JPH11514363A - 受容体選択的ソマトスタチン同族体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 他のクローン化ＳＲＩＦ受容体に比べてＳＳＴＲ１に選択的であるＳＲＩＦ同族体。これらの同族体は受容体ＳＳＴＲ１の組織および細胞内発現および内分泌、外分泌および神経系におけるその生物学的役割の決定に、並びに腫瘍増殖の調節に有用である。ＳＲＩＦ同族体ペプチド、例えばｄｅｓ−ＡＡ^1,2,5［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］−ＳＲＩＦ、は［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦのクローン化ヒト受容体ＳＳＴＲ１への結合を阻止するが、マウスＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ３、ヒトＳＳＴＲ４またはラットＳＳＴＲ５には結合しない。これらの選択的ＳＲＩＦ同族体の２−位にヨウ素化チロシンを挿入することによって、薬剤スクリーニング法に有用な標識化合物が作られる。

Description

【発明の詳細な説明】 受容体選択的ソマトスタチン同族体 本発明はソマトスタチン関連ペプチド並びにこのようなペプチドを使用する哺 乳動物の薬物治療に向けられている。より詳細に述べるならば、本発明は短かく したソマトスタチン同族体、このようなペプチドを含む薬物学的組成物、このよ うなペプチドを使用する哺乳動物の診断および治療法、およびこのようなペプチ ドを使用する薬剤スクリーニング法に関するものである。 発明の背景 環状テトラデカペプチド ソマトスタチン−１４（ＳＲＩＦ）は最初は視床下 部から分離され、脳下垂体前部からの成長ホルモン放出を生理的に抑制する物質 であると記述されている。それはギルミン(Guillemin)らによって同定され、米 国特許第３，９０４，５９４号（１９７５年９月９日）に記載されている。この テトラデカペプチドは３−および１４−位の２つのシステインアミノ酸残基のス ルフヒドリル基の間に架橋−または環状化結合を有する。ＳＲＩＦは膵臓からの インスリン、グルカゴンおよびアミラーゼ分泌、および胃の胃酸放出も調節する ことが判明した。ＳＲＩＦは脳の視床下部内領域にも発現し、運動活性および認 識機能の調節に一定の役割を有する。ＳＲＩＦは中枢神経系全体に分布し、神経 伝達物質として作用する。中枢神経系においてＳＲＩＦは神経細胞の興奮を促進 および抑制の両方に調節し、その他の神経伝達物質の放出に影響を及ぼし、運動 活性および認識プロセスを調節することが示された。 ソマトスタチンおよび多くのソマトスタチン同族体はin vitroにおいて培養し たばらばらになったラット前部脳下垂体細胞からの成長 ホルモン（ＧＨ）の抑制に関して活性をあらわす；それらはin vivoにおいてラ ットおよびその他の哺乳動物のＧＨ、インスリンおよびグルカゴンの分泌も抑制 する。そのような同族体の１つは［Ｄ−Ｔｒｐ⁸］−ＳＲＩＦである。それはア ミノ酸配列：（ｃｙｃｌｏ ３−１４）Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ− Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅ ｒ−Ｃｙｓ−ＯＨ、を有し、米国特許第４，３７２，８８４号（２／８／８３） に開示されている。ソマトスタチンは胃および膵臓の分泌要素に直接作用してそ れぞれガストリンおよびセクレチンの分泌を阻止することも判明した、そしてソ マトスタチンはヨーロッパでは潰瘍患者の治療用に市販されている。ＧＨのみな らずインスリンおよびグルカゴンの分泌にもソマトスタチンが強力な阻止作用を 与えることから、若年性糖尿病の抑制および治療にソマトスタチンが果たすかも 知れない役割の研究が行われるようになり、ソマトスタチンがヒト代謝における これらホルモン類の生理学的および病理学的効果の研究に役立つことがわかった 。 プラデイロール（L．Pradayrol）らはFEBS Letters １０９、５５−５８ペー ジ、１９８０年１月、において、ブタの上部小腸からソマトスタチン−２８（Ｓ ＲＩＦ−２８）を分離し、同定したことを報告した。ＳＲＩＦ−２８はＳＲＩＦ のＮ末端が延長した変形体であり、付加的１４アミノ酸残基をもち、in vivoで 投与したときに若干高い効力を示す。 ＳＲＩＦは複数の細胞プロセスに影響を与える。諸研究は、ＳＲＩＦが種々の 組織のアデニリルシクラーゼの阻止的調節物質であることを示した。ＳＲＩＦは Ｋ⁺およびＣａ²⁺チャンネルを含めるイオンチャンネルのコンダクタンスも調節 する。ＳＲＩＦのこれらの作用は百日咳毒素感受性−グアニンヌクレオチド結合 蛋白質によって仲介される。ＳＲＩＦはまた、百日咳毒素不感受性メカニズムに よってチロシンホスファターゼ、Ｎａ⁺／Ｈ⁺アンチポート、および細胞増殖の活 性も調節する。 ＳＲＩＦは構造的に類似の膜結合性受容体の或る群と相互作用することによっ てその生物学的効果を誘起する。５種類のＳＲＩＦ受容体がかなり最近クローン 化され、ＳＳＴＲ１−５と名付けられた。ヒトＳＳＴＲ１、マウスＳＳＴＲ２お よびマウスＳＳＴＲ３はレイノー（Raynor）らのMolecular Pharmacology、４３ 巻、８３８−８４４ページ（１９９３）に記載されている。ヒトＳＳＴＲ１、２ および３は米国特許第５，４３６，１５５号（７／２５／９５）に開示されてい る。ヒトＳＳＴＲ４およびラットＳＳＴＲ５を含む５受容体はすべてＳＲＩＦお よびＳＲＩＦ−２８に高い親和性をもって結合する。ＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ ５の選択的アゴニスト（作動薬）が確認され、これらの受容体の明白な機能を明 らかにするために使用されている。ＳＳＴＲ２は成長ホルモン、グルカゴンおよ び胃酸分泌の抑制を仲介すると考えられている。対照的にＳＳＴＲ５は主として インスリンおよびアミラーゼ放出の抑制に関係するようにみえる。ＳＳＴＲ３は ＳＲＩＦによる胃平滑筋収縮抑制を仲介すると考えられている。これらの研究結 果は、種々の受容体サブタイプが体内におけるＳＲＩＦの異なる機能を仲介する ようにみえることを示唆している。 ＳＲＩＦは今や腫瘍細胞増殖を抑制することも見いだされ、ＳＭＳ−２０１− ９９５と命名された環状ＳＲＩＦ同族体、すなわちＤ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ −Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−olは腫瘍増殖抑制のために臨 床的に用いられ、また癌において発現するＳＲＩＦ受容体を検出するための診断 薬として用いられている。ＳＭＳ−２０１−９９５およびその他の臨床的に用い られるＳＲＩＦ同族体は３種類の受容体サブタイプ、すなわちＳＳＴＲ２、ＳＳ ＴＲ３およびＳＳＴＲ５と顕著に相互作用する。ＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ５は 、腫瘍細胞増殖に対するＳＲＩＦの抗増殖効果を仲介することが最近報告された ；そのため、それらはヒトにおけるＳＭＳ−２０１−９５５の臨床的効果を仲介 するらしい。 ＳＳＴＲ１はクローン化された最初のＳＲＩＦ受容体である。それ はＳＲＩＦおよびＳＲＩＦ−２８に高親和性を示すが、大部分の合成ＳＲＩＦ同 族体には非常に低い親和性しかもたない。ＳＳＴＲ１ ｍＲＮＡは中枢神経系並 びに多数の内分泌および外分泌器官にも発現する、そしてＳＳＴＲ１ ｍＲＮＡ は多くの腫瘍で特に多い。クローン化ＳＳＴＲ１はＳＲＩＦの抗増殖効果を、多 分Ｎａ⁺／Ｈ⁺イオン交換活性の調節によってまたはチロシンホスファターゼの刺 激によって仲介することが報告された。そのためＳＳＴＲ１は、ＳＲＩＦの生理 的作用のためにも、ＳＲＩＦ同族体の腫瘍細胞増殖阻止という治療的効果のため にも、重要な標的であると考えられる。 ソマトスタチンより強力であり、および／または別個のものと考えられる阻止 機能を示すソマトスタチン同族体、特にＳＳＴＲ１に選択的である同族体の探査 が続けられている。しかし、ＳＳＴＲ１に選択的に結合するリガンドは手に入ら ず、体内のＳＳＴＲ１の正確な場所を決定し、その生物学的作用を確認するため の努力は、選択的ＳＳＴＲ１リガンドの欠如によって実らなかった。 発明の概要 その他のクローン化ＳＲＩＦ受容体とは対照的に、ＳＳＴＲ１に選択的なＳＲ ＩＦ同族体を創出するのに効果的な或る変法が今や発見された。クローン化ＳＳ ＴＲ１に特異的に結合するＳＲＩＦアゴニストペプチドが作成された。これらペ プチドの同族体はヨウ素化することができ、他方それらの所望の生物学的特性は 保存される。これらの新規のペプチドは、受容体ＳＳＴＲ１の組織および細胞内 発現や内分泌、外分泌および神経系におけるその役割を確認するために、並びに これまでＳＲＩＦを用いて行われてきた腫瘍増殖調節およびその他の幾つかの薬 物学的機能を、これまではＳＲＩＦ投与の特徴であった付随する副作用もおこさ ずに調節するために有用である。 本発明のＳＲＩＦ同族体ペプチドは、［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦ とクローン化ヒト受容体ＳＳＴＲ１との結合を阻止するが、マウスＳＳＴＲ２お よびＳＳＴＲ３、ヒトＳＳＴＲ４またはラットＳＳＴＲ５には結合しない。２の 位置にヨウ素化チロシンを組み込んだこれらＳＲＩＦ同族体のその他のものも、 ＳＳＴＲ２−５には結合しないが、ＳＳＴＲ１にはまだ強力に、飽和的に結合す る。これらのＳＲＩＦ同族体の、ＣＯＳ−７細胞に発現するＳＳＴＲ１への結合 はＧＴＰｇＳおよび百日咳毒素処理によって減少し、一方、［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹ ］ＳＲＩＦとＳＳＴＲ１（これにもそれは強く結合する）との結合はこれらの処 理によって影響を受けない。これは、これらのＳＲＩＦ同族体が天然ペプチドＳ ＲＩＦとは異なる仕方でＳＳＴＲ１に結合することを示している。 これらＳＲＩＦ同族体の多くは、ＳＳＴＲ１に選択的に結合するのみならず、 それらは高親和性をもってこれに結合する。“選択的に結合する”とは、それら のＳＳＴＲ１に関するＫ_dまたはＩＣ₅₀が、その他の少なくとも３種類のＳＲＩ Ｆ受容体に関するそれらの約１０分の１またはそれ以下であることを示す。それ ら（ＳＲＩＦ同族体）は体内のそのような受容体の定位およびＳＳＴＲ１受容体 を発現する腫瘍の診断に有用である。その上、それらはＳＳＴＲ１受容体によっ て仲介される腫瘍増殖を抑制するために特に有用であるのが、これはそれらが複 数のＳＲＩＦ受容体と作用し合う現在使用できるＳＲＩＦ同族体の投与でおきる 副作用をおこさずに使用できるからである。これらのＳＲＩＦ同族体の幾つかは 、容易に標識化することができ、効果的薬剤スクリーニング法に利用することが できる。それらはＳＳＴＲ１受容体の選択的精製にも用いられ、その後薬剤スク リーニング試験に用いることができる。 好適実施態様の詳細な説明 特に定義されていない場合、すべての技術的および科学的用語は、 本発明が属する分野の熟練せる当業者によって一般的に理解される同一の意味を もつ。ペプチドを定義するために用いた命名法は、シャロダー（Scharoder）お よびルブケ（Lubke）著“ペプチド”（Academic Press）（１９６５）に説明さ れているものである。そこには一般的表現法にしたがい、アミノ基は左に、カル ボキシル基は右にあらわされている。アルファ−アミノ酸残基を同定するための 標準的３文字の略語があり、アミノ酸残基が異性体型をもつ場合には、特に記載 がなければ、それはアミノ酸のＬ−型をあらわす；例えばＳｅｒ＝Ｌ−セリンで ある。Ｄ、Ｌによって、特定のα−アミノ酸のＤ−およびＬ−異性体の混合物が 表される。 ＳＲＩＦ受容体ＳＳＴＲ１に選択的親和性を有するＳＲＩＦ同族体ペプチドが 提供される；好適な同族体はＳＳＴＲ１に対して高い親和性も有する。すなわち 約１０ナノモル以下のＫ_dと同等のＫ_dを有する。これらのペプチドは公知のＳＲ ＩＦ同族体またはその明白な変形物を広く包含する；それらは天然ペプチドの８ −位に相当する位置にＤ−異性体、好適には芳香族Ｄ−異性体、より好適にはＤ −ＴｒｐまたはＤ−Ｎａｌを有し、そして天然ペプチドの９−位に相当するその 隣接位置にアミノメチルＰｈｅ残基（それはアルキル化されているかも知れない ）を有する。塩基性分子がＳＲＩＦ受容体に結合することによってＳＲＩＦ特性 をあらわす場合、それぞれ８−および９−位へのこの残基の組み合わせの挿入は 、ＳＳＴＲ１受容体に高度に親和性をもつ分子を作り出す。ＳＳＴＲ１に対する 結合親和性を高めるためには５−位残基がないことも好ましい。ＳＲＩＦが同定 されて以来、幾つかの点で高められた効力を有するＳＲＩＦ同族体が多数合成さ れた。その効力は本発明の改良を取り入れることによってＳＳＴＲ１に選択的に することができる。下記の米国特許はそのようなＳＲＩＦ同族体を例として挙げ ている： Ｒｅ．３０，５４８；４，１３３，７８２；４，２１１，６９３；４ ，３１６，８９１；４，３７２，８８４；４，３９３，０５０；４，０６１，６ ０８；４，０８１，４３３；４，１８２，７０７； ４，１９０，５７５；５，１８５，０１０；４，２１５，０３９；４，２３０， ６１７；４，２３８，４８１；４，２３３，９９８；４，２８２，１４３；４， ３２８，２１４；４，３５８，４３９；４，２０９，４４１；４，２１０，６３ ６；４，３１６，８９０；および５，０７３，５４１。 本発明の所望の特徴をあらわす幾つかの代表的ペプチドの例は、天然哺乳動物 ＳＲＩＦの１４残基配列と一致するナンバリング系に基づく下記のアミノ酸配列 を有するものを含める： （シクロ ３−１４）Ｘａａ₁−Ｘａａ₂−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ₅−Ｐｈｅ− Ｐｈｅ−Ｄ−Ｘａａ₈−Ｘａａ₉−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｘａａ₁₃−Ｃｙｓ、 ここでＸａａ₁はｄｅｓ−ＸａａまたはＡｌａ；Ｘａａ₂はＴｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒま たはｄｅｓ−ＸａａまたはＧｌｙ；Ｘａａ₅はｄｅｓ−ＸａａまたはＡｓｎ；Ｄ −Ｘａａ₈はＤ−アミノ酸；Ｘａａ₉はアミノメチルＰｈｅ；Ｘａａ₁₃はＳｅｒま たはＤ−Ｓｅｒである。Ｘａａ₅はｄｅｓ−Ｘａａであるのが好ましい。Ｄ−Ｘ ａａ₈は芳香族でなければならず、Ｄ−Ｔｒｐまたは置換Ｄ−Ｔｒｐ、または同 等の残基、例えばＤ−Ｎａｌなどである。Ｘａａ₉はフェニル環に好適には環の ３−または４−位にアミノメチル置換を有するＰｈｅ残基、すなわちＡｍｐを含 む；最も好適にはＸａａ₉は（Ｃ）４Ａｍｐを含み、ここでＣは水素または低級 アルキル（Ｃ₁−Ｃ₅）基である。より好適にはＣはメチル、エチル、イソプロピ ルまたはイソブチルであり、Ｃがイソプロピルであるのが最も好ましい。 ＳＲＩＦアゴニストの好適な亜属は下記のアミノ酸配列を有する： （シクロ ３−１４）Ｘａａ₁−Ｘａａ₂−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ₅−Ｐｈｅ− Ｐｈｅ−Ｄ−Ｘａａ₈−Ｘａａ₉−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｘａａ₁₃−Ｃｙｓ、 ここでＸａａ₁はｄｅｓ−Ｘａａ；Ｘａａ₂はＴｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒまたはｄｅｓ− Ｘａａ；Ｘａａ₅はｄｅｓ−Ｘａａ；Ｄ−Ｘａａ₈はＤ−Ｔｒｐか置換Ｄ−Ａｌａ のどちらかであり、この際β−炭素上の１つの水素は下記によって置換される： （ａ）３つ以上の直鎖低級アルキル基で置換されたフェニル、ナフチ ル、ピリジル、アントリル、フルオレニル、フェナントリル、ビフェニリルおよ びベンズヒドリルからなる群から選択される炭素環式アリール含有基；または （ｂ）３つ以上の直鎖低級アルキル基で置換したシクロアルキル、ペルヒドロナ フチル、ペルヒドロビフェニリル、ペルヒドロ−２，２−ジフェニルメチル、お よびアダマンチルからなる群から選択される飽和炭素環式基； Ｘａａ₉は任意的にアルキル化（Ｃ₁−Ｃ₅）されたアミノメチルＰｈｅであり； Ｘａａ₁₃はＳｅｒまたはＤ−Ｓｅｒである。 ＳＲＩＦアゴニストペプチドのその他の好適亜属は次のアミノ酸配列を有する ：（シクロ ３−１４）Ｘａａ₁−Ｘａａ₂−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ₅−Ｐｈｅ −Ｐｈｅ−Ｄ−Ｘａａ₈−Ｘａａ₉−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｘａａ₁₃−Ｃｙｓ 、ここでＸａａ₁はｄｅｓ−Ｘａａ；Ｘａａ₂はＴｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒまたはｄｅｓ −Ｘａａ；Ｘａａ₅はｄｅｓ−Ｘａａ；Ｄ−Ｘａａ₈はＤ−ＴｒｐまたはＤ−Ａｌ ａのどちらかであり、ここでβ−炭素上の１つの水素は下記によって置換されて おり： （ａ）３つ以上の直鎖低級アルキル基で置換されたフェニル、ナフチル、ピリジ ル、アントリル、フルオレニル、フェナントリル、ビフェニリルおよびベンズヒ ドリルからなる群から選択される炭素環式アリール含有基；または （ｂ）３つ以上の直鎖低級アルキル基で置換されたシクロアルキル、ペルヒドロ ナフチル、ペルヒドロビフェニリル、ペルヒドロ−２，２−ジフェニルメチル、 およびアダマンチルからなる群から選択される飽和炭素環式基； Ｘａａ₉は任意的に（Ｃ₃またはＣ₄）アルキル化アミノメチルＰｈｅであり；Ｘ ａａ₁₃はＳｅｒまたはＤ−Ｓｅｒである。 ＳＲＩＦアゴニストペプチドのその他の好適亜属は次のアミノ酸配列を有する ：（シクロ ３−１４）Ｘａａ₁−Ｘａａ₂−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ −Ｘａａ₅−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｘａａ₈−Ｘａａ₉−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ −Ｘａａ₁₃−Ｃｙｓ、ここでＸａａ₁はｄｅｓ−Ｘａａ；Ｘａａ₂はＴｙｒ、Ｄ− Ｔｙｒまたはｄｅｓ−Ｘａａ；Ｘａａ₅はｄｅｓ−Ｘａａ；Ｄ−Ｘａａ₈は（Ａ） Ｄ−Ｔｒｐ、ここでＡはＨ、Ｆ、Ｃｌ、またはＢｒ、または（Ｂ）Ｄ，Ｌ−Ａｌ ａ、ここでＢはナフチル、ピリジル、フルオレニル、アダマンチル、アントリル 、ビフェニル、トリ（低級アルキル）フェニル、ペンタメチルフェニル、フェナ ントリル、トリアルキルシクロヘキシル、ペルヒドロナフチルまたはペルヒドロ ビフェニルであり；Ｘａａ₉は（Ｃ₃またはＣ₄）アルキル化アミノメチルＰｈｅ であり；Ｘａａ₁₃はＳｅｒまたはＤ−Ｓｅｒである。 ＳＲＩＦアゴニストペプチドのまた別の好適亜属は次のアミノ酸配列を有する ：（シクロ ３−１４）Ｘａａ₁−Ｘａａ₂−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ₅−Ｐｈｅ −Ｐｈｅ−Ｄ−Ｘａａ₈−Ｘａａ₉−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｘａａ₁₃−Ｃｙｓ 、ここでＸａａ₁はｄｅｓ−Ｘａａ；Ｘａａ₂はＴｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒまたはｄｅｓ −Ｘａａ；Ｘａａ₅はｄｅｓ−Ｘａａ；Ｄ−Ｘａａ₈はＤ−Ｔｒｐ、Ｄ−１Ｎａｌ 、Ｄ−Ｍｅ５−Ｐｈｅ、Ｄ−ＴＭＰ、Ｄ−ＢＩＡ、Ｄ−ＴＢＡ、−Ｄ−アントリ ル−Ａｌａ、Ｄ−フルオレニル−ＡｌａまたはＤ−アダマンチル−Ａｌａ；Ｘａ ａ₉はイソプロピル−４−アミノメチルＰｈｅ；そしてＸａａ₁₃はＳｅｒまたは Ｄ−Ｓｅｒである。 β−Ｄ−Ｎａｌとは、アラニンのＤ−異性体で、β−炭素原子にナフチル置換 があるものを意味する；それは３−Ｄ−Ｎａｌとも呼ばれる。ナフタレン付加が 環構造の２の位置である３−Ｄ−２Ｎａｌを用いるのが好ましい；しかし３−Ｄ −１Ｎａｌも用いることができる。Ｐａｌは、β炭素原子がピリジルによって置 換されているアラニンをあらわす；結合がピリジン環の３の位置に起きるのが好 ましい。置換されたＤ−Ｔｒｐを用いるとき、単一の水素の置換が５または６の どちらかの位置に行われるのが好ましい、それらの置換基はクロロ、フルオロ、 ブロモおよびニトロから選択され、クロロ、フルオロおよび ニトロが好ましい。或いは、インドール窒素をホルミルでアシル化してもよい（ ＮⁱⁿＦｏｒ−または１Ｆｏｒ−）。Ａｍｐとは、（アミノメチル）フェニルアラ ニンを意味する；特に記載しない限り、アミノ置換基を含むメチル基は、フェニ ル環の４−位またはパラ位にあると理解すべきである。ＩＡｍｐとは（Ｎ−イソ プロピル−アミノメチル）フェニルアラニンを意味する；ここでアミノ基はイソ プロピル基でアルキル化されている。Ｄ−Ｍｅ５Ｐｈｅとは、３−（２，３，４ ，５，６−ペンタメチルフェニル）−Ｄ−Ａｌａを意味する。Ｄ−ＴＭＰとは３ −（２，４，６−トリメチルフェニル）−Ｄ−Ａｌａを意味する。Ｄ−ＢＩＡと は３−（ベンズイミダゾール−２−イル）−Ｄ−Ａｌａを意味する。Ｄ−ＴＢＡ とは３−（４，５，６，７−テトラヒドロベンズイミダゾール−２−イル）−Ｄ −Ａｌａを意味する。 ここに用いられる用語“低級アルキル”は、炭素原子１ないし５個を有する直 鎖または枝分かれ鎖、飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、 イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、 イソペンチルおよびｎ−ペンチルなどである；用語“環状アルキル基”は炭素原 子４ないし６個を有する環状飽和炭化水素基、例えばシクロブチル、シクロペン チルおよびシクロヘキシルである。ここに用いる“ナフチル”は１−および２− ナフチルを含み、“アントリル”は１−、２−および９−アントリルを含み；“ フルオレニル”は２−、３−、４−および９−フルオレニルを含み；“フェナン トリル”は２−、３−および９−フェナントリルを含み；“アダマンチル”は１ −および２−アダマンチルを含む。 ＳＳＴＲ１はクローン化された最初のソマトスタチン受容体であるとはいえ、 その生物学的および薬物学的特性の同定はその他のＳＲＩＦ受容体より遅れた。 それはＳＳＴＲ１にとって顕著に選択的なリガンドがなかったためである。本発 明のペプチド類は最初の真のＳＳＴＲ１選択的リガンドであると考えられ、よっ てそれはこの受容体の機能的役割を決定するために、そして他の受容体を活性化 せずこのＳＲ ＩＦ受容体のみを選択的に活性化するために非常に有用である。 本発明のペプチド類とＳＳＴＲ１との結合の選択性は、それらと５種類のクロ ーン化ＳＲＩＦ受容体との相互作用を試験することによって証明された。受容体 を発現する組換え細胞を洗い、均質化して、当業者には公知の適切な緩衝液で粗 蛋白質ホモジネートを作る。典型的分析試験では、その細胞ホモジネートから或 る量の蛋白質を取り、それを適切なｐＨをもつ適した分析試験緩衝液の少量に入 れる。候補となる物質、例えば潜在的アゴニストおよびアンタゴニスト（拮抗物 質）をその混合物に適切な濃度で加え、候補物質と受容体ポリペプチドとの相互 作用をモニターする。本発明のペプチドは実質上ＳＳＴＲ１のみに結合し、それ らの結合は高親和性ものであった。 受容体結合アッセイを概ねレイノーらが示した方法（上記）でクローン化ＳＲ ＩＦ受容体で行い、選択した量の受容体（など）の結合部位の半分（５０％）を 占めるのに必要なリガンドの濃度を示すＫ_d値を出した。別法として、結合部位 の５０％から測定される標的リガンドの飽和濃度を置換するために必要な競合的 リガンドの濃度を示すＩＣ₅₀も、このような競合試験で計算することができる。 ペプチドｄｅｓ−ＡＡ^1,2,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］ＳＲＩＦは［¹²⁵Ｉ− Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦとクローン化ヒトＳＳＴＲ１との結合をＩＣ₅₀１．８±０． ７ｎＭで阻止する。このＳＲＩＦ同族体ペプチドは１００ｎＭ以下の濃度ではマ ウスＳＳＴＲ２、マウスＳＳＴＲ３、ヒトＳＳＴＲ４またはラットＳＳＴＲ５に は結合しない。 ２-位にチロシン残基を有するｄｅｓ−ＡＡ^1,2,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹ ］ＳＲＩＦの同族体をヨウ素化し、クローン化ＳＲＩＦ受容体に対する結合を試 験した。¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ²−ｄｅｓ−ＡＡ^1,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］ＳＲ ＩＦも同様にＳＳＴＲ２−５に結合しなかったが、それはＳＳＴＲ１には強力に 、飽和的に結合し、Ｋ_dは０．５±０．１ｎＭ、Ｂ_maxは２２６±５６ｆｍｏｌ／ ｍｇ蛋白質であった。Ｂ_max値は与えられた時間に占領される特定部位の最高数 、すなわち飽和点 をあらわす。¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ²−ｄｅｓ−ＡＡ^1,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］ ＳＲＩＦのＳＳＴＲ１への結合は、ＳＲＩＦ、［Ｄ−Ｔｒｐ⁸］ＳＲＩＦおよび ＳＲＩＦ−２８によって強力に阻止され、そのときのＩＣ₅₀値はそれぞれ０．８ ±０．４、０．２±０．１および０．７±０．２ｎＭであった。さらにＳＲＩＦ 同族体、ｄｅｓ−ＡＡ^1,2,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹、Ｄ−Ｓｅｒ¹³］ＳＲ ＩＦはＳＳＴＲ１に強力に結合し、そのときのＩＣ₅₀値は５．３±０．８ｎＭで あり、¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ²−ｄｅｓ−ＡＡ^1,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］ＳＲＩ Ｆに比較される。これに対して、ＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ５に選択的に結合す るＳＲＩＦ同族体は¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ²−ｄｅｓ−ＡＡ^1,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍ ｐ⁹］ＳＲＩＦをＳＳＴＲ１から追い出すことができない。ＣＯＳ−７細胞で発 現させたＳＳＴＲ１と¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ²−ｄｅｓ−ＡＡ^1,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡ ｍｐ⁹］ＳＲＩＦとの結合はＧＴＰｇＳおよび百日咳毒素処理によって減少した ；それに対して、［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦとＳＳＴＲ１との結合はこれら の処理によって影響されなかった。これらの研究結果は、ｄｅｓ−ＡＡ^1,2,5− ［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］ＳＲＩＦおよび¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ²−ｄｅｓ−ＡＡ^1,5 −［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］ＳＲＩＦが、天然ペプチドＳＲＩＦとは異なる仕 方でＳＳＴＲ１に結合することを示唆する。ＳＳＴＲ１に高親和性で結合するｄ ｅｓ−ＡＡ^1,2,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］ＳＲＩＦおよびその他のＳＲＩ Ｆ同族体はＳＳＴＲＩ受容体を活性化することが見いだされている。よって、こ れらのＳＲＩＦ同族体は、この受容体によって仲介される腫瘍増殖をその他のＳ ＲＩＦ受容体を活性化せずに抑制するのに有用であると考えられる。 本発明のＳＲＩＦ同族体とＳＳＴＲＩとの結合が天然ＳＲＩＦおよびＳＲＩＦ −２８によつて強力に阻止されるとはいえ、それは多くの他の合成ＳＲＩＦ同族 体によっては阻止されない。その上、本発明のペプチドがＳＳＴＲ４とは結合し ないということは特に興味深い、なぜならばＳＳＴＲ１およびＳＳＴＲ４は約６ ８％のアミノ酸配列同 一性を有するからである。これは他のいかなる２つのＳＲＩＦ受容体よりも高い 配列類似性である。さらに、ＳＳＴＲ１とＳＳＴＲ４とは両方共、ＳＳＴＲ２、 ＳＳＴＲ３およびＳＳＴＲ５に強力に結合するその他の多くの合成ＳＲＩＦ同族 体に対して非常に低い親和性を示す。高いアミノ酸配列類似性および同様なリガ ンド結合特性は普通、これら２つのＳＲＩＦ受容体がリガンド結合ドメインに何 らかの共通の構造的類似性を有することを予言するものである；しかし本発明の ペプチド類がＳＳＴＲ１にのみ結合するという事実は、これら２つの、構造的に 類似する受容体の間にリガンド結合特性に関してはかなりの差があることを示唆 する。 ＳＳＴＲ１はチロシンホスファターゼに結合することが報告された、そしてこ の酵素の刺激は、この受容体の活性化によってＳＲＩＦの抗増殖効果を高めると 考えられる。ＳＳＴＲ１ ｍＲＮＡは多数の腫瘍に見いだされている。ＳＳＴＲ １がＳＲＩＦの抗増殖効果を仲介することができるため、悪性組織がこの受容体 を発現する癌を治療するために、ＳＳＴＲ１選択的ＳＲＩＦアゴニストが治療薬 として有効となる。 ＳＳＴＲ１選択的アゴニストが抗癌剤としてもつ特に重要な利点は、それらが 長期使用後も連続的に有効であることである。腫瘍治療におけるＳＭＳ−２０１ −９９５の連続使用は、このペプチドが相互作用し得る受容体であるＳＳＴＲ２ 、ＳＳＴＲ３およびＳＳＴＲ５の急速な感受性低下によって阻止されると考えら れる；事実、これら３つの受容体はすべて、急速に感受性が低下すると報告され た。これとは対照的に、諸研究はＳＳＴＲ１がアゴニスト誘起性調節に他の受容 体よりも強く抵抗することを示唆している。その結果として、本発明のＳＳＴＲ １選択的ペプチドアゴニストは長期の抗増殖作用をもつと考えられ、そのため現 在抗癌剤として使用されている市販のＳＲＩＦ同族体に比較して改善された癌治 療効果をあらわすはずである。 さらに最近、ＳＭＳ−２０１−９９５の同族体を用いて、ポジトロン放出断層 撮影法（ＥＣＴ）の使用により、ＳＲＩＦ受容体の高発現 を示すヒト腫瘍の検出が行われている。このＳＲＩＦ同族体はＳＳＴＲ２、ＳＳ ＴＲ３またはＳＳＴＲ５を区別せず、ＳＳＴＲ１発現を検出できそうにない。 本発明の標識化ＳＲＩＦ同族体は同様な目的に用いることができ、ＳＳＴＲ１ を発現する腫瘍を確認するために特に有用であると考えられる。そのような腫瘍 はその後ＳＳＴＲ１選択的リガンドで治療する治療的標的となる。 ＳＳＴＲ１はその他のＧ−蛋白質結合受容体の典型的構造を有するが、この受 容体が実際にＧ蛋白質と結合し、アデニリルシクラーゼに効果的に結合するかど うかについては議論がある。成る研究者は、この受容体へのＳＲＩＦ結合はＧＴ Ｐ同族体または百日咳毒素によって影響を受けず、アデニリルシクラーゼに効果 的に結合しないと報告したが、或る研究者はアゴニストとその受容体との結合の ＧＴＰ同族体による調節を示すことができず、受容体がＳＲＩＦによるｃＡＭＰ 形成阻止を仲介することを見いだした；しかしこれは使用した特定の細胞系の機 能かも知れない。 これまでの研究は、［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦとＳＳＴＲ１との結合はＧ ＴＰ同族体によっても百日咳毒素処理によっても顕著な影響を受けないことを確 認した。対照的に、本発明の放射性標識ＳＲＩＦ同族体の結合はＧＴＰｇＳによ って減少し、ＧＴＰｇＳ効果は百日咳毒素処理によって減少する。百日咳毒素処 理は結合のＧＴＰｇＳ調節を消失させたから、ＳＳＴＲ１はＧ_iaおよび／または Ｇ_oaと結合できるようにみえる、そのため本発明のＳＲＩＦ同族体はこの受容体 ではアゴニストである。本発明の同族体とＳＳＴＲ１との結合がＧＴＰｇＳおよ び百日咳毒素効果により調節されることは、ＳＲＩＦとこの受容体との結合には これらの作用物質の効果がないことと比べてみるとき、ＳＲＩＦと本発明の同族 体とは異なるＳＳＴＲ１コンフォーメーション変化を誘起することを示唆する。 例えば本発明のＳＲＩＦ同族体は受容体のＧ蛋白質との効果的結合を誘起すると 考えられ、他方ＳＲＩ Ｆはこのような結合を引き起こす効果がより少ないのかも知れない。これらの結 果は、ＳＲＩＦが本発明のＳＲＩＦ同族体のそれとは基本的に異なる仕方でＳＳ ＴＲ１と相互作用することを暗示する。若干の結果は、本発明のＳＲＩＦ同族体 が、ＳＳＴＲ１を発現する細胞において、ＳＲＩＦでさえ生成することができな かった反応を引き起こし得ることも示唆している。 本発明のＳＲＩＦ同族体はＳＳＴＲ１における第１の選択的アゴニストであり 、ＳＳＴＲ１を発現する癌との戦いにおいて有効である。それらは脳において、 そして内分泌および外分泌系においてこの受容体を発現する細胞および組織を定 位し、体内におけるこの受容体の選択的機能を確認するためにも非常に有用であ ると考えられる。それらは過去２年間にわたってＳＲＩＦが有用であることが判 明しているＳＳＴＲ１によって仲介される薬物学的効果の幾つかを選択的に行う 上でも有用である。 本発明の標識化ＳＲＩＦ同族体は、薬物スクリーニング試験に用いて、非常に 有効なアゴニストまたはアンタゴニストである、ＳＳＴＲ１に高親和性をもって 結合する新しい効果的ペプチド−および非ペプチド作用物質をスクリーニングす るためにも有用である。受容体ＳＳＴＲ１のための公知のリガンドがあれば、組 換え法によって生成した受容体のベースライン活性を得ることができる。そこで インヒビターまたは改質剤、すなわち受容体機能のアンタゴニストで試験するた めに、試験混合物に、受容体に対する効果を試験すべき候補物質を挿入すること ができる。候補物質の存在または不在下で行われる反応を比較することによって 、その候補物質の受容体の正常機能に与える効果に関して情報を得ることができ る。 本発明のペプチド類は典型的溶液合成法によっても合成できるが、それらは固 相法によって合成するのが好ましい。クロロメチル化樹脂またはヒドロキシメチ ル化樹脂が好適に用いられる。例えば、遊離カルボキシルＣ−末端を有するこれ らのペプチドは、１９８９年３月２ ８日に出願された米国特許第４，８１６，４３８号に教示されるように好適に合 成される。固相合成は上記米国特許に示される方法で、Ｃ−末端から始め、アミ ノ酸を鎖に段階的に付加する方法で行われる。好適には、当業者には公知の側鎖 保護基が、特に反応性に富む側鎖を有するアミノ酸の一部として含まれる。その ような側鎖保護基は、その他のもの例えばＴｒｐなどの場合、樹脂上に構築され る鎖にそのようなアミノ酸を結合させるときに任意的に用いることができる。こ のような合成は完全に保護された中間体ペプチド樹脂を提供する。 或る種の好適ＳＲＩＦ同族体を一般的に本発明にしたがって合成するために用 いる化学的中間体は下記の式によってあらわされる： Ｘ¹−Ｘａａ₂（Ｘ²）−Ｃｙｓ（Ｘ³）−Ｌｙｓ（Ｘ⁴）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ− Ｘａａ₈（Ｘ⁵）−Ｘａａ₉（Ｘ³）−Ｔｈｒ（Ｘ⁶）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｘ⁶）−Ｘ ａａ₁₃（Ｘ⁶）−Ｃｙｓ（Ｘ³）−Ｘ⁷ 上記式中、Ｘ¹は、ポリペプチドの段階的合成において有用であることが当業者 には公知である種類のα−アミノ保護基である。所望ペプチド組成中のＧが特定 のアシル基である場合、保護基のような基を用いることが適切であるかも知れな い。Ｘ¹によって網羅されるα−アミノ保護基の種類のなかには（１）アシル型 保護基、例えばホルミル（Ｆｏｒ）、トリフルオロアセチル、フタリル、ｐ−ト ルエンスルホニル（Ｔｏｓ）、ベンゾイル（Ｂｚ）、ベンゼンスルホニル、ジチ アスクシノイル（Ｄｔｓ）、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル（Ｎｐｓ）、トリ チルスルフェニル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、アクリリル（Ａｃｒ）、ク ロロアセチル、アセチル（Ａｃ）およびγ−クロロブチリル；（２）芳香族ウレ タン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル（Ｚ）、フルオレニルメチロキ シカルボニル（Ｆｍｏｃ）および置換ベンジルオキシカルボニル、例えばｐ−ク ロロベンジルオキシカルボニル（ＣｌＺ）、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニ ル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニルおよびｐ−メトキシベンジルオキシカ ルボニル；（３）脂肪族ウレタン保護基、例えばｔｅｒｔ−ブチル オキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピ ルオキシカルボニル、エトキシカルボニルおよびアリルオキシカルボニル；（４ ）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロペンチルオキシカルボニル、 アダマンチルオキシカルボニルおよびシクロヘキシルオキシカルボニル；（５） チオウレタン型保護基、例えばフェニルチオカルボニル；（６）アルキル型保護 基、例えばアリル（Ａｌｙ）、トリフェニルメチル（トリチル）およびベンジル （Ｂｚｌ）；（７）トリアルキルシラン基、例えばトリメチルシラン。好適α− アミノ保護基はＢｏｃである。 Ｘ²は水素か、またはテトラヒドロピラニル、ｔｅｒｔ−ブチル、トリチル、 ベンジル、Ｚ、２−ブロモベンジルオキシカルボニル（２ＢｒＺ）および２，６ −ジクロロベンジル（ＤＣＢ）からなる群から選択される、Ｔｙｒのフェノール 性ヒドロキシル基の保護基である。２ＢｒＺが好ましい。 Ｘ³は、Ｃｙｓの保護基であり、好適にはｐ−メトキシベンジル（Ｍｏｂ）、 ｐ−メチルベンジル、アセタミドメチル、トリチルおよびＢｚｌからなる群から 選択される。最も好ましい保護基はｐ−メトキシベンジルである。Ｘ³は水素で もよく、硫黄上に保護基がないことを意味する。 Ｘ⁴はアミノ側鎖基、第一または第二アミノ、例えばＬｙｓのそれの保護基で ある。適した側鎖アミノ保護基の例はＺ、２−クロロベンジルオキシカルボニル （２−Ｃｌ−Ｚ）、Ｔｏｓ、ｔ−アミロキシカルボニルおよびＢｏｃである。側 鎖アミノ保護基の選択は、それが合成中のα−アミノ基の脱保護中に除去されな いものでなければならないことを除いて、重要ではない。そのためα−アミノ保 護基および側鎖アミノ保護基は同じあってはいけない。 Ｘ⁵は水素か、またはＴｒｐのインドール窒素の保護基、例えばＢｚ、Ａｃま たはＦｏｒなどである。多くの合成では、Ｔｒｙは保護する必要がない。 Ｘ⁶は水素、またはＴｈｒまたはＳｅｒのヒドロキシル側鎖の保護基、例えば Ａｃ、Ｂｚ、トリチル、ＤＣＢまたはベンジルエーテル（Ｂｚｌ）などであり、 Ｂｚｌが好ましい。 Ｘ⁷はＯＨ、ＯＣＨ₃および、エステルからなる群から選択される；エステル類 は、下記の式によってあらわされる固体樹脂支持体に結合させるために固相合成 において用いられるベンジルエステル−またはヒドロキシルエステルアンカー結 合を含める： −Ｏ−ＣＨ₂−ポリスチレン樹脂支持体 および Ｏ−ＣＨ₂−ベンジル−ポリスチレン樹脂支持体。 このようなポリスチレンポリマーは好適にはスチレンと、架橋剤としての約０． ５ないし２％ジビニルベンゼンとのコポリマーである。この架橋剤は或る種の有 機溶媒においてポリスチレンポリマーを完全に不溶性にする。 Ｘ²−Ｘ⁶のための幾つかの側鎖保護基を選択する規準は、その保護基が合成の 各段階においてα−アミノ保護基（好適にはＢｏｃ）を除去するために選択され た反応条件においてその試薬に対して安定でなければならないということである 。これらの保護基は概して結合条件下では分離してはならないが、所望アミノ酸 配列の合成完了時にはそのペプチド鎖を変えない反応条件下で除去可能でなけれ ばならない。或る８−位残基のために最初に用いられる保護基は、以下で説明す るように、その位置で反応が行われるために樹脂から切り離す前に除去されても よい。アミノメチルＰｈｅ（Ａｍｐ）の形の９位残基はその最終的所望型に導入 されるか、またはそれは保護基除去され、所望ならば、樹脂ペプチドの一部と同 時にアルキル化される。 こうして、下記の式を有するＳＲＩＦ同族体ペプチドの製法が広く提供される ： （シクロ３−１４）Ｈ−Ｘａａ₂−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｘａ ａ₈−Ｘａａ₉−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｘａａ₁₃−Ｃｙｓ −ＯＨ 上記式中、Ｘａａ₂、Ｄ−Ｘａａ₈、Ｘａａ₉およびＸａａ₁₃は前に示されたもの であり、この方法は（ａ）式：Ｘ¹−Ｘａａ₂（Ｘ²）−Ｃｙｓ（Ｘ³）−Ｌｙｓ（ Ｘ⁴）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｘａａ₈（Ｘ⁵）−Ｘａａ₉（Ｘ³）−Ｔｈｒ（Ｘ⁶） −Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｘ⁶）−Ｘａａ₁₃（Ｘ³）−Ｃｙｓであらわされ、式中、Ｘ¹ は水素またはα−アミノ保護基；Ｘ⁵は水素またはインドール窒素のための保護 基；Ｘ⁶はＴｈｅまたはＳｅｒのヒドロキシル基の保護基；Ｘ²は水素または、Ｔ ｙｒのフェノール性ヒドロキシル基のための保護基；Ｘ³は水素かまたはスルフ ヒドリル側鎖の保護基かのどちらかであり；Ｘ⁴はアミノ側鎖の保護基であり、 Ｘ⁷は−Ｏ−ＣＨ₂−［樹脂支持体］、または保護基またはＯＨである中間体ペプ チドを形成し、（ｂ）Ｘ¹ないしＸ⁶の残りの基を分離し、および／またはＸ⁷に 含まれる樹脂支持体から切り離す；（ｃ）酸化してＣｙｓ側鎖間にジスルフィッ ド結合を作る；そして（ｄ）所望ならば無毒性塩に変換することを含んでなる。 ペプチドの精製のために、ＣＭＣカラム上でのイオン交換クロマトグラフィー が行われ、その後溶出系：ｎ−ブタノール；０．１Ｎ酢酸（１：１容量比）を用 いる分配クロマトグラフィーがセファデックスＧ−２５充填カラムで行われる、 或いはＨＰＬＣを用いて行われる。これらの精製法は当業者には公知で、リビア ー（J.Rivier）らのJ.Chromatography、２８８巻、３０３−３２８ページ（１９ ８４）に詳細に説明されている。 本発明のＳＲＩＦ同族体は体重１ｋｇあたり１００マイクログラム以下の水準 で有効である。ＳＳＴＲ１受容体を有する癌性腫瘍を長期抑制するためには、約 ０．１ないし約２．５ミリグラム／ｋｇ体重の範囲の投与量水準が必要であるら しい。これらの同族体は生理的ｐＨでは特に溶解性であり、相対的に濃い溶液と して作り、投与することができる。 下記の実施例は、本発明の種々の特徴をあらわす多数のＳＲＩＦ同 族体ペプチドの合成、およびそのようなペプチド合成に使用するための保護され たアミノ酸の合成を説明する。これらのペプチドのすべては、最低１つのＤ−異 性体アミノ酸残基を含み、好適ＳＲＩＦ同族体には天然ＳＲＩＦ配列との比較が 容易になるような１４個のアミノ酸残基が含まれないとはいえ、それらのペプチ ド同族体は１から１４までの位置を有し、３および１４−位のＣｙｓ残基は環状 化ジスルフィッド結合によって連結している天然ＳＲＩＦ配列に匹敵する位置を 参照することによって説明される。 実施例１ Ｌ−Ｎ^α−Ｂｏｃ−Ｎ⁴−Ｃｂｚ−（４−イソプロピルアミノメチル）フェニ ルアラニン（この化合物は略語命名法によるとＢｏｃ−ＩＡｍｐ（Ｚ）と命名さ れる）の合成は次のように行われる： Ｌ−Ｎ^α−Ｂｏｃ−（４−アミノメチル）フェニルアラニン（Ｂｏｃ−Ａｍｐ ）（１５．３ｇ、５２ｍｍｏｌ）をアセトン（２００ｍｌ）に溶解し、５００ｍ ｌパール水素化容器中で分子篩（６．０ｇ、４Å）をその溶液に加える。その混 合物をＮ₂で１０分間パージし、、それからＰｄ／Ｃ １０％（６００ｍｇ）を 加える。還元的アルキル化反応がおこり、ＨＰＬＣによってそれをモニターする ；それは約２６時間行われる。濾過して触媒および分子篩を除去し、溶媒を蒸発 すると、所望中間体Ｌ−Ｎ^α−Ｂｏｃ−（４−イソプロピルアミノメチル）フェ ニルアラニンが粘稠液として得られる。 生成物をその後ＴＨＦ／Ｈ₂Ｏ混合物（１：１、２００ｍｌ）中でｐＨ＝９． ５で、ベンジルクロロホルメート（Ｚ−Ｃｌ、８．６ｍｌ、６０ｍｍｏｌ）を用 いてＣｂｚ−保護する。好収量のＬ−Ｎ^α−Ｂｏｃ−Ｎ４−Ｃｂｚ−（４−イソ プロピルアミノメチル）フェニルアラニンがフォームとして得られる：１７．５ ｇ（３７ｍｍｏｌ、７１．４％）；ｍ．ｐ．３９−４２℃；［α］D＝＋５．２ °（ｃ＝１、ＭｅＯＨ、ｔ＝２０℃）。 実施例２ 下記構造： を有するソマトスタチンアゴニストｄｅｓ−ＡＡ^1,2,5−［Ｄ−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍ ｐ⁹］ＳＲＩＦを、下記の固相法によってクロロメチル化樹脂上で段階的に合成 する。樹脂はスチレンと１ないし２パーセントのジビニルベンゼンとの共重合に よって作られた合成樹脂の微細ビーズ（直径２０−７０ミクロン）からなる。樹 脂中のベンゼン環をフリーデル−クラフツ反応でクロロメチルメチルエーテルお よび塩化錫でクロロメチル化する。こうして導入された塩素は反応性塩化ベンジ ル型のリンカー（linker）を作り出す。フリーデル−クラフツ反応は、樹脂が樹 脂１ｇあたり０．５ないし２ミリモルの塩素を含むまで続けられる。 Ｃｙｓのｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｓ−パラメトキシベンジル誘導 体、すなわちＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍｏｂ）、を次のような公知の方法によって樹脂 に結合する；（１）トリエチルアミンの存在下でエタノール中で還流する、（２ ）Ｂｏｃ−保護アミノ酸のセシウム塩を５０℃のジメチルホルムアミド（ＤＭＦ ）中に一晩保持する、または（３）Ｂｏｃ−保護アミノ酸をＫＦ中、８０℃のＮ −メチルピロリドン（ＮＭＰ）中に２４時間保持する。樹脂上のＣｌの１ミリ等 量あたり保護Ｃｙｓを１ミリ等量用いる。脱保護、中和および各アミノ酸の添加 は下記のスケジュールにしたがって行う： 各アミノ酸のＢｏｃ−誘導体を用いる。上記のスケジュールにより最初の残基 、すなわちＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍｏｂ）のα−アミノ酸脱保護後、ＳｅｒのＮ^αＢ ｏｃ誘導体を結合剤（coupling agent）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｄ ＣＣ）と共に加える；Ｓｅｒの側鎖はベンジルエーテル（Ｂｚｌ）で保護する。 Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）のＮ^αＢｏｃ誘導体を次にＤＣＣと共に加える。Ｎ^αＢｏｃ− Ｐｈｅおよびその後Ｎ^αＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）の結合後、Ｎ^αＢｏｃ−４− イソプロピルアミノメチルＰｈｅ（Ｚ）を同様に結合する。 Ｎ^αＢｏｃ−Ｌｙｓ（２−ＣｌＺ）を次に加え、その後残りの保護されたＣｙ ｓを結合してペプチド鎖をＮ−末端に延ばす。これは中間体：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（ Ｍｏｂ）−Ｌｙｓ（２−ＣｌＺ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＩＡｍｐ（Ｚ ）−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｃｙｓ （Ｍｏｂ）−Ｏ−ＣＨ₂−樹脂支持体を作り出す。 樹脂からペプチドを分離し、側鎖保護基を除去するために、フッ化水素（ＨＦ ）（２５ｍｌ）中で、２ｍｌアニソールおよび２ｍｌジメチルスルフィッドの存 在下で室温で２０分間処理後、０℃で１．５時間処理する。高真空でフッ化水素 を除去した後、樹脂−ペプチドを無水ジエチルエーテルで洗う。 直ちにその樹脂を７５％酢酸（２００ｍｌ）で抽出する。抽出物を濾過して５ ００ｍｌ丸底フラスコに入れ、その後酸化し、強く撹拌することによってジスル フィッド環化結合を生成せしめる。その間メタノール中１０重量％ヨウ素溶液を 速やかに加え、生成した溶液がオレンジ色を保つまでにする。その後さらに１０ −２０分間撹拌し、１０％アスコルビン酸水溶液を黄色が消失するまで加える。 真空下で濃縮を行い、容量を約５０ｍｌにまで減らし、その後水で約３００ｍｌ に希釈する。その溶液を粗いフリット（coarse-fritted）の漏斗中の４ｃｍ×７ ｃｍのＣ₁₈シリカ パッド上に置いた。このパッドはあらかじめ０．１％トリフ ルオロ酢酸（ＴＦＡ）中５％ＣＨ₃ＣＮで平衡化させ てある。真空濾過後、溶出液を５００ｍｌに希釈し、再びそのパッドに置いた。 溶出液を集め、約８００ｍｌに希釈し、濾過を繰り返す。その後、パッドを０． １％ＴＦＡ中５％アセトニトリル約３００ｍｌで洗い、６０％ＣＨ₃ＣＮ水溶液 約２５０ｍｌを用いてペプチドを溶出する。生成した溶液を蒸留水で約５００ｍ ｌに希釈し、冷凍し、凍結乾燥する。 凍結乾燥した物質をＣ₁₈カラムで分析ＨＰＬＣにかけることによって精製する 。その後、ヘーガー（Hoeger）ら、Biochromatography ２巻、１３４−１４２ ページ（１９８７）に開示されている緩衝系を用いて個々に精製したピークの位 置を測定する。最後の分析的ＨＰＬＣは緩衝液Ｂ３０％から６０％までの勾配を 用いて３０分間行う；緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液であり、緩衝液Ｂは緩衝 液Ａ中６０％ＣＨ が所望の環状ペプチドとして得られる。それは毛細管ゾーン電気泳動法で純度９ ７％以上であることがわかる。 ＭＳ分析は、期待分子量１４３５．７Ｄａを示す。比旋光度： ［α］²² _D＝−１０．３°±１°（ｃ＝５０％酢酸中０．５） このペプチドを以後ペプチドＮｏ．２と呼ぶことにする。 実施例２Ａ 実施例２に記載した合成を１箇所だけ変えて反復する。Ｎ^αＢｏｃ−Ｎ⁴−Ｃ ＢＺ−（４−アミノメチル）フェニルアラニン、すなわちＢｏｃ−Ａｍｐ、を用 いて９−位の残基を作る。その後実施例２におけるように鎖をさらに延長し、切 断、保護基除去、環化および精製を実施例２のように行う。精製した環状ペプチ ドは：（シクロ １−１１） の式を有するこれをペプチドＮｏ．２Ａと呼ぶことにする。 実施例２Ｂ 実施例２Ａに記載されている最初の合成を１箇所だけ変えて反復する；Ｎ^αＢ ｏｃ−Ｎ⁴−Ｆｍｏｃ−（４−アミノメチル）フェニルアラニン、すなわちＢｏ ｃ−Ａｍｐ（Ｆｍｏｃ）を用いて９-位の残基を作る。その後実施例２Ａのよう に鎖をさらに延長し、Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｍｏｂ）による最後の結合を行う。 まだＮ−末端にあるＮ^αＢｏｃ基でＡｍｐの側鎖をアルキル化する。ＮＭＰま たはＤＭＦ（１０ｍｌ）中２０％ピペリジンで約１５分間処理することによって Ｆｍｏｃ保護基を選択的に除去する；その中間体をＮＭＰで洗い、その後さらに ピペリジン／ＮＭＰで１５分間洗うのが好ましい。ペプチド樹脂をＮＭＰで好適 に洗浄した後、新たに遊離したアミノメチル基をＮＭＰ＋ジイソプロピルエチル アミン中（ＭｅＯ−フェニル）２−ＣＨＣｌ（Ｄｏｄ−Ｃｌと呼ばれる）で１− ２時間処理する。洗浄後、ペプチド樹脂（約１−２ｇ）を３６％ホルムアルデヒ ド６ｍｌおよびＮＭＰ中１％酢酸１０ｍｌ＋シアノボロヒドリッド（ＮａＢＨ₃ ＣＮ）０．３５ｇで２０分間処理する；２０分間の終わりに、この処理をもう一 度繰り返す。この反応はアミノメチルＰｈｅ側鎖に１個のメチル基を付加する。 この反応の詳細はカルジャスト（Kaljuste）およびウンデン（Unden）、Int.J.P eputide Protein Res ． ４２巻、１１８−１２４ページ（１９９３）に記載され ている。一般的洗浄を行い、その後ＤＣＭ中６０％ＴＦＡで２０分間処理するこ とによってＤｏｄ−Ｃｌ保護基およびＮ−末端のＢｏｃ基を除去する。その後分 離、保護基除去、環化および精製を実施例２のように行う。精製した環状ペプチ ドは下記の式であらわされる： これをペプチドＮｏ．２Ｂと呼ぶことにする。 実施例２Ｃ 実施例２Ｂに記載した合成を１箇所だけ変えて反復する。保護されたアミノメ チル部分を３６％ホルムアルデヒドと反応させる代わりに、この反応を１％酢酸 −ＮＭＰ溶液中４０％アセトアルデヒドの溶液１５ｍｌ＋０．３５ｇｍシアノボ ロヒドリッドで行い、１回繰り返す。この結果、（ＭｅＯ−フェニル）₂−ＣＨ Ｃｌ（４−エチルアミノメチル）フェニルアラニンが９−位の残基として生成す る。ＢｏｃおよびＤｏｄ−Ｃｌ基の除去、分離、保護基除去、環化および精製を 実施例２Ｂのように行う。精製環状ペプチドは下記の式であらわされる：（シ これをペプチドＮｏ．２Ｃと呼ぶことにする。 実施例２Ｄ 実施例２Ｂに記載した合成を１箇所だけ変えて反復する。保護されたアミノメ チル部分を３６％ホルムアルデヒドと反応させる代わりに、反応を１％酢酸−Ｎ ＭＰ溶液中４０％イソブチルアルデヒドの溶液１５ｍｌ＋シアノボロヒドリッド ０．３５ｇｍと共に２０分間行い、１回繰り返す。この結果、（ＭｅＯ−フェニ ル）₂−ＣＨＣｌ（４−イソブチル アミノメチル）フェニルアラニンが９−位 の残基として生成する。ＢｏｃおよびＤｏｄ−Ｃｌ基の除去、分離、保護基除去 、環化および精製は実施例２Ｂのように行われる。精製した環状ペプチドは下記 の式であらわされる： これをペプチドＮｏ．２Ｄと呼ぶことにする。 ペプチドＮｏ．２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２ＤはＳＳＴＲ１に選択的に結合する 。 実施例３ 実施例２に記載の合成を１箇所だけ変えて反復する。Ｂｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐを８ −位の残基と呼ばれるものとして連結する代わりに、Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−２Ｎａｌ を用いる。その後実施例２に記載のようにして鎖をさらに延長する。 分離、保護基除去、環化および精製は実施例２のように行われる。アミノ酸分 析から、異なるアミノ酸の推定比率が判明する。精製した環状ペプチドは下記の 式であらわされる： これをペプチドＮｏ．３Ａと呼ぶことにする。 この合成を反復し、Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−２ＮａｌをＮ^αＢｏｃ−Ｄ−１Ｎａｌに 置き換えると下記の式であらわされる、ペプチドＮｏ．３Ｂと呼ばれる精製環状 ペプチドが得られる： 両ペプチドＮｏ．３Ａおよび３ＢはヒトＳＳＴＲ１に選択的に結合する。 実施例４ 実施例２に記載した合成を１箇所だけ変えて繰り返す。１３-位残基と呼ばれ るものとしてＢｏｃ−Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を連結する代わりに、ＮαＢｏｃ−Ｄ− Ｓｅｒ（Ｂｚｌ）を用いる。その後鎖の延長を実施例２のように行う。 分離、保護基除去、環化および精製を実施例２のように行う。ＨＰＬＣおよび ＣＺＥの結果から、そのペプチドが純度９７％以上であることがわかる。比旋光 度は、［α］²² _D＝＋２０．０°±１°（ｃ＝５０％酢酸中０．５）である。 アミノ酸分析は、異なるアミノ酸の推定比率を示す。ＭＳ分析は、 推定分子量１４８５．７Ｄａを示す。精製した環状ペプチドは下記の式であらわ される： ＯＨ これをペプチドＮｏ．４と呼ぶことにする。 実施例５ 実施例２に記載された合成を１箇所だけ変えて繰り返す。１つの残基による鎖 延長は、Ｎ−末端にＮ^αＢｏｃ−Ｔｙｒ（２ＢｒＺ）を結合することによって行 われる。 分離、保護基除去、環化および精製を実施例２のように行う。比旋光度は ［α］²² _D＝−９．６°±１°（ｃ＝５０％酢酸中０．５） である。アミノ酸分析の結果から異なるアミノ酸の推定比率がわかる。ＭＳ分析 は推定分子量１６４８．７Ｄａを示す。精製した環状ペプチドは下記の式であら わされる： これをペプチドＮｏ．５と呼ぶことにする。 実施例６ 実施例２に記載した合成を１箇所だけ変えて繰り返す。８-位残基と呼ばれる ものとしてＢｏｃ−Ｄ−Ｔｒｐを結合する代わりに、Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−３−Ｐａ ｌを用いる。その後、鎖の延長を実施例２に記載のように行う。 分離、保護基除去、環化および精製を実施例２のように行う。精製した環状ペ プチドは下記の式であらわされる： これをペプチドＮｏ．６Ａと呼ぶことにする。 上の合成をその後２２回繰り返す、各回に８-位の異なるアミノ酸を次のよう に置換する： Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−５ＣｌＴｒｐ Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−６ＦＴｒｐ Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−５ＮＯ₂Ｔｒｐ Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−６ＢｒＴｒｐ Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ−ＮⁱⁿＦｏｒＴｒｐ Ｎ^αＢｏｃ−３−（９−フルオレニル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（１−アダマンチル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（４−ビフェニリル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（２−アントリル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（２，４，６−トリエチルフェニル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（９−アントリル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（２−フルオレニル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（１−アントリル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ，Ｌ−Ｍｅ５−Ｐｈｅ； Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ，Ｌ−ＴＭＰ； Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ，Ｌ−ＢＩＡ； Ｎ^αＢｏｃ−Ｄ，Ｌ−ＴＢＡ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（３−フェナントリル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（２，４，６−トリメチルシクロヘキシル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌ ａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（ペルヒドロ−４−ビフェニリル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； Ｎ^αＢｏｃ−３−（１−ペルヒドロナフチル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； および Ｎ^αＢｏｃ−３−（２、２−ジフェニルメチル）−Ｄ，Ｌ−Ａｌａ； 生成したＳＲＩＦ同族体はペプチド６Ｂ〜６Ｗと呼ぶ。 ペプチド６Ａ−６ＷはＳＳＴＲ１に選択的に結合する。 実施例７ 下記構造： （シクロ）Ｈ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ａｇｌ（インドールカルボキシルル）−ＩＡ ｍｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−ＯＨを有するベタイド（ｂｅ ｔｉｄｅ）ソマトスタチン同族体ｄｅｓ−ＡＡ^1,2,5［Ａｇｌ（インドールカル ボキシル）⁸、ＩＡｍｐ⁹］−ＳＲＩＦを実施例２に記載した次のような固相法に よってクロロメチル化樹脂を用いて合成する。 各アミノ酸のＢｏｃ誘導体を用いる。第１の残基、すなわちＢｏｃ−Ｃｙｓ（ Ｍｏｂ）の保護基を除去した後、実施例２に示すスケジュールによって、Ｓｅｒ のＮ^αＢｏｃ誘導体を結合剤、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と共 に加える；Ｓｅｒの側鎖はＯ−ベンジルエーテル（Ｂｚｌ）で保護されている。 次にＴｈｒ（Ｂｚｌ）のＮ^αＢｏｃ誘導体をＤＣＣと共に加える。Ｎ^αＢｏｃ− Ｐｈｅを、次にＮ^αＢｏｃ−Ｔｈｒ（Ｂｚｌ）を結合させた後、Ｎ^αＢｏｃ−４ −イソプロピルアミノＰｈｅ（Ｚ）を同様に結合する。 その後Ｂｏｃ−Ｄ／Ｌ−Ａｇｌ（Ｆｍｏｃ）を８−位に結合し、その後Ｎ^αＢ ｏｃ−Ｐｈｅの２残基を結合する。ベンジルオキシカルボニル−２Ｃｌ、すなわ ち２ＣｌＺ、をＳＲＩＦの４−位のＬｙｓ側鎖の保護基として用いる。最後の保 護されたＣｙｓを結合してペプチド鎖をＮ−末端まで延ばす。まだＮ−末端にあ るＮ^αＢｏｃ基でＡｇｌの側鎖を変形する。Ｆｍｏｃ保護基は２０％ピペリジン −ＮＭＰまたはＤＭＦ溶液（１０ｍｌ）で約１５分間処理することによって選択 的に除 去される；中間体は好適にはＤＭＦで洗い、その後ピペリジン／ＤＭＦでさらに １５分間処理する。ペプチド樹脂をＤＭＦで好適に洗った後、新たに遊離したア ミノ基を、適した結合剤、例えばＴＢＴＵまたはＨＢＴＵまたはＢＯＰなどを用 いてインドール−３−カルボン酸と約１０時間反応させる。 樹脂からのベタイド（ｂｅｔｉｄｅ）の分離およびベタイド（ｂｅｔｉｄｅ） の側鎖保護基の除去はフッ化水素酸（ＨＦ）（２５ｍｌ）中で、アニソール２ｍ ｌおよびジメチルスルフィッド２ｍｌの存在下で０℃で１．５時間、周囲温度で ２０分間行われる。高真空下でＨＦを除去した後、樹脂−ベタイド（ｂｅｔｉｄ ｅ）を無水ジエチルエーテルで洗う。 その後、実施例２に一般的に記載したように、樹脂を抽出し、環化し、凍結乾 燥する。凍結乾燥した材料をその後Ｃ₁₈カラム上で分析ＨＰＬＣにかけて精製す る。ピークの位置を決め、その後同じ緩衝系を用いてそれらを個々に精製する。 最終的分析ＨＰＬＣは緩衝液Ｂ３０％から６０％の勾配を用いて３０分間にわた って行う。緩衝液Ａは０．１％ＴＦＡ水溶液で、緩衝液Ｂは緩衝液Ａ中６０％Ｃ Ｈ₃ＣＮである。所望の環状ベタイド（ｂｅｔｉｄｅ）である、（シクロ １− １ ＯＨが２つの分離したジアステレオマーの形で得られる。これらは毛細管ゾーン 電気泳動法で純度９７％以上であることがわかる。これら環状ベタイド（ｂｅｔ ｉｄｅ）は両方共ＳＳＴＲＩに結合する。 実施例８ 概して実施例に記載したように合成を行い、下記構造： （シクロ）Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−ＩＡｍｐ−Ｔｈｒ−Ｐｈ ｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ を有する［ＩＡｍｐ⁵］−ＯＤＴ８を合成する。 分離、保護基除去、環化および精製を実施例２に記載のように行う。ＨＰＬＣ およびＣＺＥはこのペプチドを純度９７％以上であることを示す。比旋光度は ［α］²² _D＝−３５°± １°（ｃ＝５０％酢酸中０．５）である。アミノ酸分 析は、異なるアミノ酸の推定比率を示す。 実施例９ 実施例２に記載した合成を、１箇所だけ変えて反復する。鎖にＢｏｃ−Ｌｙｓ （２ＣｌＺ）を連結する前に、ＢｏｃＡｓｎ（Ｘａｎ）を５-位残基として連結 する。実施例２に記載のようにさらに鎖を延長する。 分離、保護基除去、環化および精製を実施例２に記載のように行う。アミノ酸 分析は、異なるアミノ酸の推定比率を示す。精製した環状ペプチドは下記の式を 有する： −ＯＨ これをペプチドＮｏ．９と呼ぶことにする。 Ｎ−末端ではＮ^αＢｏｃ−ＧｌｙおよびＮ^αＢｏｃ−Ａｌａを加えて合成を反 復すると下記の精製環状ペプチドが得られ、これをペプチド９Ａとする：（シク ロ ３−１４）Ｈ−Ａｌａ−Ｇｌｙ− ｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］ＳＲＩＦである。 Ｎｏ．９および９Ａは両方共ヒトＳＳＴＲ１に選択的に結合する。 In vitroバイオアッセイ（生物学的検定）：種々のソマトスタチン同族体の効 果について、ＣＯＳおよびＣＨＯ細胞に発現した単離クローン化受容体にそれら が結合する能力をin vitroで試験した。 複数のソマトスタチン受容体サブタイプをコードしている遺伝子の 分子クローニングは、哺乳動物細胞におけるこれら受容体の発現およびそれらそ れぞれの薬物学的プロフィールの特徴づけを可能にする。そのような５種類の受 容体サブタイプ、ＳＳＴＲ１からＳＳＴＲ５まで、がこれまでにクローン化され た。そしてレイノーら、Molecular Pharmacology ４３巻、８３８−８４４ペー ジ（１９９３）およびレイノーら、Molecular Pharmacology ４４巻、３８５− ３９２ページ（１９９３）に報告され、説明されている。これらの文献は、特定 のＳＲＩＦ同族体が５種類の受容体型の１つ以上に選択的に結合するかどうか、 そしてそれらがそのような受容体に高親和性または低親和性で結合するかどうか を決定するために用いることができる結合−アッセイを記載している。これらの 受容体型は今ではそれらの薬物学的プロフィールに関して特徴づけられているか ら、このような結合研究の結果の知識並びにこれらの受容体の体内における特殊 な分布状態の知識は、各受容体サブタイプがＳＲＩＦの異なる、だが重複する生 理的効果を仲介することを示唆する；そのため、例えば受容体ＳＳＴＲ１に選択 的に結合する化合物を用いて、ＳＲＩＦの特定の生理的機能を、多分ＳＲＩＦの その他の生理的機能（この機能は他のＳＲＩＦ受容体によって仲介される）に起 因する不都合な効果をあらわすことなく、調節することができる。 ペプチドＮｏ．２のＳＲＩＦ受容体に結合する選択性を試験するために、この ペプチドの、［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦと５種類のクローン化ＳＲＩＦ受容 体との結合を阻止する能力を最初に試験した。これまでの研究は、［¹²⁵Ｉ−Ｔ ｙｒ¹¹］ＳＲＩＦが５種類すべてのクローン化ＳＲＩＦ受容体に同様な親和性で 結合することを示した。１μＭの濃度で、ペプチドＮｏ．２は、［¹²⁵Ｉ−Ｔｙ ｒ¹¹］ＳＲＩＦとマウスＳＳＴＲ２およびＳＳＴＲ３との結合、ヒトＳＳＴＲ４ との結合、およびラットおよびヒトＳＳＴＲ５との結合には最小の影響を示した 。対照的に、それは［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦのヒトＳＳＴＲ１との結合を 置換し、そのＩＣ₅₀値は１．８±０．７ｎＭであった。同様に、 Ｄ−Ｓｅｒ¹³変形を含むペプチドＮｏ．４はＳＳＴＲ１に選択的に結合し、ペプ チドＮｏ．５、チロシン同族体もＳＳＴＲ１と選択的に作用し合う。 ペプチドＮｏ．５のヨウ素化同族体が選択的ＳＳＴＲ１放射性リガンドとして 役立つかどうかを研究するために、そのペプチドをヨウ素化し、５種類のクロー ン化ＳＲＩＦ受容体との結合を試験した。ペプチドＮｏ．５とＳＳＴＲ２−５の 特異的結合は認められなかった。それに対してペプチドＮｏ．５はＳＳＴＲ１に は効果的に結合し、その程度は［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦと大体同じであっ た。 ペプチドＮｏ．５とＳＳＴＲ１との結合は３０分までに平衡に達した。その結 合はＫ_d０．５±０．１、およびＢ_max２２６±５６ｆｍｏｌ／ｍｇ蛋白質で、飽 和可能であった。ＳＲＩＦ、［Ｄ−Ｔｒｐ⁸］ＳＲＩＦおよびＳＲＩＦ−２８は すべてペプチドＮｏ．５とＳＳＴＲ１との結合を、それぞれ０．８±０．４、０ ．２±０．１ｎＭおよび０．７±０．２ｎＭのＩＣ₅₀で、強力に阻止した。ＳＲ ＩＦ同族体ペプチドＮｏ．４もＳＳＴＲ１に強力に結合する。そしてＩＣ₅₀値は 、ヨウ素化ペプチドＮｏ．５の結合を阻止する能力に基づき、５．３±０．８ｎ Ｍである。 ＣＯＳ−０７細胞に発現するＳＳＴＲ１に関するこれまでの研究は、［¹²⁵Ｉ −Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦとＳＳＴＲ１との結合が、ＦＴＰｇＳ前処理によっても百 日咳毒素前処理によっても顕著な影響を受けないことを示した。これはこの受容 体がＧ蛋白質には効果的に結合しないことを示唆する。同様に、ＧＴＰｇＳおよ び百日咳毒素処理は［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦとクローン化ＳＳＴＲ１との 結合を減少させなかった。しかしＧＴＰｇＳはペプチドＮｏ．５とＳＳＴＲ１と の結合を濃度依存的に顕著に減少させた。一晩の百日咳毒素処理はＧＴＰｇＳの 効果を減少させた。すなわち、ＧＴＰｇＳはもはや百日咳毒素前処理ＳＳＴＲ１ への結合に著しい影響を与えることはできなかった。これらの研究結果は、ＳＳ ＴＲ１が百日咳毒素感受性Ｇ蛋白質に結合で きること、そしてＳＲＩＦと受容体との結合対本発明の１ペプチドの結合では、 ＳＲＩＦ受容体とＧ蛋白質との結合に差があることを示唆している。 ペプチドＮｏ．５の結合はＧＴＰによって調節されるので、そのペプチドの、 ＳＳＴＲ１を発現するＣＯＳ−７細胞におけるｃＡＭＰ蓄積を調節する能力を試 験した。１μＭのペプチドＮｏ．２もＳＲＩＦそれ自体もＳＳＴＲ１を発現する ＣＯＳ−７細胞におけるフォルスコリン刺激ｃＡＭＰ生成を阻止しない。そのた め、ペプチドＮｏ．２はＳＳＴＲ１と百日咳毒素Ｇ蛋白質との見かけ上の結合を 生成することはできるが、ＣＯＳ−７細胞におけるアデニリルシクラーゼ活性を 調節するようには見えない。 組換え宿主から直接得た受容体ポリペプチドを用いる当業者には公知のスクリ ーニング試験を用いて、ソマトスタチンの好都合な幾つかの面はそっくり模し、 一方その他の受容体の活性化から生ずるこのホルモンの不都合な幾つかの面は排 除するために有用な作用物質を確認することができる。 先行技術の化合物ＯＤＴ８、（シクロ １−８）Ｈ−Ｃｙｓ− Ｐｈｅ−Ｐｈ ｅ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＯＨ、を含む幾つかのＳＲ ＩＦ同族体の、［¹²⁵Ｉ−Ｔｙｒ¹¹］ＳＲＩＦと種々のクローン化マウスＳＲＩ Ｆ受容体との放射性リガンド結合を阻止する効力を、ＳＲＩＦおよびＳＲＩＦ− ２８と比較して下表に示す；この表ではＩＣ₅₀値はナノメーター濃度で与えられ る。付加的測定は現在実施中である。 本発明のペプチド類はＳＳＴＲ１により選択的に結合するリガンドを提供する のみならず、例えば¹²⁵Ｉで標識した放射性ペプチドＮｏ．５を使用すればより 効果的アゴニストのための薬剤スクリーニングが容易にもなる。候補化合物との 競合的結合試験を先ず最初にこの方法でＳＳＴＲ１に対して行い、高結合親和性 を探査する；それから複数のＳＲＩＦ受容体をスクリーニングすることによって 、所望のようにこの受容体にのみ選択的に結合するかどうかを確認することがで きる。 薬物学的または獣医学的に容認される担体と組み合わせて薬物学的組成物を形 成するこれらのＳＲＩＦ同族体またはそれらの無毒性塩は、ヒトおよびその他の 哺乳動物を含める動物に静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、例えば鼻内など、髄腔 内または経口的に投与することができる。そのペプチドは最低９０％の純度でな ければならない、そして最低約９８％の純度を有することが好ましい；しかしよ り低い純度でも有効で、ヒト以外の哺乳動物には使用してもよい。この純度は、 意図するペプチドに、すべての類似のペプチド類およびペプチド断片が上記重量 ％だけ存在することを意味する。ヒトへの投与は、医師の指示のもとで、特殊の 腫瘍および癌を克服するように行われ、またはＳＳＴＲ１受容体がコントロール 機能をあらわすような―例えばチロシンホスファターゼに結合してこの酵素の刺 激がＳＲＩＦの抗増殖効果を仲介する―その他の諸条件を仲介するように行われ る。必要な投与量は治療すべき特殊の状態、その状態の重症度および所望治療の 持続期間によって変り得る。 このようなペプチド類は薬物学的または獣医学的に容認される無毒性塩の形で 投与されることが多い：例えば酸付加塩類、または例えば亜鉛、鉄、カルシウム 、バリウム、マグネシウム、アルミニウムなどとの金属錯塩。このような無毒性 塩の例は、塩酸塩、臭酸塩、硫酸塩、燐酸塩、タンニン酸塩、蓚酸塩、フマール 酸塩、グルコン酸塩、アルギン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息 香酸塩、琥珀酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。活性 成分が錠剤型で投与される場合は、その錠剤は結合剤、例えばトラガント、コー ンスターチまたはゼラチンなど；崩壊剤、例えばアルギン酸；滑剤、例えばステ アリン酸マグネシウムなどを含むことができる。液体型で投与したい場合には、 甘味料および／または芳香剤を使用してもよい。等張食塩液、燐酸緩衝溶液など に溶解して静脈内投与も行われる。 これらのＳＲＩＦ同族体を１回の投与によって長期間、例えば１週間から１年 までの期間にわたって供給することも望まれる。当業者には公知のように徐放性 製剤、デポ型製剤またはインプラント投与型が用いられる。例えば、或る投与型 は体液への溶解度が低い化合物の薬物学的に容認される無毒性塩、例えば多塩基 性酸との酸付加塩；多価金属カチオンとの塩；または２つの塩の組み合わせなど 、を含む。比較的不溶性の塩はゲルとして処方することもできる：例えばステア リン酸アルミニウムゲルなど。適した注射用徐放性デポ型製剤もＳＲＩＦ同族体 またはそれらの塩を、徐々に分解する無毒性または非抗原性ポリマー、例えば米 国特許第３，７７３，９１９号に記載されているようなポリ乳酸／ポリグリコー ル酸ポリマーなどに分散またはカプセル化して含むことができる。 治療的有効量のペプチドを医師の指示のもとに投与する必要があるが、薬物学 的組成物は普通、そのペプチドを一般的な薬物学的または獣医学的に容認される 担体と共に含む。治療的有効量は、所望の効果を得るように計算したあらかじめ 定められた量であると考えられる。必要な投与量は特殊の治療並びに所望治療の 継続期間によって変化する；しかし、体重１ｋｇあたり約１０マイクログラムな いし約１マイクログラムの用量を治療に用いることが期待される。このような化 合物を前に述べたようにデポ型または長期持続性型で投与するのが特に好都合で ある。治療的有効量とは、生理的に容認される組成物として末梢、例えば静脈内 に投与したとき、ＳＲＩＦ同族体の血中濃度が約０．１μｇないし約１００μｇ ／ｍｌ、好適には約１μｇないし約５０ μｇ／ｍｌ、より好適には最低約２μｇ、普通は５ないし１０μｇに達するのに 十分なＳＲＩＦ同族体量である。 本発明を、発明者が現在知り得る最適方法である本発明の好適実施態様に関し て説明したが、本分野の熟練せる当業者には明白なように、ここに添付せる請求 の範囲に示される本発明の範囲から逸脱することなく種々の変化および変更が行 われ得ることは明らかである。クレイムは本発明をペプチド配列に関して種々に 定義しているとはいえ、そのようなものには、それらの等価物であることが公知 で、最もしばしば投与される、それらの無毒性塩を含めることは理解される。Ｃ −末端の簡単な遊離酸の代わりに、ペプチド技術では公知のように、低級アルキ ルエステルを挿入してもよい。ここに詳細に示されるＳＲＩＦ同族体の配列にほ ぼ一致するアミノ酸残基配列を有する環状ペプチド（そのなかで１つ以上の残基 は機能的に類似のアミノ酸残基によって保存的に置換されている）は、それらが ＳＳＴＲ１に選択的に結合する限り、等価であると考えられる。 前に示したように、これらの詳細に述べられた変形をこれまでに開示されたＳ ＲＩＦ同族体に挿入してＳＳＴＲ１−選択性を作り出すことができる。５−位の 残基の挿入は任意的であるが、好ましくない、なぜならば選択性は残っていると はいえ概して結合親和性を減ずるからである。同様に、１−および２−位の残基 の挿入は任意的であるが、ＴｙｒまたはＤ−Ｔｙｒを除くと、それだけの価値が あるとは考えられない。広義には、当業者にはＳＲＩＦ生物学的活性を有するこ とが公知の既存のＳＲＩＦ同族体のアミノ酸配列を変えることによって、ＳＲＩ Ｆ受容体ＳＳＴＲ１に特異的親和性を有する環状ソマトスタチン同族体ペプチド を作ることができると考えられる。変形ペプチドは少なくとも８残基の長さのア ミノ酸配列を有し、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィッド結合を含み、環としての上記 Ｃｙｓ残基間には少なくとも６残基の配列があり、少なくとも６残基配列からな るこのような配列の中心に、好適にはＮ末端にあるまたはＮ末端近くのＣｙｓ残 基から ２または３残基だけ離れた、Ｄ−Ｔｒｐまたはその同等物を含む；この同族体ペ プチドは、上記Ｄ−ＴｒｐにＣ末端側に直接結合する（Ｃ）Ａｍｐが存在するこ とによって特徴づけられ、ＣはＨまたは低級アルキルである。開示された環状Ｓ ＲＩＦ同族体は１つ（または２つ）の残基上のαアミノ基、好適にはＳＲＩＦの ７−１０-位のアミノ基のＮ−メチル化によって改質することもできる；例えば ｄｅｓ−ＡＡ^1,2,5［Ｎ^αＣＨ₃−Ｔｒｐ⁸、ＩＡｍｐ⁹］−ＳＲＩＦ。生成したＳ ＲＩＦ同族体はＳＳＴＲ１に対するそれらの特異性を保有し、場合によってはよ り大きい結合親和性を有する。このようなペプチド類およびそれらの塩類は請求 せる発明の範囲内であると考えられる。 ここまでに示されたすべての特許および出版物の開示はここに明らかに参照さ れている。ここで用いられるすべての温度は℃で、すべての比率は容量比である 。液体材料のパーセントも容量である。 本発明の種々の特徴が以下の請求の範囲において強調されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１０月２日 【補正内容】 原文明細書第３９頁の差し替え頁の翻訳文 １８． アミノ酸配列： 特徴とする環状ソマトスタチン（ＳＲＩＦ）同族体ペプチド。 １９． Ｔｙｒがヨウ素化されていることを特徴とする請求項１８に記載のペプ チド。 ２０． 最低８残基の長さのアミノ酸配列を有する環状ソマトスタチン（ＳＲＩ Ｆ）同族体ペプチドにおいて、Ｃｙｓ残基の間に位置する最低６残基の配列を環 として含むＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィッド結合を含み、前記最低６−残基配列の 中心にＤ−Ｔｒｐまたはその同等物を含み、前記Ｄ−ＴｒｐにＣ−末端側に直に Ｌｙｓまたはその他の不飽和α−アミノ酸を含むときには高い親和性をもってＳ ＲＩＦ受容体ＳＳＴＲ１に結合する前記ペプチドにおいて、 前記Ｄ−ＴｒｐにＣ末端側に直接結合する（Ｃ）Ａｍｐの置換を含んでなり、 ここでＣはＨまたは低級アルキルであり、その置換の結果として前記ペプチドが ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４およびＳＳＴＲ５に対するその親和性とは 異なり、ＳＳＴＲ１に対して特異的親和性をあらわすことを特徴とする改良され たペプチド。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． アミノ酸配列（シクロ ３−１４）Ｘａａ₁−Ｘａａ₂− ｓ−ＸａａまたはＡｌａ；Ｘａａ₂はＴｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒまたはｄｅｓ−Ｘａａ またはＧｌｙ；Ｘａａ₅はｄｅｓ−ＸａａまたはＡｓｎ；Ｄ−Ｘａａ₈は芳香族Ｄ −アミノ酸；Ｘａａ₉は（Ｃ）アミノメチルＰｈｅで、ＣはＨまたは低級アルキ ル；そしてＸａａ₁₃はＳｅｒまたはＤ−Ｓｅｒである）を有することを特徴とす るＳＲＩＦ受容体ＳＳＴＲ１に特異的親和性を有する環状ソマトスタチン（ＳＲ ＩＦ）同族体ペプチド。 ２． Ｘａａ₈が（Ａ）Ｄ−Ｔｒｐ、（Ｂ）Ｄ−Ａｌａ、または（Ｂ）Ｄ、Ｌ− Ａｌａであって、ＡがＨ、Ｃｌ、Ｆ、Ｂｒ、ＮＯ₂またはホルミルであり、Ｂが ナフチル、フルオレニル、アダマンチル、アントリル、ビフェニル、トリ（低級 アルキル）フェニル、ペンタメチルフェニル、フェナントリル、トリアルキルシ クロヘキシル、ペルヒドロナフチルまたはペルヒドロビフェニルであることを特 徴とする請求項１に記載のペプチド。 ３． Ｘａａ₁、Ｘａａ₂およびＸａａ₅がｄｅｓ−Ｘａａであり、Ｃがメチル、 エチル、イソプロピル、またはイソブチルであることを特徴とする請求項２に記 載のペプチド。 ４． Ｘａａ₉が（イソプロピルアミノメチル）Ｐｈｅ、すなわちＩＡｍｐであ ることを特徴とする請求項２に記載のペプチド。 ５． Ｘａａ₁₃がＤ−Ｓｅｒであることを特徴とする請求項４に記載のペプチド 。 ６． Ｘａａ₂がＴｙｒまたはＤ−Ｔｙｒであることを特徴とする請求項４に記 載のペプチド。 ７． Ｄ−Ｘａａ₈が（Ａ）Ｔｒｐで、ＡがＨまたはＦであることを特徴とする 請求項４に記載のペプチド。 ８． Ｄ−Ｘａａ₈が（Ｂ）Ｄ−Ａｌａまたは（Ｂ）Ｄ、Ｌ−Ａｌａであり、Ｂ が３−（１−ナフチル）であることを特徴とする請求項４に記載のペプチド。 ９． Ｄ−Ｘａａ₈が（Ｂ）Ｄ−Ａｌａまたは（Ｂ）Ｄ、Ｌ−Ａｌａであり、Ｂ が３−（９−フルオレニル）であることを特徴とする請求項４に記載のペプチド 。 １０． Ｄ−Ｘａａ₈が（Ｂ）Ｄ−Ａｌａまたは（Ｂ）Ｄ、Ｌ−Ａｌａであり、 Ｂが３−（１−アダマンチル）であることを特徴とする請求項４に記載のペプチ ド。 １１． Ｄ−Ｘａａ₈が（Ｂ）Ｄ−Ａｌａまたは（Ｂ）Ｄ、Ｌ−Ａｌａであり、 Ｂが３−（４−ビフェニル）であることを特徴とする請求項４に記載のペプチド 。 １２． Ｄ−Ｘａａ₈が（Ｂ）Ｄ−Ａｌａまたは（Ｂ）Ｄ、Ｌ−Ａｌａであり、 Ｂが３−（２−アントリル）であることを特徴とする請求項４に記載のペプチド 。 １３． Ｄ−Ｘａａ₈が（Ｂ）Ｄ−Ａｌａまたは（Ｂ）Ｄ、Ｌ−Ａｌａで、Ｂが ３−（２、４、６−トリメチルフェニル）であることを特徴とする請求項４に記 載のペプチド。 を有し、ここでＸａａ₁₃がＳｅｒまたはＤ−Ｓｅｒであることを特徴とする請求 項１に記載のペプチド。 １５． 請求項１に記載のペプチドと最低１つの薬物学的に容認される担体との 混合物を含むことを特徴とする薬物学的組成物。 １６． 請求項１５に記載の組成物の有効量を投与することを含んでなり、前記 量はＳＳＴＲ１受容体を有する腫瘍の増殖を少なくとも遅らせるのに有効な量で あることを特徴とする患者における腫瘍の成長を抑制する方法。 １７． ＳＳＴＲ１、請求項１に記載の標識化ペプチドおよび候補リガンドとの 競合的結合試験を実施し、前記候補リガンドの前記標識ペプチドを置換する能力 を測定することを含むことを特徴とする高親和性でＳＳＴＲ１に結合するリガン ドをスクリーニングする方法。 １８． アミノ酸配列： 特徴とする環状ソマトスタチン（ＳＲＩＦ）同族体ペプチド。 １９． Ｔｙｒがヨウ素化されていることを特徴とする請求項１８に記載のペプ チド。 ２０． 最低８残基の長さのアミノ酸配列を有し、Ｃｙｓ−Ｃｙｓジスルフィッ ド結合を含み、環状である前記Ｃｙｓ間には最低６残基が位置し、前記最低６残 基配列の中心にはＤ−Ｔｒｐまたはその同等物を含み、この同族体ペプチドは前 記Ｄ−ＴｒｐにＣ末端側に直接結合した（Ｃ）Ａｍｐの存在によって特徴づけら れ、ここでＣはＨまたは低級アルキルであることを特徴とするＳＲＩＦ受容体Ｓ ＳＴＲ１に特異的親和性を有する環状ソマトスタチン（ＳＲＩＦ）同族体ペプチ ド。