JPH11514743A

JPH11514743A - 高速液体クロマトグラフィー方法及び装置

Info

Publication number: JPH11514743A
Application number: JP9517502A
Authority: JP
Inventors: クイン，フバート，エム．; タカリュウスキ，ジョセフ，ジェー．，ジュニア
Original assignee: コヒースィヴテクノロジーズ，インク．
Priority date: 1995-11-02
Filing date: 1996-11-01
Publication date: 1999-12-14
Anticipated expiration: 2016-11-01
Also published as: WO1997016724A2; TW518246B; CA2236712C; ES2130857T3; JP3354155B2; AU706707B2; US5772874A; NZ322280A; DE69601722D1; DK0838032T3; WO1997016724A3; US5919368A; EP0838032B1; EP0838032A2; ATE177531T1; DE69601722T2; AU7599596A; CA2236712A1; PL326484A1

Abstract

(57)【要約】改良された速度および量で分析および調製を行う液体クロマトグラフィーの方法および装置であって、カラムを通過する流体の速度はその流体に乱流を生起するのに十分な速度となっている。一の態様においては、当該装置および方法は、約３０μｍ以上の粒径を有し、その表面がクロマトグラフ活性である、多数の剛性固体多孔質粒子を充填することによって得られる、ほぼ均一なクロマトグラフィーカラムを含む。粒子表面と反応する少なくとも１種の溶質を含む流体混合物をカラムに注入し、次いで溶離液を流すことによりカラムから溶離する。注入および溶離はいずれも、粒子間間隙の少なくとも実質的部分において約５０００以上の換算速度で流れを生起するのに十分な速度で行う。

Description

【発明の詳細な説明】高速液体クロマトグラフィー方法及び装置この発明は広くクロマトグラフィーに関し、より特別には改良高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を行うための方法及び手順に関する。発明の背景高速液体クロマトグラフィーによる分離の有用性は、低分子量から高分子量に及ぶ分子の分析及び精製を含む広範囲の適用にわたって実際に示されている。液体クロマトグラフィーにおいては、ガスクロマトグラフィーにおけると同様に、分析に要する時間に由来する大きな制限がある。これらの制限を十分に理解するには、これらの分離方法が基づいている理論的根拠についての簡単な説明が有用であるかもしれない。その分離方法は、固定相として知られる粒子の充填床を通してろ過される液体の流れ中の多数の溶質分子を互いに効率よく分離することが出来るという事実に依っている。個々の試料成分は、各成分が固定相に対して異なる親和性を有し、各成分が異なる移行速度及びカラムから出てくる異なる流出時間を生じるために、分離される。分離効率は、床又はカラムを通過するときの溶質バンドの展開の量によって決定される。そのような分離の理論的背景は、いわゆる“クレイグ機（Craig machine）” （調製用非線形クロマトグラフィーの基礎、アカデミックプレス（１９９４）(F undamental of Preparation and Non-Linear Chromatography,Academic Press) の１７４頁にグイチョン（Guichon）等によって記載されている）に関連して生じたが、そこでは、分離は、複数の結合された、等しい、別々の、仮想の段階において行われ、その各体積は固定相及び移動相の両方を含み、その各々において完全な平衡が成立している、と考えることが出来る。そのような各段階は“理論” 段と呼ばれる。計算理論段当たりのカラムの長さは“理論段相当高さ”またはＨと呼ばれ、バンド幅の広がりの尺度である。クロマトグラフィーにおいては、１つの相は固定されており、他の相は比較的速い速度で最初の相を通過して移動するので、事実上、２つの相の間で完全な平衡は達成されない。そして、当然、明瞭な段は観察されない。それでもなお、段理論は、一般的にクロマトグラフィーを通しての溶質の通過を説明し、多数の速度ファクターによるバンド幅の広がりを明らかにするために使用されている。クロマトグラフィーのカラムへ段理論を適用する場合に仮定しなければならないことは、すべての溶質はまず、カラムの最初の段容積中に存在し、分配係数は出会う溶質濃度に対して一定であり、そして溶質はそれ自体、各段容積中の２つの相の間ですばやく分配する、ということである。個々の試料のバンド幅の最小の広がりを与えるカラムは分取モダンＨＰＬＣシステムの特別重要なものであるので、カラムに入れられる充填物の性質及びカラムを充填する方法のすべてが回収されるべき溶質と関連して非常に重要である。従って、カラム性能に対して結果的に有害な影響を有する相対的なバンド幅の広がりを決定する種々のプロセスは最小限にするのが望ましい。カラム段高さＨに対するこれらのプロセスの各々の影響は、移動相速度ｕ、充填物粒径ｄ_p、及び移動相中の溶質拡散係数のような実験的変数に速度理論によって関連付けられると考えられる。理論段相当高さＨに寄与するＨＰＬＣのバンド幅を広げる主なプロセスは一般的に：（３）縦拡散ｂＤ／ｕ＝Ｂ／ｕ、及び（４）停滞移動相物質移動ｃｄ_p ²ｕ＝Ｃｕ（上記式中、ａ_e、ａ_m、ｂ及びＣは段高さ係数であり；ｎは分数指数であり；Ａ、Ｂ及びＣは一定のカラムについての定数であり；及びＤは移動相中の溶質の拡散係数である）と考えられている。これらの種々な寄与を与えると、バンド幅の広がりを記述するヴァンデームター（Van Deemter）式として周知の古典的な式が与えられ、それは下記の通り簡単な形で記述される。（式１）Ｈ＝Ａｕ^a＋Ｂ／ｕ＋Ｃｕ典型的なＨ対ｕ（ｃｍ／秒）のプロットは図１に示す通りである。図１において、Ａ領域はカラム充填物に特有の渦拡散項を表わす。即ち、カラムを通しての流れには粒子間に様々な長さの曲がりくねった流路が見い出される。このとき、分子はカラムを横切りながら異なる距離を進むことができ、バンド幅の広がりを生じそして分離効率を与える。カラムを通しての流れのプロファイルは一定のままであると仮定すると、Ａ項もまた、カラムを通しての流体の流れの線速度のすべての値に対して一定のままになると推測される。図１のＢ領域はカラムを通しての流体の線速度の関数であり、その速度の値が低い場合には明らかにより顕著であり、速度が高い場合には溶質分子の軸方向分子拡散のプロセスによるバンド幅の広がりに寄与するファクターとしては無視できる。そのような分子拡散は濃度勾配によって駆動され、従って、バンド幅の広がりへの相対的な寄与は、カラム中の時間の長さが短くなるにつれて、少なくなる。図１のＣ領域は、Ｂの反対の意味で変化する。すなわち、Ｈへの寄与は、流量の増加と共に増加する。溶質分子がより速く流れるにつれて、分離効率は、粒子の細孔内あるいは細孔外へ拡散する試料の成分の能力によって限定されるようになる。従って、Ｃ項は、この拡散で駆動されるプロセスの物質移動の限定を表す。この理由で、図１によって例示されたクロマトグラフィーのプロセスは時間的に限定された分析の境界を持っている。従って、従来の理論の具体例としてのヴァンデームター式は、最大の分離効率を達成するために、固定分析時間を定めなければならない、ということを教示する。図１の曲線に類似の一群の曲線が、カラム径、充填物粒度、固定相の量等の変数についてＨ対ｕをプロットすることによって得られる。ヴァンデームターによって例示される速度理論にしたがって、そのような一群の曲線のそれぞれの最小が、バンド幅の広がりを最小にするために、カラムを通しての移動相の最適流量を示す。重要なことに、曲線は、カラムを通しての流量がＣ領域において増加するにつれて、カラム段高さＨおよひバンド幅の広がりも増加する、ということを明確に表している。図１のようなプロットにおいてＨＰＬＣカラムの機能を説明する場合に、ヴァンデームター曲線を使用した場合と同様に、カラム段高さＨを移動相の線速度ｕに対してプロットすることが一般的に行われている。ＨＰＬＣプロセスは拡散駆動プロセスであるので、そして異なる溶質分子は異なる拡散係数を有するので、ＨＰＬＣプロセスを広範囲の異なる分子量の溶質に適用する場合にこの後者の変数を考慮することができる。また、カラム中の粒子のサイズはカラム毎に異なることができ、別の変数としても考えることができる。同様に、溶質のための溶媒の粘度が考えられるかも知れない。プロットを標準化してこれらの変数を考慮するために、換算座標を使用するのが有利である。特に、ギディングス(Giddings) によって教示されそして最新液体クロマトグラフィー入門（Introduction to Mo dern Liquid Chromatography）、第２版、２２４乃至２３５頁に記載されているように、Ｈをｈに代え、ｕをｖに代えると、下記の如きヴァンデームター式の換算形を得る。（式２）ｈ＝ａ^*＋ｂ^*／ｖ＋ｃ^*ｖ、または（式３）Ｈ＝ａ^*ｄ_p＋ｂ^*Ｄ／ｕ＋ｃ^*ｕｄ_p／Ｄ上記式中、座標ｈはＨ／ｄ_p（ここで、ｄ_pは粒径である）として定義され、従って、ｈは次元のない座標である。同様に、次元のない座標ｖはｕｄ_p/Ｄ（ここで、Ｄは移動相中の溶質の拡散係数である）として定義される。ｖはまたペクレ（Peclet）数としても知られているということが分かる。しかしながら、本発明の説明において使用される換算座標またはペクレ数は、カラム中の粒子間の間隙容積の通路を通しての流体の流れを記述するものであって、カラム中の充填ベットを構成する多孔質粒子の孔内の液体の流を記述するものであると考えるべきではない、ということを強調しておかなければならない。式３から、渦拡散項ａ^*ｄ_pは粒度の関数であることがわかる。従って、ヴァンデームターの換算式は、粒度が増加するにつれて、効率が減少しなければならない、ということを予言する。縦拡散項ｂ^*Ｄ／ｕは流体速度と拡散係数との両方の関数として表わされる。逆の関係は、非常に低い液体速度での小さな分子について、この項はより顕著になることを示す。液体速度が増加するにつれて、物質移動項が拡散項を支配するようになる。後者の項Ｃ^*ｕｄ_p／Ｄは三つの変数すべての、すなわち、粒度、液体速度及び拡散係数の関数として表わされる。流体速度が増加するとき、その式は、物質移動項が、速度と粒子径の積に比例して悪化を伴って効率を支配するようになる、と予言する。従って、一定の拡散係数について、ヴァンデームター式による効率はこの領域の流体速度の関数として常に減少しなければならない。ヴァンデームター式のこれらの解釈は混乱した様式の流れについては有効ではないということが下記で示される。分析化学（Analytical Chemistry）、第３５巻、１３３８（１９６３）において、ジェイ．シー．ギディングス（J．C．Giddings）は、式３のａ^*項は移動相の物質移動と結合して、ａ^*ｄ_pまたはｃ^*ｖ単独よりも小さな項を生じる、ということを提案している。ギディングスは、この結合理論は、段高さが一定の値に近づくこと、すなわち、高い流量では、段高さは流の速度に依存すると主張し、そして液体クロマトグラフィーにおいて２．５の低い値の証拠をもっていると主張している。同じ著者が、その後クロマトグラフィージャーナル（Journal of C hromatography）、第１３巻、３０１（１９６４）において、「ｈの値を２よりずっと小さくすることはできない、すなわち、段高さＨを２つの粒径よりずっと小さく押しやることはできない。」と書き、最適段高さは１と２の間の低い速度に見い出されることになるということを予言する曲線を提示している。バンド幅の広がりの最小化は、特に分析用クロマトグラフィーにおける、溶質の最適分離、及び特に調製クロマトグラフィーにおける生成物純度を得ることを確保するに望ましいであろう。工業用酵素、治療及び診断法などにおける使用のための種々のタンパク質のような生物学的巨大分子の分離においてそれらの目標はは特に真実であるが、しばしば所望の分子は非常に多い用量の流体中非常に少ない量で生産され、相当する小さな拡散係数を有する非常に大きなものである。従って、ＨＰＬＣによる所望の分子の分離は、ヴァンデームター曲線により最適として指示された移動相流速に限定されるならば、苦痛なほど遅くかつ過度に高価なものであろう。さらに、生物製剤は、調製溶液中熱的あるいはプロテアーゼなどの存在により時間とともに変性するので、迅速な分離が非常に望ましい。生物学的巨大分子用液体クロマトグラフ分離法を使用して達成された生産効率はam ount-of-product/dollarによって示すことができる。至適生産を達成するためには生産スピード及び容量が重要であるが、現在それによく合致するものはない。分離が容量処理の高分解及び高速の両者で特徴づけられるＨＰＬＣシステムの創作が研究されている。例えば、米国特許第５０１９２７０号（以下「’２７０特許」という。）に開示され及び請求された方法は、とりわけ、２セットの内部結合した細孔で形成されたマトリックスを通して溶質の流体混合物を流すことを含み、それぞれのセットは他のセットと実質的に異なる平均粒径を有するものである。その方法を達成するために、より小さな平均粒径を有する細孔のセットを通過する明らかに圧力勾配下での対流的な流体の流れの速度は、より小さな細孔のセットを通過する溶質の拡散速度を超える限界速度を超えなければならない。同様に、’２７０特許の分割継続出願である、米国特許第５２２８９８９号（以下、「’９８９特許」という。）は、より大きな範囲の細孔の平均径に対する粒径が特定な比を有する２つの相違する粒径範囲内にある細孔を有する粒子である並数（モード）を２つ持つ細孔構造を有するものとして特徴づけられる粒子を充填することによるカラムの形成を教示している。’９８９特許の分割である、米国特許第５３８４０４２号（以下、「’０４２特許」という。）は、’９８９特許に請求された粒子で本質的に形成されたマトリックスを開示及び請求している。 ’２７０、’９８９及び’０４２特許の教示は、クロマトグラフィーカラムを通過する流体の流速からバンドの拡散現象を分離すると主張しているにもかかわらず、それらの特許は、Ｃ項が床速度と完全に無関係ではなく、さらに請求された改良された特性が２つの関連するセットの細孔の存在によるものであると言及しているので、ヴァンデームター仮説の有効性はそれらに本質的に問題にされていない点に注目すべきである。関連ある先行技術の別の例は、Introduction to Liquid Chromatography，2nd Ed.，Snyder及びKirkland，John Wiley & Sons，N.Y.(1979)に記載されており、これは現在、本主題に関する権威ある本の一つと考えられており、２３８頁には、「予測できる将来全てのＬＣ分離は９９％であろう」と特徴づけられる表５．２５が示されている。この表は、以下の結論が指示されている；「より高い処理圧力はより大きなＮ値（仮想Ｌが比例して増加する）を与える・・・しかしながら、Ｐの主な増加（例えば、表５．２５における１０倍）の利点はｄｐの小さな値及び／又はｔの大きな値に対してのみ重要なものである。小さな粒子（５から１０μｍ）及び１５分から２．５時間の分離時間に対しては、Ｐにおける１０倍増加は、おおまかにＮにおける２倍増加を与える。より小さな粒子及び長い分離時間に対しては、Ｐにおける１０倍増加は、Ｎにおける１０倍増加に変換できる。しかしながら、含まれている実験条件は分離時間が非常に長すぎ、さらにｄｐ値が至適値ではない点で全体的に実用化できないものである。」（ここで、Ｎは段数であり、Ｐは圧力であり、ｄｐは粒子サイズであり、及びＬはカラム長である。）このテキストはさらに続けて以下のように記載している：「分離時間ｔの増加に伴い、ｄｐの至適値はより高い値に移動し、例えば、１日の分離時間では５μｍである。より高い処理圧力では、より低いｄｐ値が好ましい・・・・・・なぜならば試料の分子量の増加に伴いｍＤは減少し、ｄｐの至適値も減少するからである。」２４１頁の表は、分子量３００、０００を有する溶質に対する至適ｄｐ値は約０．０３から０．１μｍであろうと主張し、そしてこのテキストは以下のように結論している：「前述のデータから、ミクロン以下の粒子は大きな分子の分離に決定的に有利であるように見える」及び「５０００ｐｓｉより高い圧力はＬＣ分離に価値があるように思えない。」（２４０頁）。以下の記載から明らかなように、本願発明は先行技術の主張及び結論と実質的に区別されるものである。 M．Golay により説明されている理論(Gas Chromatography，D.H．Desty，ed， p.36，Buttersworths，London，1958)は、カラムを通過する層流に対してのみ正しい多くの仮説に基づいている。これは J.C．Glddings（Advances in the Theo ry of Plate Height in Gas Chromatography，Analytical Chemistry，Vol.35， No.4，April 1963，pp.439-448）により確立され、彼は、ヴァンデームター式の欠点に注目し、この式は有効な膜厚の大きさを固定するための条件を含まず、さらに渦拡散、ガス相物質移動及び液膜移動に関連した誤り及び欠落を含んでいるから、この式は独立データからクロマトグラフィーカラムにおける数値的段高の値を予想することはできないと主張している。 V．Pretorius 及び T．Smuts（Turbulent Flow Chromatography：a New Appro ach to Faster Analysis，Analytical Chemistry，Vol.38，No.2，Feb.1966，pp .274-280）は、所定の一対の溶質を分離させるのに必要な最小時間に関する以前の全ての研究は、移動相の層流に関するもののみであったことに注目している。そのPretorius et al.の文献は、クロマトグラフィーを層流の代わりに乱流を使用して開放管カラム中で行うと最小分析時間が有効に換算できることを示している。Pretorius et al．は、乱流条件下では Golay 式は有効でないことに気づき、そして R．Aris，Proc．Roy．Soc，A235，67(1956); 同A252，538 (1959)により提供された乱流条件下でのバンド幅の分散に関する先行研究を特に引き出して、層流及び乱流の両者に有効であろう Golay式の一般式であると考えられる式を誘導している。Pretorius et al.は、約１０³のレイノルズ数での開放管を通過する層流から乱流への移動に関し、実験的及び新しい式による計算的な段高を換算することを示すプロットを提供している。その文献は、層流よりむしろ乱流を使用することにより、ガスクロマトグラフィーのための分析時間がほぼ大きさのオーダーにより改良されると結論している。その著者等は、クロマトグラフィーのため、移動相が液体である場合、層流を使用する従来のガス及び液体クロマトグラフィーにおける分析時間との比較の彼らの推定に基づき、分析時間は約１０⁴のファクタで短縮されるべきであると推測している。さらに、Preto rius et al.は、乱流を有する液体クロマトグラフィーで使用した開放乱流カラムの長さが、層流に対する長さとしての約１０倍であるべきであり、単純な分離は数気圧の圧力添加を必要とし、さらにより困難な分離は１００気圧より高い圧力添加を含むであろうと議論している。高精度及び高速の調製分離を得るための乱流液体クロマトグラフィーの使用は、Pretorius et al.、の教示からタブー視されるであろう、なぜならばこの文献の２８０頁、カラム２には、直径０．１ｃｍ及び長さ２０００ｃｍ（分離ファクタ１．５）の管での分離は明らかに２４日かかり、そして分離ファクタ．７５での分析時間は約６日にまで短縮されるかもしれないという記載があるからである。キャピラリークロマトグラフィーカラムに乱流を利用することは、数年前に、非常に効率的な分離を達成するための魅力ある手段として主張されたが、乱流を得るために必要な圧力損失が実際上の考慮にはあまりに大きすぎると考えられたことから、その乱流の使用は充填したカラムまでには及ばなかった。M．Martin らの、Influence of Retention on Band Broadening In Turbulent Flow Liquid and Gas Chromatography，Anal．Chem．５４，１５３３−１５４０（１９８２）を参照。Mass Transfer Ideal and Geometrically Deformed Open Tubes-II． Potential Applications of Ideal and Coiled Tubes in Liquid Chromatograph y，J．Chromatogr，１７３，２２９−２４７，（１９７９）において I．Halasz は同様な結論に到達した。この文献では、比透過率が層流におけるよりも少なくとも３倍ないし、ｈ価が理論上予想されるより十倍高く、また高い圧力損失は許容されないし、注入は高い入り口圧力では非常に困難であるので、乱流領域での液体クロマトグラフィーについて議論することを明確に拒否している。さらに、乱流条件の下でクロマトグラフ環境における固定相を維持することは、どうみても困難であったし、また高い剪断力を伴うため実際的ではないように思われた。 D.S．Horne らの、A Comparison of Mobile-Phase Dispersion in Gas and Li quid Chromatography，Sep．Science，１（５）、５３１−５５４（１９６６）には、カラムを通過する流れについての流体力学の研究が提供されており、非常に高い液体速度では、乱流が流れにおける分散の割合に影響を与えることが認められた。液体試験で示される最も高い速度は、大体６，５００程度の換算速度であるlog ｖ＝３．８であった。この文献では、非常な高速度のときで、そしてレイノルド数が約１０を超えるとき、換算段高さはその速度とは無関係になると述べている。この文献は、直径が５００μｍの非多孔質のガラスビーズが詰め込まれ、カラム−対−粒子の直径の比が１０対３０である準備されたカラムを用いて行った研究に基礎が置かれていた。ビーズ上に溶質が全く保持されなかったので、クロマトグラフ的分離は全く行われなかった。同様に、H．Kaizurma らのEval uation of Coupling and Turbulence by the Dynamical Comparison of Gas and Liquid Chromatography，J．Chrom．Science，Vol．８，６３０−５３４（Ｎｏｖ．１９７０）によると、クロマトグラフィー活性でない、５００μｍの非多孔質の、球状ガラスビーズを詰め込んだカラムを通過する流れについての流体力学の他の研究では、高い速度極値を得るための１２３ａｔｍまでの入力カラム圧を使用することに基づいて、カップリング及び乱流が、段高さ対速度のプロットをヴァンデームター形とは根本的に異なるものとすると記載している。後者の文献は、ｌｏｇ換算段高さ対ｌｏｇ液体についての換算速度プロットが８，０００を超える換算速度まで延び、また段高さ（およそ１０）が低下し始める前に最大値およそ約５０００ぐらいを示すことを示している。この文献は、乱流がＬＣにおいては重要であるようには思われないと結論づけている。均一な断面と比較的平滑な壁を有する、中空の円筒状のパイプ又はチューブを流れる非圧縮性の粘性流体の流れに関していえば、定常的な層流（すなわち、ここでは圧力低下が速度に比例する）そして流体は不規則的に大きく変動することのない層状に流体が移動するものを、不規則的でそして非定常的な又は乱れのある流れ（すなわち、ここでは圧力低下は速度の２乗にもっと密接に変化する、そして流体における局部速度及び圧力が不規則的に変化する）から区別する、臨界又は遷移流速が存在することが長い間認識されてきた。かかる流れは、（式４）Ｒｅ＝ ρｖｄ／μ （式中、ρは流体の密度（ｇ/ｃｍ³）、ｖは流体の速度（ｃｍ／ｓｅｃ）、ｄはパイプの直径（ｃｍ）であり、またμは流体の粘度（ｇ／ｃｍｓｅｃ）である）、として定義されるレイノルズ数Ｒｅに基づいて説明することができる。レイノルズ数は、次元単位を有するものではなく、したがって流体の流れの類型についての判断基準として利用できる。例えば、通例、もしレイノルズ数が小さくて、例えば、約２１００未満であるなら、かかる平滑な壁のチューブ内の流れは層流であり、またそれより高いレイノルズ数であるときは、例えば、約３０００より大きいときは、その流れは乱流となることがよく知られている。約２１００と３０００との間のレイノルズ数での流れは、臨界的な遷移段階を構成する。レイノルズ数の値は、上述したように、流体が流れる導管の内部表面の平滑度に、ある程度、依存する。導管の内部表面が荒い、すなわち、不規則であるときには、乱流への変化は幾分か低いレイノルズ数であるとき生ずるものである。少なくとも水性型の流体では、乱流は、レイノルズ数が約２１００を超えるときにのみ、生ずると広く信じられていたので、クロマトグラフイーカラムの充填床を通過するかかる流れを達成することが不可能であることは明らかであるようであった。というのは、大きな圧力容器を必要とし、そしてより大事なことには、カラム中の多孔質粒子を崩壊してしまうような圧力をかける以外には、誰もこのレイノルズ数に到達することができないからである。発明の目的本発明の主たる目的は、高速、高分解性の、溶質の分離を行うための、改良を加えたクロマトグラフィー装置及び方法を提供することである。本発明のさらに他の目的は、従来技術による教示内容に反して、ＨＰＬＣに使用して溶質の分離を行うと、バンド幅の広がりが、ＨＰＬＣカラム中の移動相の速度がＢセグメントからＡセグメントへ増大するにつれて増大し、カラム中の移動相の速度がＡセグメントを超えて増大するにつれて減少するというようなヴァンデームターカーブの実質的に逆である特徴的なカーブを示す装置及び方法を提供する。本発明の他の目的は、生物学的薬剤などのような小さい分子及び大きい分子の両方についての分析用クロマトグラフィー及び分取クロマトグラフィーの両者の速度及び能力の両方を劇的に向上させる装置及び方法を提供すること、有意に改良された結果をもって今まで使用されたどのようなものよりもかなり大きい移動相の速度をもって操作しうる装置及び方法を提供すること、粒子が実質的に一般的に従来技術で使用されたものより大きい充填粒子床で操作されるそのような装置及び方法を提供すること、乱流液体クロマトグラフィーについて従来技術により教示されたものよりかなり低い圧力で操作できる装置及び方法を提供することである。発明の概要これらを目的とする本発明は、液体クロマトグラフィーを実行する新規な方法であって、クロマトグラフィーカラムすなわちクロマトグラフ床が、以下に詳述するように約３０μｍ以上代表的には５０μｍ以上で場合によっては（ただしそれに限定されないが）１０００μｍのほぼ均一な平均断面寸法すなわち平均断面径を有する、ほぼ均一に配置された複数の剛性固体多孔質粒子として形成されるものに関する。ここで用いている「粒子」という用語は、その対称性の有無、偏平率、規則性などに拘わらず、いかなる形状もしくは形態にも限定されるものではない。ここで用いている「固体(solid)」という用語は、そのものの物理的状態をいい、多孔質粒子を排除するものとは解釈しない。こうした粒子は各種の寸法及び形態のものから選択され、カラムの全容積の約４５％以上の容積を有する粒子間隙を形成するように、加圧、焼結などにより床すなわちカラム内に集合させたものである。粒子表面は、その粒子内の細孔表面を含めて、クロマトグラフィー固定相となる層でコートすることにより、クロマトグラフィー活性化されている。この方法は、カラムに負荷をかけるために、粒子表面と相互に作用する少なくとも１種の溶質または懸濁相を含む流体混合物をカラムを通して流す工程を含む。カラム内の粒子および充填物の性状のために、カラムを通す流体混合物の流速を上げることができ、好ましくは平均換算速度（後記に定義する）を約５０００以上、場合によっては後記するように７００００以上に上げることもできる。そのような条件では、間隙容積の少なくとも大部分で混合物の乱流が生起すると考えられ、そうした乱流が実は物質輸送速度を上げて、カラムの動的容量を増大させるのだと思われる。さらに本発明は、非常に大きい平均径を有するクロマトグラフィー活性粒子（たとえばｄｐ＝５００μｍ以上）と乱流特に換算流速ｖの高い領域（たとえば４００００以上）との組み合わせが、予想に反して換算段高さを１以下にするということを確立する。本発明の方法はまた、溶質を含む混合物をカラムに流した後、やはり好ましくは約５０００以上の換算速度で溶離液をそのカラムに通す工程を含む。後述するように、そのような換算速度で溶離液をカラムの間隙容積を通して流すことにより、カラムから溶離される溶質によって生ずるバンド幅の広がりは、ヴァンデームターからの予想に反して、溶離液についてのレイノルズ数の逆数的関数、そして当該溶離液中における当該溶質の拡散係数の大きさの直接的関数となり、その場合に溶質の分子量が上記拡散係数の大きさに大きく影響するのである。本発明はまた、約３０μｍ以上のほぼ均一な平均径を有する複数の剛性固体粒子を充填して形成したクロマトグラフィーカラムを含んでなる、クロマトグラフィー装置に体現される。これらの粒子としては種々の寸法および形状のものが形成もしくは選択され、粒子間に通路ないしは空間を形成してそうした粒子間の間隙容積がカラムの全容積の約４５％以上となるのに十分な圧力で充填される。これらの粒子の表面は、クロマトグラフィー用固定相となる１以上の層でコートされるなどにより、クロマトグラフィー活性である。好適な態様では、特にカラムの粒子が許容できる断面寸法の下限に近い場合、そうした粒子は後述するように不規則である。カラムを通して少なくとも約５０００の換算速度で流体混合物を流す手段が設けられるが、そのような換算速度は間隙容積の少なくとも大部分において、固定相となる層と相互に作用する少なくとも１種の溶質を含む上記混合物の乱流を生起する。本発明はさらに、溶離液によってカラムから溶離される溶質のバンド幅の広がりが、溶離液の流れについてのレイノルズ数と溶離液中の溶質の分子量の大きさとの逆数的関数になるように選択された速度で、負荷カラムを通して溶離液を流す手段を含む。このためには、溶離液の流れは約５０００以上の換算速度を有することになる。本発明のまた別の態様としては、比較的小さい分子量（たとえば５０以下）を有する溶質分子を分離するのに特に適したものとして、数百μｍ（たとえば５００μｍ）以上の平均径を有する粒子の充填床を設けるものがある。この態様も試料および溶離液の流体混合物を、必要な乱流を生起すると考えられる７００００以上の高い換算速度で、カラムを通して流す手段を含む。そのようなｄｐおよびｖの典型的な値を採用するそうしたカラムにおいては、換算段高さｈが移動相の速度と逆の相関を示し、従来考えられていたように速度と無関係ではないという予想に反する知見が得られたのである。また、クロマトグラフィー活性粒子の充填床に導入される溶質が非特異的に結合するようなクロマトグラフィープロセスにおいては、そうした非特異的結合は、単に液体混合物中のそのような溶質を約５０００以上の平均換算速度でカラムに流し、続いてただちに少なくとも同じ平均換算速度で溶離液を流すことにより、低減されるという知見も得られた。本発明の上記および他の目的は、その一部は自ずと明らかであり、また一部は以下において明らかにされる。従って本発明は、以下の詳細な説明に例示される構造および部材の配置を有する装置、並びにいくつかの工程およびそれらのうちの１ないし２以上の工程と他の工程との間の関係および順序を包含する方法からなり、それらの適用の範囲は特許請求の範囲に示されることになる。図面の簡単な説明図１は、従来技術であるヴァンデームター曲線を例示するものであり、代表的なカラム段高さＨをｕ（ｃｍ／ｓｅｃ）に対してプロットしたものである。図２は、本発明の原理を体現する装置の模式図である。図３は、図２のカラムの一態様の一部を理想化かつ拡大して示す図である。図４は、異なるコーティングを施した多孔質粒子の選択されたバッチについて細孔サイズの分布を示すグラフであり、粒子細孔の侵入体積を選ばれた溶質の分子量の対数に対してプロットしたものである。図５は、公称５０μｍの未官能化多孔質アルミナ粒子を用い本発明に従って作製されたクロマトグラフィーカラムについて測定されたデータを示すものであり、カラムを流れる流体の流速の関数として、層流から乱流への遷移領域を含む各種流速におけるカラムの効率を換算座標上にプロットしたものである。図６は、図５と同様なプロットであって、公称２０μｍの粒子からなるカラムの効率を、カラムを流れる流体の流速の関数として図５と同様な換算座標上にプロットしたものであり、図５にグラフ化された実施例における圧力程度では、このサイズの粒子を用いた場合には乱流が得られないことを示す。図７は、図５と同様な別のプロットであって、公称１０μｍの粒子を用いた実施例に基づくものであり、このサイズの粒子を用いた場合には明らかに乱流が得られないことを示す。図８は、実施例１、２及び３から得られたｐｓｉ単位で測定した圧力損失のデータを流体の線速度に対してプロットしたものであり、図５、６及び７を補完するものである。図９は、それぞれ異なる高分子量タンパク質である２種類の試験溶質を、公称平均寸法５０μｍの粒子にカチオン交換容量を付与したものを充填した本発明のＨＰＬＣカラムから、毎分０．５ｍＬ〜１０ｍＬの速度で溶出させて分析した結果を示すグラフであり、得られたデータは換算段高さｈをcm/sec単位で表したμ に対してプロットしてある。図１０は、図９に関して用いたものと同じ試験溶質の１つを、同じ流速で同じ粒子サイズのカラムから溶出させて分析した結果を、同じスケールの同じ座標にプロットしたものであるが、粒子にはアニオン交換容量を付与している。図１１は、図９に関して用いたものと同じ試験溶質の１つを、公称２０μｍの粒子にアニオン交換容量を付与したものを充填した本発明のクロマトグラフィーカラムから、図９と同様にして溶出させて分析した結果を、図９と同じ座標にプロットしたものである。図１２は、図１１に関して用いたものと同じ試験溶質の１つを、公称１０μｍの粒子にアニオン交換容量を付与したものを充填した本発明のクロマトグラフィーカラムから、図１１と同様にして溶出させて分析した結果を、図１１と同じ座標にプロットしたものである。図１３は、ヒトトランスフェリンとウシ血清アルブミンの混合物を本発明の原理を用いて分離する際に得られた、分取用クロマトグラフィーのクロマトグラムである。図１４は、非常に大きな粒子の充填床を用いたＨＰＬＣカラムに、水中のアセトン試料を種々の非常に高い流速で注入して得られたデータのプロットである。図１５は、同一の試料を順次ＨＰＬＣカラムに注入し、最初は乱流速度、次いで層流速度で溶離したときに得られたデータをプロットしたものであり、試料溶液積算注入量の関数としての試料の回収率に関し、非特異的結合があることを示している。図１６は、同一の試料を順次ＨＰＬＣカラムに注入し、最初は乱流速度、次いで層流速度で溶離したときに得られたデータをプロットしたものであり、試料溶液積算注入量の関数としての試料の積算非特異的結合量の関数としての試料の回収率に関し、非特異的結合があることを示している。発明の詳細な説明本発明は、液体クロマトグラフィーに関する従来の知識は徹底しておらずまた完全に正確なものでもないという多くの知見を利用したものである。例を挙げると、上述したようにVan Deemterの式は移動相の流れが基本的に層流であるというシチュエーションに限定される。本発明はヴァンデームターの式が移動相流が乱流である場合には無効であることを確立するものと考える。本発明の１つは、図２に図式的に示すように、多数の剛体の固体粒子２２が充填されて形成されるクロマトグラフィーカラム２０からなるクロマトグラフィー装置として実体化され、本発明の一態様によれば粒子２２は実質的に均一な約３０μｍ以上の平均直径を有する。ここで用いられる「平均直径」という用語は、平均した直径すなわち粒子の形状に係わらず断面の寸法の平均を言うものであって、かならず球状あるいは揃った固体粒子に限定するものと解釈してはならない。このような平均直径の値は典型的には信頼係数が約９５％における直径分布の内部にある。本発明の好ましい面は、以下に叙述するように粒子の形の不揃いにあるのである。ここで用いる「不揃い」という用語は、形の一致がないと言うことを定義するのみならず、粒子が多様な多面体形状の混合多様性として存在してもよいので、一般的に荒くて均一でないでこぼこな表面を持つ、球状、円錐曲線体、長円形などの形の粒子のような回転固体や、短い繊維をも包含するものである。本発明の粒子は非圧縮性材料から作るのが好ましい。非圧縮性と言う用語は少なくとも約５×１０³ｐｓｉの圧力をかけた場合（アウトレットカラムフリットリテーナーを含む）に粒子の密度と容積が変化する時間速度が実質的にゼロのままであって高圧下においてさえ塑性変形を起こさないことを意味するものである。本発明の粒子は成形したのち、図３に詳しく示すように間隙通路２４を有することを特徴とするカラムを作るのに十分な圧力で充填できるようサイズと形が一定の範囲にはいるものを選別する。粒子が不揃いなため、そのような通路の内部壁は必ず形状が相当粗いことがわかる。少なくとも通路２４の大部分は平均断面直径が実質的に約４μｍより小さくてはならず、間隙容積部分（粒子間の間隙通路２４の合計容積）がカラム２０の全容積の約４５％より少なくてはならない。従来技術の代表的なカラムは間隙容積部分が４５％よりも少なく、具体的には約３５％から４２％の範囲にあることが理解されよう。粒子２２の表面はこの分野でよく知られているようにそれ自体がクロマトグラフィー用に活性であるか、これまたこの分野でよく知られているクロマトグラフィー用に活性のある固定相の層で被覆するなどの処理をすることによって活性があるものである。粒子２２は薄膜であってもよいし、あるいは活性表面面積を増すために、典型的には例えば約６０オングストロームから５０００オングストロームの範囲内にある平均直径を有する粒子内細孔により多孔であることが好ましい。間隙容積部分が約４５％より小さくないことと組み合わされた粒子の不揃い性のため、本発明のカラムの間隙通路を通過する乱流は驚くべきことに１０よりかなり小さいレイノルズ数で誘発することができる。多孔性粒子でできたカラムの間隙容積Ｖｉは以下のように定義できる。（式５）Ｖｉ＝Ｖ−Ｖｐ−Ｖｓ式中Ｖは空カラムの全容積Ｖｐは粒子それ自体の細孔の全容積Ｖｓは粒子の骨格すなわち骨組みの全体積である。非多孔性粒子でできたカラムの間隙容積Ｖｉ配下のように定義できる。（式６）Ｖｉ＝Ｖ−Ｖｘ式中Ｖｘは粒子の全体積である。よく知られたＨｇ侵入解析を用いて多孔性及び非多孔性の粒子のカラムの間隙容積を求めることができる。本発明においては、カラム２０の近端に接続したポンプ２６のような手段を用いて流体混合物（液だめ２８のような適当な源から）及び／または溶質（２７のような適当なループインジェクターから）を、換算速度で（i.e.すでに定義したようにｕｄ_p/Ｄ、これは本発明の第１の態様においては実質的に約５０００より上である）、流すことができる。後者はｈ／ｖ曲線の傾きが換算座標ｈ（i.e．H ／Dp）軸にそって減少し始める近似値であって、換算速度が増加するについて効率が向上することを示す。本発明の第１の態様のカラムにおいて、混合物の乱流は換算速度約５０００に相当する流速で誘発される。本発明は更に、負荷カラム（i.e.初めに溶質混合物をカラムに流した結果、クロマトグラフィー的に活性な表面の少なくともいくらかに溶質分子が結合しているカラム２０）に（通常もう１つの適当な液だめすなわち貯蔵タンク３０から）溶離液を流すためポンプ２６のような手段を包含する。溶離液で溶出された溶質分子は、カラム２０の遠端に設けられた、この分野でよく知られた型の検出器３１により、この分野でよく知られた方法、通常は光学的方法、により検出される。カラム２０を通過する溶離液流は換算速度−本発明の第１の態様においては約５０００より上−に対応する線速度でなければならない。そうすることによって溶離液によりカラムから溶出される溶質のバンドの広がりは溶離液のレイノルズ数の逆数的関数で、溶離液中の溶質の拡散係数の大きさの直接の関数である。溶質の分子量とその拡散係数との間の関係から見て、本発明のカラムから溶離液によって溶出される溶質のバンド幅の広がりはまた溶質の分子量の逆数的関数としても定義されることが理解されよう。カラム２０は通常中空の、管状の入れ物であって、ステンレス鋼などの堅く強い材料で化学的に不活性すなわちそれに通過させる流体に反応性がない材料からできている。クロマトグラフィー処理するべき液体の体積により、カラムの内径は小さくてもよい（例えば数ｍｍ）し、あるいは非常に大きくてもよい。D．S． Horne et al．「ガス及び液体クロマトグラフィーにおける移動相分散の比較（A Comparison of Mobile-phase Dispersin in Gas and Liquid Chromatography， Sep．Science，1(5)，531-554(1996)）」によれば、少なくとも移動相が中程度の流速でカラム直径と粒子直径の比が約１０と３０の間である場合には球状の粒子を詰めたカラム床中のバンドの拡散は、最も望ましくないものである。しかし本発明は乱流を達成するための非常に高い流速に関係するものであり、カラム直径対粒子直径比は決定的ではない。本発明の好ましい態様において、カラムは平均直径が約３０μｍ以上の粒子を好ましくは少なくとも約５×１０³ｐｓｉの圧力をかけて充填してつくるが、これはできたカラムに互いに接触している粒子２２間にできる間隙通路２４以外にはほとんど空隙がない、すなわちカラム２０が実質的に均質な嵩密度を持つようにするためである。こうして作られたカラム２０は粒子が多孔性であるか否かに係わらず、約４５％以上の間隙部分を有していなければならない。多孔性で非剛性のポリスチレン粒子では、間隙割合が少ない、たとえば３５％付近であると、粒子がつぶれたり壊れたりしやすい許容できないほど高い圧力をかけない限り必要な換算流体速度が得られない。述べたように、好ましい間隙部分を持った均一な密度の望ましいカラムを確実に作り、操作圧力下での潰れを回避するためには、本発明でカラムを充填するために使用される粒子は、少なくとも約５×１０³ｐｓｉ、好ましくは約１×１０⁴ ｐｓｉと高い充填圧にもかならず潰れない堅い固体である。この目的のためには、好ましい粒子はアルミナ、チタニア、シリカ、ジルコニア、バナジア、炭素、種々の比較的不活性な金属や、それらの組合せを材料として作られる。したがって本発明の方法はクロマトグラフィーカラム中の少なくとも大部分の間隙通路を通過する流れが乱流であることを必要とする。クロマトグラフィーカラムを通過する層流に特徴的な典型的な放物線状の流れのプロファイルとは違って乱流のプロファイルはほとんどフラットであるいう前提にたつ。もっと重要なのは、乱流を誘発した場合、速度の半径方向成分は通常の拡散プロセスと重なって、通常の拡散プロセスとバンド幅の広がりの動態をカラムの効率にとって好ましいように変える、と考えられることである。カラムを通過する乱流を誘発し持続させるためには、流れる通路の直径と線流速の間に決定的な関係があり、それによりこれらの２つのパラメーターの積は線速度が変わっても一定に保たれるということがさらなる前提である。剛体であって圧力が変化しても塑性変形が起こらない粒子の必要性は、すでに述べたように非常に重要である。もしクロマトグラフィーカラム中の乱流を測定するのに普通の基準を使おうと思うなら、すなわちレイノルズ数が２０００より大きい流れを提供しようとするなら、実際的な見地からはそのような流れは一般的に密に充填した床を通しては得ることができない、ということに留意してほしい。本発明の方法でカラム中に乱流を起こさせるための鍵は、粒子の荒さと間隙容積割合が高い（＞４５％）ことである。これらのファクターの結果として、本発明のクロマトグラフィーカラム中の乱流は１０を切るようなレイノルズ数で誘発される。本発明の方法を初めに述べた図２の態様の装置で実施するにあたり、充填カラムを作るのに異なる粒子のバッチをいくつか使用した。これらのバッチは細孔の直径が操作されている、すなわち被覆していない粒子のバッチをクロマトグラフィー的に活性な材料の層で被覆することにより被覆していない粒子の細孔径から選択的に変化させてある、という点でまず異なっている。このような多孔性粒子のバッチごとの細孔密度分布は、いくつかの異なる分子量のポリスチレンをそれぞれ塩化メチレンに溶解したものからなるポリスチレン標準溶液を用いて既知の方法で求めた。具体的に言うと、２×１０³〜６×１０⁶にわたる分子量を持つポリスチレンを使用して粒子の排除限界と侵入のプロファイルを求めた。このような標準ポリスチレンを含有する溶液をそれぞれ決まったサイズ及び／または被覆の多孔性粒子の床に注入した。細孔容積はそのような床のそれぞれにアセトンを完全浸透プローブとして注入し、ついで分子量６×１０⁶のポリスチレンを完全排除プローブとして注入した。各標準品について、床の通過あるいは溶離時間を２５４ｎｍのＵＶ検出により測定した。侵入％は各プローブの溶離体積から排除プローブの溶離体積を引いて細孔容積で割ったものである。多孔性を測定するため粒子バッチをいくつか調べた。まず調べたのは被覆してなくて官能化されていない高度に不揃いな形の多孔性アルミナ粒子であって、公称直径５０μであるがコールターカウンター分析で求めた実際の平均直径は９５％信頼係数の内部で４２．３９μであるものである（ここではＣＴ−５０Ａｌ− ００２とする）。他の４つの粒子バッチは、公称直径５０μｍの形が不揃いで多孔質のアルミナであって、官能性を与える固定化されたポリマーコーティングの程度がバッチにより様々であるもの（ここではそれぞれＰＳ−１１−０３５、ＰＳ−９−０８７、ＰＳ−４−０９０、ＰＳ−１０−０２４とする）で、同じ手法により調べた。官能化コーティングしたこれら４つのバッチは熱重量分析で２．７から６．０４パーセントの重量減少となる表面被覆範囲を代表する。この重量減少は分析中の高温で官能化ポリマーコーティングが燃焼したために起こる。記載した粒子は不揃いで一般的に球状ではないことが好ましいので、ここで使用される直径という用語は粒子の断面の寸法の平均を意味するものであることは理解されるであろう。これらの粒子バッチのすべてについて、上に述べたように一連の異なる分子量のポリスチレンプローブで試験した。得られた結果は累積％侵入に対して分子量を対数としてプロットして図４に示す。図４の曲線はすべてほぼ対数直線で、ほぼ同じ傾きを有するので軽く被覆した粒子では細孔直径がすこし狭くなることは明らかである。しかし多量に被覆した粒子では粒子の内部細孔の実質的かつ直線的縮小が起こっていることを示す。ポリスチレン標準品の拡散係数Ｄｍは、G.Guiochon et al．「調製用非線形クロマトグラフィーの基礎(F undamentals of Preparative and Non-linear Chromatograpy)」（前出）p.142 に記載された式にしたがって算出した。個々のＨＰＬＣは、不揃いで多孔質のアルミナ粒子で公称直径５０μ（ＣＴ− ５０Ａｌ）、２０μ（ＣＴ−２０Ａｌ−００２）、及び１０μ（ＣＴ−０７Ａｌ −００２）のそれぞれのバッチを用いて以下に述べる充填プロトコールにしたがって作成した。各バッチ約２グラムをそれぞれのマルチ溶媒混合物中でスラリーにした。各スラリーは機械的装置に移し、その装置がそれぞれ空の０．４６×１０ｃｍの管に５×１０³の充填圧でスラリーを充填した。これらのカラムはカラム−粒子直径比が少なくとも９０であった。できた充填カラムは充填装置からはずしてふたをし、適当な試験溶媒中で平衡化させた。以下の実施例との関連で使用したこれらの充填床カラムを評価するのに用いたＨＰＬＣはヒューイットパッカード社（カリフォルニア、パロアルト）から市販されている１０５０型ＨＰＬＣシステムである。このシステムはカラム中に流体を送り込むポンプと、カラムから溶出されたバンドを調べるための波長可変のＵＶ検出器とからなる。検出器から受け取ったデータを加工するシステムは、HPLC Chemstation Rev.A.02.00としてヒューレットパッカード社（カリフォルニア、パロアルト）から市販されているソフトウェアプログラムを走らせた、Acer America（カリフォルニア、サノゼ）から市販されている４８６／３３ＳＸコンピュータである。以下は本発明の原理を実体化する液体クロマトグラフィーカラムの調製、試験及び使用の例である。実施例１上記のように調製し且つ呼称平均直径５０μの所要量のＣＴ−５０Ａｌ−００２粒子で充填されたＨＰＬＣカラムを塩化メチレン溶媒中での平衡によって評価した。塩化メチレンに溶解した種々の分子量のポリスチレンの標準溶液をこのカラムにそれぞれ注入した。評価を０．２ｍｌ／分乃至２０ｍｌ／分の範囲の流量で行った。検出ピークの半高さ点のピーク幅を測定してそれぞれの注入の効率を算出した。２５４ｎｍでの紫外部検出で測定してそれぞれの注入の溶離時間を記録した。各流量における圧力低下を測定しそして表にした。得られた効率データを、換算パラメーター座標、h及びv、に基づいてプロットした、図５のグラフ形式にまとめる。実施例２上記のように調製し且つ未被覆の、官能化していない高度に不規則な形状の、多孔性アルミナ粒子である呼称平均直径２０μの所要量のＣＴ−２０Ａｌ−００２で充填されたＨＰＬＣカラムを、塩化メチレンに溶解した種々の分子量のポリスチレンの標準溶液をこのカラムにそれぞれ注入して、実施例１のように評価した。全て実施例１に記載した手順に従って、評価を各流量で行い、各注入の効率を算出し、溶離時間を記録しそして圧力低下を表にした。得られた効率データを、図５に示したものと同様な座標として図６に示す。実施例３上記のように調製し且つ未被覆の、官能化していない高度に不規則な形状の、多孔性アルミナ粒子である呼称平均直径１０μの所要量のＣＴ−０７Ａｌ−００２で充填されたＨＰＬＣカラムを、塩化メチレンに溶解した種々の分子量のポリスチレンの標準溶液をこのカラムにそれぞれ注入して、実施例１のように評価した。全て実施例１に記載した様に、評価を各流量で行い、各注入の効率を算出し、溶離時間を記録しそして圧力低下を表にした。得られた効率データを、図５及び６に示したものと同様な座標として図７に示す。実施例４実施例１、２及び３で溶離したカラムのそれぞれについて背圧を測定しそして記録した。得られたデータは図８に圧力低下（ｐｓｉ）対線速度（ｃｍ／秒）としてプロットされている。実施例５上記の様に調製し且つ呼称平均直径５０μの所要量のＰＳ−１０−０１１粒子で充填されたＨＰＬＣカラムを官能性基を含む表面化学処理で変換して、カチオン交換によって分離するのに都合良くした。カラムを２ＭのＮａＣｌを含む中性ｐＨの２０ｍＭのtris（トリスヒドロキシメチルアミノメタン）バッファーで平衡させた。ＢＳＡ（bovine serum albumin；ウシ血清アルブミン）及びリゾチーム（両者ともミズーリ州、セントルイス所在の Sigma Chemical Co．から入手、分子量はそれぞれ約６７，０００及び１３，０００）のそれぞれ６０ｍｇ／ｍｌの試料を移動相に溶解し、カラムに注入しそして０．５ｍｌ／分乃至１０ｍｌ／分の範囲の流量で溶離した。得られたデータをh及びuに換算して図９にプロットした。実施例６上記のように調製し且つ呼称平均直径５０μの所要量のＰＳ−１４−０３７粒子で充填されたＨＰＬＣカラムを４級アミン官能性基を含む表面化学処理で変換して、アニオン交換で分離可能なようにした。カラムを実施例５に記載のように平衡させた。実施例５におけるのと同じＢＳＡの６０ｍｇ／ｍｌの試料を移動相に溶解し、カラムに注入しそして実施例５に記載の手順の流量で溶離した。得られたデータを図９で使用した同じ座標及びスケールで図１０にプロットした。実施例７上記のように調製し且つ所要量のＰＳ−１１−０９０（呼称平均直径２０μ粒子）で充填されたＨＰＬＣカラムを４級アミン官能性基を含む表面化学処理で変換して、アニオン交換で分離可能なようにした。カラムを実施例５に記載のように平衡させそしてテストした。得られたデータを図１１にプロットした。実施例８上記のように調製し且つ所要量のＰＳ−１１−０２７（呼称平均直径１０μ粒子）で充填されたＨＰＬＣカラムを４級アミン官能性基を含む表面化学処理で変換して、アニオン交換で分離可能なようにした。カラムを実施例５に記載のように平衡させそしてテストした。得られたデータを図１２にプロットした。実施例９特に調製クロマトグラフィーに適用される本発明の方法の高速及び高解像を説明するために、上記のように調製し且つ呼称平均直径５０μの所要量のＣＴ−５０Ａｌ−００２粒子で充填されたＨＰＬＣカラムを４級アミン官能性基を含む表面化学処理で変換し、そしてマサチューセッツ州マールボロー所在のBioSepra社で製造されたProsys HPLC 機器を使用して傾斜溶離で評価した。この機器はポンプ１台あたり最高３０ｍｌ／分の流量を有するポンプを４台備えているので、合計最大流量は１２０ｍｌ／分であった。この機器はまたスタティックミキサー（static mixer）、２８０ｎｍで測定する紫外部検出器、５ｍｌシリンジ注入部（syringe loader）及び注入ループ、検出器出力及びその他のデータを処理する内部ソフトウエアプログラム、及び出力データを表示するスクリーンを備えていた。このProsys機器に関連して、３０ｍｌ／分の最高流量を有する第３のHPLCポンプ（形番号６２００Ａ、日本国、東京所在の日立計器の製品）を備えていて、この２系列のポンプシステムはProsys機器中の混合機の上流で共にＴ型連結される構成を取り、最高１５０ｍｌ／分の流量を得ることが出来る。カラムを中性ｐＨの５０ｍＭのtrisバッファーで平衡させた。分子量約８０，０００のヒトトランスフェリン（Sigma Chemical Co.から入手）と分子量約６７，０００のＢＳＡ（Sigma Chemical Co.から入手）の混合試料をそれぞれ２ｍｇ／ｍｌの濃度でバッファーに溶解し、そして５ｍｌ注入ループにこの混合物を充填した。このtrisバッファーでカラムを平衡させた後、この試料を１２０ｍｌ／分の流量でカラムに注入した。５秒後、移動相を段階傾斜によって２Ｍ−ＮａＣｌを５％含むバッファーに変えた。更に７秒後に、移動相を段階傾斜によって２０％バッファー／ＮａＣｌ溶液に変えた。流量切り替えを両機器とも手動で、蛋白質溶質のイオン的分離が可能な様に同時に流量を変更して、行った。２８０ｎｍでの溶出液の紫外部痕跡として、得られたクロマトグラムは図１３に示されており、大凡１５秒の全分析時間の間に得られた解像度及びピークを示している。図５乃至７を通して示されているプロット及び上記実施例のデータから、約５０μｍ粒子で作成したカラムに対しては、換算段高さは、ヴァンデームターの予測に対比して、約５，０００の換算速度値以上減少する、事は明らかである。その様な乱流挙動を示す約５０μｍ粒子のカラムでは、換算段高さは約４０，０００の換算速度で最小に戻り、そしてこの換算速度に対応する分析時間は同じ量、即ち、約４×１０⁴だけ減少する事は図５から明らかである。１０μｍ及び２０ μｍ粒子で作成したカラムは流れに対する段高さの同様な関係を示さず、かえって、図６及び７に示すように、層流によって認められる従来型の関係に当てはまる。大量の液体中に非常に少量の目的とする溶質が含まれているとき、分離調製する溶質でクロマトグラフカラムに負荷を掛けることは時間のロスでありそして従って調製クロマトグラフィーが高価になる１面である。本発明ではカラム全体を比較的高速の流量で流せるので、カラムに溶質を負荷するのに必要な時間を顕著に低減できるだけでなく、その様な高速流れによって引き起こされる乱れがカラム中の粒子の細孔中の変換された表面上に溶質分子の負荷を強める、と考えられる。分子の精製に於いて、商業上の関心の多くは価格であり、生産性は単位時間当たりに精製される材料の量として規定されることは認識されている。本発明によって分析時間を数分の１から数十分の１に減少できるから、特に実施例９に示したように節約の同じファクターを生産性にまで広げることは合理的である。本発明の充填カラムの動的能力は質量移動の観点によって影響されるから、この推論は明らかに全く関連している。本発明の別の実施態様を基礎としている別の発見はまた液体クロマトグラフィーに関する先行技術の考察は正確でないことを示している。例えば、ヴァンデームターの式は、Giddingsのカップリング理論の検討に於いてさえ、先の述べたように換算段高さh 値は、高流量に於いてさえ、約２以下であると期待されないこと及びこの段高さは移動層の流れ速度に無関係である事を予測している。今や、ヴァンデームターに反して、カップリング係数（式３に於けるａ^*項）は流量に無関係でなくかつ大粒子（例えば、平均直径で少なくとも４００μｍ）の充填床を通じて乱流を使用することによって十分に１以下の値を想定できる事が見出された。この発見の意義は以下の実施例から明らかである。実施例１０充填したカラムを使用した本発明の装置の他の実施態様を図２に示すものと同様の装置を用いて作成した。図２において、カラム２０は、充填された多数の、剛性で固体の、好ましくは実質的に均一な平均直径、典型的には数百μｍの平均直径を有する非圧縮性粒子２２として形成した。この実施例では、カラム２０は、光学顕微鏡により約５０μｍの平均直径を有することが確認された Davisil 6 36 Davison Silica（W.R．Grace Co.，Boca Raton，Fla.）の粒子を充填した、U pchurch２０μｍチタンフリットを有する、Upchurch（Upchurch Scientific Co. ，Seattle，Wash.）製の４．６×１００ｍｍ液体クロマトグラフィーカラムであった。粒子カラム２０の先に説明した態様におけるのと同様に、各粒子２２の表面はクロマトグラフィー的に活性であった。各粒子２２は、先に述べた他の粒子のあらゆるものの直径に関するもの以外の諸属性を有するものであった。容器２８のような適当な源からの液体混合物の一連の各試料を、カラムの間隙容積の少なくとも大部分を通して流すために流量調節ポンプ２６（Bran & Luebb e，Chicago，III製の Model N-P）のような手段をカラム２０の基部端に接続した。そのような試料はそれぞれＨＰＬＣ級水で希釈したアセトン４０μＬであり、それらを適当なループ注入器２７(Rheodyne.L.P.，Cotati，Cal.製の Model 7125) によって約８０ｍＬ／ｍｉｎと１４０ｍＬ／ｍｉｎとの間のいくつかの実験的な流量で注入した。検出手段３１（Fisher Scientific，Pittsburg，Pa．製のKipp & Zonen Model BD-112 記録計に接続した Thermo Separation Products，San F ransisco，Cal.製のModel UV-1000を含む）をカラム２０の端部端に配置した。この、後に説明した液体クロマトグラフィー系を操作して得られたデータを下記表中に記載する。下記表はまた、mL/minで表した上記の各実験的流量（水中アセトンについて拡散係数を１．５×１０^-5ｃｍ²/ｓｅｃと仮定）の換算速度ｖに対する関係をも示すものである。該表は、そのようなカラム２０についてのｄ_p 及びｖの典型的な値において換算段高さｈが移動相の速度に逆数的に関連づけられるものであって従来技術において考えられていたように該速度と独立でも一定でもなく、かつ１より十分小さい値をとり得ることが実証されたことを示している。回収はアセトンのような小さな分子のものであっても非常に早く、各試料について、検出器３１によって検出されたピークの幅及び振幅は一試料当たり１５秒以下の時間内に注入アセトンの実質的に完全な回収があったことを示した。ここでｕ＝移動相平均線速度；ｖ＝換算線速度；Ｎ＝理論段数；Ｈ＝段高さ；及びｈ＝換算段高さである。 μｍで表した段高さＨの測定値に対するmL/minで表した流量Ｑの各値のプロットを図１４に示す。実施例１０により得られたデータから、上述した装置を用いた調整用クロマトグラフィーは、１００より十分小さい分子量を有する分子に対してさえも非常に高速で高容量の分離を示し得ることは明かである。以上説明したように、物質移動は乱流によって増大され、その機構はクロマトグラフ粒子の表面領域結合部位への接近の、結果としての減少であると考えられる。従って、もし想定した機構が正しければ、非特異的結合は対応して減少するはずである。本明細書中において、非特異的結合とは、クロマトグラフィーにおいてクロマトグラフ粒子の表面結合部位に捕捉された試料分子がそれに続く溶離による置換に抵抗すること又は溶離により除去することができない減少をいうものとする。この仮説が正しいことを立証するために以下の研究を行った。実施例１１実施例６で上記したように０．４６ｘ１０ｃｍのＨＰＬＣカラムの一組を調製し、実施例９に記載した器具を用いて評価した。ＢＳＡ（Sigma Chemical Co.）のサンプル混合物を、２ＭＮａＣｌを用いてｐＨ８．６２でトリバッファーから形成した移動相中に６０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解することにより、調製した。バッファーによる平衡の後に、サンプルの複数の１０μｌの注入を、約５０００より大きい換算速度での平均流速で各カラムに連続して行った。サンプルの回収を面積の関数として測定した。第一に、各カラムを、このサンプル及びカラム中の粒径に関して３０，０００を超過した換算速度に相当する３０ｍｌ／ｍｉｎの移動相の溶出流速で試験した。一度、これらの高い流速での飽和を達成し、同じカラムを使用したが、ヴァンデームターの関係で確立されている教示に従って層流のより慣習的な水量の状況に相当する１ｍｌ／ｍｉｍの流速で研究を続けた。得られたデータは図１５および１６に示している。前述の条件及び使用した移動層の性質においては、サンプル中のＢＳＡは一般的に保持されないが、下層のアルミナ支持体を用いてたぶん非特異的結合相互反応を有することを認識できる。無機基質が、微少量にだけ存在し及び／又は非常に価値があるサンプルの測定可能量を取るという傾向にあるかぎりは、ＨＰＬＣにおいて重大な問題を非特異的結合は提示しうる。図１５に示されるように、乱流条件下において、注入したサンプル溶液の累積量が５ｍｇに達した時間までに、回収されたサンプルの百分率は１００％に達した。層流の状況下では、注入したサンプル溶液の累積量が１３ｍｇに達するまで、１００％回収は達成されなかった。これは、サンプルの非特異的結合が乱流条件下よりも層流条件下でかなりより多く起こったことを示している。図１６は、回収よりむしろ起こった非特異的結合の累積量によるデータを簡単に再表示している。これは、使用したカラムに関して、非特異的結合をしたＢＳＡの実際の量は、乱流条件下において約１．２ｍｇで安定水準又は飽和状態に達したが、ＢＳＡの約３．８ｍｇが非特異的結合をするまでに層流条件においては安定水準に達しなかったことを示している。それゆえに、ＨＰＬＣに乱流条件を使用することにより、非特異的結合による損失は実質的に最小限にできることは明らかである。そのために、カラムに導入されたサンプル中の溶質はカラム粒子に非特異的結合をする傾向があるクロマトグラフィーカラムにおいて、本発明の教示は、サンプルをカラムに注入する手段や、サンプル注入の実質的直後に、溶離剤液体をカラムに流す手段を設けることにより、そのような非特異的結合を減少させるのに有用である。これら両方の注入及び溶離剤液体の流れは、約５０００より大きい平均換算速度で確立されている。上記の装置及び方法においては、本発明の範囲から逸脱することなく変更をしても良いから、上記の記載に含まれる又は添付の図面に示される全ての事項は例示的な意味においてかつ限定的な意味でないことと解釈される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 30/48 Ｇ０１Ｎ 30/48 ＨＥ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者タカリュウスキ，ジョセフ，ジェー．，ジュニアアメリカ合衆国．01801 マサチューセッツ，ウォバーン，ウエストゲイトドライヴ 10，アパートメントティー−４

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の組み合わせを含んでなるクロマトグラフィー装置：クロマトグラフ活性表面を有するほぼ均一に配置された多数の剛性固体多孔質粒子として形成され、該粒子が約３０μｍ以上の平均径を有し、該粒子間の間隙容積が該床の全容積の約４５％以上であるクロマトグラフ床；および手段。２．該粒子の平均径がほぼ均一である請求項１記載の装置。３．該間隙容積が多数の該粒子間の間隙通路からなり、該通路の少なくとも大部分は約５μｍ以上の平均断面寸法を有する請求項１記載の装置。４．該粒子が固定相の層でコートされ、該表面がクロマトグラフ活性となっている請求項１記載の装置。５．該粒子が実質的に非圧縮性であり、約１×１０⁴ｐｓｉまでの充填圧力で実質的に塑性変形を起こさない請求項１記載の装置。６．該粒子がアルミナ、シリカ、チタニア、バナジア、ジルコニア及びカーボンのうちの１種以上から形成される請求項１記載の装置。７．該粒子の細孔が約６０Å〜約５０００Åの範囲の平均径を有する請求項１記載の装置。８．該粒子が実質的に５×１０³ｐｓｉ以上の圧力で充填される請求項１記載の装置。９．該間隙容積の少なくとも実質的部分に約５０００以上の換算速度で溶離液の流れを生じるのに十分な速度で該溶離液を該床に流すことにより、負荷された溶質を該床から溶離する手段を含む請求項１記載の装置。１０．溶離液により該床から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、溶離液の流れについてのレイノルズ数の逆数的関数となり、かつ該溶離液中における該溶質の拡散係数の大きさの直接的関数となるように選択された速度で、該溶離液を該床に流すことにより、負荷された溶質を該床から溶離する手段を含む請求項１記載の装置。１１．溶離液により該床から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、溶離液のレイノルズ数の増大とともに減少するように選択された速度で、該溶離液を該床に流すことにより、負荷された溶質を該床から溶離する手段を含む請求項１記載の装置。１２．溶離液により該床から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、該溶離液中における該溶質の拡散係数の大きさの直接的関数となるように選択された速度で、該溶離液を該床に流すことにより、負荷された溶質を該床から溶離する手段を含む請求項１記載の装置。１３．以下の組み合わせを含んでなるクロマトグラフィー装置：クロマトグラフ活性表面を有するほぼ均一に配置充填された多数の剛性固体多孔質粒子として形成され、該粒子が約５００μｍ以上のほぼ均一な平均径を有するクロマトグラフィーカラム；および該表面と反応する少なくとも１種の溶質を含む液体混合物を、該粒子間の間隙容積の少なくとも実質的部分に約５００００以上の換算速度で該混合物の流れを生じるのに十分な速度で該カラムに流すことにより、該表面を該溶質で負荷する手段。１４．少なくとも約５００００の換算速度で溶離液を該床に流すことにより負荷された溶質を該カラムから溶離する手段を含む請求項１３記載の装置。１５．約３０μｍ以上のほぼ均一な平均径を有する多数の剛性固体粒子を充填した床として形成され、該粒子の表面がクロマトグラフ活性であって該床に導入された溶質が該粒子と非特異的に結合しやすいクロマトグラフィーカラムを含んでなるクロマトグラフィー装置において、該装置が以下のものを含んでなることを特徴とする装置：該溶質を含む液体混合物を約５０００以上の換算速度で該カラムに注入することにより該溶質で該粒子を負荷する手段；及び溶離液を約５０００以上の平均換算速度で該カラムに流すことにより負荷された溶質を該粒子から溶離する手段。１６．以下の工程を含んでなる液体クロマトグラフィー実行方法：クロマトグラフ活性表面を有するほぼ均一に配置された多数の剛性固体多孔質粒子の床を、約３０μｍ以上の平均径を有する該粒子間に間隙容積を与えるように形成し；該表面と反応する少なくとも１種の溶質を含む液体混合物を、該間隙容積の少なくとも実質的部分に約５０００以上の換算速度で該混合物の流れを生起するのに十分な速度で該床に流すことにより、該表面を該溶質で負荷する。１７．該粒子が不規則な形状を有する請求項１６記載の方法。１８．該粒子間の間隙容積が該床の全容積の約４５％以上となるように粒子及びその形状を選択する請求項１６記載の方法。１９．該粒子が固定相の層でコートされることにより該表面がクロマトグラフ活性となっている請求項１６記載の方法。２０．生起された該混合物の流れが実質的に乱流である請求項１６記載の方法。２１．実質的に非圧縮性であり約１×１０⁴ｐｓｉまでの充填圧力で変形を起こさない材料からなる粒子を選択する工程を含む請求項１６記載の方法。２２．該粒子がアルミナ、シリカ、チタニア、バナジア、ジルコニア及びカーボンのうちの１種以上から形成される請求項１６記載の方法。２３．平均径が約６０Å〜約５０００Åの範囲にある細孔を有するように該粒子を選択する請求項１６記載の方法。２４．該粒子を実質的に５×１０³ｐｓｉ以上の圧力で充填する工程を含む請求項３５記載の方法。２５．互いに接触する粒子間の間隙空間以外には実質的に該カラム内に空隙を形成しないように該粒子を充填する工程を実行する請求項３５記載の方法。２６．該間隙容積の少なくとも実質的部分に約５０００以上の換算速度で溶離液の流れを生起するのに十分な速度で該溶離液を該床に流すことにより、負荷された溶質を該床から溶離する工程を含む請求項３５記載の方法。２７．溶離液により該床から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、溶離液のレイノルズ数の増大とともに減少するように選択された速度で、該溶離液を該床に流すことにより、該溶離工程を実行する請求項２６記載の方法。２８．溶離液により該床から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、該溶離液中における該溶質の拡散係数の大きさの直接的関数となるように選択された速度で、該溶離液を該床に流すことにより、該溶離工程を実行する請求項２６記載の方法。２９．溶離液により該床から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、該溶質の分子量の大きさの逆数的関数となるように選択された速度で、該溶離液を該床に流すことにより、該溶離工程を実行する請求項２６記載の方法。３０．溶離液により該床から溶離された溶質のバンド幅の広がりが、溶離液の流れについてのレイノルズ数の逆数的関数となり、かつ該溶離液中における該溶質の拡散係数の大きさの直接的関数となるように選択された速度で、該溶離液を該床に流すことにより、該溶離工程を実行する請求項２６記載の方法。３１．該粒子として少なくとも約５００μｍの粒径を有するものを選択し、約５００００以上の換算速度で負荷工程および溶離工程を実行する請求項２６記載の方法。３２．クロマトグラフ活性粒子の充填床に導入された溶質が該粒子に非特異的に結合することになるクロマトグラフィープロセスにおいて、液体混合物中の該溶質を約５０００以上の換算速度で該カラムに流す工程を含んでなる上記非特異的結合を低減する方法。３３．該混合物の流れが実質的に乱流である請求項３２記載の方法。３４．該負荷工程が、少なくとも該換算速度で該混合物を該カラムに注入し、次いでほぼ直ちに、少なくとも該換算速度で溶離液を流して該混合物中の溶質を該カラムから溶出させることからなる請求項３２記載の方法。３５．クロマトグラフィーカラムを形成するように該粒子を乱流容器内に充填することにより、該床を形成する請求項１６記載の方法。