよび作用物質および拮抗物質は、食塩水、緩衝食塩
水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびその組み合わせな
どの適当な医薬担体と組み合わせて用いられる。処方物は投与様式にあったもの
でなければならない。本発明はさらに、１またはそれ以上の本発明の医薬組成物
の成分を充填した１またはそれ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供
する。ポリペプチド、作用物質、および拮抗物質を他の治療化合物と組み合わせ
て用いてもよい。
医薬組成物は、特定の適応症の治療に関して有効な量で、局所、静脈内、腹膜
組織内、筋肉内、腫瘍内、皮下、鼻腔内、または皮内経路によるなど都合よい方
法で投与される。これらの用途は当業者に明らかである。
ケモカインポリペプチド、作用物質、またはポリペプチドである拮抗物質は本
発明にしたがってこのようなポリペプチドのｉｎ ｖｉｖｏでの発現により用い
られる。この種の遺伝子療法は当業者には周知である。例えば、患者からの細胞
を、ｅｘ ｖｉｖｏでＣｋβ−８ポリペプチドの短縮形をコードするＤＮＡまた
はＲＮＡを用いて操作し、これらのポリペプチドを発現する操作した細胞を患者
に投与する。同様に、細胞をｉｎ ｖｉｖｏのポリペプチドの発現のためにｉｎ
ｖｉｖｏで操作してもよい。
当業界で公知のように、本発明のポリペプチドをコードするＲＮＡを含有する
レトロウイルス粒子を用いてもよい。レトロウイルスプラスミドベクターを用い
て、種々の手段（例えばエレクトロポレイション）によりパッケージングセルラ
イン（例えば、ＰＥ５０１）を導入してプロデューサーセルラインを形成する。
好ましい具体例において、ポリヌクレオチド配列を含有するレトロウイルス発現
ベクターはＬＴＲなどのプロモーターの制御下にあり、選択可能な薬剤耐性マー
カー（例えば、ｎｅｏ）を含有する。これらのベクターの調製および得られたセ
ルラインは当業者に、また本明細書に記載されている技術からよく知られたもの
である。プロデューサーセルラインはポリペプチドをコードする核酸配列を含む
感染性レトロウイルスベクター粒子を生成する。このようなレトロウイルスベク
ター粒子を用いて線維芽細胞または内皮細胞などの真核細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏ
またはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで導入する。導入された真核細胞は次にタンパ
ク質をコードする核酸配列を発現する。
本発明の配列はさらに染色体同定について重要である。配列は特異的に標的に
され、個々の染色体上の特定の位置でハイブリッド形成できる。染色体について
のＤＮＡのマッピングは病気に関連する遺伝子の相関において重要な段階である
。当業者に公知の技術の１つでは、個々のヒトの染色体を含有する体細胞ハイブ
リッドのＰＣＲスクリーニングに用いるプライマーの調製を含む。プライマーに
対応するヒト遺伝子を含有するこれらのハイブリッドだけが増幅されたフラグメ
ント
を生じる。当業者に公知の他のマッピング法は、正常部位ハイブリダイゼーショ
ン、標識した流動分別染色体でのプレスクリーニング、同じＰＣＲプライマーを
用いた特定の染色体のフラグメントへのサブローカライゼーション、および染色
体特異性−ｃＤＮＡライブラリーを構築するためのハイブリダイゼーションによ
る予備選択を包含するが、これに限定されない。分裂中期染色体に対するｃＤＮ
Ａクローンの蛍光正常部位ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を、１工程にお
ける正確な染色体位置を得るために用いることができる。
配列を正確な染色体位置に決定すると、配列の物理的位置を遺伝子地図データ
と相関させることができる。遺伝子と病気との関係は連関分析により確認できる
。病気にかかった個体とかかっていない個体間のｃＤＮＡまたはゲノム配列にお
けるいずれの違いも病気を表示しうる。例えば、病気にかかった個体にのみ見い
だされるＤＮＡにおける突然変異は、病気の原因物質であり得る。
ポリペプチド、そのフラグメントまたは他の誘導体、あるいはその類似体、ま
たはこれらを発現する細胞を免疫原として用いて、これに対する抗体を産生する
ことができる。これらの抗体は、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗
体であり得る。本発明はさらに、キメラ、単鎖およびヒト化抗体、ならびにＦａ
ｂフラグメント、またはＦａｂ発現ライブラリーの産物も包含する。当業界で公
知の種々の手順を、このような抗体およびフラグメントの産生について用いる。
標準法によりに調製したポリクローナル抗体を、該ポリペプチドを発現する組織
からポリペプチドを単離するのに用いることができる。モノクローナル抗体の調
製について、連続セルライン培養により産生される抗体を提供するいずれの技術
も用いることができる。さらに、本発明の免疫原性ポリペプチドに対するヒト化
抗体を産生するのに、単鎖抗体の産生について記載された技術を用いてもよい。
また、本発明の免疫原性ポリペプチドに対するヒト化抗体を発現するのに、トラ
ンスジェニックマウスを用いてもよい。
本発明をさらに以下の実施例を参照して記載する；しかし、本発明はこのよう
な実施例に限定されないと理解される。以下の実施例の理解を助けるために、頻
出法および／または用語を記載する。
本発明における出発プラスミドは、市販されているか、無制限に公に入手可能
であるか、または公開された手順にしたがって入手可能なプラスミドから構築で
きる。加えて、記載されているものと等価なプラスミドは当業界で公知であり、
当業者には明らかである。本発明においてＤＮＡの「消化」に用いる種々の制限
酵素は商業的に入手可能であり、その反応条件、コファクターおよび他の要件は
、当業者に知られているようにして用いた。開裂したフラグメントの寸法分離を
８％ポリアクリルアミドゲルを用いて行う。
オリゴヌクレオチドは化学的に合成された一本鎖ポリデオキシヌクレオチドま
たは２本の相補ポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを意味する。このような
合成オリゴヌクレオチドは、５’ホスフェートを有しないので、キナーゼの存在
下でホスフェートにＡＴＰを添加しないで他のオリゴヌクレオチドと結紮できな
い。合成オリゴヌクレオチドを脱ホスホリル化していないフラグンメントと結紮
する。特記しないかぎり、形質転換は、Ｇraham,Ｆ.およびＶan der Ｅｂ，Ａ、
バイロロジー（Ｖirology）１９７３、５２、４５６−４５７の方法において記
載されているようにして行った。
以下の実施例は例示目的のみで提示されたものであって、本発明の範囲をなん
ら制限するものではない。
実施例
実施例１：Ｃｋβ−８の細菌性発現および精製
Ｃｋβ−８をコードするＤＮＡ配列、ＡＴＣＣ＃７５６７６を、まず処理した
Ｃｋβ−８タンパク質の５’および３’末端配列(シグナルペプチド配列を除く)
およびＣｋβ−８遺伝子に対するベクター配列３’に対応するＰＣＲプライマー
を用いて増幅した。５’オリゴヌクレオチドプライマーは配列５’ＴＣＡＧＧＡ
ＴＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＡＧＡＴＧＣＡＧＡ３’(配列番号：５)を有し、３’プ
ライマーは配列５’ＣＧＣＴＣＴＡＧＡＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ３
’(配列番号：６)を有する。これらのプライマーはそれぞれアンピシリン耐性細
菌発現ベクターＰＱＥ−９[キアゲン・インコーポレイテッド(Ｑuigen,Ｉnc.，
Ｃhatswarth，ＣＡ)]のポリリンカー領域中へのクローニングに用いられるＢ
ａｍＨＩおよびＸｂａＩ制限部位を含む。増幅された配列をフレーム中ＰＱＥ−
９中にヒスチジンタグおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）をコードする配列と
結紮した。この結紮を、複数のプラスミドｐＲＥＰ４を含有するイー・コリＭ１
５／ｒｅｐ４株（キアゲン）を形質転換するのに用いた。ｐＲＥＰ４はｌａｃＩ
リプレッサーを発現し、さらにカナマイシン耐性を付与する。形質転換体をその
アンピシリン／カナマイシンを補足したＬＢプレート上で増殖する能力により選
択した。望ましい構造を有するクローン（制限分析により単離し、確認）をＡｍ
ｐ（１００μｇ／ｍｌ）およびＫａｎ（２５μｇ／ｍｌ）の両方で補足したＬＢ
培地中液体培地中で一夜増殖させた。この培養物を用いて、大きな培養物に１：
１００ないし１：２５０の割合で接種した。細胞を０．４と０．６間の光学密度
６００まで増殖させた。ＩＰＴＧ（イソプロピル−Ｂ−Ｄ−チオガラクト−ピラ
ノシド）を次に最終濃度１ｍＭに添加した。細胞をさらに３ないし４時間増殖さ
せ、遠心分離により収穫した。細胞ペレットをカオトロフィー剤、６Ｍ グアニ
ジンＨＣｌ中に可溶化させ、清澄化させ、６−Ｈｉｓタグを含有するタンパク質
による緊密な結合をもたらすような条件下でニッケル−キレートカラム上クロマ
トグラフィーにかけた[Ｈochuli,Ｅ.ら、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィ
ー（Ｊ.Ｃhromatography）１９８４、４１１、１７７−１８４]。切断Ｃｋβ−
８（９５％純度）を６ＭグアニジンＨＣｌ ｐＨ５中カラムから溶出させ、復元
のために３ＭグアニジンＨＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、１０ｍＭグルタ
チオン（還元）および２ｍＭグルタチオン（酸化）に調節した。この溶液中１２
時間インキュベートした後、タンパク質を１０ｍＭリン酸ナトリウムに対して透
析した。
実施例２：ＣＯＳ細胞における組換えＣｋβ−８の発現
プラスミド、ＣＭＶ−Ｃｋβ−８ ＨＡの発現は、アンピシリン耐性遺伝子お
よびＣＭＶプロモーター、それに続くポリリンカー領域、ＳＶ４０イントロン、
ならびにポリアデニル化部位を含有するベクターｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ（インビ
トロゲン）から誘導される。切断Ｃｋβ−８配列およびフレーム中で３’末端と
融合したＨＡタグをコードするＤＮＡフラグメントをベクターのポリリンカー領
域中にクローンし；組換えタンパク質発現をＣＭＶプロモーター下で行う。ＨＡ
タグはすでに記載されているようにインフルエンザヘマグルチニンタンパク質由
来のエピトープに対応する[Ｉ.Ｗilsonら、セル（Ｃell）１９８４、３７：７６
７]。ＨＡタグの標的タンパク質への浸出により、ＨＡエピトープを認識する抗
体での組換えタンパク質の検出が容易になる。
Ｃｋβ−８の組換え短縮形の発現のために、ＣＯＳ細胞をＤＥＡＥ−デキスト
ラン法により発現ベクターでトランスフェクションする[Ｊ.Ｓambrook、Ｅ.Ｆri
tsch、Ｔ.Ｍaniatis、モレキュラ・クローニング:ア・ラボラトリー・マニュアル(
Ｍolecular Ｃloning：ＡＬaboratory Ｍanual,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌabora
tory Ｐress)(１９８９)]。細胞を８時間３５Ｓ−システインでトランスフェク
ションの２日後に標識する。培地を次に集め、細胞を界面活性剤（ＲＩＰＡ緩衝
液(１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ−４０、
０．５％ＤＯＣ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５)）で溶解させる[Ｗilson,Ｉ.
ら、同上、１９８４、３７：７６７]。細胞溶解物および培地の両方をＨＡ特異
性モノクローナル抗体で沈殿させる。析出したタンパク質を１５％ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥゲル上で分析する。
実施例３：バクロウイルス発現系を用いたケモカインＣｋβ−８の短縮形の発現
および精製
ＳＦ９細胞を、Ｃｋβ−８ｃＤＮＡを発現するようにデザインされた組換えバ
クロウイルスで感染させた。細胞を１０リットルの培地中、感染多重度２で感染
させ、低血清条件下、２８℃で７２ないし９６時間感染させた。感染培地からの
細胞片を低速遠心分離により除去した。プロテアーゼ抑制物質カクテルを上清に
最終濃度２０μｇ／ｍｌ（１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌ Ｅ−６４
および１ｍＭ ＥＤＴＡ）で添加した。これらの特定の培養条件（すなわち、低
血清）によりＣｋβ−８ポリペプチドのいくつかのＮＨ−２末端切断形態が得ら
れる。２０ないし３０μｌの上清を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上にかけること
により上清中のＣｋβ−８のレベルをモニターした。Ｃｋβ−８の短縮形を数ｍ
ｇ／リットルの発現レベルに対応する可視バンドとして検出した。末端切断Ｃｋ
β−８を３段階精製法によりさらに精製した：
１）ヘパリン結合アフィニティークロマトグラフィー。バクロウイルス培養物
の上清を、１００ｍＭ ＨＥＰＥ／ＭＥＭ／ＮａＯＡｃ ｐＨ６を含有する１／
３体積の緩衝液と混合し、０．２２μｍ膜を通して濾過した。サンプルを次にヘ
パリン結合カラム（ＨＥ１多孔性２０、バイオ−パースペクティブ・システム・
インコーポレイテッド）にかけた。ＣＫβ−８の短縮形を約３００ｍＭ ＮａＣ
ｌで５０ｍＭ ＨＥＰＥ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ（ｐＨ６）中５０ないし５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌの直線的勾配で溶出し；
２）カチオン交換クロマトグラフィー。ヘパリンクロマトグラフィーにより富
化したタンパク質を５０ｍＭ ＨＥＰＥ／ＭＥＳ／ＮａＯＡｃ（ｐＨ６）を含有
する緩衝液で５倍希釈にした。得られた混合物を次にカチオン交換カラム（Ｓ／
Ｍ 多孔性２０、バイオ−パースペクティブ・システム・インコーポレイテッド）
にかけた。末端切断されたＣｋβ−８を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＭＥＳ／ＮａＯ
Ａｃ（ｐＨ６）中２５から３００ｍＭのＮａＣｌの直線的勾配中２５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌで溶出し；
３）サイズ排除クロマトグラフィー。
カチオン交換クロマトグラフィーの後に、末端切断されたＣｋβ−８をサイズ
排除カラム（ＨＷ５０、ＴＯＳＯ ＨＡＡＳ、１．４×４５ｃｍ）によりさらに
精製した。精製したサンプルのアミノ酸配列化により、タンパク質の４つの切断
形態（配列番号１、２、３、および４）に対応する少なくとも４つの主な配列が
判明した。
実施例４：Ｃｋβ−８の短縮形を含む混合物でのＥＯＬ−３細胞およびＰＢＳの
刺激
ＥＯＬ−３細胞を標準的増殖条件下で増殖させ、２週間１μＭ Ｎａブチラー
トで分画した。ＰＢＬ（末梢血白血球）をヒトドナーから静脈穿刺により得た。
ＰＢＬを標準的技術により精製した。両細胞調製物に別々にＦＵＲＡ−２（１μ
Ｍ）を４５分間添加た。１×１０6／ｍｌ（合計２ｍｌ）の細胞をプラスチック
製キュベットに移した。ＣＫβ−８の短縮形（８７１ａ、８７１ｂ、８７１ｃ、
８７１ＰＲ）または長形（８８９）を０．３３ないし３３ｎＭの濃度で添加する
前に、蛍光分光光度計を調節して、ベースライン記録を得た。蛍光の増加を分光
光度計でモニターした。細胞内部のフリーなＣａ＋＋における変化を、まず細胞
を過剰のＣａ＋＋の存在下でＴｒｉｔｏｎ×１００で溶解させ(Ｆｍａｘを得る
ため)、次にＦｍｉｎを得るために５ｍＭ ＥＧＴＡを添加することにより計算し
た。フリーなＣａ＋＋の割合は最小および最大値から計算できる。ＭＣＰ−１（
単球走化性タンパク質−１）は公知のケモカインであり、正の対照として用いた
。
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(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02
Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ
Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
1/68 Ａ６１Ｋ 37/02
//(Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(Ｃ１２Ｐ 21/02
Ｃ１２Ｒ 1:91）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ
，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，
ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，Ｌ
Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ
，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，
ＵＺ，ＶＮ
(72)発明者 オシャネシー，ダニエル
アメリカ合衆国19468ペンシルベニア州
リマリック、ヒッコリー・グローブ・ドラ
イブ912番
(72)発明者 フォーンウァルド，ジェイムズ・アラン
アメリカ合衆国19403ペンシルベニア州
ノーリスタウン、リングネック・ロード
2849番
(72)発明者 オドネル，ケビン
アメリカ合衆国19002ペンシルベニア州
アンバー、イースト・パーク・アベニュー
204番