JPH11513031A - 多種サブタイプｆｉｖワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、多種サブタイプFIVワクチンを用いて、広範囲のFIV株による感染からネコを守るための新規の方法および組成物に関する。無細胞ウイルス全体またはウイルス感染細胞株のいずれかを含む多種サブタイプFIVワクチンについて記述する。本ワクチン組成物によるネコのワクチン接種法についても記述する。本発明の方法および組成物に従ってワクチン接種したネコは、同種または異種FIV株でチャレンジした場合、FIVに対して防御的液性および細胞性免疫反応を示す。本発明はまた、FIV易感染性である新規のネコ科細胞株およびその利用法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 多種サブタイプFIVワクチン 本発明は米国国立衛生研究所助成金番号NIH AI30904による助成を受けた研究 プロジェクトの下で政府の支援を受けて行われた。米国政府は本発明に一定の権 利を保有する。 発明の背景 飼いネコは、ネコ白血病ウイルス（FeLV）、ネコ肉腫ウイルス（FeSV）、内因 型C型オンコロナウイルス（RD-114）、およびネコ合胞体形成ウイルス（FeSFV） を含むいくつかのレトロウイルスによる感染症にかかりやすい。これらの中で、 FeLVは最も重要な病原体で、リンパ網内系および骨髄新生物、貧血、免疫媒介疾 患、ならびにヒト後天性免疫不全症候群（AIDS）と同様の免疫不全症候群を含む 多様な症状を引き起こす。最近では、FeLV-AIDSと呼ばれる特定の複製欠損FeLV 変異株が免疫抑制特性により一層関連している。 ネコTリンパ球親和性レンチウイルス（現在では、ネコ免疫不全ウイルス、FIV と呼ばれている）の発見は、ペダーセンら（Pedersen，1987）によって最初に報 告された。FIVの特徴は、ヤマモトら（Yamamoto，1988a）；ヤマモトら（Yamamo to，1988b）；およびアックリーら（Ackley，1990）において報告されている。 血清疫学的データにより、FIV感染が世界中の飼いネコおよび野生のネコに固有 であることが示された。流産、脱毛、貧血、結膜炎、慢性鼻炎、腸炎、歯肉炎、 血便排泄、神経異常、歯周炎、および脂漏性皮膚炎を含む広く多様な症状は、FI Vによる感染症に関連する。FIVに感染した飼いネコの顕著な免疫学的特徴は、ネ コのCD4⁺末梢血リンパ球の慢性的および進行性枯渇、CD4：CD8細胞比の低下、お よびいくつかの症例ではCD8保有リンパ球の増加である。分子、生化学、および 免疫病理学的特徴に基づき、ネコのFIV感染症は今や、FeLV-FAIDSより良いネコ のAIDSモデルであると思われる。 FIVのクローニングおよび配列分析は、オルムステッドら（Olmsted，1989a） ；オルムステッドら（Olmsted，1989b）；およびタルボットら（Talbott，1989 ）において報告されている。ホージー＆ジャレット（Hosie and Jarret，1990） は、FIVに感染したネコの血清学的反応について記述している。FIVウイルスサブ タイ プは、それぞれの株によって誘発された交叉中和抗体の濃度に基づく免疫型に従 って分類することができる（マーフィー＆キングスバリー（Murphy and Kingsbu ry）、1990）。近年、ヌクレオチド配列の相同性に基づく遺伝子型に従って、ウ イルスがサブタイプに分類された。HIVおよびFIVサブタイプ分類は遺伝子型に基 づくが（ソドラら（Sodora）、1994）；リグビーら（Rigby）、1993；およびル ワジーら（Louwagie）、1993）、サブタイプの遺伝子型と免疫型の間の相関に関 してはほとんどわかっていない。FIVウイルス単離体は現在、４つのFIVサブタイ プに分類されている：A、B、CおよびD（カキヌマら（Kakinuma）、1995）。感染 性単離体および感染性分子クローンは、サブタイプCを除く全てのFIVサブタイプ について記述されている（ソドラら（Sodora）、1994）。サブタイプCのFIVは、 カナダのネコの細胞DNAから唯一同定されている（ソドラら（Sodora）、1994； リグビーら（Rigby）、1993；カキヌマら（Kakinuma）、1995）。 FIVワクチンを開発する上で主に難しい点は、異なるサブタイプまたはクレー ドからのフィールド単離体を含む広範囲のFIV株に対して有効なワクチンアプロ ーチを特定することであった。FIVに対するワクチン予防は、単一株のワクチン を用いた場合、同種およびわずかに異種の株に対しては予防できたが、中程度か ら大きく異なる種の株によるチャレンジでは予防できない（ジョンソンら（John son）、1994；ヤマモトら（Yamamoto）、1993））。したがって、依然として多 数のFIVサブタイプから防御することのできるワクチンが必要とされている。 発明の簡単な概要 本発明は、宿主動物におけるFIV感染症に対して広範囲の防御的免疫を誘発す るワクチンに関する。特に、本発明は異なるFIVサブタイプから単離された無細 胞ウイルス単離株、またはそれぞれが異なるサブタイプの異なるプロトタイプFI Vウイルスに感染した細胞株の組み合わせ、を用いて調製される多種サブタイプF IVワクチンに関する。本発明のFIVワクチンを接種したネコは、同種および異種F IV株に対して液性および細胞性の免疫反応を引き起こす。 本発明はまた、多種のFIVサブタイプに易感染性である新規のネコ科細胞株に も関する。本発明の細胞株は、本発明の方法によるFIVワクチンにおける使用と 共に、多種のFIVサブタイプの増殖および産生に有用である。さらに、本細胞株 はまた 、ネコ抗血清のFIVウイルス中和アッセイにおいてネコ末梢血単核球（PBMC）の 代わりに用いることができる。 図面の簡単な説明 図１は、これらのFIV株でFeT-1CおよびFeT-J細胞株を感染させた後に産生され たFIV_BangおよびFIV_Shiの逆転写酵素（RT）濃度を示す。 図２は、イムノブロットによって検出された、２種サブタイプワクチン接種ネ コの抗FIV抗体とFIV蛋白質との免疫反応を示す。各ブロット上の数値は、血清を 検査した時点での動物に行ったワクチン接種回数を表す。 図３は、イムノブロットによって検出された、３種サブタイプワクチン接種ネ コの抗FIV抗体とFIV蛋白質との免疫反応を示す。各ブロット上の数値は、血清を 検査した時点での動物に行ったワクチン接種回数を表す。 図４は、ELISAによって検出した、３種サブタイプワクチン接種ネコから得た 抗FIV抗体とFIV SU-V3-2ペプチドとの免疫反応性を示す。 図５は、ELISAによって検出した、３種サブタイプワクチン接種ネコから得た 抗FIV抗体とFIV TM-C1ペプチドとの免疫反応性を示す。 図６は、FIV_Pet（A_P）、FIV_Dix（A_D）、FIV_UK8（A_U）、FIV_Bang（B_B）、FIV_{Ao m1} （B_A）、およびFIV_Shi（D_S）のいずれかに感染したネコから得た血清の交叉中 和抗体価を示す。感染前（カラム１）、感染後６ヶ月（カラム２）、および感染 後12ヶ月（カラム３）での血清を、FeT-1C-細胞株においてサブタイプA FIV_Pet 、サブタイプB FIV_Bang、およびサブタイプD FIV_Shiに関して試験した。１株当 たり少なくとも３匹のネコを試験し、結果は各株の代表的なネコから得たVN力価 を示す。VNアッセイに関しては、初代培養PBMCを用いても同様の結果が得られた 。 配列の簡単な説明 配列番号：１は、SV-V3-2と呼ばれるFIV表面エンベロープペプチドのアミノ酸 配列である。 配列番号：２は、TM-C1と呼ばれるFIV膜通過ペプチドのアミノ酸配列である。 配列番号：３は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：４は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：５は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：６は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：７は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：８は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：９は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：10は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：11は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：12は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：13は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：14は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：15は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 配列番号：16は、FIV PCRプライマーのヌクレオチド配列である。 発明の詳細な開示 本発明は、感受性宿主動物におけるFIV感染症に対する防御的免疫の誘導に有 用な新規の方法およびワクチン組成物に関する。本明細書に記載のワクチン組成 物は、宿主動物に投与すると、FIVの同種および異種株による感染症に対して防 御的液性および細胞性免疫反応を誘導する。ワクチン組成物は、無細胞FIVウイ ルス単離株を含んでいてもFIV-感染細胞株を含んでいてもよい。好ましい態様に おいて、本発明のワクチン組成物は、異なる２つのFIVサブタイプからのFIV株を 含む。好ましくは、ワクチン組成物は、各株が異なるFIVサブタイプである３つ のFIV株を含む。より好ましくは、FIVサブタイプA、サブタイプBおよびサブタイ プDのそれぞれから少なくとも１つのFIV株がワクチン組成物に含まれる。 特定の態様において、ワクチン組成物はFIV_Pet-およびFIV_Shi-感染細胞株を含 む。もう一つの態様において、ワクチン組成物はFIV_Pet-、FIV_Bang-、およびFIV_Shi -感染細胞株を含む。FIVサブタイプの全てまたは一部を表すその他のFIV株の 使用は、本発明において特に企図されるところである。例えば、FIVサブタイプA プロトタイプウイルスを提供する目的で、FIV_DixまたはFIV_UK8をFIV_Petに加えて 、またはFIV_Petの代わりに、ワクチン組成物に含めることができる。FIVサブタ イプBおよびDプロトタイプウイルスに関しても、その他のFIV株による同様の追 加または置換を行うことができる。 本明細書に記載のように、本明細書のワクチン組成物は、FIV感染細胞株、ま たは無細胞ウイルスおよび感染細胞株の組み合わせと共に、無細胞ウイルス全体 、またはウイルス、FIV蛋白質およびポリペプチドの一部を含んでいてもよい。F IV感染細胞株からなるワクチン組成物は、それぞれが異なるFIVサブタイプに感 染した多数の細胞株を含んでいてもよい。本発明のワクチン組成物はまた、例え ばFIV env、gag／pro、またはenv-gag／proを含む組換えウイルスベクターに基 づくFIV構築物を含む。組換え型ベクター／FIV構築物を調製するために用いるこ とができるいかなる適当なウイルスベクターも、本発明での使用が企図される。 例えば、アデノウイルス、鳥類ポックスウイルス、ネコヘルペスウイルス、ワク シニア、カナリアポックス、昆虫ポックス、ブタポックス、および当技術分野で 既知のその他のウイルスに由来するウイルスベクターを、本発明の組成物および 方法と共に用いることができる。FIV成分をコードし発現する組換えポリヌクレ オチドベクターは、当技術分野で既知の標準的な遺伝子操作技術を用いて構築す ることができる。さらに、本明細書に記載の様々なワクチン組成物は、個別に用 いることも、互いに組み合わせて用いることもできる。例えば、動物の一次免疫 には、単一または複数のサブタイプ成分を有する、組換えベクターに基づくFIV 構築物を用い、二次免疫には不活性化FIV-感染細胞株からなるワクチン組成物を 用いてもよい。本発明のワクチン組成物によるその他の免疫プロトコルは、当業 者には明らかで、本発明の範囲内であると企図される。 本明細書に特に記載された多種サブタイプFIVワクチンのネコにおける免疫原 性および有効性を調べた。本ワクチン組成物でワクチン接種した特定病原体非保 有（SPF）ネコの、同種および異種FIV株によるチャレンジ前後の液性および細胞 性免疫をモニターした。液性免疫は、ウイルス中和（VN）抗体活性の測定によっ てモニターし、細胞性免疫は細胞障害性Tリンパ球（CTL）活性の測定によってモ ニターした。ワクチン接種ネコの血清および免疫細胞の同種および異種FIV株に 対するVNおよびCTL活性をそれぞれインビトロで試験し、本ワクチンがFIV感染に 対する広範囲の防御を誘発できることを証明した。本発明の指示に従い、異なる FIVサブタイプからのプロトタイプウイルス単離株を組み合わせることによって 、または異なるサブタイプのプロトタイプウイルスに感染させた個々の細胞を組 み合わ せることによって、有効な多種サブタイプFIVワクチンを産生することができる 。 本明細書に特に例示した株に加えて全てのFIV株は、本発明での使用が企図さ れる。多くのFIV単離株が文献に記述されており、当業者に既知である。FIV_Pet は米国特許第5,037,753号に記述されている。記述されているその他のFIV単離体 は、当業者によって定法を用いて感染したネコから容易に単離することができる 。FIVの単離および培養法は、参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5 ,037,753号および第5,118,602号に記述されている。 本明細書に例示されている新規の細胞株は、本発明のワクチン接種法および組 成物において用いることができる。末梢血単核細胞を含むFIV株易感染性のその 他の細胞または細胞株もまた、本発明での使用が企図される。 FIVウイルス蛋白質の天然ポリペプチド、組換えポリペプチドまたは合成ポリ ペプチド、およびそのペプチド断片もまた、本方法によるワクチン組成物として 用いることができる。好ましい態様において、多種のFIVサブタイプに由来するF IVポリペプチドをワクチン組成物に結合させ、これを用いて宿主動物にワクチン 接種する。例えば、異なるサブタイプからの少なくとも２つのプロトタイプFIV 株からのFIVエンベロープ糖蛋白質に基づくポリペプチドをワクチンに組み合わ せることができる。ポリペプチドは一つの株に対して同種であってもよく、その アミノ酸配列が少なくとも２つの明確なFIVサブタイプからの接合または結合ポ リペプチドに由来する「ハイブリッド」または「キメラ」ポリペプチドを含むも のであってもよい。FIVポリペプチドの調製手順は当業者に周知である。例えば 、FIVポリペプチドは固相合成法を用いて合成することができる（メリフィール ド（Merrifield）、1963）。FIVポリペプチドはまた、FIV蛋白質またはペプチド をコードするポリペプチド分子が、細菌、酵母、または哺乳類細胞株などの宿主 細胞で発現されるよう、DNA組換え技術を用いて産生することができ、当技術分 野の標準的な技術を用いて発現した蛋白質を精製することができる。 本発明はまた、FIVに対して易感染性である新規のネコ科T細胞株にも関する。 インターロイキン-2（IL-2）依存的細胞および非依存的細胞の両者を特に例示す る。FeT-1CおよびFeT-Jと呼ばれる細胞株を本明細書に記述する。FeT-1C細胞株 はIL-2依存的であり、FeT-J細胞株はIL-2非依存的である。本発明の細胞株は、 イン ビトロでのFIVウイルス株の増殖および産生と共に、ネコのFIV免疫の媒体を提供 するのに有用である。IL-2依存的FeT-1CおよびIL-2非依存的FeT-J非感染細胞株 をいずれも培養液中の逆転写酵素（RT）活性についておよびPCRによるFIVプロウ イルス配列について20回以上試験し、FIV陰性であることを確認した。FeT-J細胞 株は、FIV_Shi、FIV_Dix、FIV_UK8、FIV_PetおよびFIV_Bangを含む調べた全てのFIV株 に高度に感染可能であったが、FIV_Shiに直接感染させることはよ比較的困難であ った。 本発明はさらに、本発明の細胞株によって産生された細胞性産物にも関する。 細胞性産物は当業者に既知の方法を用いて単離および検出することができる。細 胞株に対する抗体は、既知の方法を用いて産生させることができ、本発明に企図 される。 FeT-1C（ATCC寄託番号CRL 11968）、およびFeT-J（ATCC寄託番号CTL 11967） と呼ばれるFIV非感染細胞株はいずれも、1995年８月24日に、米国メリーランド 州ロックビルのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ATCC）に寄託された 。FIV_Bang-（ATCC寄託番号11975）およびFIV_Shi-（ATCC寄託番号11976）感染細 胞株は、1995年８月25日にアメリカンタイプカルチャーコレクションに寄託され た。 本培養物は、本特許出願の係属中、特許庁長官により37 CFR 1.14および35 U. S.C.122の下で資格を与えられると決定された者は、寄託物を利用することがで きるよう保証される条件下で寄託されている。寄託物は、本出願の写しまたはそ の所産が提出されている国の外国特許法の要請に応じて利用することができるだ ろう。しかし、寄託物の利用は、政府の決定によって付与された特許権の適用の 制限において本発明を実施する認可とはならないことを理解すべきである。 さらに、本培養寄託物は、微生物の寄託に関するブダペスト条約（BudaPest T reaty for the Deposit of Microorgamisms）の要件に従って保存され、公的に 利用可能となる、すなわち、寄託物は、寄託試料の最も最近の分譲請求から少な くとも５年間、そしていずれにしても、寄託日から少なくとも30年間、または培 養物の開示が発行されるあらゆる特許の有効期間にわたって、細心の注意を払っ て保存され、汚染を免れる。寄託者は、寄託物の状態のために、寄託所が請求時 に試料を分譲できない場合には、寄託物を交換する義務を理解している。本培養 寄 託物の公衆への利用可能性を制限するものは全て、これを開示する特許が付与さ れた際に、変更不可能に取り除かれるであろう。 本発明の方法によれば、本明細書に記載のFIVワクチン組成物は、易感染性宿 主、典型的には飼いネコに有効な量および方法で投与され、その後のチャレンジ またはFIVによる宿主の感染に対する防御的免疫を誘導する。ワクチンは、例え ば皮下、腹腔内、または筋肉内注射によって非経口的に投与されるのが一般的で ある。その他の適当な投与法は経口または鼻腔内投与である。通常、ワクチンは 宿主に少なくとも２回、各投与間に１週間以上の間隔をあけて投与する。しかし 、ワクチンの初回および追加投与に関するその他のレジメは企図されており、実 施者の判断および処置する特定の宿主動物に依る。 本発明のワクチン組成物は、当業者に周知の方法によって調製することができ る。例えば、ワクチンは注射可能の形態、例えば溶液または懸濁液として調製す ることが一般的である。ワクチンは投与剤形と融和するように、受容者に治療的 有効量かつ免疫誘発量で投与する。特定のワクチン製剤の至適投与量および投与 パターンは、当業者によって容易に決定することができる。 ワクチン製剤におけるウイルスおよび細胞は、当技術分野で既知の方法を用い て不活化または弱毒化してもよい。例えば、ウイルス全体および感染細胞をパラ ホルムアルデヒド、ホルマリン、フェノール、UV光線、温度上昇等に暴露するこ とによって不活化またば弱毒化することができる。ワクチン用量における無細胞 FIV全体の量は通常、約0.1 mg〜約５ mgの範囲内で、より通常は約0.2 mg〜約２ mgの範囲内である。FIV感染細胞株からなるワクチン製剤の投与量は通常、約10⁶ 〜約10⁸細胞／用量であり、より一般的には５×10⁶〜約7.5×10⁷細胞／用量で ある。ウイルスまたは細胞は、投与直前にアジュバントと混合するのが一般的で ある。ワクチン製剤において用いられるアジュバントは、トレオニルムラミルジ ペプチド（MDP）（バイアーズら（Byars）、1987）またはフロイトの完全および 不完全アジュバントの混合液のいずれかであることが一般的である。ミョウバン などの、本発明の方法およびワクチンでの使用に適当なその他の多様なアジュバ ントは、当技術分野で周知であり、本発明での使用が企図される。 本発明はさらに、本発明の非感染細胞株を用いて、試料中のウイルス中和（VN ）抗体を解析する新規の方法にも関する。一定数の継代後に使用できなくなり、 FeT-1CまたはFeT-J細胞ほど容易に増殖しないPBMCとは異なり、FeT-1CおよびFeT -J細胞は、確立された細胞株で、今後の使用のために容易に凍結保存することが できる。異なるSPFネコから得られたPBMCは細胞増殖速度およびFIV易感染性が個 々に異なるため、FeT-1C細胞を用いたVNアッセイから得られた結果は、PBMCを用 いたVNアッセイより再現性が高い。さらに、VNアッセイ用のPBMCは、PBMCを用い たインビトロVNアッセイに影響を及ぼす可能性がある、起こりうるインビボ感染 を排除するために、無菌室収容および維持を必要とするSPFネコから得なければ ならない。このように、異なるサブタイプのFIVに容易に感染させることが可能 なFeT-1Cのようなネコ科細胞株は、VNアッセイにおいてPBMCの都合の良い代用と することができる。 本明細書では、FIV株について以下の略語を用いる： 株（サブタイプ） 略語 Petaluma（A） FIV_Pet Dixon（A） FIV_Dix UK8（A） FIV_UK8 Bangston（B） FIV_Bang Aomori-1（B） FIV_Aom1 Aomori-2（B） FIV_Aom2 Shizuoka（D） FIV_Shi 材料および方法 細胞培養。全ての懸濁細胞株は10％熱不活化仔ウシ胎児血清（FCS）を含むPRM I 1640培地で培養した。10 mM HEPES（N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-n'-2- エタンスルホン酸）、２ mM L−グルタミン、50 μg／mlゲンタマイシンおよび ５×10^-5M 2-メルカプトエタノール。IL-2依存的細胞にはヒト組換えIL-2（Cetu s Corporation、エメリービル、カリフォルニア）100 U／mlを補足した。懸濁細 胞は、0.5〜４×10⁶細胞／mlの細胞濃度で継代し、週２回新鮮な培地で再度培養 した。単層細胞は全て、細胞初濃度２×10⁶細胞／mlで週２回継代した。FIV感染 細胞からの組織培養液（TCF）を週２回回収し、3000 rpmで１時間遠心して、残 留細胞 を除去し、試験時に直ちに使用する予定のTCFに関しては、-20℃または-70℃で 保存した。FIV-易感染性細胞（１×10⁶細胞／ml）は約30,000 cpm／mlの逆転写 酵素（RT）活性を有するFIVに感染させた。 FIV の精製。FIV感染細胞株の組織培養液は、個々に2000〜3000 rpmで１時間遠 心して細胞を除去した。TCF中のウイルスは16,000 rpmで２時間超遠心してペレ ットにし、まず10／50％（w／v）不連続蔗糖勾配で、次に10／50％連続蔗糖勾配 で超遠心して精製した（ペダーセンら（Pedersen）、1987；ヤマモトら（Yamamo to）、1988）。ウイルス単離株のそれぞれを18時間1.25％滅菌パラホルムアルデ ヒド（0.22 μm濾過滅菌）で不活化し、その後滅菌PBSで十分に透析した。不活 化ウイルスは、滅菌PBSで500 μg／mlの濃度に希釈し、各株の250 μg／0.5 ml を滅菌マイクロフュージチューブに移して-70℃で保存した。不活化FIV株は室温 で解凍し、不活化ウイルス250 μgの0.5 ml滅菌PBS溶液を免疫直前にアジュバン ト0.5 mlと混合した。FIV-感染細胞株は、個別に18時間1.25％滅菌パラホルムア ルデヒドで不活化し、滅菌PBSで３回洗浄し、滅菌チューブ中で約5.0×10⁷細胞 ／mlの濃度に再懸濁して４℃で保存した。典型的には、不活化感染細胞約2.5×1 0⁷細胞／mlの0.5 ml PBS溶液を免疫直前にアジュバント0.5 mlと混合した。トレ オニルムラミルジペプチド（MDP MF75.2アジュバント；Chiron Corporation、エ メリービル、CA）250 μg／0.5 mlをアジュバントとして用いた。 CTL アッセイ。末梢血単核細胞（PBMC）を、10日間のFIV感染前にコンカナバリ ンA（Con A）で３日間刺激した（ソングら（Song，1992））。これらの細胞をCT Lアッセイの標的細胞として用いた。CTL活性は、Con A刺激PBMCをUV-および放射 線不活化FIV-感染自家PBMCと共に５日間培養することによって生じた。これらの 細胞を刺激エフェクター細胞として用いた。解析当日に標的細胞をNa⁵¹CrO₄ 50 μCiで１〜３時間標識して、３回洗浄し、次に固定数の標識標的細胞（５×10⁴ 細胞／ウェル）をマイクロタイタープレートに加えた。エフェクター細胞を様々 なエフェクター／標的細胞比（例えば、100：1、50：1、および10：1）で３連ず つ加えた。プレートを400 rpmで１分遠心し、37℃で４時間インキュベートした 。対照⁵¹Cr-標識標的細胞を洗浄剤で溶解し、最大放出値を得た。被験試料ウェ ルから上清を収集し、ガンマカウンターを用いて放射能を定量した。エフェクタ ー細胞 の非存在下で⁵¹Cr-標識標的細胞をインキュベートすることによって、自然発生 放出を定量した。特異的細胞障害百分率は以下のように計算した： イムノブロットおよび酵素結合イムノソルベントアッセイ（ELISA） ヤマモ トら（Yamamoto，1993）の記述のように、蔗糖勾配精製ウイルスをイムノブロッ トアッセイの基質として用いた。感染細胞の組織培養液からのFIV_Petは低速遠心 （2000 rpmで45分）で不純物を除去し、超遠心（16,000 rpmで２時間）によって 濃縮し、10／50％（w／v）連続蔗糖勾配上での超遠心によって精製した。この技 法で精製したウイルスをイムノブロットアッセイの基質として用いた。 これまでに記述されたイムノブロット技法（ヤマモトら（Yamamoto）、1991a ）の改変を用いた。ウイルスブロット片は、ウイルスを0.1％SDSで可溶化し、そ の後10％SDSポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ニトロセルロース膜上に 電気泳動的に移動させることによって調製した。ワクチン接種ネコからの血清試 料を緩衝液３（0.15 M塩化ナトリウム、0.001 Mエジチ酸、0.05 Mトリス塩基、0 .05％ツイーン20、および0.1％ウシ血清アルブミン）で１：50に希釈し、イムノ ブロットプレートの個々のウェル中でウイルスブロット片と共に37℃で18時間イ ンキュベートした。ブロット片は洗浄液（0.15 M NaClおよび0.05％ツイーン20 脱イオン水溶液）で個々に洗浄し、ビオチン化抗ネコIgG（Vector Laboratories 、バーリンゲイム、CA）と共に37℃で１時間インキュベートし、洗浄液で３回洗 浄した。次にブロット片を個々に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ス トレプトアビジン（ベクター・ラボラトリーズ）と共に30分インキュベートした 。十分な洗浄後、各片を新鮮な基質溶液（0.05％ジアミノベンジジン、400 μg ／ml NiCl₂、および0.01％H₂O₂の0.1 Mトリス緩衝溶液、pH 7.4）と共に室温で インキュベートした。目に見えるバンドが確立した後、過剰量の蒸留水を加えて 反応を停止させ、ブロット片を乾燥させた。次に、イムノブロット上のバンドの 分子量は、先にアミドブラックで染色した片上の分子量標準物質の移動距離とそ れらの移動距離を比較して決定した。各イムノブロット分析には診断的評価の内 部対照として陽性および陰性対照血清を含めた。 ウイルス抗原特異的ELISAは既に記述されている（ヤマモトら（Yamamoto）、1 991a；ヤマモトら（Yamamoto）、1993）。蔗糖勾配精製FIV_Petおよび表面エンベ ロープ（SU）ならびにFIV_Petの保存（C）および可変（V）領域双方の膜通過（TM ）ペプチドは、96ウェルイムノロンプレート（Dynatic Laboratories，Inc.、シ ャンティリー、VA）上に重炭酸緩衝液（pH 9.6）と共に250 ng／ウェルで12〜18 時間、37℃でコーティングし、ELISAの基質として用いた。SU-V3-2ペプチドのア ミノ酸配列は：Gly Ser Trp Phe Arg Ala Ile Ser Ser Trp Lys Gln Arg Asn Ar g Trp Glu Trp Arg Pro Asp Phe（配列番号：１）；およびTM-C1ペプチドのアミ ノ酸配列は：Gln Glu Leu Gly Cys Asn Gln Asn Gln Phe Phe Cys Lys Ile（配 列番号：２）である。合成ペプチドは、FMOCペプチド合成化学（マガジンら（Ma gazine）、1988）を用いて、バイオサーチ9500ペプチドシンセサイザー（Biosea rch、サンラファエル、CA）で合成した。合成ペプチドの純度は、逆相高速液体 クロマトグラフィー上での単一のピークの存在によって決定し、ピーク試料につ いて実施したアミノ酸配列分析によって確認した。 ペプチドコーティングプレートは、使用直前に緩衝液３で１回洗浄した。血清 試料を緩衝液３で１：200に希釈し、FIV抗原コーティングウェル中で37℃で１時 間インキュベートし、６回洗浄した。ウェルを洗浄液で洗浄し、ビオチン化抗ネ コIgG（Vector Laboratories、バーリンゲイム、CA）と共に37℃で１時間インキ ュベートし、６回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合ストレプト アビジン（ベクター・ラボラトリーズ）と共に37℃で１時間インキュベートした 。次にウェルを洗浄液で６回洗浄して、ELISA基質溶液（0.005％テトラメチルベ ンジジンおよび0.015％H₂O₂の0.96％クエン酸溶液）と共に室温でインキュベー トした。既知のFIV陽性ネコ血清からなる連続希釈標準物質に可視反応色が確立 すれば、0.1 Mフッ化水素酸で反応を停止させた。バイオラッドELISAリーダー（ バイオラッド・ラボラトリーズ、ハーキュルズ、CA）で光学濃度414 nmでの吸光 度を測定した。 ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）。感染細胞のプロウイルスDNA濃度は、同じまた は異なるサブタイプからの多種FIV株を識別するために最近開発された分別PCRに よってモニターした（オカダら（Okada）、1994）。PCRの感度を増加させる手段 として、表１に示すネステッドPCRプライマーセットを用いた。PCRは２段階反応 で行い、最初はオカダら（Okada，1994）が記述した条件下で１対の外側のプラ イマー（全てのFIV株に共通）で行った。PCRの第二段階では、内側のプライマー （各FIV株に特異的）を用いて第一段階産物の1／25を増幅した。ネステッドPCR を用いて、FIV_Pet、FIV_UK8、FIV_Bang、FIV_Aom1、FIV_Aom2、およびFIV_Shiに感染 した細胞を互いに区別することができる。 プロウイルスDNAの細胞当たりのおおよその量は、既知の細胞数から抽出したD NAの希釈を変化させて半定量的PCRによって定量した。例えば、10⁵個の細胞をDN A抽出に用いた場合、DNA調製物を10^-5希釈すれば、細胞１個当たりに存在するDN Aにほぼ相当することになる。これらの変化させたDNA希釈液についてPCRを実施 し、陽性PCR結果を示す最終希釈をエンドポイント希釈と見なす。エンドポイン ト希釈に相当する細胞数を用いて、以下の式に従って所定の細胞調製物中のウイ ルス感染細胞の百分率を決定した： 式中、Ｚはエンドポイント希釈に相当する細胞数である。 逆転写酵素（RT）アッセイ。RNA-依存的DNAポリメラーゼ（RT）の有無は、本 質的にレイら（Rey）の記載に従い細胞培養上清において解析した。FIVを検出す るRTアッセイは、外因性鋳型プライマーとしてポリ（rA）-オリゴ（dT_12-18）、 異なる４つのデオキシリボヌクレオチド３リン酸、２価陽イオンとしてMg⁺⁺と共 に20 mM KCl、および１試料当たり５μCi[³H]-標識チミジン３リン酸を用いた。 ５μCi[³H]TTPは、ベックマンLS250シンチレーションカウンター（Beckman Inst ruments，Inc.、パロアルト、CA）でシンチレーション液混合物（キシレン１対 研究産物国際生物分解計数シンチラント９の割合）を用いて、平均総カウント1, 200,000 cpmを生じた。その結果、調べる試料のRT値は1,200,000 cpm／ml未満と なると考えられる。 ウイルス中和アッセイ。株およびサブタイプ特異的VNアッセイを開発する計略 は記述されている（オカダら（Okada）、1994）。ネコ末梢血単核細胞（PBMC） （４×10⁵細胞／ml）またはFIV易感染性FeT-1C細胞（２×10⁵細胞／ml）を加え る前に、熱不活化血清の連続希釈物を24ウェルプレート中で37℃で45分、各FIV 株の100 TCID₅₀と共にインキュベートした。培養３日後に、細胞をHank's緩衝塩 溶液で１回洗浄し、培養から残留ウイルスを除去し、次に細胞を新鮮な培養培地 （10％熱不活化仔ウシ胎児血清、10 mM HEPES緩衝液、50μg／mlゲンタマイシン 、５×10^-5M 2-メルカプトエタノール、および100 単位／mlヒト組換えIL-2を含 むRPM I-1640）に再懸濁した。細胞のウイルス感染は、培養９、12、15、および18日目 に回収した培養液のMg⁺⁺依存的RTアッセイによってモニターした。RT活性が、SP F血清からなる感染対照培養の25％以下である場合、血清はVN抗体陽性と見なし た。 以下は、本発明の実施に関する最良の形態を含む手順を図示する実施例である 。これらの実施例は、制限的なものと解釈してはならない。百分率は全て重量で 表し、溶媒混合比は、他に明記していなければ全て容積である。実施例１−FIV感染細胞株 。 IL-2依存的FeT-1Mクローンの母株であるFeT-1Cと呼ばれる新規インターロイキ ン-2（IL-2）依存的ネコ科T細胞株を用いて、FIV_Pet、FIV_Dix、FIV_UK8、FIV_Bang 、FIV_Aom2、またはFIV_Shiのいずれかに慢性的に感染させた個々の細胞株を確立 した。FeT-1Mクローン（FIV-Fet1Mとも呼ばれる）は、本明細書に参照として組 み入れられる米国特許第5,275,813号に記述されており、これを用いて、FIV_Pet を慢性的に産生するIL-2非依存的細胞株FL-4（これも米国特許第5,275,813号に 記述されている）を産生した。FeT-1C細胞株は、FIVサブタイプA、B、およびDの 異なる単離体に高度に感染可能である。FeT-1C細胞株を長期間継代すると、その 感染性、特にFIVサブタイプDに対する感染性は低下する；したがって、至適FIV 感染率を得るため、またはVNアッセイで使用するためには、継代回数は約35回未 満とすること。半定量的PCRおよびウイルスコア抗原分析により、FIVに暴露され た細胞株は全て、個々のFIV株に有意に感染することが示された。 FIV易感染性のIL-2非依存的ネコ科細胞株も同様に、FeT-1C細胞から作製した 。FeT-Jと呼ばれるこの細胞株は、FIV感染培地または細胞を用いて共培養によっ てFIVに感染させることができる。例えば、FIV_Bang感染FeT-1C細胞株を、IL-2の 非存在下で非感染FeT-J細胞と共培養して、IL-2非依存的FIV_Bang感染FeT-J細胞 株（Bang／FeT-Jと呼ぶ）を確立した。共培養による感染法では、Bang／FeT-1C 細胞を非感染FeT-J細胞と約２：１〜約10：１（感染：非感染）の比で混合した 。細胞混合物はIL-2の非存在下で培地中で数日間培養し、FeT-1C細胞を死亡させ た。残った細胞は、FIV_Bang感染FeT-J細胞から成った。このように、FIV感染FeT -1C細胞を用いてFeT-J細胞を感染させ、異なるFIVサブタイプに感染したIL-2非 依存的FeT- J細胞株を確立することができる。FIV感染FeT-1C細胞との共培養法の結果、異な るFIVサブタイプを中等度から高レベル産生するIL-2非依存的FeT-J細胞株が得ら れた。 FeT-1C細胞株をまたFIV_Shiに感染させ、十分に継代すると、Shi／FeT-1Cと呼 ばれるIL-2依存的細胞株が得られた。Shi／FeT-1C細胞株を後に、IL-2の非存在 下でFeT-Jと共培養し、得られたIL-2非依存的FIV_Shi-感染細胞株をShi／FeT-Jと 呼んだ。IL-2非依存的Shi／FeT-J細胞株は、IL-2依存的Shi／FeT-1C細胞株より 高レベルのFIV_Shiを産生する（図１）。 FIV_Bangに感染させたFeT-J細胞株の作製はまた、FeT-1C細胞株を用いずに実施 した。FeT-J細胞株を無細胞FIV_Bang接種体に直接感染させ、IL-2を用いずに十分 に継代した。得られたIL-2非依存的FIV_Bang産生細胞株をBang／FeT-Jと命名した 。Bang／FeT-J細胞株は、FeT-1C細胞株をFIV_Bangに感染させて作製したIL-2依存 的Bang／FeT-1C細胞株より高レベルのFIV_Bangを産生した。実施例２−多種サブタイプFIVワクチン 。 FIV感染細胞は遠心によって上清から除去し、不活化し、そしてワクチンとし て用いた。同様に、FIVウイルス全体は、超遠心によって感染した無細胞上清か ら沈殿させ、不活化した。感染細胞およびウイルスはいずれも、５℃で1.25％パ ラホルムアルデヒドで24時間処置して不活化し、その後それぞれ、十分に洗浄、 またはPBSで透析した。この方法は、免疫原性を失うことなくFIVを効率よく不活 化する。本方法によって産生されたFIV免疫原は、防御免疫の誘導に非常に有効 である（ヤマモトら（Yamamoto）、1993；ヤマモトら（Yamamoto）、1991a；ヤ マモトら（Yamamoto）、1991b）。弱毒化したウイルス単離体もまた、本発明の ワクチン組成物に用いることができると企図される。 FIV_Shi感染FeT-1C細胞株をFIV_Pet株に重複感染させると、多種サブタイプFIV （すなわち多種サブタイプA／D FeT-1C細胞株）に感染した単一の細胞株が得ら れるが、共感染の２ヶ月以内に、FIV_Shiプロウイルス濃度は50％から５％未満に 減少し、一方FIV_Petプロウイルス濃度は同時に約50％に増加した。このように、 FIVワクチンとして用いるための、多種サブタイプFIVに感染させた単一細胞株の 維持は、本発明の好ましい態様ではない。 その結果として、本発明の一つの態様において、ワクチン組成物は、各株が異 なるFIVサブタイプに感染した２つの個々の細胞株から作製した。特定の態様に おいて、２種サブタイプのFIVワクチン組成物は、FIVサブタイプA感染細胞株（P et／FL-4）とFIVサブタイプD感染細胞株（Shi／FeT-1C）との組み合わせから成 った。AサブタイプおよびDサブタイプ感染細胞株は記述のように不活化し、等し い細胞数（MDP 250 μg中に各2.5×10⁷細胞）を混合し、これを用いてネコを免 疫した。SPFネコ３匹を不活化Pet／FL-4細胞でワクチン接種し、別のネコ４匹を 不活化Shi／FeT-1C細胞でワクチン接種した（2.5×10⁷細胞／接種量）。一連の ４回のワクチン接種後、２種サブタイプ（Pet／FL-4およびShi／FeT-1C）ワクチ ンは、調べた両FIV株に対して有意なVN抗体価を含む抗FIV抗体を誘導した（図２ および表２、試験I）。２種サブタイプ（Pet／FL-4およびShi／FeT−IC）ワクチ ン接種ネコ４匹に、FIV_Bang（50 CID₅₀）をチャレンジした。Pet／FL-4ワクチン 接種ネコ３匹全てとShi／FeT-1Cワクチン接種ネコ２匹にFIV_Bangの50 CID₅₀量を チャレンジした。残る２匹のShi／FeT-1Cワクチン接種ネコには、FIV_Shiの50 CI D₅₀量をチャレンジした。 ２種サブタイプワクチン接種ネコは全て、感染後（pi）６週目でのウイルス単 離およびPBMCのPCRにより、FIV_Bang陰性であったが、偽免疫ネコは全て、感染後 ６週目でのウイルス単離およびPCRにより、FIV_BangまたはFIV_Shiのいずれかに対 して陽性であった（表２、試験I）。対照的に、Pet／FL-4ワクチン接種およびSh i／FeT-1Cワクチン接種群のネコそれぞれ１匹ずつにFIV_Bangをチャレンジすると 、FIV_Bang陽性であった。予想されたように、FIV_shiワクチンを接種し、その後F IV_Shiをチャレンジしたネコは全て、感染後６週目でFIV_Shiに対して陰性であっ た。このように、特に例示した２種サブタイプワクチンは、異種FIV_Bangチャレ ンジに対してと同様、同種FIV_shiに対する感染も防御または遅らせた。 ２種サブタイプワクチンを接種したネコ（Pet／FL-4細胞およびShi／FeT-1C細 胞）は、２回目の免疫後、ウイルスコア蛋白質p25（FIV p28とも呼ばれる）に対 して特異的なFIV抗体を産生した（図２）。他のウイルス抗原に対するより高い 抗体価は、３〜４回の免疫後に示された。FIV_Petに対するVN抗体は、２回の免疫 後に産生されたが、FIV_Shiに対するVN抗体は４回の免疫後に産生された（表４） 。 FIV_PetおよびFIV_Shiに対するCTL反応は、調べた全てのネコにおいて３回の免疫 で検出され（表３）、両株に対するより強いCTL反応は４回の免疫後に得られた 。さらに、調べたネコ３匹のうち２匹が、４回の免疫後FIV_Bangに対するCTL反応 を示した。結果は、４回のワクチン接種後、２種サブタイプワクチンは、FIV_Pet およびFIV_Shiに対して強いCTL反応を誘導し（表３）、両FIV株に対してVN抗体価 を含む高いFIV抗体を誘導した。 不活化Shi／FeT-1C細胞で免疫したネコは、２回の免疫後ウイルスコア蛋白質p 25に対して特異的なFIV抗体を産生し、３回の免疫後その他のウイルス抗原に対 する抗体を産生した（図２）。これらのネコでは、FIV_Shiに対するVN抗体は４回 の免疫後に産生されたが、FIV_Petに対するVN抗体は免疫の過程において検出され なかった。Shi／FeT-1Cワクチン接種ネコはいずれも、４回の免疫後に限ってFIV_Shi に対するCTL反応を起こしたが、FIV_Petに対するCTL反応は４回の免疫後でも 起こさなかった（表３）。 不活化Pet／FL-4細胞で免疫したネコは、２回の免疫後にp25に対する抗体を産 生し（図２）、２〜３回の免疫後FIV_Petに対するVN抗体を含む他のウイルス抗原 に対する抗体を産生した（表４）。Pet／FL-4細胞で免疫したネコに検出される 唯一のCTL反応は、FIV_Petに対するものであった。全体的に、２種サブタイプワ クチンは、１種サブタイプワクチンより、速やかにかつ高いVN抗体価、および両 FIV株に対するCTL反応を誘導した。偽免疫SPFネコは、ウイルス抗体、VN抗体、 または抗FIV CTL反応を示さなかった。 好ましい態様において、本発明のワクチン組成物は、各細胞株が異なるFIVサ ブタイプ（AまたはBもしくはD）からのウイルス株に感染している３つの細胞株 から調製された３種サブタイプFIVワクチンからなる。特定病原体不在ネコ３匹 を３種サブタイプ（FIV_Pet＋FIV_Bang＋FIV_Shi）ワクチンで免疫した。その他の ネコは１種サブタイプFIV_Bangワクチンで免疫して、ワクチン成分としてマクロ ファージ親和性FIV_Bangの免疫原性を評価した。VN抗体価の結果は、３種サブタ イプ（FIV_{Pe t} ＋FIV_Bang＋FIV_Shi）と１種類サブタイプFIV_Bangワクチンはいずれも、２回の 免疫後においても高い抗ウイルス抗体価を誘発した（表２、試験IIおよび表５） 。このように、リンパ球親和性およびマクロファージ親和性FIVは、本発明のワ クチン組成物の成分として用いることができる。 不活化Pet／FL-4、不活化Bang／FeT-J、および不活化Shi／FeT-1C細胞の組み 合わせ（全体でMDP 250 μg中に各2.5×10⁷細胞）で免疫したSPFネコ３匹は、ウ イルスコア蛋白質p25およびFIV SUおよびTMエンベロープ蛋白質を含むその他の ウイルス抗原に特異的なFIV抗体を２回の免疫後に産生した（図３、４、５）。F IV_Pet、FIV_Bang、およびFIV_Shiに対するVN抗体は、２回の免疫後まもなく大多数 のネコに産生され、３回目の免疫により全てのネコに産生された（表５）。さら に、ネコ１匹が３回の免疫後にFIV_UK8に交叉反応するVN抗体を産生した。不活化 Bang／FeT-J細胞のみで免疫したSPFネコ４匹は、ウイルスコア蛋白質p25および その他のウイルス抗原に特異的な抗体を産生した（図３）。これらのネコではFI V_Bangに対するVN抗体は２回の免疫後に産生された（表５）が、FIV_PetおよびFIV_UK8 に対するVN抗体は免疫過程において検出されなかった。３種サブタイプFIVワ クチン（Pet／FL-4、Bang／FeT-JおよびShi／FeT-1C細胞）で３回免疫したネコ のFIV A、B、およびDサブタイプ標的細胞に対するCTL反応を表６に示す。調べた これら３つのFIVサブタイプ全てに対してCTL反応が検出された。このように、３ 種サブタイプワクチンは、１種サブタイプワクチンより幅広いCTL反応ならびに 、より速やかかつより高いVN抗体価およびSU-エンベロープ抗体価を誘導した。 非感染FeT-Jまたは偽免疫SPFネコも、ウイルス抗体またはVN抗体を産生しなかっ た。 実施例３−FIVサブタイプに対するVN抗体。 FIVに対するVN抗体のアッセイはまた、本発明のFeT-1C細胞を用いて開発され た。FIV_Pet感染ネコおよび不活化Pet／FL-4細胞または不活化FIV_Petウイルスで ワクチン接種したSPFネコの血清を、本明細書に記述のVNアッセイ法に従って、F eT-1C細胞またはPBMCのいずれかを用いてVN抗体価を調べた。ワクチンを接種せ ず、FIVに感染していないSPFネコ２匹の血清を対照血清として用いた。ワクチン 接種およびFIV感染ネコの血清は1000以上の高いVN抗体価を示したが、非ワクチ ン接種SPFネコの血清は検出可能なVN抗体価を示さなかった。FeT-1Cに基づくVN アッセイは、ネコの初代培養PBMCを用いて得られた結果と同等のVN抗体価結果を 示す（表６）。この知見は、FeT-1C細胞を用いたVNアッセイでのVN抗体価が、PB MCを用いたVNアッセイに関して得られた結果と相関することを証明している。し たがって、FeT-1C細胞は、全てのFIVサブタイプに感染させることが可能で、組 織培養において容易に増殖させることが可能なため、FIVに関する標準的なVNア ッセイにおいてPBMCの代わりに都合良く用いることができる。 実施例４−FIV株の免疫タイピング FIVサブタイプがFIV免疫型を反映するか否かを評価するために、FeT-1C細胞を 用いてインビトロ試験を実施した。免疫タイピングはワクチン防御におけるVN抗 体の役割を理解する上で重要である。FIVサブタイプA株（FIV_Pet、FIV_Dix、FIV_{U K8} ）、サブタイプB（FIV_Bang、FIV_Aom1）、およびサブタイプD（FIV_Shi）に感染 させたネコの抗血清を、VNアッセイにおいてFeT-1C細胞を用いてインビトロでこ れらの株を中和する能力に関して調べた（図６）。試験抗血清は全て、対応する 同種FIV株に対する中和活性を示した。サブタイプA株であるFIV_Petは、FIV_Dixに 感染させたネコの抗血清によって有意に交叉中和された。FIV_Petは、表面エンベ ロープ糖蛋白質（Env）領域がFIV_Dixと約９％異なる。FIVサブタイプAに感染さ せたネコの抗血清はサブタイプBのFIV_Bangと交叉中和したが、サブタイプD FIV_{S hi} を中和しなかった。サブタイプBおよびD株に感染させたネコの抗血清のみが、 同種サブタイプ内の他のFIV株を交叉中和した。さらに、FIV_UK8に感染させたネ コの抗血清はFIV_Bangを中和したが、サブタイプA内のFIV株を中和しなかった。F IV_UK8はサブタイプAに分類されているが（ソドラら（Sodora）、1994；リグビー ら（Rigby）、1993；カキヌマら（Kakinuma）、1995）が、これらの結果は、FIV_UK8 に 対する抗血清がサブタイプB株を認識するがサブタイプA株を認識しないことを示 唆しており、不活化FIV_PetワクチンがFIV_UK8およびFIV_Shiに対して無効である理 由を説明する可能性がある（ジョンソンら（Johnson）、1994）。このように、 遺伝子型と免疫型との間には緩やかな相関が存在する。遺伝子型分析によりFIV 株分類が可能となったが、交叉中和抗体試験はFIV株の免疫原性を反映し、これ は、ワクチンによって誘発される広範囲の液性防御における重要なパラメーター である。実施例５−FIV細胞親和性 感染FeT-1Cおよび感染FeT-J細胞株から得たFIV株の細胞指向性を、初代培養PB MCから得たFIV株の細胞指向性と比較した（表８）。FIV単離体２個、FIV_UK8およ びFIV_Bangはいずれも等しくリンパ球親和性およびマクロファージ親和性である が、FIV_Shiは非常にリンパ球親和性である。FIV_Petは、マクロファージ親和性よ りリンパ球親和性で、その細胞親和性はその細胞源によって有意に影響を受けな かった。FIV_Bangのマクロファージ親和性は、ウイルスの細胞源によって影響を 受けなかった。感染FeT-1C細胞株からのFIV株の細胞親和性は、初代培養PBMCか ら得られた細胞親和性と同等であるため、FeT-1C細胞内で増殖するウイルスは、 VNアッセイの接種体として用いることができ、治療および予防的アプローチを評 価するための試験では、インビボ接種体として用いることもできる。 本明細書に記載の実施例および態様は例示目的のためのみであり、その様々な 改変または変更は当業者に示唆され、本出願および付属の請求の範囲の範囲内に 含まれるものと理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ Ｃ１２Ｑ 1/68 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ， ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，Ｍ Ｋ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．FIV感受性動物において複数のFIVサブタイプに対して免疫反応を誘発するこ とが可能なFIV免疫源を含むワクチン組成物。 ２．組換えウイルスベクターFIV構築物、多種FIVサブタイプに由来するFIVポリ ペプチド、多種の無細胞FIVウイルス全体、およびそれぞれが異なるFIVサブタイ プ由来のFIV株に感染している多種の細胞株からなる群より選択される、請求項 １記載のワクチン組成物。 ３．ワクチンを宿主動物に投与する前に、FIVウイルスまたはFIV感染細胞株を、 該ウイルスまたは該細胞株が不活化されるよう処置する、請求項２記載のワクチ ン組成物。 ４．ワクチンを宿主動物に投与する前に、FIVウイルスまたはFIV感染細胞株を、 該ウイルスまたは該細胞株が弱毒化されるよう処置する、請求項２記載のワクチ ン組成物。 ５．複数のFIVサブタイプに対して免疫反応を誘発することが可能なワクチン組 成物の有効量を宿主に投与することを含む、感受性宿主動物においてFIV感染に 対する防御的免疫反応を誘導する方法。 ６．ワクチン組成物が、組換えウイルスベクターFIV構築物、多種FIVサブタイプ に由来するFIVポリペプチド、多種の無細胞FIVウイルス全体、およびそれぞれが 異なるFIVサブタイプのFIV株に感染している多種の細胞株からなる群より選択さ れる、請求項５記載の方法。 ７．FIVウイルスまたはFIV感染細胞株が、ワクチンを宿主動物へ投与する前に、 不活化されるよう処置される、請求項６記載の方法。 ８．FIVウイルスまたはFIV感染細胞株が、ワクチンを宿主動物へ投与する前に、 弱毒化されるよう処置される、請求項６記載の方法。 ９．FIVサブタイプが、サブタイプA、B、CおよびDからなる群より選択される、 請求項５記載の方法。 10．少なくとも一次免疫が組換えウイルスベクターFIV構築物を投与することを 含み、その後、組換えウイルスベクターFIV構築物、FIVポリペプチド、無細胞FI Vウイルス全体、およびFIV感染細胞株からなる群より選択されるワクチン組成物 で追 加免疫が行われる、請求項５記載の方法。 11．細胞株が、少なくとも１つのFIVサブタイプによる注射に感受性であり、該F IVサブタイプが、サブタイプA、B、CおよびDからなる群より選択される、ネコ科 由来T細胞株。 12．FeT-1Cと称される、請求項11記載の細胞株。 13．細胞株が、FIV_Dix、FIV_UK8、FIV_Bang、FIV_Aom1、FIV_Aom2、FIV_Pet、およびF IV_shiからなる群より選択されるFIVウイルス株の少なくとも１つに感染する、請 求項11記載の細胞株。 14．IL-2非依存的である、請求項11記載の細胞株。 15．FIV_Dix、FIV_UK8、FIV_Bang、FIV_Aom1、FIV_Aom2、FIV_Pet、およびFIV_Shiから なる群より選択されるFIVウイルス株の少なくとも１つに感染する、請求項14記 載の細胞株。 16．FeT-Jと称される、請求項14記載の細胞株。 17．試料伝FIVに接触させ、次に請求項10記載の細胞株を該試料中で有効な時間 培養し、該細胞を新鮮な培養培地で培養し、次に該培養培地中の逆転写酵素活性 量を定量することを含む、試料中のFIVウイルス中和抗体の検出または定量法。 18．細胞株が、FeT-1CおよびFeT-Jと称される細胞株からなる群より選択される 、請求項17記載の方法。