JPH11513372A - パラインフルエンザウイルスの糖タンパクおよびワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 血球凝集素ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）糖タンパクを、パラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ−１）およびパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ−３）から共分離および共精製する。ＨＮおよびＦ糖タンパクを、パラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２）から別に分離し、精製する。ワクチンとして製剤した糖タンパクは高い免疫原性を有し、パラインフルエンザ抗原投与に対して関連動物モデルを防御する。ＰＩＶ−３からのＨＮおよびＦ糖タンパクを含むワクチンは、成人および幼児において安全で、かつ免疫原性を有する。ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３からのＨＮおよびＦ糖タンパクを含む三価ワクチンは、各ウイルスを中和することのできる免疫反応を誘発する。

Description

【発明の詳細な説明】 パラインフルエンザウイルスの糖タンパクおよびワクチン 発明の分野 本発明はパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）糖タンパク、その調製法なら びに当該タンパクからなる多価ワクチン組成物に関する。 発明の背景 ヒト呼吸器系シンチチウムウイルスＡ型およびＢ型（ＲＳＶ ＡおよびＢ）お よびヒトパラインフルエンザウイルス１、２および３型（ＰＩＶ−１、２、３） 感染は、先進国における乳幼児および幼児の急性下気道感染の最も一般的な病因 である。米国だけでも、年間約５百万人の幼児がパラインフルエンザウイルスに 感染している。ＰＩＶ−３は、ＲＳＶについで乳幼児における気管支炎および肺 炎の第二の主要病因である。米国においては、６歳以下の幼児約６００，０００ 人が毎年ＰＩＶ−１および２の感染により喉頭気管支炎（クロープ）を発症し、 約１，０００人の乳幼児がＰＩＶ−３感染により死亡していると推定される。気 管支炎および肺炎のために入院した患者の約１０〜１５％がＰＩＶ−３感染によ るものと推定され、米国においては毎年１．４百万人以上の乳幼児が臨床的に重 度のＰＩＶ−３感染を患っていると推定される（参考文献１）。本出願では、本 発明の分野における最新の技術水準をより完全に記載するため、各種の参考文献 を括弧内に引用する。各引用文献の完全な情報は、詳細な説明の後の請求項の前 に添付する。これら引例の開示は、本発明で比較として引用する。ＰＩＶ−３感 染患者のうち１〜２％は入院を必要とし、死亡する幼児もいる。ＰＩＶ−３感染 が最も高い年齢は２〜４カ月で、ＰＩＶに関連したクループが最も高いのは９〜 ２４カ月齢である。パラインフルエンザは再感染がきわめて一般的で、最も頻繁 に再感染が起こるのはＰＩＶ−３である。現在のところ、これらウイルス感染か ら乳幼児および幼児を防御することのできる安全で、有効なワクチンはない。し たがって、有効なパラインフルエンザワクチンの開発が望まれている。 パラインフルエンザウイルスに有効な生ウイルスワクチンおよび糖タンパクサ ブユニットワクチンの開発研究が進められている。ホルマリン不活性化Ｐ ＩＶ １、２、３型ワクチンを用いた臨床試験の結果から、このワクチンは有効 でないことが確認された（参考文献２、３、４）。ホルマリン不活性化ＲＳＶワ クチンの臨床試験でＲＳＶ感染防御効果がないばかりか、ワクチン接種を受けた 被験者の多くでその後のＲＳＶ感染による発病がかえって重度になることが確認 されたため、化学的に不活性化したワクチンの開発研究は中止された。パライン フルエンザワクチンに関する研究のほとんどはＰＩＶ−３ワクチン候補を中心に 行われ（参考文献５）、ＰＩＶ−１およびＰＩＶ−２に関する報告はきわめてわ ずかである。ＰＩＶ−３ワクチンに関する最近の研究の傾向は、きわめて近縁の ウシパラインフルエンザウイルス３型の利用、およびウイルスの低温適応による 弱毒ウイルスの生成である（参考文献６、７、８、９）。 その他、パラインフルエンザウイルス３型ワクチン開発の傾向として、表面糖 タンパク、すなわち血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）タ ンパクを中心としたサブユニットの研究が行われている（参考文献１０、１１、 １２）。典型的なＩＩ型糖タンパクであるＨＮ抗原は血球凝集活性およびノイラ ミニターゼ活性を示し、シアル酸を含む宿主細胞レセプターに対するウイルスの 付着に重要な役割を果たしている。Ｉ型Ｆ糖タンパクはウイルス外被タンパクと 細胞膜との融合ならびにウイルスの細胞間での伝搬を仲介する。最近、膜融合に ＨＮおよびＦ糖タンパクの必要性が実証された。Ｆ糖タンパクは不活性な前駆体 （Ｆ）として合成され、それがタンパク加水分解酵素によってジフルフィド架橋 を有するＦ２およびＦ１部分に解裂される。ＰＩＶ−１、２および３のＨＮおよ びＦタンパクは構造的によく似ているが、抗原的には識別される。いずれかのＰ ＩＶ型のＨＮおよびＦタンパクに対する中和抗体は、交叉防御作用を有さない。 したがって、効果的なＰＩＶサブユニットワクチンはパラインフルエンザウイル スの３種類の型からのＨＮおよびＦ糖タンパクを含む必要がある。いずれかの糖 タンパクに対する抗体は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで中和される。中和抗体力価と乳幼 児におけるＰＩＶ−３感染抵抗性の間に直接的な相関性が認められている。パラ インフルエンザウイルス３型の天然サブユニットワクチンの２種類の表面糖タン パク防御効果について研究が行われている。典型的に、非イオン性界面活性剤を 用いてウイルスから糖タンパクを抽 出し、レクチンアフィニティーまたは免疫アフィニティークロマトグラフィー法 でさらに精製する。しかし、これらの方法はいずれも、全ての条件下でワクチン を大量に製造するには不適当である。小型動物（ハムスターおよびコットンラッ ト）を用いた防御モデルでは、糖タンパクを免疫投与すると生ＰＩＶ−３による 感染を防御することが実証されている（参考文献１３、１４、１５、１６、１７ ）。ＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タンパクは、組替えＤＮＡ技術を用いても製造 されている。ＨＮおよびＦ糖タンパクは、バキュロウイルス表現系を用いて昆虫 でも製造され、遺伝子組換えワクシニアウイルスおよびアデノウイルスを用いて も製造されている（参考文献１８、１９、２０、２１、２２）。バキュロウイル ス表現系では、ＰＩＶ−３糖タンパクの完全長およびトランケート体ならびにキ メラ型のＦ−ＨＮ融合タンパクが表現されている。組換えタンパクは小型動物モ デルで防御効果を有することが実証されている（本出願人によるＷＯ９１／００ １０４、ＵＳＡＮ０７／７７３，９４９、１９９１年１１月２９日出願参照）。 パラインフルエンザウイルス感染は、重度の疾患につながる。ワクチン、他の 抗原および免疫原用の担体を含む免疫原調製物に抗原として使用し、また診断試 薬の調製に使用できる天然ウイルスからの精製ＰＩＶ糖タンパクおよびその精製 法を提供することは、大きな利点がある。 発明の概略 本発明は、ワクチン級の培養細胞（ＶＥＲＯ細胞）上でのＰＩＶ−３の製造、 発酵槽から収穫したウイルスの精製、精製ウイルスからのＨＮおよびＦ糖タンパ クの抽出およびＨＮおよびＦ糖タンパクを免疫アフィニティーまたはレクチンア フィニティー段階を利用せずに約８５％またはそれ以上の純度にまで共精製する 方法を提供するものである。特に、レクチンアフィニティー法を用いると、リガ ンドが製品中に漏出する恐れがある。 さらに、本発明は、世界に先駆けてＰＩＶ−１およびＰＩＶ−２のＨＮおよび Ｆ糖タンパクを分離、精製する方法ならびにＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩ Ｖ−３から分離、精製したＨＮおよびＦ糖タンパクの混合物からなる免疫原性組 成物を提供する。 単離、精製したＨＮおよびＦ糖タンパクは、非発熱性で、非免疫強化性で、本 質的に血清および培養細胞により汚染されていない。単離、精製した糖タンパク は免疫原性を有し、感染性ＰＩＶおよびその他の外因性物質を全く含まない。 したがって、本発明は、その１側面において、還元条件下でナトリウムドデシ ル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき一 般に約７０〜約８０ｋＤａの見かけ分子量を有するパラインフルエンザウイルス １型（ＰＩＶ−１）の単離、精製した血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖 タンパクまたは糖タンパクの免疫原性を保持したそのフラグメントまたは類縁体 を提供する。 本発明は、別の側面で、還元条件下でナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルア ミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき一般に約４５〜約５５ｋ ＤａのＦ₁ポリペプチドサブユニットの見かけ分子量を有するパラインフルエン ザウイルス１型（ＰＩＶ−１）の単離、精製した融合（Ｆ）糖タンパクまたは糖 タンパクの免疫原性を保持したそのフラグメントまたは類縁体を提供する。 さらに本発明は、別の側面において、還元条件下でナトリウムドデシル硫酸ポ リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき一般に約７ ０〜約８０ｋＤａの見かけ分子量を有するパラインフルエンザウイルス１型（Ｐ ＩＶ−１）の単離、精製した血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパク と、約４５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチドサブユニットの見かけ分子量を有 する融合（Ｆ）糖タンパクの共分離、共精製した混合物を提供する。当該混合物 は、純度が少なくとも約７５％であることが望ましい。 さらに本発明は、別の側面において、還元条件下でナトリウムドデシル硫酸ポ リアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき一般に約７ ０〜約８５ｋＤａの見かけ分子量を有するパラインフルエンザウイルス２型（Ｐ ＩＶ−２）の単離、精製した血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパク または糖タンパクの免疫原性を保持したそのフラグメントまたは類縁体を提供す る。ＨＮ糖タンパクは、ＰＩＶ−２の融合（Ｆ）糖タンパクを 本質的に含まないものであってもよいが、純度が少なくとも約６５％であること が望ましい。 さらに本発明は、別の側面で、還元条件下でナトリウムドデシル硫酸ポリアク リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき一般に約４５〜約 ５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチドサブユニットの見かけ分子量を有するパラインフ ルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２）の単離、精製した融合（Ｆ）糖タンパクま たは前記糖タンパクの免疫原性を保持したそのフラグメントまたは類縁体を提供 する。Ｆ糖タンパクは、ＰＩＶ−２のＨＮ糖タンパクを本質的に含まないもので あってもよいが、純度が少なくとも約８０％であることが望ましい。 さらに本発明は、別の側面において、レクチンを含まず、本質的に還元条件下 でナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ）で測定したとき一般に約７０〜約７５ｋＤａの見かけ分子量を有する血球凝集 素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパクからなるパラインフルエンザウイルス ３型（ＰＩＶ ３）の単離、精製した未変性糖タンパクと、約４５〜約５０ｋＤ ａの見かけ分子量を有する融合（Ｆ）糖タンパクの共分離、共精製した混合物を 提供する。当該混合物は、純度が少なくとも約７５％であることが望ましい。 また本発明は、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３の糖タンパクからな る多価免疫原性組成物を含む。したがって、本発明は、別の側面で、免疫学的に 有効量の（ａ）一般に約７０〜約８０ｋＤａの見かけ分子量（ここで、分子量は 還元条件下でナトリウムドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ −ＰＡＧＥ）で測定する）を有するパラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ− １）の血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパクと、（ｂ）一般に約４ ５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチドサブユニットの見かけ分子量を有するパラ インフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ−１）の融合（Ｆ）糖タンパクと、（ｃ） 一般に約７５〜約８５ｋＤａの見かけ分子量を有するパラインフルエンザウイル ス２型（ＰＩＶ−２）の血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパクと、 （ｄ）一般に約４５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチドサ ブユニットの見かけ分子量を有するパラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ− −２）の融合（Ｆ）糖タンパクと、（ｅ）一般に約７０〜約８０ｋＤａの見かけ 分子量を有するパラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ−３）の血球凝集素− ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパクと、（ｆ）一般に約４５〜約５５ｋＤａの Ｆ₁ポリペプチドサブユニットの見かけ分子量を有するパラインフルエンザウイ ルス３型（ＰＩＶ−３）の融合（Ｆ）糖タンパクとからなるか、または前記糖タ ンパクの免疫原性を保持する（ａ）から（ｆ）の糖タンパクのいずれかのフラグ メントまたは類縁体からなる免疫原性組成物を提供する。 ＰＩＶ−１およびＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タンパクは共分離、共精製した 糖タンパクの混合物として提供し、ＰＩＶ−２のＨＮおよびＦ糖タンパクは別に 分離、精製した糖タンパクとして提供することが望ましい。 ここで提供する免疫原性組成物は、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３ によって起こる疾病に対する防御能を付与することを目的にして宿主にｉｎ ｖ ｉｖｏ で投与するためにあらかじめ設定した量の各糖タンパクを含むワクチンと して製剤することができる。ここでいう宿主は霊長類、特にヒトである。 本発明に係わる免疫原性組成物は、微粒剤、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポ ソーム調製物として製剤してもよい。当該免疫原性組成物は、ターゲティング分 子と組み合わせて使用し、免疫系の特定細胞または粘膜表面に運搬させることも できる。ターゲティング分子の例をいくつかあげると、ＷＯ９２／１７１６７（ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ．Ｌｔｄ．）に開示されているＢ １２株および細菌毒素のフラグメントまたは米国特許第５,１９４,２５４号（Ｂ ａｒｂｅｒら）に開示されているモノクローナル抗体がある。さらに当該免疫原 性組成物は、少なくとも１種類の別の免疫原または免疫刺激性物質、すなわち少 なくとも１種類のアジュバントを含んでいてもよい。 前記の少なくとも１種類のアジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アル ミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ、これらの誘導体および成分、ＩＳＣＯＭマ トリックス、リン酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁化 合物、アミノ酸のオクトデシルエステル、ムラミル ジペプチド ポリホスファ ゼン、リポタンパクおよびＴｈ１反応を誘導するその他のアジュバントからなる 群から選ぶことができる。 ここで提供する免疫原性組成物は、少なくとも１種類の別の免疫原を含むよう に製剤することもできる。前記の少なくとも１種類の別の免疫原は、ヒト呼吸系 シンシチウムウイルス（ＲＳＶ）タンパク、例えばＲＳＶ Ａおよび／またはＢ 型からのタンパクからなると便利である。しかし、他の免疫原、例えばクラミジ ア、ポリオ、肝炎Ｂ，ジフテリアのトキソイド、破傷風のトキソイド、インフル エンザ、ヘモフィルス、百日咳、肺炎球菌、ミコバクテリア、肝炎Ａ、モラクセ ラからの免疫原を混合してもよい。 本発明は、パラインフルエンザウイルスからのＨＮおよびＦ糖タンパクならび にそれぞれＨＮおよびＦタンパクの共精製および共分離を含む。 本発明は、別の側面で、ここで提供する免疫原性組成物を免疫学的に有効な量 で宿主に投与することにより宿主に免疫反応を誘発させる方法を提供する。当該 免疫原性組成物は、宿主にｉｎ ｖｉｖｏで投与し、ヒトを含む宿主に投与する ことによってＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３に起因する疾病に対する 防御能を与えるようにワクチンに製剤することが望ましい。当該免疫反応は、体 液性または細胞介在免疫反応である。 本発明は、さらに別の側面において、ここで提供する免疫原性組成物を試験宿 主に投与してＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３に起因する疾病に対する 防御能賦与に必要な当該免疫原性組成物の相対量および投与頻度を決定し、前記 のように決定した投与量および投与頻度で処理宿主に投与するに適した形態に免 疫原性組成物を製剤することからなるパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感 染により起こる疾病を防御するためのワクチンの製造法を提供する。前記の処理 宿主は、ヒトであってもよい。 本発明は、別の側面で、 （ａ）ここで提供する免疫原性組成物と試料を接触させることにより、 パラインフルエンザウイルスの糖タンパクと試料中に存在する前 記抗体、特に前記糖タンパクと反応性の抗体とからなる複合体を 形成させ、 （ｂ）前記複合体の形成を測定することからなる 試料中の抗体、特にパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）の糖 タンパクと反応する抗体の有無を検査する方法を提供する。 本発明は、さらに別の側面で、 （ａ）ここで提供する免疫原性組成物を被験者に投与してＰＩＶ−１、 ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タンパクに特異的 な抗体を形成させ、 （ｂ）試料と当該抗体を接触させることにより試料中に存在するあらゆ るＰＩＶ糖タンパクと前記糖タンパク特異性抗体の複合体を形成 させ、 （ｃ）前記複合体を測定することからなる 試料中のパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）糖タンパクの有 無を測定する方法を提供する。 本発明は、さらに別の側面において、 （ａ）ここで提供する免疫原性組成物と、 （ｂ）パラインフルエンザウイルス糖タンパクと試料中に存在する前記 の抗体とからなる複合体を形成させるために、試料と免疫原性組 成物とを接触させるための手段と、 （ｃ）当該複合体を測定するための手段とからなる 試料中に存在する特にパラインフルエンザウイルスの糖タンパク と反応性の抗体の有無を測定するための診断キットを提供する。 さらに、本発明は、 （ａ）ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タン パクに特異的な抗体と （ｂ）ＰＩＶ糖タンパクとＰＩＶ糖タンパクに特異的な抗体とからなる 複合体を形成させるために、試料と抗体とを接触させるための手 段と、 （ｃ）当該複合体を測定するための手段とからなる 試料中のパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）糖タンパクの有 無を検出するための診断キットを提供する。 本発明は、別の側面において、 （ａ）ここで提供する免疫原性組成物を少なくとも１匹のマウスに投与 して少なくとも１匹の免疫マウスを用意し、 （ｂ）前記マウスからＢ−リンパ細胞を採取し、 （ｃ）前記マウスのＢ−リンパ細胞と骨髄腫細胞を融合させてハイブリ ドーマを形成させ、 （ｄ）特定の抗ＰＩＶ糖タンパク抗体を生産するハイブリドーマをクロ ーニングし、 （ｅ）抗ＰＩＶ糖タンパク抗体を生産するクローンを培養し、 （ｆ）培地から抗ＰＩＶ糖タンパク抗体を分離することからなる パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）の糖タンパクに特異的な モノクローナル抗体の製造法を提供する。 本発明は、さらに別の側面において、培地中でパラインフルエンザウイルス１ 型（ＰＩＶ−１）を培養し、培養したウイルスを培地から分離し、分離したウイ ルスから血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）膜糖タンパク を溶解させ、さらに溶解した膜糖タンパクを共分離および共精製することからな るＰＩＶ−１の共分離、共精製糖タンパク混合物の製造法を提供する。 共分離および共精製は、溶解させた膜糖タンパクのイオン交換クロマトグラフ ィーからＨＮおよびＦ糖タンパクを含む溶出液を回収し、ヒドロキシアパタイト マトリックスからＨＮおよびＦ糖タンパクを選択的に共溶出させることによって 行うこともできる。選択的に溶出させたＨＮおよびＦ糖タンパクをタンジェント フロー限外濾過によってさらに濃縮してもよい。さらに共分離および共精製は、 ＨＮおよびＦ糖タンパクを共沈殿させ、沈殿したＨＮおよびＦ糖タンパクを分離 し、分離したＨＮおよびＦ糖タンパクを再溶解させることによって行ってもよい 。本発明は、さらに別の側面で、パラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２ ）を培地中で培養し、培養したウイルスを培地から分離し、分離したウイルスか ら血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）膜糖タンパクを溶解 させ、さらに溶解した膜糖タンパクの少なくともいずれかを分離および精製する こ とからなるＰＩＶ−２の分離、精製糖タンパクの製造法を提供する。 溶解させた膜糖タンパクを別々に分離および精製する。このような別々の分雌 および精製は、溶解させた膜糖タンパクのイオン交換クロマトグラフィーからＦ 糖タンパクを含む溶出液を回収し、一方ＨＮ糖タンパクはイオン交換樹脂に保持 させ、回収した溶出液からヒドロキシアパタイト マトリックスでＦ糖タンパク を分離し、可溶化に用いた界面活性剤をヒドロキシアパタイト マトリックス溶 出液から選択的に除去して単離、精製したＦ糖タンパクを得、イオン交換樹脂か らＨＮ糖タンパクを溶出させて単離、精製したＨＮ糖タンパクを得ることによっ て行うこともできる。混在する核酸は、ベンゾナーゼを含むヌクレアーゼ（ＴＭ ）で処理することによって単離、精製したＨＮ糖タンパクから除去することがで きる。単離、精製したＨＮ糖タンパクをゲル濾過媒体に載せ、それから回収して 分子量の異なる混在物をＨＮ糖タンパクから除去するか、単離、精製したＨＮ糖 タンパクをヒドロキシアパタイト マトリックスに吸着させ、その後ＨＮ糖タン パクを溶出させてもよい。単離、精製したＦおよびＨＮ糖タンパクは、その後タ ンジェントフロー限外濾過によってさらに濃縮してもよい。 本発明は、さらに別の側面において、培地中でパラインフルエンザウイルス３ 型（ＰＩＶ−３）を培養し、培養したウイルスを培地から分離し、分離したウイ ルスから血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ）膜糖タンパク を溶解させ、さらにレクチンを含まない糖タンパクを共分雌および共精製するこ とからなるＰＩＶ−３の共分離、共精製糖タンパク混合物の製造法を提供する。 共分離および共精製は、まずＨＮおよびＦ膜糖タンパクをイオン交換樹脂に載 せ、混在物を樹脂から溶出させ、ついで前記のイオン交換樹脂からＨＮおよびＦ 糖タンパクを溶出させ、分子量の異なる汚染物質をＨＮ糖タンパクから除去する ことによって行うこともできる。共溶出したＨＮおよびＦ糖タンパクを別のイオ ン交換樹脂に載せ、混在物を樹脂から溶出させる。その後ＨＮおよびＦ糖タンバ クを樹脂から溶出させ、共分離、共精製したＨＮおよびＦ糖タンパクを得る。共 溶出させたＨＮおよびＦ糖タンパクは、タンジェントフロー限外濾過によってさ らに濃縮してもよい。 本発明の利点は、 −ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３の単離、精製したＨＮおよびＦ糖 タンパク −このような糖タンパクを含む多価免疫組成物 −このような糖タンパクの単離手順 −ＰＩＶおよびそれに感染した宿主の識別に用いる診断キット である。 図面の簡単な説明 図を参照し、以下に本発明をさらに詳しく説明する。 図１は、本発明の実施例に係わるパラインフルエンザウイルス１、２および３ 型からの血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融解（Ｆ）糖タンパクの 精製法を示すフローダイアグラムである。 図２（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型ＨＮおよびＦ糖タン パクのナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動による分析 である。 図２（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型ＨＮ糖タンパクの免 疫ブロット分析である。検出は、抗ＰＩＶ−１ ＨＮ抗体を用いる。 図２（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型Ｆ糖タンパクの免疫 ブロット分析である。検出は、抗ＰＩＶ−１ Ｆ抗体を用いる。 図３（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス２型ＨＮ糖タンパクのナ トリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動による分析である。 図３（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス２型ＨＮ糖タンパクの免 疫ブロット分析である。検出は、抗ＰＩＶ−２ ＨＮ抗体を用いる。 図３（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス２型Ｆ糖タンパクのナト リウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動による分析である。 図３（ｄ）は、精製したパラインフルエンザウイルス２型Ｆ糖タンパクの免疫 ブロット分析である。検出は、抗ＰＩＶ−２ Ｆ抗体を用いる。 図４（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タン パクの還元条件下でのナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気 泳動による分析である。 図４（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タン パクのＨＮおよびＦ特異性抗体を用い還元条件下でＳＤＳ−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動で分離したタンパクの免疫ブロット検出による分析である。 図４（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タン パクの非還元条件下でのナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電 気泳動による分析である。 図４（ｄ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タン パクのＨＮおよびＦ特異性抗体を用い非還元条件下でＳＤＳ ポリアクリルアミ ド ゲル電気泳動で分離したタンパクの免疫ブロット検出による分析である。 図５（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型ＨＮおよびＦ糖タン パクを免疫投与したマウスにおける抗ＨＮ抗体反応を示す。 図５（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型ＨＮおよびＦ糖タン パクを免疫投与したマウスにおける抗Ｆ抗体反応を示す。 図５（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型ＨＮおよびＦ糖タン パクを免疫投与したマウス血清におけるＰＩＶ−１中和力価を示す。 図６（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型ＨＮおよびＦ糖タン パクを免疫投与したハムスターにおける抗ＨＮ抗体反応を示す。 図６（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型ＨＮおよびＦ糖タン パクを免疫投与したハムスターにおける抗Ｆ抗体反応を示す。 図６（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１型ＨＮおよびＦ糖タン パクを免疫投与したハムスター血清におけるＰＩＶ−１中和力価を示す。 図７は、別々に精製したパラインフルエンザウイルス２型ＨＮおよびＦ糖タン パクを約１：１の比で混合し、免疫投与したときのマウス血清におけるＰＩＶ− ２中和力価を示す。 図８は、別々に精製したパラインフルエンザウイルス２型ＨＮおよびＦ糖タン パクを数段階の混合比で免疫投与したマウスにおける抗ＨＮ抗体反応を示す。 図９は、別々に精製したパラインフルエンザウイルス２型ＨＮおよびＦ糖タン パクを数段階の混合比で免疫投与したマウスにおける抗Ｆ抗体反応を示す。 図１０（ａ）は、別々に精製したパラインフルエンザウイルス２型ＨＮおよび Ｆ糖タンパクを数段階の混合比で免疫投与したマウス血清におけるＰＩＶ−２中 和力価を示す。 図１０（ｂ）は、別々に精製したパラインフルエンザウイルス２型ＨＮおよび Ｆ糖タンパクを数段階の混合比で免疫投与したマウス血清におけるＰＩＶ−２血 球凝集阻害（ＨＡＩ）力価を示す。 図１１（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したマウスにおける抗ＰＩＶ３反応を示す。 図１１（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したマウス血清における血球凝集阻害力価を示す。 図１１（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよび「糖タ ンパクを免疫投与したマウス血清におけるＰＩＶ−３中和力価を示す。 図１２（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したモルモットにおける抗ＰＩＶ３反応を示す。 図１２（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したモルモット血清における血球凝集阻害力価を示す。 図１２（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したモルモット血清におけるＰＩＶ−３中和力価を示す。 図１３（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したハムスターにおける抗ＰＩＶ−３抗体反応を示す。 図１３（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したハムスター血清における血球凝集阻害力価を示す。 図１３（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したマウス血清におけるＰＩＶ−３中和力価を示す。 図１３（ｄ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与し、生ＰＩＶ−３を抗原投与したハムスターの鼻腔洗浄液およ び肺洗浄液中のＰＩＶ−３中和力価を示す。 図１４（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したコットンラット血清における血球凝集阻害力価を示す。 図１４（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したコットンラット血清におけるＰＩＶ−３中和力価を示す。 図１４（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス３型ＨＮおよびＦ糖タ ンパクを免疫投与したコットンラットにおけるＰＩＶ−３肺力価を示す。 図１５（ａ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１、２および３型のＨ ＮおよびＦ糖タンパクからなる多価ワクチンを免疫投与したマウス血清における ＰＩＶ−１中和力価を示す。 図１５（ｂ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１、２および３型のＨ ＮおよびＦ糖タンパクからなる多価ワクチンを免疫投与したマウス血清における ＰＩＶ−２中和力価を示す。 図１５（ｃ）は、精製したパラインフルエンザウイルス１、２および３型のＨ ＮおよびＦ糖タンパクからなる多価ワクチンを免疫投与したマウス血清における ＰＩＶ−３中和力価を示す。 発明の詳細な説明 上記のように、本発明はＰＩＶ−１ウイルスから共分離、共精製したＨＮおよ びＦ糖タンパクを含む。ＰＩＶ−１について図１に模式的に示したように、ウイ ルスをＶＥＲＯ細胞等のワクチン級の培養細胞で増殖させ、増殖したウイルスを 収穫する。培養は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびトリプシンの存在下で行って もよい。 収穫したウイルスを濾過し、ついで典型的に所定の分子量カットオフ膜を用い たタンジェントフロー限外濾過によって濃縮し、透析を行う。濃縮したウイルス を遠心分離し、上清を廃棄する。ついで、遠心分離で得られたペレットを界面活 性剤で抽出し、ＨＮおよびＦ糖タンパクを溶解させる。例えば、ペレットをもと の濃縮物の容量となるようにトライトンＸ−１００を含む非イオン系界面活性剤 等の界面活性剤を添加した抽出緩衝液に再懸濁させる。 遠心分離によって不溶性のタンパクを除去した後、ＨＮおよびＦ糖タンパク抽 出物をクロマトグラフィー法で精製する。まず、ＨＮおよびＦ糖タンパクは通過 し、不純物はカラムに保持されるように条件付けしたＴＭＡＥ−フラクトゲルカ ラム等のイオン交換クロマトグラフィーカラムに抽出物を載せる。 ついで、ＨＮおよびＦ糖タンパクはマトリックスに吸着し、汚染物質はカラム を通過するように条件付けしたヒドロキシアパタイトカラムに溶出液を載せる。 ついで、適当な溶媒を用い、吸着したＨＮおよびＦ糖タンパクをカラムから共 溶出させる。得られたＨＮおよびＦ糖タンパクの共精製溶液は、さらに純度を上 げるための処理をしてもよい。 溶出液は、まず所定の分子量カットオフ膜を用いたタンジェントフロー限外濾 過によって濃縮する。濾液に所定の分子量、例えば約６０００〜８０００のポリ エチレングリコールを添加し、糖タンパクを沈澱させる。遠心分離し、上清を廃 棄した後、ペレットをＰＢＳに再懸濁させ、透析によりポリエチレングリコール を除去する。最後に、ＰＩＶ−１のＨＮおよびＦ糖タンパクの透析液を滅菌濾過 する。滅菌濾過した溶液をミョウバンに吸着させる。 ポリエチレングリコール沈澱および再懸濁による精製工程は、必要であれば精 製操作の初期の段階で行ってもよい。 ＰＩＶ−２のＨＮおよびＦ糖タンパクは、図１に示す一般的なスキームにした がってＰＩＶ−２ウイルスから別々に回収する。ウイルスの培養および収穫につ いで、ＰＩＶ−１と同様に収穫したウイルス濃縮物を得る。収穫したウイルス濃 縮物にポリエチレングリコールを添加し、ウイルスを沈澱させる。遠心分離およ び上清の廃棄を行い、ペレットを尿素溶液に懸濁させ、再度遠心分離および上清 の廃棄を行う。 ペレットを再懸濁させ、得られた尿素洗浄ウイルス懸濁液に界面活性剤を添加 し、細胞マスからＰＩＶ−２のＨＮおよびＦ糖タンパクを可溶化させる。遠心分 離し、上清を回収し、糖タンパクをさらに精製し、不溶性タンパクは廃棄する。 Ｆ糖タンパクはカラムを通過し、ＨＮ糖タンパクはカラムに保持されるように 条件付けしたＴＭＡＥ−フラクトゲルカラム等のイオン交換クロマトグラフィー カラムに上清を載せ、２種類のタンパクを効果的に分離し、ついで別々に処理す る。 イオン交換カラムからの溶出液を、Ｆ糖タンパクはカラムを通過し、汚染物質 はカラムに保持されるように条件付けしたヒドロキシアパタイトマトリックスに 載せる。ついで、溶出液を、Ｆ糖タンパクはカラムに保持され、汚染物質はカラ ムを通過するように条件付けした別のイオン交換カラムに載せてもよい。 ついで、カラムからＦ糖タンパクを溶出させ、精製したＰＩＶ−２のＦ糖タン パクを得る。所定の分子量カットオフ膜を用いたタンジェントフロー限外濾過に よって、溶出液を濃縮してもよい。濃縮したＦ糖タンパク溶液は、滅菌濾過する 。 ＰＩＶ−２のＨＮ糖タンパクは、適当な条件下でイオン交換カラムから溶出さ せる。ついで、溶出液をセファアクリルＳ−３００カラム等のゲル濾過カラムに 通し、ＨＮ糖タンパクとその他分子量の異なる汚染物質を分離する。セファアク リルカラムの代わりに、ヒドロキシアパタイトカラムを用いてもよい。 カラムからＨＮ糖タンパクを溶出し、精製したＰＩＶ−２のＨＮ糖タンパク液 を得る。適当な分子量カットオフ膜を用いたタンジェントフロー限外濾過によっ て、溶出液を濃縮してもよい。濃縮したＨＮ糖タンパク液を滅菌濾過する。 ＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タンパクは、図１に示す一般的なスキームにした がってＰＩＶ−３ウイルスから共分離、共精製する。ウイルスをワクチン級の培 養細胞で増殖させ、増殖したウイルスを単回または数回収穫する。数回収穫する 場合は、例えば感染後４、７および１０日の間隔で行う。 収穫したウイルスは、限外濾過によって濃縮する。濃縮したウイルスは最初の 精製操作、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、ポリエチレングリコール沈澱ま たはセルフィン硫酸クロマトグラフィーに供する。精製したウイルスを界面活性 剤で抽出し、ＨＮおよびＦ糖タンパクを可溶化させる。 ＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タンパクの可溶化についで、上清を糖タンパクは カラムに保持され、汚染物質はカラムを通過するように条件付けしたセルフィン 硫酸クロマトグラフィーカラム等のイオン交換クロマトグラフィーカラムに載せ る。同様に、セルフィン硫酸カラムの代わりに、ＴＭＡＥ−フラクトゲルカラム を用いてもよい。２種類のカラムを組合せ、連続精製してもよい。 カラムからＨＮおよびＦ糖タンパクを共溶出させ、共精製した糖タンパク液を 得る。所定の分子量カットオフ膜を用いたタンジェントフロー限外濾過によって 、この溶液を濃縮してもよい。濃縮した糖タンパク調製物を滅菌濾過し、カラム に吸着させる。 精製したＨＮおよびＦ糖タンパクは、二量体、三量体およびそれ以上の重合体 を含むホモまたはヘテロオリゴマーの形態であってもよい。 ＰＩＶ糖タンパク調製物は、外因性物質、血球吸着性物質または生ウイルスを 含まないことが実証された。 本発明には、パラインフルエンザウイルスの感染によって起こる疾病に対する ワクチンの有効成分として医薬品に使用するパラインフルエンザウイルスからの ＨＮおよびＦ糖タンパクも含まれる。本発明には、パラインフルエンザウイルス からのＨＮおよびＦ糖タンパクおよび必要に応じて薬理学的に許容される担体お よび／または希釈剤を含む医薬用ワクチン組成物も含まれる。 本発明は、別の側面で、パラインフルエンザウイルスの感染によって起こる疾 病に対する免疫賦与に使用する医薬用ワクチン組成物の調製にパラインフルエン ザウイルスからのＨＮおよびＦ糖タンパクの利用を提供する。１．ワクチンの調製および使用 ワクチンとしての使用に適した免疫原性組成物は、ここに開示するようにＰＩ Ｖ−１、ＰＩＶ−２および／またはＰＩＶ−３の免疫原性ＨＮおよびＦ糖タンパ クから調製することができる。抗原性物質は、広範な透析により不要な低分子量 の分子を除去するか、所定の担体と容易に製剤できるように凍結乾燥することが 望ましい。免疫原性組成物は免疫反応を誘導し、抗Ｆおよび抗ＨＮ抗体を含む抗 ＰＩＶ'抗体等の抗体が生産される。このような抗体は、ウイルスを中和する。 ワクチンを含む免疫原性組成物は、注射剤、液剤、懸濁剤または乳剤として調 製することができる。免疫原性を有する有効成分は、薬理学的に許容され、当該 有効成分と相容性のある添加剤と混合してもよい。このような添加剤としては、 水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびこれらの混 合物であってもよい。免疫原性組成物およびワクチンは、さらにその効果を向上 させるための湿展剤または乳化剤、緩衝剤またはアジュバント等の補助剤を含ん でいてもよい。免疫原性組成物およびワクチンは、皮下注射または皮内注射等非 経口的に投与することもできる。別の方法として、本発明にしたがって調製した 免疫原性組成物は粘膜表面において免疫反応を誘導するような方法で製剤および 投与することもできる。すなわち、免疫原性組成物を、例えば鼻内または経口（ 胃内）経路によって粘膜表面に投与することができる。別の方法としては、座薬 および経口製剤等の別の投与形態も望ましい。座薬には、例えばポリアルキレン グ リコール類またはトリグリセリド類等のバインダーおよび担体を添加してもよい 。このような座薬は、約０．５〜約１０％、望ましくは約１〜２％の範囲の有効 成分を含む混合物から製剤する。経口製剤は、医薬品級のサッカリン、セルロー スおよび炭酸マグネシウム等一般的に使用されている初発剤を含んでいてもよい 。これらの組成物は、溶液、懸濁液、タブレット、ピル、カプセル、徐放製剤ま たは粉末の形態とし、約１〜９５％、望ましくは約２０〜約７５％の有効成分を 含んでいてもよい。 免疫原性組成物およびワクチンは剤形に適合する方法で、療法的に有効で、防 護および免疫効果がある用量で投与する。投与量は被験者、例えば個人の免疫系 の抗体合成能力、必要とする防御の程度、および必要であれば細胞介在免疫反応 によって異なる。実際の投与量は医師の判断によるが、適当な用量範囲を決める ことは当該分野の専門家にとっては容易なことであり、投与あたり数μｇの範囲 にある。初回投与およびブースター量にも変動があるが、初回投与後数回の投与 が行われる。用量は投与経路によっても異なるが、宿主の体重によっても異なる 。 本発明に係わる免疫原性組成物中の有効成分タンパクの濃度は、一般に約１〜 ９５％の範囲にある。１種類の病原体の抗原のみを含むワクチンは、１価抗体ワ クチンである。数種類の病原体の抗原を含むワクチンは複合ワクチンであり、こ れらも本発明に包含される。このような複合ワクチンは、例えば各種病原体、同 一病原体の各種系統または各種病原体の組み合わせからの抗体を含む。本発明に おいては、上記のようにＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３のＨＮおよび Ｆ糖タンパクを単一の多価性免疫原性組成物として混合し、さらにその他の免疫 原を含むこともできる。 抗原をアジュバント（一般にリン酸緩衝液中０．０５〜０．１％の溶液として 使用される）と同時に投与すると、免疫原性を著しく増強させることができる。 アジュバントは抗原の免疫原性を向上させるが、それ自体は必ずしも免疫原性を 有さない。アジュバントは抗原を投与部位の近くに保持し、デポー作用を発揮し 、抗原を免疫系の細胞に徐々に、長期にわたって放出する作用を有する。またア ジュバントは免疫系の細胞を抗原のデポーに引きつけ、これらの細胞を刺激しで 免疫反応を誘発させることもできる。 免疫刺激剤またはアジュバントは、例えばワクチンに対する宿主の免疫反応を 増強させるために長年にわたって使用されている。リポ多糖類等の内在性アジュ バントは、死菌または弱毒ワクチンの成分として広く使用されている。外因性ア ジュバントは免疫修飾物質であり、典型的に抗原と非共有結合をし、宿主の免疫 反応を増強させるように製剤化されている。このように、アジュバントは、非経 口的に投与する抗原に対する免疫反応を増強するものとして認識されている。し かし、これらアジュバントのいくつかは有毒であり、望ましくない副作用を起こ すため、ヒトや多くの動物に使用することはできない。事実、ヒトおよび家畜用 のワクチンには、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（一般にミョウ バンと総称されている）のみがアジュバントとして定常的に使用されている。ミ ョウバンのジフテリアおよび破傷風トキソイドに対する抗体反応増強効果はよく 知られており、ＨＢｓＡｇワクチンのアジュバントとして使用されている。ミョ ウバンのＨＮおよびＦ糖タンパク免疫原性増強効果は、Ｅｗａｓｈｙｓｈｙｎら によって実証されている（参考文献１６）。ミョウバンは一部の用途には有利で あるが、限界がある。例えば、ミョウバンはインフルエンザワクチンには効果が なく、細胞仲介免疫反応の発現に一貫性がない。ミョウバンをアジュバントとす る抗原によって誘導される抗体は主としてマウスにおけるＩｇＧ１アイソタイプ のものであり、一部のワクチンによる防護反応には最適ではない。 広範囲の外因性アジュバントが、抗原に対する強力な免疫反応を誘導する。こ れらは膜タンパク抗原と複合化したサポニン類（免疫刺激性複合体）、鉱物油中 の多イオンポリマー、鉱物油中の不活性化マイコバクテリア、フロイントの完全 アジュバント、ムラミル ジペプチド（ＭＤＰ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、リピ ドＡおよびリポソーム等の細菌製剤である。 体液性免疫反応（ＨＩＲ）および細胞仲介免疫反応（ＣＭＩ）を効果的に誘導 するため、しばしば免疫原がアジュバント中で乳化されている。多くのアジュバ ントは、顆粒腫、急性および慢性炎症（フロイントの完全アジュバント、ＦＣＡ ）、細胞融解（サポニン類および多イオンポリマー）および発熱性、関節炎およ び腹側ブドウ膜炎（ＬＰＳおよびＭＤＰ）等の毒性を示す。ＦＣＡは優れたアジ ュバントであり、研究に広く用いられているが、このような毒性があるため、ヒ トお よび家畜用のワクチンとしては承認されていない。 理想的なアジュバントの望ましい特性は、以下のとおりである。 （１）毒性を有さないこと （２）長期間の免疫反応を刺激すること （３）製造が容易で、長期保存に耐えること （４）必要に応じて各種の経路で投与した抗原に対してＣＭＩおよびＨＩＲの両 方を誘導すること （５）他のアジュバントと相乗効果を有すること （６）抗原を提供する細胞群と選択的な相互作用を有すること （７）特に適当なＴ_H１またはＴ_H２細胞特異的免疫反応を誘導すること （８）抗原に対して適当な抗体アイソタイプレベル（例えば、ＩｇＡ）を選択的 に増加させること 比較例としてここでも引用した米国特許第４、８５５、２８３号（Ｌｏｃｋｈ ｏｆｆら、１９８９年８月８日）では、免疫修飾物質またはアジュバントとして 糖残基がアミノ酸で置換されたＮ−グリコシルアミド類、Ｎ−グリコシルウレア 類およびＮ−グリコシルカーバメート類等のグリコリピド類が開示されている。 すなわち、Ｌｏｃｋｈｏｆｆら（米国特許第４、８５５、２８３号および参考文 献３２）は、天然のグリコリピド類に構造的に類似したグリコスフィンゴリピド 類およびグリコグリセロリピド類等のＮ−グリコリピド類縁化合物が単純疱疹ウ イルスワクチンおよび仮性狂犬病ウイルスワクチンで強い免疫反応を誘導すると 報告している。天然のリピド残基の機能に類似したアノマー炭素原子を介して糖 類と直接結合している長鎖アルキルアミン類および脂肪酸類から、数種類のグリ コリピドが合成されている。 本出願人に譲渡され、ここでも比較例として引用した米国特許第４、２５８、 ０２９号でＭｏｌｏｎｅｙは、オクタデシル チロシン塩酸塩（ＯＴＨ）が破傷 風トキソイドおよびホルマリン不活性化Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型ポリオウイルス ワクチンと複合したときアジュバントして機能することを開示している。また、 Ｎｉｘｏｎ−Ｇｅｏｒｇｅら（参考文献３３）は、芳香族アミノ酸のオクタデシ ルエステルが組換えＢ型肝炎表面抗原と複合したときＢ型肝炎ウイルスに対する 宿主の免疫反応を増強すると報告している。２．免疫検定 本発明に係わるＨＮおよびＦ糖タンパクは、抗体形成免疫原として、酵素結合 免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡｓおよびその他の非酵素結合抗体結合検定 または従来の抗体検出法を含む免疫検定の抗原として有用である。ＥＬＩＳＡで は、特定のＨＮまたはＦ糖タンパクまたは糖タンパクの混合物を特定の表面、例 えばポリスチレン微量定量プレートの壁等タンパク吸着性を有する表面に固定す る。吸着が不完全な物質を洗浄除去した後、検体と比較して抗原的に中性である ことが知られているウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）溶液等の非特異的タンパクを 特定の表面に結合させる。これによって固定表面上の非特異的吸着部位をブロッ クし、表面に対する抗血清の非特異的結合によって起こるバックグラウンドを減 らすことができる。 ついで、固定表面に臨床または生物試料を接触させ、免疫複合体（抗原／抗体 ）を形成させるときと同様に試験する。これには、ＢＳＡ溶液、ウシガンマーグ ロブリン（ＢＧＧ）および／またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）／ツイン等 の希釈剤で試料を希釈することが含まれる。ついで、約２５℃〜３７℃の温度で 、約２〜４時間インキュベーションする。インキュベーション後、試料接触面の 非免疫複合物質を洗浄除去する。洗浄手順としては、ＰＢＳ／ツインまたは硼酸 緩衝液等の溶液による洗浄が含まれる。供試試料と結合糖タンパクとの間で特異 的免疫複合体を形成させた後、洗浄し、最初の抗体に対して特異性を有する第２ の抗体と免疫複合体を形成させることによって免疫複合体形成の有無および場合 によっては量を測定する。検体がヒトに由来する試料である場合、第２の抗体は ヒト免疫グロブリン、一般にＩｇＧに特異性を有する抗体である。検出手段を提 供するため、第２の抗体は例えば適当なクロモーゲンとともにインキュベーショ ンしたとき呈色するような酵素活性等の活性を有する必要がある。ついで、例え ばスペクトロメーターを用いて発色の程度を測定し、定量を行う。 以上は、本発明の概要であるが、以下の実施例を参照することによって本発明 の完全な理解が得られる。これらの実施例はもっぱら説明を目的としたものであ り、本発明の範囲を限定するものではない。形態の変更および同等のもので置換 することは容易である。ここでは特異的な用語を用いたが、これらの用語は本発 明を正確に記述するために用いたものであり、発明の範囲を限定するためではな い。 本明細書では用いた分子遺伝学的、タンパク生化学的、ウイルス学的および免 疫学的方法が必ずしも明瞭に記載されているとは限らないが、これらの実施例は 科学文献に詳細に報告されており、当該分野の専門家にとっては容易に理解でき ることである。 実施例実施例１： 本実施例は、大型で制御された発酵槽内におけるミクロキャリヤービーズ上の 哺乳類細胞株に基づく高力価ＰＩＶ−１の製造を説明する。 濃度１０⁵細胞／ｍＬのワクチン品質アフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞 （ＶＥＲＯ細胞）を、シトデックス−１ミクロキャリヤービーズ３６０ｇを入れ た１５０Ｌバイオリアクター中のＣＭＲＬ１９６９培地、ｐＨ７．２の６０〜７ ５ｌに加えて、２時間撹拌した。さらにＣＭＲＬ１９６９を加えて総容積１５０ Ｌとした。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えて最終濃度３．５％とした。グルコー スを加えて最終濃度３．０ｇ／Ｌとし、グルタミンを加えて最終濃度０．６ｇ／ Ｌとした。溶解酸素（４０％）、ｐＨ（７．２）、撹拌（４０ｒｐｍ）および温 度（３７℃）を制御した。細胞増殖、グルコース、ラクテーートおよびグルタミ ンレベルを監視した。細胞が対数期にあると、通常３日目から４日目に密度約１ ．０〜２．５ｘ１０⁶細胞／ｍＬに達した。培地を発酵槽から排出し、ＣＭＲＬ １９６９、ｐＨ７．２（ＦＢＳなし）１２０Ｌを加え、培地を１０分間撹拌した 。発酵槽の排出および注加は、通常１回で行ったが、３回までは反復できた。細 胞を洗浄した後に、発酵槽から排液し、ＦＢＳ０．１％（ｖ／ｖ）を含むＣＭＲ Ｌ１９６９の５０Ｌを加えた。ＰＩＶ−１接種体を０．００１の感染多重度（ｍ ．ｏ．ｉ）で加えた。Ｆタンパクの加水分解開裂による効果的な感染を促進する ために、必要な場合にはトリプシンも加えた。さらにＦＢＳ０．１％ｖ／ｖを含 む ＣＭＲＬ１９６９を加えて最終容積１５０Ｌとした。培養は３４℃において４〜 ６日間続けた。標準的には感染４日後において、発酵槽１基からウイルスを１回 収穫した。発酵槽１基から多数回収穫してもよい。液体は、下記の手順で収穫し た。撹拌を停止し、ビーズを沈殿させた。さらに処理するためにウイルス培地液 をタンク中に排出した（下記の実施例４参照）。ＰＩＶ−１増殖は、組織培養感 染価（ＴＣＩＤ₅₀）によるウイルス力価の測定、血球凝集（ＨＡ）、ＨＮおよび Ｆ抗体ＥＬＩＳＡ試験により監視し、結果は表１に記載してある。実施例２： 本実施例は、大型で制御された発酵槽内におけるミクロキャリヤービーズ上の 哺乳類細胞株に基づく高力価ＰＩＶ−２の製造を説明する。 濃度１０⁵細胞／ｍＬのワクチン品質アフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞 （ＶＥＲＯ細胞）を、シトデックス−１ミクロキャリヤービーズ３６０ｇを入れ た１５０Ｌバイオリアクター中のＣＭＲＬ１９６９培地、ｐＨ７．２の６０Ｌに 加えて、２時間撹拌した。さらにＣＭＲＬ１９６９の６０Ｌを加えて総容積１２ ０Ｌとした。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えて最終濃度３．５％とした、グルコ ースを加えて最終濃度３．０ｇ／Ｌとし、グルタミンを加えて最終濃度０．６ｇ ／Ｌとした。溶解酸素（４０％）、ｐＨ（７．２）、撹拌（３６ｒｐｍ）および 温度（３７℃）を制御した。細胞増殖、グルコース、ラクテートおよびグルタミ ンレベルを監視した。細胞が対数期（通常３日目から４日目）にあると、細胞は 密度約１．０〜２．５ｘ１０⁶細胞／ｍＬに達した。培地を発酵槽から排出し、 ＣＭＲＬ１９６９、ｐＨ７．２（ＦＢＳなし）６０Ｌを加え、１０分間撹拌した 。発酵槽の排出および注加は、通常１回で行ったが、３回までは反復できた。細 胞を洗浄した後に、発酵槽から排液し、０．１％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＣＭＲ Ｌ１９６９の１２０Ｌを加えた。ＰＩＶ−２接種体を０．００１の感染多重度（ ｍ．ｏ．ｉ）で加えた。Ｆタンパクの加水分解開裂による効果的な感染を促進す るために、必要な場合にはトリプシンも加えた。培養は３２〜３７℃において３ 〜６日間続けた。標準的には感染４日後において、発酵槽１基からウイルスを１ 回収 穫した。発酵槽１基から多数回収穫してもよい。液体は、下記の手順で収穫した 。撹拌を停止し、ビーズを沈殿させた。さらに処理するためにウイルス培地液を タンク中に排出した（下記の実施例４参照）。ＰＩＶ−２増殖は、ＴＣＩＤ₅₀に よるウイルス力価の測定、血球凝集（ＨＡ）、総ウイルスおよびＦ抗体ＥＬＩＳ Ａ試験により監視し、結果は表２に記載してある。実施例３： 本実施例は、大型で制御された発酵槽内におけるミクロキャリヤービーズ上の 哺乳類細胞株に基づく高力価ＰＩＶ−３の製造を説明する。 濃度１０⁵細胞／ｍＬのワクチン品質アフリカ・グリーン・モンキー腎臓細胞 （ＶＥＲＯ細胞）を、シトデックス−１ミクロキャリヤービーズ３６０ｇを入れ た１５０Ｌバイオリアクター中のＣＭＲＬ１９６９培地、ｐＨ７．２の６０Ｌに 加えて、２時間撹拌した。さらにＣＭＲＬ１９６９の６０Ｌを加えて総容積１２ ０Ｌとした。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えて最終濃度７．０％とした。グルコ ースを加えて最終濃度３．０ｇ／Ｌとし、グルタミンを加えて最終濃度０．６ｇ ／Ｌとした。溶解酸素（４０％）、ｐＨ（７．２）、撹拌（３６ｒｐｍ）および 温度（３７℃）を制御した。細胞増殖、グルコース、ラクテートおよびグルタミ ンレベルを監視した。４日目に細胞は密度約１．０〜１．８ｘ１０⁶細胞／ｍＬ に達した。培地を発酵槽から排出し、ＣＭＲＬ１９６９、ｐＨ７．２（ＦＢＳな し）１００Ｌを加え、１０分間撹拌した。発酵槽の排出および注加は、通常１回 で行ったが、３回までは反復できた。細胞を洗浄した後に、発酵槽から三度目に 排液し、ＣＭＲＬ１９６９の６０Ｌを加えた。ＰＩＶ−３接種体を０．００１の 感染多重度（ｍ．ｏ．ｉ）で加え、培地を３７℃において２時間攪拌した。さら にＣＭＲＬ１９６９、ｐＨ７．２の６０Ｌを加え、同じ条件下で培養を続けた。 標準的には感染後４日目、７日目、１０日目において、発酵槽１ロットからウイ ルスを多数回収穫できる。ウイルス液は、下記の手順で収穫した。攪拌を停止し 、ビーズを沈殿させた。さらに処理するためにウイルス培地液をタンク中に排出 した（実施例４参照）。発酵槽に再びＣＭＲＬ１９６９培地１２０Ｌを満たし、 上 記のようにして培養した。ＰＩＶ−３増殖は、ＴＣＩＤ₅₀によるウイルス力価の 測定、血球凝集（ＨＡ）、ウイルス抗体ＥＬＩＳＡ試験により監視し、結果は表 ３に記載してある。ウイルスタンパクの収量は、８〜１２ｍｇ／Ｌであった。 ＰＩＶは、同じ手順を用いて、ワクチン品質ヒト肺二倍体細胞（ＭＲＣ−５） に基づいても製造できた。実施例４： 本実施例は、ＰＩＶウイルス収穫の浄化および濃縮を記載する。 ＰＩＶ−１に対しては、ウイルス収穫（１５０Ｌ）を一連のデッドエンド・フ ィルター（１．２μｍ）続いて０．４５μｍ）を通して濾過した。３００ＮＭＷ Ｌ膜を用いる接線流限外濾過を用いて、浄化された収穫液を４０〜１５０倍濃縮 し、ＰＢＳを用いてダイアフィルトレーションした。この処理の間のウイルス回 収率をＨＡ、ＴＣＩＤ₅₀およびＥＬＩＳＡにより測定した。ウイルス収穫は、下 記の実施例３〜６に記載した引き続く精製の前に冷凍保存（−２０℃または−７ ０℃）できた。 ＰＩＶ−２に対しては、ウイルス収穫（１２０Ｌ）を１μｍデッドエンド・フ ィルターを通して濾過した。３００ＮＭＷＬ膜を用いる接線流限外濾過を用いて 、浄化された収穫液を４０〜９０倍濃縮し、ＰＢＳを用いてダイアフィルトレー ションした。この処理の間のウイルス回収率をＨＡにより測定し、７５％以上と 高かった。ウイルス収穫は、引き続く精製の前に、プロテアーゼ抑制剤、例えば １ｍＭペファブロック（Ｐｅｆａｂｌｏｃ）の存在下で、冷凍保存（−２０℃ま たは−７０℃）できた。 ＰＩＶ−３に対しては、ウイルス収穫（１２０Ｌ）を一連のデッドエンド・フ ィルター（２０μｍ−＞１μｍ−＞０．４５μｍ、サルトリウス）を通して濾過 するか、または０．４５μｍ接線流ミクロ濾過を用いで処理した。３００ＮＭＷ Ｌ膜を用いる接線流限外濾過を用いて、浄化された収穫液を４０〜５０倍濃縮し 、ＰＢＳを用いてダイアフィルトレーションした。この処理の間のウイルス回収 率をＨＡ、ＴＣＩＤ₅₀およびＥＬＩＳＡ試験により測定し、代表的には８０％以 上であった。。ウイルス収穫は、さらに精製するまで冷凍保存（−２０℃または −７０℃）できた。実施例５： 本実施例は、ＰＩＶ−１血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（ Ｆ）糖タンパクの精製を記載する。 ウイルス収穫濃縮液を３０分間、４℃において２８，０００ｘｇで遠心分離し た。上清を廃棄し、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭＮａＣｌ 、２％（ｗ／ｖ）トライトンＸ−１００から成る抽出緩衝液中にペレットを再懸 濁し、最初の収穫濃縮液容積とした。ペファブロックを加えて最終濃度５ｍＭと した。懸濁液を室温で３０分間攪拌した。可溶性のＨＮおよびＦ糖タンパクを含 む上清を３０分間、４℃において２８，０００ｘｇで遠心分離して浄化した。 ＴＭＡＥ−フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｇｅｌ）カラム（１０ｃｍ ｘ １５ｃ ｍ）を０．０２％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７ ．０、１５０ｍＭＮａＣｌを用いて平衡化した。可溶性のＨＮおよびＦ糖タンパ クを含むトライトンＸ−１００上清（約１ｍｇ負荷抽出液／ｍＬ樹脂）をＴＭＡ Ｅ−フラクトゲルカラムに直接負荷した。添加した総容積＋０．０２％トライト ンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭＮａＣｌ の床２容積分を集めた。ＨＮおよびＦを含むＴＭＡＥ−フラクトゲルカラム溶出 液を０．０２％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７． ０を用いて３倍に希釈した。 ヒドロキシアパタイト・カラム（１０ｃｍ ｘ １５ｃｍ）を１０ｍＭトリス −ＨＣｌ、 ｐＨ７．０、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％トライトンＸ−１０ ０を用いて平衡化した。ＴＭＡＥ溶出液を負荷した後に、１０ｍＭトリス−ＨＣ ｌ、ｐＨ７．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０２％トライトンＸ−１００のカラム ２容積分、次いで５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１ＭＮａＣｌ、０．０ ２％トライトンＸ−１００のカラム４容積分を用いてカラムを洗浄した。２０ｍ Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１ＭＮａＣｌ、０．０２％トライトンＸ−１ ００ のカラム４容積分を用いてタンパクを溶出した。Ａ₂₈₀に基づいて画分を集め、 タンパク含有量および抗原濃度を測定した。 ３００ｋＤａ ＮＭＷＬ膜を用いる接線流遠心分離により、同時精製されたＨ ＮおよびＦ糖タンパクを限外濾過した。ＰＥＧを加えて最終濃度１０％とし、引 き続き２〜８℃において１時間攪拌して、３００ｋＤａ濾液をＰＥＧ沈殿させた 。次いで、懸濁液を１時間、４℃において２８，０００ｘｇで遠心分離した。ペ レットをＰＢＳ中に再懸濁して、タンパク濃度２００〜３００μｇ／ｍＬとした 。試料を１時間、２０〜２５℃で攪拌し、３日間、４℃において、０．０２％ト ライトンＸ−１００を含むＰＢＳに対して透析（分子量カットオフ６，０００〜 ８，０００）した。 透析したＨＮおよびＦ糖タンパクをデッドエンド０．２〜０．２２μｍ膜フィ ルターを用いて滅菌濾過し、リン酸アルミニウム上に吸着させた（最終濃度０． ７５〜３ｍｇ／ｍＬ）。実施例６： 本実施例は、ＰＩＶ−２血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（ Ｆ）糖タンパクの精製を記載する。 ウイルス収穫濃縮液を５０％ＰＥＧを加えて最終濃度４％とし、混合液を２〜 ８℃において１時間間培養してＰＥＧ沈殿させた。次いで、懸濁液を３０分間、 ４℃において２８，０００ｘｇで遠心分離し、ＰＢＳ中の２Ｍ尿素中にペレット を再懸濁し、最初の容積の半分とした。懸濁液を１時間、２０〜２５℃において 攪拌し、次いで１時間、４℃において２８，０００ｘｇで遠心分離した。１０ｍ Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、１５０ｍＭＮａＣｌ緩衝液中にペレットを再懸 濁し、最初の容積の１／１０とした。次いで、試料を−２０℃で冷凍するか、ま たは直ちに処理した。 尿素洗浄ウイルス懸濁液にトライトンＸ−１００（１０％）を加えて、最終濃 度２％とし、２０〜２５℃で２時間攪拌した。可溶性のＨＮおよびＦ糖タンパク を含む上清を３０分聞、４℃において２８，０００ｘｇで遠心分離して浄化した 。 ＴＭＡＥ−フラクトゲルカラム（１．５ｃｍ ｘ ３０ｃｍ）を０．０１％ト ライトンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、５０ｍＭＮａ Ｃｌを用いて平衡化した。可溶性のＨＮおよびＦ糖タンパクを含むトライトンＸ −１００上清（約１ｍｇ負荷抽出液／ｍＬ樹脂）を１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ８．５を用いて２倍に希釈し、ＴＭＡＥ−フラクトゲルカラムに直接負荷した 。添加した総容積＋０．０１％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス Ｈ Ｃｌ、ｐＨ８．５、５０ｍＭＮａＣｌの床２容積分を集めた。ＴＡＭＥ−フラク トゲル溶出液は、可溶性Ｆ糖タンパクを含む。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８ ．５、２００ｍＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００のカラム４容積分 を用いてＴＡＭＥカラムを洗浄した。１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、３ ００ｍＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００を用いてＨＮ糖タンパクを 溶出した。 ＴＭＡＥ−フラクトゲルカラムからのＨＮ濃縮画分にベンゾナーゼを加え、Ｍ ｇＣｌ₂を用いて混合液を１ｍＭとした。室温で一晩、混合液を培養した。 ヒドロキシアパタイト・カラム（２．５ｃｍ ｘ １０ｃｍ）を５０ｍＭＮａ Ｃｌおよび０．０１％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐ Ｈ８．５を用いて平衡化した。ＴＭＡＥ溶出液をヒドロキシアパタイト・カラム に負荷し、ＵＶ₂₅₀吸収溶出液（Ｆ−糖タンパクを含む）＋５０ｍＭＮａＣｌお よび０．０１％トライトンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８． ５のカラム２容積分を集めた。 酢酸ナトリウムを用いてヒドロキシアパタイト溶出液を３０ｍＭとし、１０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ− １００を用いて予備平衡化したＳＯ₃−フラクトゲルカラムに負荷した。１０ｍ Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ− １００のカラム２容積分を用いてカラムを洗浄した。さらに１０ｍＭ酢酸ナトリ ウム、ｐＨ５．０、２ＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００のカラム２ 容積分を用いてカラムを洗浄した。１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００のカラム４容積分を用いてＦ糖タン パクを溶出し、Ａ₂₈₀吸収ピーク＋１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ1５．０、１Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００のカラム２容積分を集めた。 Ｓ−３００カラム（１．５ｃｍ ｘ ９０ｃｍ）を充填し、５０ｍＭリン酸ナ トリウム、ｐＨ７．５、０．５ＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００を 用いて平衡化した。可溶性のＨＮ−糖タンパクを含むＴＭＡＥ溶出液を４℃にお いて攪拌式細胞濃縮機中で濃縮して、Ｓ−３００カラム容積の約２％の最終容積 とし、Ｓ−３００ゲル濾過カラムに負荷した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ ７．５、０．５ＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００、１０％グリセリ ンを用いてこのカラムを溶出し、集められたＨＮ糖タンパクを含むＡ₂₈₀吸収ピ ーク（カラム容積の２〜４倍）を収穫した。 あるいは、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８．５、０．０１％トライトンＸ− １００を用いてΓＡＭＥ溶出液を５倍に薄め、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ，ｐＨ８ ．５、５０ｍＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００を用いて平衡化した ヒドロキシアパタイトカラム（５ｃｍ ｘ １５ｃｍ）に負荷した。５０ｍＭリ ン酸ナトリウム、ｐＨ８．５、０．０１％トライトンＸ−１００のカラム４容積 分を用いてカラムを洗浄した。１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５、０． １５ＭＮａＣｌ、０．０１％トライトンＸ−１００のカラム４容積分を用いて、 ＨＮ糖タンパクを溶出した。精製ＨＮおよびＦ糖タンパクは、３００ｋＤａ Ｎ ＭＷＬ膜を用いる接線流遠心分離により限外濾過した。２０ｋＤａ ＮＭＷＬ膜 を用いる接線流遠心分離により３００ｋＤａ濾液をタンパク濃度２００〜３００ μｇ／ｍＬまで濃縮し、次いで０．０１％トライトンＸ−１００を含むＰＢＳに 対してダイアフィルトレーションした。 濃縮したＨＮおよびＦ糖タンパクは、デッドエンド０．２〜０．２２μｍ膜フ ィルターを用いて滅菌濾過し、リン酸アルミニウム上に吸着させた（最終濃度０ ．７５〜３ｍｇ／ｍＬ）。実施例７： 本実施例は、ＰＩＶ−３血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）および融合（ Ｆ）糖タンパクの精製を記載する。 ＰＩＶ−３は、ウイルス収穫それぞれから別々に精製できるか、または収穫を プールした。ＰＩＶ−３は、ＰＥＧ６０００−８０００を加えて最終濃度約２％ （ｖ／ｖ）とし、約２時間、４℃で攪拌してウイルス収穫から沈殿させた。沈殿 物を遠心分離により集め、リン酸塩緩衝食塩水中に再懸濁させた。トライトンＸ −１００を加えて、最終濃度１％（ｖ／ｖ）とし、混合液を１〜３時間、３７℃ で攪拌し、ＨＮおよびＦ糖タンパクを抽出した。非可溶化タンパクを遠心分離に より除去した。大部分のＨＮおよびＦ糖タンパクは、上清中に存在した。 あるいは、セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）Ｓ−５００カラム（２．５ｘ １００ｃｍ）を０．２５ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７． ５の流量２．５ｍｌ／分を用いて平衡化した。ウイルス保持プール（１００ｍｌ ）をこのカラムに負荷し、カラム溶出液をＡ₂₈₀で監視した。ＰＩＶ−３は非充 填部分に溶出した。画分もＨＡ活性をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパ ク汚染物からウイルスは良好に分離し、高いＨＡ活性の回収率（＞８０％）が得 られた。ＰＩＶ−３を含む画分をプールし、上記のようにして界面活性剤抽出し た。 あるいは、感染前の細胞の洗浄の回数を２回から４回に増やした場合には、Ｐ ＩＶ−３の直接精製のために硫酸セルファイン（Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ）を用いる ことができる。硫酸セルファインカラム（１０ｃｍ ｘ １５ｃｍ）を１０ｍＭ トリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５ＭＮａＣｌを用いて平衡化した。ウイル ス収穫濃縮液（２．５ｍｇ負荷／ｍｌ硫酸セルファイン）を流量２ｍＬ／分でカ ラムに負荷した。負荷の後、平衡化緩衝液のカラム５容積分を用いてカラムを洗 浄した。ウイルスおよびウイルス断片を２％トライトンＸ−１００を含む５０ｍ Ｍトリス・ＨＣｌ、０．１５ＭＮａＣｌを用いて溶出した。次いで、溶出液プー ルを室温または３７℃で２〜３時間培養して、ＨＮおよびＦ糖タンパクを抽出し た。不溶性物質は遠心分離で除去した。 適当な大きさの硫酸セルファインカラム（約１ｍｇ負荷抽出液／ｍｌ樹脂）を １０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０２％トライ トンＸ−１００を用いて平衡化した。界面活性剤抽出液またはＴＭＡＥ−フラク トゲル溶出液プールの伝導率は、蒸留水または０．０２％トライトンＸ−１００ を添加して、約４ｍＳ／ｃｍまたはこれ以下に調整し、線流速５０ｃｍ／時間で カラムに負荷した。負荷の後、平衡化緩衝液のカラム５容積分を用いてカラムを 洗浄した。ＨＮおよびＦ糖タンパクを１．０ＭＮａＣｌ、０．０２％トライトン Ｘ−１００を含む１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５を用いて溶出した。画分 を集め、吸光率をＡ₂₈₀で監視した。ピークをプールし、タンパク含有量および ＨＡ活性を試験した。硫酸セルファインカラムからの溶出画分中からＨＮおよび Ｆ糖タンパクを回収した。 ＨＮおよびＦ濃縮抽出液（ゲル透過クロマトグラフィーにより精製されたウイ ルス）または硫酸セルファインからのＨＮおよびＦプールを陰イオン交換クロマ トグラフィーによりさらに精製した。 ＴＭＡＥ−フラクトゲルカラム（約２．５ｍｇ抽出液または負荷した硫酸セル ファイン溶出液プール／ｍＬ樹脂）を０．０５ＭＮａＣｌ、０．０２％トライト ンＸ−１００を含む１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５を用いて平衡化した。 抽出液または硫酸セルファイン溶出液プールの伝導率は、蒸留水を用いて４ｍＳ ／ｃｍ以下またはこの値に調整し、線流速１００ｃｍ／時間で試料をカラムに負 荷した。試料の負荷の後、平衡化緩衝液のカラム５容積分、引き続き１０ｍＭト リス・ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１５ＭＮａＣｌ、０．０２％トライトンＸ−１ ００のカラム５容積分を用いてカラムを洗浄した。１０ｍＭトリス・ＨＣｌ、ｐ Ｈ７．５、０．６ＭＮａＣｌ、０．０２％トライトンＸ−１００を用いでタンパ クを溶出した。画分を集め、Ａ₂₈₀値に基づいてプールし、画分のタンパク含有 量およびＨＡ活性を測定した。 同時精製したＨＮおよびＦ糖タンパクは、３００ｋＤａＮＨＷＬ膜を用いて接 線流遠心分離により限外濾過し、ＰＢＳを用いてダイアフィルトレーションした 。 ＨＮおよびＦ糖タンパクを含む３００ｋＤａ濾液およびダイアフィルトレーショ ン液を一緒にし、３０ｋＤａ膜を用いて再濃縮し、ＰＢＳを用いてダイアフィル トレーションした。濃縮された糖タンパク調製体を０．２２μｍで滅菌濾過し、 リン酸アルミニウム上に吸着させた（最終濃度０．７５〜３ｍｇ／ｍＬ）。実施例８： 本実施例は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，免疫ブロット法および走査型濃度測定による ＰＩＶ ＨＮおよびＦ糖タンパクの分析を説明する。 ＰＩＶ ＨＮおよびＦ糖タンパク調製体を減圧下で１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲル上、または減圧しない条件下で７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を通した 。ゲルはクーマシー・ブルーを用いて染色した。ＰＩＶ ＨＮおよびＦ糖タンパ ク双方のより高い分子量形が検出された。免疫ブロット分析は、単一特異性抗− ＨＮおよび抗−Ｆ抗血清またはモノクロナール抗体を用いて高分子量形の特性を 確認するために使用した。調製体中に存在するＨＮおよびＦ糖タンパクの全量は 、レーザー濃度計を用いて各レーンを走査し、ＨＮおよびＦ糖タンパクバンドに 相当するピークの下の面積を合計して測定した。これらの分析からの結果は、Ｐ ＩＶ−１に対しては図２（ａ）〜２（ｃ）、ＰＩＶ−２に対しては図３（ａ）〜 ３（ｄ）、ＰＩＶ−３に対しては図４（ａ）〜４（ｄ）に記載してある。実施例９： 本実施例は、マウスにおけるＰＩＶ−１ ＨＮおよびＦ糖タンパクの免疫原性 を説明する。 マウス５匹のグループ（ＣＤ−１、１８〜２０ｇ）を０日目および２８日目に 、リン酸アルミニウム（ミョウバン）３ｍｇ／ｍＬを加えたＰＩＶ−１ ＨＮお よびＦ糖タンパク０．３、１、３または１０μｇを用いて腹腔内免疫（０．５ｍ Ｌ）した。０日目、２８日目および４２日目に血液試料を採取した。ＰＢＳ／ミ ョウバンを用いて免疫化したマウスを陰性対照とした。抗−ＨＮ、抗−Ｆ抗体力 価およびＰＩＶ特異性中和力価について、血清を分析した。試験したすべでの投 与量について、４週後および６週後に強い抗−ＨＮ、抗−Ｆおよび中和抗体が検 出さ れた。結果は図５（ａ）〜５（ｃ）に総括してある。実施例１０： 本実施例は、ハムスターにおけるＰＩＶ−１ ＨＮおよびＦ糖タンパクの免疫 原性を説明する。 ハムスター１０匹のグループ（ゴールデン・シリアン種、チャールズ・リバー ）を０日目および２８日目に、リン酸アルミニウム（ミョウバン）３ｍｇ／ｍＬ を加えたＰＩＶ−１ ＨＮおよびＦ糖タンパク１または１０μｇを用いで筋肉内 免疫（０．５ｍＬ）した。０日目、２８日目および４２日目に血液試料を採取し た。ＰＢＳ／ミョウバンを用いて免疫化したハムスターを陰性対照とした。抗− ＨＮ、抗−Ｆ力価およびＰＩＶ−１特異性中和力価について、血清を分析した。 試験したすべての投与量について、４週後および６週後の両方で強い抗−ＨＮ、 抗−Ｆおよび中和抗体が認められた。結果は図６（ａ）〜６（ｃ）に要約してあ る。実施例１１： 本実施例は、マウスにおけるＰＩＶ−２ ＨＮおよびＦ糖タンパクの免疫原性 を説明する。 マウス５匹のグループ（ＣＤ−１、１８〜２０ｇ）を０日目および２８日目に 、リン酸アルミニウム（ミョウバン）３ｍｇ／ｍＬを加えたＰＩＶ−２ ＨＮお よびＦ糖タンパク０．３、１、３または１０μｇを用いて腹腔内免疫（０．５ｍ Ｌ）した。精製したＰＩＶ−２ ＨＮおよびＦ糖タンパクを比１：１で混合した （例えば、投与物１０μｇは、ＨＮ５μｇとＦ５μｇとを含む）。０日目、２８ 日目および４２日目に血液試料を採取した。ＰＢＳ／ミョウバンを用いて免疫化 したマウスを陰性対照とした。抗−ＨＮ、抗−Ｆ力価およびＰＩＶ−２特異性中 和力価について、血清を分析した。試験したすべての投与量について、４週後お よび６週後にＰＩＶ−２中和抗体反応が検出された。結果は図７に総括してある 。実施例１２： 本実施例は、異なるＨＮ：Ｆ比の場合のマウスにおけるＰＩＶ−２ ＨＮおよ びＦ糖タンパクの免疫原性を説明する。 マウス５匹のグループ（ＣＤ−１、１８〜２０ｇ）を０日目および２８日目に 、リン酸アルミニウム（ミョウバン）３ｍｇ／ｍＬを加えたＰＩＶ−２ ＨＮお よびＦ糖タンパク０．１、１または１０μｇを用いて腹腔内免疫（０．５ｍＬ） した。それぞれの糖タンパク投与に対して、ＨＮ：Ｆ比１：１、１：２および１ ：５で試験した。０日目、２８日目および４２日目に血液試料を採取した。ＰＢ Ｓ／ミョウバンを用いて免疫化したマウスを陰性対照とした。抗−ＨＮ、抗−Ｆ 力価およびＰＩＶ−２特異性中和力価について、血清を分析した。１または１０ μｇ投与の中に存在するＨＮとＦプロテアーゼの比とは無関係に、すべての配合 量について、４週後および６週後の動物に強い抗−ＨＮ、抗−Ｆおよび中和抗体 が誘発された。結果は図８〜１０に総括してある。実施例１３： 本実施例は、マウスにおけるＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ糖タンパクの免疫原性 を説明する。 マウス（１８〜２０ｇ、ＣＤ−１、チャールズ・リバー）をリン酸アルミニウ ム（投与当たりに１．５ｍｇ）を加えたＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ糖タンパク１ 、３、１０および２０μｇ投与の０．５ｍｌを用いて腹腔内免疫した。陽性対照 として、生ＰＩＶ−３（１０⁵ＴＣＩＤ₅₀）を用いてマウスを鼻腔内免疫し、陰 性対照として、リン酸アルミニウム１．５ｍｇ／０．５ｍＬを用いてマウスを免 疫化した。５週後に、リン酸アルミニウムに吸着された同量のタンパクを用いて 動物にブーストした。０日目、３５日目および４９日目に血液試料を採取した。 免疫血清中の血球凝集抑制（ＨＡＩ）、中和性および抗ＰＩＶ−３ＥＬＩＳＡ力 価を測定した。高い抗−ＰＩＶ−３、ＨＡＩおよび中和抗体の力価が、５および ７週目に１、３、１０または２０μｇのいずれかで免疫化した動物の血清中に存 在した。結果は図１１（ａ）〜１１（ｃ）に記載してある。実施例１４： 本実施例は、モルモットにおけるＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ糖タンパクの免疫 原性を説明する。 モルモット（３００ｇ、ブーフベルク）をリン酸アルミニウム（１．５ｍｇ） を加えたＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ糖タンパク１、３、１０および２０μｇ投与 を用いて腹腔内免疫（０．５ｍｌ）した。生ＰＩＶ−３の１０⁵ＴＣＩＤ₅₀を用 いて鼻腔内免疫した動物を陽性対照とし、アジュバントだけ（リン酸アルミニウ ム１．５ｍｇ／０．５ｍｌ）を用いて免疫化した動物を陰性対照とした。４週後 に、リン酸アルミニウム中の同量の投与を用いて動物にブーストした、０日目、 １４日目、２８日目、４２日目および５６日目に血液試料を採取し、血清中のＨ Ｉ、ＮＴおよび抗ＰＩＶ−３ＥＬＩＳＡ力価を測定した。ブースター注入の後で も、いずれの試験のいかなる投与量の間にも、これらの力価に違いはなかった。 これらの結果は図１２（ａ）〜１２（ｃ）に記載してある。実施例１５： 本実施例は、ハムスター中に防御免疫反応を発現するＰＩＶ−３ ＨＮおよび Ｆ糖タンパクの能力を説明する。 ハムスター（雌、４〜６週齢）を、リン酸アルミニウム（１．５ｍｇ）を加え た同時精製ＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ糖タンパク１、３、１０または２０μｇ投 与を用いて筋肉内免疫（０．５ｍｌ）した。２８日目にリン酸アルミニウム中の 同量の投与を用いて、動物にブーストした。ＰＩＶ−３（１０⁵ＴＣＩＤ₅₀）を 用いて鼻腔内免疫した動物を陽性対照とし、リン酸アルミニウム（１．５ｍｇ／ ０．５ｍｌ）を用いて免疫化した動物を陰性対照とした。０日目および２８日目 に血液試料を採取した。４週目の放血からの血清中のＨＩ、ＮＴおよび抗ＰＩＶ −３ＥＬＩＳＡ力価を測定した。すべての投与量において、良好な一次ＨＡＩお よび中和反応が観察された。４２日目に、生ＰＩＶ−３（１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／動 物）を用いて、動物に鼻腔内抗原投与した。４日後に動物を屠殺した。気管支肺 胞洗浄液および鼻洗浄液中のウイルス力価を測定した。糖タンパクの２回の１μ ｇ投与による免疫は、ハムスターの上および下気管をＰＩＶ−３の以後の感染か ら防御した。肺洗浄液および鼻洗浄液中のウイルス力価が著しく低下した(あら ゆる投与に対して＞３ｌｏｇの低下)。これらの結果は図１３(ａ)〜１３(ｄ) に記載してある。実施例１６： 本実施例は、コットンラットにおいて防御免疫反応を誘発するＰＩＶ−３ Ｈ ＮおよびＦ糖タンパク調製体の能力を説明する。 コットンラット（シグモドン・フルヴィヴェンター、４〜６週齢）を、リン酸 アルミニウム（１．０ｍｇ／投与）を加えた同時精製ＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ 糖タンパク調製体の１μｇ投与を用いて筋肉内免疫（０．４ｍＬ）した。２８日 目に動物を放血し、リン酸アルミニウム中の同量の抗原の投与を用いて、動物に ブーストした。ブースター注入の７日後に、動物を放血し、ＰＩＶ−３を用いて 抗原投与した。投与の４日後に動物を屠殺し、肺を取り出した。血球凝集抑制（ ＨＡＩ）力価および中和力価について血清を分析した。ＨＮおよびＦ糖タンパク 調製体の単回注入は、強い中和とＨＡＩ反応を誘発した。同量のタンパク投与を 用いて動物をブーストすると、抗体反応を強化した。観察された力価は、生ウイ ルス免疫化の後に得られたものと同様であった。免疫化した動物の肺から、ＰＩ Ｖ−３ウイルスは回収されなかった。これらの結果は図１４（ａ）〜１４（ｄ） に記載してある。実施例１７： 本実施例は、霊長類におけるＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ糖タンパク調製体の免 疫原性を説明する。 若い成体雄のカニクイザル（４〜５ｋｇ）を、ＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ糖タ ンパク調５０μｇおよびリン酸アルミニウム１．５ｍｇを含む試料０．５ｍｌを 用いて筋肉内免疫し、６週後に同量の投与を用いてブーストした。０、２８、４ ２、５６、７０、８４および１１２日目に血液試料を採取した。血液学および生 化学的試験を行った。血清は、ＰＩＶ−３中和性およびＨＡＩ抗体に関し、また ＥＬＩＳＡにより抗−ＨＮおよび抗−Ｆに関して試験した。血液学および生化学 的試験は、すべて正常の範囲内にあった。免疫動物からの血清は、試験したあら ゆる時点で、抗−ＨＮ、抗−Ｆ、ＨＡＩおよび中和抗体の良好な力価を有してい た。抗体反応は、表４に記載してある。実施例１８： 本実施例は、人体内におけるパラインフルエンザウイルス・タイプ３（ＰＩＶ −３）ワクチンの臨床試験を説明する。 フェーズＩヒト臨床試験は、ＰＩＶ−３サブユニットワクチンの単回投与の安 全性と免疫原性を試験するために行った。両方の試験は、カナダ連邦健康保護局 からの研究用新薬（ＩＮＤ）の法的承認の取得の後に実施した。ＰＩＶ−３ワク チンは、リン酸アルミニウム１．５ｍｇ上に吸着した同時精製ＨＮおよびＦ糖タ ンパク２０μｇから成っていた。 第一の研究は、健康な成人４０人について行い、その内２０人はＰＩＶ−３ワ クチンを接種され、２０人は対照ワクチンを接種された。第二の研究は、２４〜 ３６月齢の健康な子供４０人について行い。その内２３人はＰＩＶ−３、１７人 は対照ワクチンを接種された。研究対象すべてを７〜８カ月間追跡した。子供の 試験には、すべての追跡期間を通じて呼吸器感染に対する積極的な監視も含まれ ていた。両方の試験共に二重盲検法であった。 各ワクチン接種の後の局部および組織的な反応に対する安全性を評価した、最 初の７２時間以内におけるＰＩＶ−３ワクチン接種に対する反応は、一過性、か つ重要でなく、その結果は表５（ａ）と５（ｂ）に記載してある。 血清抗体レベルは、ＨＮ−およびＦ−特異性ＥＬＩＳＡ、ＨＡＩ、およびウイ ルス中和試験を用いて決定した。結果は、下記の表６に記載してあり、パライン フルエンザ３サブユニットワクチンの接種者は、成人におけるすべての試験によ り、また子供におけるＨＡＩ、抗Ｆ ＥＬＩＳＡ、抗ＨＮ ＥＬＩＳＡによる測 定から、著しく大きい接種後抗体力価を有していた。これらの結果は、ワクチン を含むＰＩＶ−３ＨＮおよびＦ糖タンパクがヒト内で免疫原性であることを示し ている。実施例１９： 本実施例は、ＰＩＶ−１、２および３からのＨＮおよびＦ糖タンパクを含む三 重ワクチンのマウスにおける免疫原性を説明する。 マウス５匹のグループ（ＣＤ−１、１８〜２０ｇ）を０日目および２８日目に おいて、リン酸アルミニウム（ミョウバン）３ｍｇ／ｍｌを加えたＰＩＶ−１、 ２、または３のＨＮおよびＦ糖タンパクの混合液（すなわち、投与１０μｇに対 して、ＰＩＶ−１糖タンパク１０μｇ、ＰＩＶ−２糖タンパク１０μｇ、かつＰ ＩＶ−３糖タンパク１０μｇが存在する）０．３、１、３または１０μｇを用い て腹腔内免疫した。精製したＰＩＶ−２ＨＮおよびＦ糖タンパクは、比１：１で 混合され（例えば投与１０μｇは、ＨＮ５ｍｇおよびＦ５ｍｇを含む）、一方、 ＰＩＶ−１およびＰＩＶ−３からのＨＮおよびＦ調製体は、その同時精製のため に調整は行わなかった。血液試料は、０日目、２８日目および４２日目に採取し た。ＰＢＳ／ミョウバンを接種したマウスを陰性対照とした。３種のすべてのＰ ＩＶタイプに対する特異性中和力価に関して血清を分析した。試験したすべての 投与量に対して、パラインフルエンザウイルスの３種のタイプそれぞれに対して 中程度の中和抗体反応が４週後に観察され、強い中和反応が６週後に観察された 。結果は、図１４（ａ）〜１４（ｃ）に総括してある。実施例２０： 本実施例は、リン酸アルミニウムに吸着された後のＨＮおよびＦ糖タンパク調 製体の安定性を説明する。 ＰＩＶ−３ＨＮおよびＦ糖タンパクは、６℃で貯蔵し、３、６、９、１５およ び１８カ月後に試験した。安定性はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび免疫ブロット分析に より、またマウスにおける免疫原性試験により評価した。あらゆる時点で外観に 変化は認められなかった。代表的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ、抗−ＨＮおよび抗−Ｆ抗 体結合が観察された。凝集、沈殿または劣化の証拠は観察されなかった。 リン酸アルミニウムに吸着したＰＩＶ−３ ＨＮおよびＦ糖タンパク０．５ｍ Ｌを用いて、ＣＤ−１マウスを腹腔内免疫した。各時点で糖タンパクの数種の投 与量を試験した。マウス免疫原性試験は、表６に要約してある。６℃で１８カ月 貯蔵した後でも免疫原性に著しい変化は認められなかった。 開示の要約 この開示を要約すると、本発明は、パラインフルエンザウイルスのタイプ１、 ２および３から単離および精製した血球凝集ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融 合（Ｆ）糖タンパク、その製造方法、および免疫原性組成物および診断手段への 使用を提供する。特には、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３からのＨＮ およびＦ糖タンパクを含む三重ワクチンは、それぞれのウイルス型を中和できる 免疫反応を誘発した。本発明の範囲内での変形は可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/385 Ａ６１Ｋ 39/385 39/39 39/39 Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ０７Ｋ 16/10 Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｎ 9/24 15/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ファヒーム、ラッファト イー．エフ. カナダ国 エル５アール ２ティー２ オ ンタリオ州 ミシソーガ セレモニアル ドライヴ 524 (72)発明者 ジャクソン、ゲイル イー．ディー. カナダ国 エル４シー ５ピー３ オンタ リオ州 リッチモンド ヒル アネッテ ゲイト 10 (72)発明者 クライン、マイケル エイチ. カナダ国 エム２ピー １ビー９ オンタ リオ州 ウイロウダール ムンロ ブール ヴァード 16 (72)発明者 スィミントン、アリソン エル. カナダ国 エム４ジー ２エイチ３ オン タリオ州 トロント ヴァンダーフーフ アヴェニュー 59

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．パラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ−１）の分離、精製した血球凝集 素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパクまたは前記糖タンパクの免疫原性を保 持するそのフラグメントまたは類縁体 ２．還元条件下でナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき約７０〜約８０ｋＤａの見かけ分子量を有 する請求項１に記載の糖タンパク ３．パラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ−１）の分離、精製した融解（Ｆ ）糖タンパクまたは前記糖タンパクの免疫原性を保持するそのフラグメントまた は類縁体 ４．還元条件下でナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき約４５〜約５５ｋＤａのＦ１ポリペプチド サブユニットの見かけ分子量を有する請求項３に記載の糖タンパク ５．本質的に血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパクと融解（Ｆ）糖 タンパクとからなるパラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ−１）の共分離、 共精製した糖タンパクの混合物 ６．前記ＨＮ糖タンパクが約７０〜約８０ｋＤａの見かけ分子量を有し、Ｆ糖タ ンパクが約４５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチド サブユニットの見かけ分子 量を有し、還元条件下でナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電 気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分子量の測定を行うことを特徴とする請求項５に 記載の糖タンパク混合物 ７．純度が少なくとも約７０重量％である請求項５に記載の混合物 ８．パラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２）の分離、精製した血球凝集 素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タンパクまたは前記糖タンパクの免疫原性を保 持するそのフラグメントまたは類縁体 ９．還元条件下でナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳動 （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき約７５〜約８５ｋＤａの見かけ分子量を有 する請求項８に記載の糖タンパク １０．パラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２）の融解（Ｆ）糖タンパク を本質的に含まない請求項８に記載の糖タンパク １１．純度が少なくとも約６５重量％である請求項１０に記載の糖タンパク １２．パラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２）の分離、精製した融解（ Ｆ）糖タンパクまたは前記糖タンパクの免疫原性を保持するそのフラグメントま たは類縁体 １３．還元条件下でナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミド ゲル電気泳 動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で測定したとき約４５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチ ド サブユニットの見かけ分子量を有する請求項１２に記載の糖タンパク １４．パラインフルエンザウイルス２型の血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ ）糖タンパクを本質的に含まない請求項１２に記載の糖タンパク １５．純度が少なくとも約８５重量％である請求項１４に記載の糖タンパク １６．レクチンを含まず、本質的に血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）糖タ ンパクおよび融解（Ｆ）糖タンパクからなるパラインフルエンザウイルス３型（ ＰＩＶ−３）の共分離、共精製した未変性糖タンパク混合物 １７．前記ＨＮ糖タンパクが約７０〜約８０ｋＤａの見かけ分子量を有し、前記 Ｆ糖タンパクが約４５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチド サブユニットの見か け分子量を有し、還元条件下でナトリウム ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分子量の測定を行うことを特徴とする請求項 １６に記載の糖タンパク混合物 １８．純度が少なくとも約７０重量％である請求項１６に記載の混合物 １９．免疫学的有効量の （ａ）パラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ−１）の血球凝集素−ノイラミ ニターゼ（ＨＮ）糖タンパクと、 （ｂ）パラインフルエンザウイルス１型（ＰＩＶ−１）の融合（Ｆ）糖タンパク と、 （ｃ）パラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２）の血球凝集素−ノイラミ ニターゼ（ＨＮ）糖タンパクと、 （ｄ）パラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２）の融合（Ｆ）糖タンパク と、 （ｅ）パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ−３）の血球凝集素−ノイラミ ニターゼ（ＨＮ）糖タンパクと、 （ｆ）パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ−３）の融合（Ｆ）糖タンパク と、 （ｇ）前記糖タンパクの免疫学的性質を保持する（ａ）から（ｆ）の少なくとも １種類のＦおよび／またはＨＮのホモおよび／またはヘテロオリゴマー、そのダ イマーまたは前記（ａ）から（ｇ）の糖タンパクのいずれかのフラグメントまた は類縁体とからなる免疫原性組成物 ２０．前記ＰＩＶ−１のＨＮ糖タンパクが約７０〜約８０ｋＤａの見かけ分子量 を有し、前記ＰＩＶ−１のＦ糖タンパクが約４５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプ チド サブユニットの見かけ分子量を有し、前記ＰＩＶ−２のＨＮ糖タンパクが 約７５〜約８５ｋＤａの見かけ分子量を有し、前記ＰＩＶ−２のＦ糖タンパクが 約４５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチド サブユニットの見かけ分子量を有し 、前記ＰＩＶ−３のＨＮ糖タンパクが約７０〜約８０ｋＤａの見かけ分子量を有 し、前記ＰＩＶ−３のＦ糖タンパクが約４５〜約５５ｋＤａのＦ₁ポリペプチド サブユニットの見かけ分子量を有し、還元条件下でナトリウム ドデシル硫酸 ポリアクリルアミド ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分子量の測定を行う ことを特徴とする請求項１９に記載の免疫原性組成物 ２１．前記ＰＩＶ−１のＨＮおよびＦ糖タンパクが前記糖タンパクの共分離、共 精製した混合物として提供され、前記ＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タンパクが前 記糖タンパクの共分離、共精製した混合物として提供されることを特徴とする１ ９に記載の組成物 ２２．ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３に起因する疾病に対する防御能 を付与するためにｉｎ ｖｉｖｏで宿主に投与できるように前記糖タンパクのそ れぞれをあらかじめ設定した量で含むワクチンとして製剤した請求項１９に記載 の免疫原性組成物 ２３．微粒剤、カプセル、ＩＳＣＯＭまたはリポソーム調製物として製剤した請 求項２２に記載の免疫原性組成物 ２４．免疫系の特定の細胞または粘膜表面に運搬するターゲティング分子と組み 合わせた請求項２２に記載の免疫原性組成物 ２５．さらに別の免疫原性物質または免疫刺激性物質の少なくとも１種類を含む 請求項２４に記載の免疫原性組成物 ２６．前記の少なくとも１種類の免疫刺激性物質が少なくとも１種類のアジュバ ントであることを特徴とする請求項２４に記載の免疫原性組成物 ２７．前記の少なくとも１種類のアジュバントがリン酸アルミニウム、水酸化ア ルミニウム、ＱＳ２１、Ｑｕｉｌ Ａ、またはこれらの誘導体または成分、リン 酸カルシウム、水酸化カルシウム、水酸化亜鉛、糖脂質類縁体、アミノ酸のオク タデシルエステル、ムラミル ジペプチド、リポタンパク、ポリホスファゼン、 ＩＳＣＯＭマトリックス、ＩＳＣＯＰＲＰ、ＤＣ−ｃｈｏｌおよびＤＤＢＡから なる群から選ぶことを特徴とする請求項２６に記載の免疫原性組成物 ２８．宿主が霊長類であることを特徴とする請求項２７に記載の免疫原生組成物 ２９．霊長類がヒトであることを特徴とする請求項２８に記載の免疫原性組成物 ３０．さらに少なくとも１種類の別の免疫原を含む請求項１９に記載の免疫原性 組成物 ３１．前記の少なくとも１種類の別の免疫原がヒト呼吸器系シンシチウムウイル ス（ＲＳＶ）Ａおよび／またはＢ型のＲＳＶタンパクからなることを特徴とする 請求項３０に記載の免疫原性組成物 ３２．請求項１９に記載の免疫原性組成物の免疫学的有効量を宿主に投与するこ とからなる宿主に免疫反応を誘導する方法 ３３．前記免疫原性組成物が宿主にｉｎ ｖｉｖｏ投与するためにワクチンとし て製剤され、前記の宿主への投与によってＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ −３に起因する疾病に対する防御能を付与することを特徴とする請求項３２に記 載の方法 ３４．試料中の抗体、特にパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）の糖タンパク と反応する抗体の有無を検査する方法であって、 （ａ）試料を請求項１９に記載の免疫原性組成物と接触させて、パラインフルエ ンザウイルス糖タンパクと試料中に存在する前記抗体、特に糖タンパクと反応す る抗体の複合体を形成させ、 （ｂ）当該複合体の形成を測定することからなる方法 ３５．試料中のパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）糖タンパクの有無を検査 する方法であって、 （ａ）請求項１９に記載の免疫原性組成物を被験者に投与して、ＰＩＶ−１、Ｐ ＩＶ−２およびＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タンパクに特異的な抗体を形成させ 、 （ｂ）試料を当該抗体と接触させて、試料中に存在するあらゆるＰＩＶ糖タンパ クと前記糖タンパクに特異的な抗体とからなる複合体を形成させ、 （ｃ）当該複合体の形成を測定することからなる方法 ３６．試料中の抗体、特にパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）の糖タンパク と反応する抗体の有無を検査するための診断キットであって、 （ａ）請求項１９に記載の免疫原性組成物と、 （ｂ）パラインフルエンザウイルスの糖タンパクと試料中に存在する前記のあら ゆる抗体とからなる複合体を形成させるために試料と免疫原性組成物とを接触さ せる手段と、 （ｃ）当該複合体の形成を測定する手段とからなる診断キット ３７．試料中のパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）糖タンパクの有無を検出 するための診断キットであって、 （ａ）ＰＩＶ−１、ＰＩＶ−２およびＰＩＶ−３のＨＮおよびＦ糖タンパクに特 異的な抗体と、 （ｂ）ＰＩＶ糖タンパクとＰＩＶ糖タンパク特異性抗体とからなる複合体を形成 させるために試料と抗体とを接触させる手段と、 （ｃ）当該複合体の形成を測定する手段とからなる診断キット ３８．パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染によって起こる疾病を防御す るためのワクチンを製造する方法であって、 請求項１９に記載の免疫原性組成物を被験宿主に投与して、ＰＩＶ−１、ＰＩＶ −２およびＰＩＶ−３に起因する疾病に対する防御能を付与するに十分な免疫原 性組成物の相対量および投与頻度を決定し、 前記のように決定した投与量および投与頻度に従って処理宿主に投与するに適し た形態で免疫原性組成物を製剤することからなるワクチンの製造法 ３９．処理する宿主がヒトであることを特徴とする請求項３８に記載の方法 ４０．パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）の糖タンパクに特異的なモノクロ ーナル抗体の製造法であって、 （ａ）請求項１９に記載の免疫原性組成物を少なくとも１匹のマウスに投与して 少なくとも１匹の免疫マウスを用意し、 （ｂ）前記の少なくとも１匹の免疫マウスからＢ−リンパ細胞を採取し、 （ｃ）前記の少なくとも１匹の免疫マウスのＢ−リンパ細胞と骨髄腫細胞を融合 させてハイブリドーマを形成させ、 （ｄ）特定の抗ＰＩＶ糖タンパク抗体を生産するハイブリドーマをクローニング し、 （ｅ）抗ＰＩＶ7糖タンパク抗体を生産するクローンを培養し、 （ｆ）培地から抗ＰＩＶ糖タンパク抗体を分離することからなる方法 ４１．インフルエンザウイルス（ＰＩＶ）糖タンパクの共分離、共精製した混合 物の製造法であって、 培地中でＰＩＶ−１を培養し、 培養したウイルスを培地から分離し、 分離したウイルスから血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ） 膜糖タンパクを溶解させ、 溶解した膜糖タンパクを共分離および共精製することからなる方法 ４２．前記の共分離および共精製を、 溶解させた膜糖タンパクのイオン交換クロマトグラフィーからＨＮおよびＦ糖タ ンパクを含む溶出液を回収し、 溶出液をヒドロキシアパタイト マトリックスに載せ、 ヒドロキシアパタイト マトリックスからＨＮおよびＦ糖タンパクを選択的に共 溶出させることを特徴とする請求項４１に記載の方法 ４３．選択的に溶出させたＨＮおよびＦ糖タンパクをタンジェントフロー限外濾 過によって精製することを特徴とする請求項４２に記載の方法 ４４．前記の共分離および共精製がさらにＨＮおよびＦ糖タンパクを選択的に共 沈殿させ、沈殿したＨＮおよびＦ糖タンパクを分離し、分離したＨＮおよびＦ糖 タンパクを再溶解させることからなることを特徴とする請求項４１に記載の方法 ４５．別々に分離および精製したパラインフルエンザウイルス２型（ＰＩＶ−２ ）の糖タンパクを製造する方法であって、 培地中でＰＩＶ−２を培養し、 培養したウイルスを培地から分離し、 分離したウイルスから血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ） 膜糖タンパクを溶解させ、 溶解した膜糖タンパクの少なくともいずれかを分離および精製することからなる 方法 ４６．前記の溶解させた膜糖タンパクを別々に分離および精製することを特徴と する請求項４５に記載の方法 ４７．前記の分離および精製を、 溶解させた膜糖タンパクのイオン交換クロマトグラフィーからＦ糖タンパクを含 む溶出液を回収し、一方ＨＮ糖タンパクはイオン交換樹脂に保持させ、 回収した溶出液をヒドロキシアパタイト マトリックスに載せてＦ糖タンパクを 含む溶出液を回収し、 可溶化に用いた界面活性剤をヒドロキシアパタイト マトリックス溶出液から選 択的に除去し、て単離、精製したＦ糖タンパクを得、 イオン交換樹脂からＨＮ糖タンパクを溶出させて単離、精製したＨＮ糖タンパク を得ることを特徴とする請求項４６に記載の方法 ４８．前記の単離、精製したＨＮ糖タンパクをゲル濾過マトリックスに載せ、分 子量の異なる混在物とＨＮ糖タンパクを分離することを特徴とする請求項４７に 記載の方法 ４９．前記の単離、精製したＨＮ糖タンパクをヒドロキシアパタイト マトリッ クスに吸着させ、その後ＨＮ糖タンパクを溶出させることを特徴とする請求項４ ７に記載の方法 ５０．単離、精製したＦおよびＨＮ糖タンパクをタンジェントフロー限外濾過に よって別々に精製することを特徴とする請求項４７に記載の方法 ５１．パラインフルエンザウイルス３型（ＰＩＶ−３）の共分離、共精製した糖 タンパクの製造法であって、 培地中でＰＩＶ−３を培養し、 培養したウイルスを培地から分離し、 分離したウイルスから血球凝集素−ノイラミニターゼ（ＨＮ）および融合（Ｆ） 膜糖タンパクを溶解させ、 レクチンを含まない糖タンパクを共分離および共精製することからなる方法 ５２．前記の共分離および共精製を、 ＨＮおよびＦ膜糖タンパクをイオン交換樹脂に載せ、混在物を樹脂から溶出させ 、前記のイオン交換樹脂からＨＮおよびＦ糖タンパクを共溶出させ、 共溶出したＨＮおよびＦ糖タンパクを共溶出したＨＮおよびＦが吸着するような イオン強度で別のイオン交換樹脂に載せ、混在物を樹脂から溶出させ、 その後ＨＮおよびＦ糖タンパクを樹脂から溶出させることによって行うことを特 徴とする請求項５１に記載の方法 ５３．回収した溶出液をタンジェントフロー限外濾過によって精製することを特 徴とする請求項５２に記載の方法