JPH11514848A

JPH11514848A - 黒色腫関連タンパク質

Info

Publication number: JPH11514848A
Application number: JP9-505336A
Authority: JP
Inventors: プルシュケ，ゲルト; シュミット，ペーター
Original assignee: ノバルティス・アクチエンゲゼルシャフト
Filing date: 1995-10-10
Publication date: 1999-12-21

Abstract

(57)【要約】本発明は、黒色腫関連タンパク質（ＭＣＳＰ）、該タンパク質の誘導体およびその調製手段および方法に関する。本発明はまた、該黒色腫関連タンパク質をコードする単離核酸、この核酸分子を得る方法、およびその発現にも関する。さらに、本発明は該タンパク質および核酸の使用、特に、該タンパク質を産生する腫瘍、例えばヒト悪性黒色腫、肉腫および膠芽腫の診断、予防および治療に関連した使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】黒色腫関連タンパク質本発明は、黒色腫関連タンパク質（ＭＣＳＰ）、該タンパク質の誘導体およびその調製手段および方法に関する。本発明はまた、該黒色腫関連タンパク質をコードする単離核酸、この核酸分子を得る方法、およびその発現にも関する。さらに、本発明は該タンパク質および核酸の使用、特に、該タンパク質を産生する腫瘍、例えばヒト悪性黒色腫、肉腫および膠芽腫の診断、予防および治療に関連した使用に関する。過去２０年間、一部には、この疾患は予後不良で症例が増加しているため、ヒト悪性黒色腫の生物学および病態生理学にかなりの関心が集まっている。ヒト皮膚黒色腫が致命的な性質をもつことから(これは、慣用的な照射および化学療法にあまり反応しないことに起因する)、黒色腫関連抗原（ＭＡＡ）に対する関心が高まっている。このタンパク質は黒色腫細胞に発現されるが、正常の皮膚メラニン細胞には発現されず、これは、黒色腫、または特に黒色腫進行段階に独特な抗原、および全ての神経外胚葉を起源とする腫瘍に典型的な別の抗原を含む。立証され、または推定上の生化学的および免疫学的特徴に基づき、ＭＡＡは細胞基底相互作用糖タンパク質、イオン輸送および結合タンパク質、ガングリオシド、および増殖因子のレセプターに分類し得る。細胞基底相互作用糖タンパク質のカテゴリーには、比較的高分子量のＭＡＡがいくつか含まれている。今日まで、ヒト黒色腫細胞または該細胞の膜調製物に対して産生されるマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、この抗原の同定および部分的特徴付けに利用されてきた。このようにして、ヒト黒色腫コンドロイチン硫酸プロテオグリカン(ＭＣＳＰ)(これはまた、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）とも呼ばれる)は、ｍＡｂ９.２.２７を用いて同定された(Morgan e t al.、Hybridoma 1、27-36(1981))。ＭＣＳＰは９０％以上のヒト黒色腫組織および培養物に発現され、細胞の８０〜１００％が１×１０⁵〜６×１０⁶結合部位／細胞の濃度のＭＣＳＰを発現する(BumolおよびReisfeld、Proc.Natl.Acad .Sci.U.S.A.79,1245-1249(1982)；Bumol et al.、J.Biol.Chem.267、12733-1274 1(1984)；MuellerおよびReisfeld、Encyclopedia of Human Biology(Dulbecco編 ),p.957-967、Academic Press、ニューヨーク(1991))。ＭＣＳＰは、独特な糖タンパク質−プロテオグリカン複合体であることが報告されている。高マンノース型のアスパラギン−Ｎ結合オリゴ糖を有する、ＭＣＳＰのコア糖タンパク質は２５０kＤa分子である。コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン多糖類鎖をコア糖タンパク質のセリン残基に添加すると、２５０kＤa のコアタンパク質が高分子量のプロテオグリカン形に変換される。コンドロイチン硫酸鎖の完全な相補鎖を含む成熟プロテオグリカンの分子量は、４２０〜１０００kＤaであると推定されている(HarperおよびReisfeld、「プロテオグリカンの生物学(Biology of Proteoglycans)」(WightおよびMecham編)、p.345-366、Ac ademic Press、Orlando(1987))。ラット相同体のコアタンパク質の一次構造（ＮＧ２と呼ぶ）はNishiyama et al.、J.Cell Biology 114、359-371(1991)で既知である。プロテオグリカンは増殖制御、接着関与、細胞−基質相互作用および細胞−細胞接着に関与している(HardinghamおよびFosang、FASEB J.6,861-870(1992))。このように、ＭＣＳＰはミクロスパイクにより黒色腫細胞の上側表面に発現されることが発見され、細胞周辺にある２０μｍまでの大きさの１〜２μｍ構造体からなる。これらの周辺構造は細胞−細胞接着に関与し、また、基質と接触した複雑な足場構造を形成する(Bumol et al.、1984、上記；Harper et al.、J.Immuno l.132,2096-2104(1984)；Garrigues et al.、J.Natl.Cancer Inst.71,259-263(1 986))。細胞膜に沿って存在する接着プラークもまた、ＭＣＳＰを高度に発現した(Harper et al.、上記；HarperおよびReisfeld、J.Natl.Cancer Inst.71、259 -263(1983))。細胞−基質相互作用の安定化においてこの分子が果す可能性のある役割は、プロテオグリカンとコアタンパク質の両方を指向するｍＡｂ９.２.２７が、内皮基底膜に拡大する黒色腫細胞を早期に阻害するが、細胞接着にはほんのわずかしか影響を与えないという発見により提示される。コンドロイチン硫酸鎖を添加して修飾、またはコンドロイチン硫酸非修飾のいずれか２つの形で、ＭＣＳＰコアタンパク質が細胞表面に発現するというデータから、グリコサミノグリカン（ＣＡＧ）鎖はコアタンパク質の細胞表面発現に必要でないであろうことが示唆される。従って、このような修飾は細胞表面の分子を分離するマーカーではなさそうである(Harperet al.、J.Biol.Chem.261、3600-3606(1986))。さらに、ｍＡｂ９.２.２７により認識されるＭＣＳＰは、黒色腫細胞において、α４β １インテグリンと関連した拡大および点接触形成のコレセプターとして働くと報告されており、ＭＣＳＰが裏返しシグナル機構によりα４β１インテグリンと情報伝達するモデルが想定される(Iida et al.、Cancer Research 55、2177-2185( 1995))。ＭＣＳＰはまた、黒色腫患者の腫瘍の放射イメージにおける有効な標的であることが証明され(Oldham et al.、J.Clin.Oncol.2、1235-1245(1995))、現在、抗 −ＭＣＳＰｍＡｂにより定義された抗原決定基の細胞内イメージを有する、抗イディオタイプｍＡｂを用いた活性−特異的免疫療法を標的とするのに使用されている(Kusama et al.、J.Immunol.143、3844-3852(1989)；Chen et al.、Cancer R es.53,112-119(1993))。このように、担体と抗イディオタイプｍＡｂをコンジュゲートし、アジュバントと共に投与すると、進行黒色腫に罹患する免疫患者の約６０％に体液性抗−ＭＣＳＰ免疫を誘導する(Mittelman et al.、Proc.Natl.Aca d.Sci.U.S.A.89、466-470(1992))。この抗−ＭＣＳＰ免疫の発生は、統計学的に有意に寿命の延長に関連することが示された。ＭＣＳＰのいくつかの特徴は、上記で示した文献に記載されているが、ＭＣＳＰの正確な構造はこれまでに刊行されていない。高いＭＣＳＰ発現が病理学的に重要であることから、特に転移性病巣において、ＭＣＳＰを経由した細胞シグナル情報伝達、並びに、周辺細胞との相互作用および腫瘍拡大におけるＭＣＳＰの役割についてより深い理解が必要である。これまで、ヒト悪性黒色腫および腫瘍進行に対する深い洞察、並びに、高いＭＣＳＰ発現を示す腫瘍の診断、予防および治療における必然的な改善は、精製形のＭＣＳＰおよびアミノ酸および核酸配列情報が入手できなかったことで顕著に阻害された。特に、この知識の欠如は、腫瘍成長および転移性拡大に影響を与えることのできるヒト治療剤の探索には障害となってきた。本発明で、全長のヒトＭＣＳＰをコードするＤＮＡの単離およびシークエンスを達成し、よって、例えば組換えＤＮＡ技術により、ヒトＭＣＳＰのアミノ酸配列が提供され、ＭＣＳＰの産生が可能となる。全長のタンパク質をコードする完全なｃＤＮＡの合成は、極めて困難であり、慣用的な方法では行うことができない。本発明で初めて、ＭＣＳＰ構造と機能の相関が可能となり、従って、ＭＣＳＰ発現により特徴づけられる腫瘍、例えばＭＣＳＰを発現する黒色腫、膠芽または肉腫の改善された診断、予防および治療などの手段が提供される。より具体的には、本発明はＭＣＳＰと呼ばれる精製または単離タンパク質、またはその誘導体に関する。明細書で使用されている、「精製」または「単離」なる語は、実質的に純粋な形の本発明に記載の分子を意味し、この分子は天然源または遺伝子工学から得られる。本発明の精製タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡは、天然のタンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡとは違う点で、例えばＭＣＳＰの発現または活性を選択的に調節する化合物の同定などに有益であり得る。好ましい態様において、本発明は配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、特に１位のアミノ酸（Ａla）から２２９３位のアミノ酸（Ｖal）のアミノ酸配列を有する成熟タンパク質に関する。以後、このようなタンパク質をＭＳＣＰと呼ぶ。配列番号２の２９から１のアミノ酸を含むペプチドは、ＭＣＳＰシグナル・ペプチドを示す。ＭＣＳＰは、単一の疎水性膜貫通領域で比較的短い細胞質尾から分離された、大きなアミノ−末端外ドメインをもつ細胞内膜タンパク質であることが発見されている。本明細書で理解されている「単離ＭＣＳＰ」または「本発明のタンパク質」の範囲内に含まれるものは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質の脱グリコシル化、非グリコシル化またはグリコシル化形、ＭＣＳＰコード一次転写産物の選択的スプライシングにより産生されたｍＲＮＡによりコードされたスプライシング変異、および配列番号２のタンパク質のアミノ酸変異体である。加えて、本発明はインビトロで産生された、本発明のタンパク質の共有結合または集合による誘導体に関する。本発明によると、精製ＭＣＳＰは、実質的に天然に存在する物質が全部なく、それがあればヒト組織に典型的にみられる。例えば、組換え手段により産生したＭＣＳＰは、インビボの生理学的環境において典型的にみられる不純物がない。精製ＭＣＳＰはまた、組換え細胞培養物中の本発明に記載のタンパク質をも含む。本発明の前述したタンパク質、またはその誘導体は、天然ＭＣＳＰに特徴的なプロフィールと実質的に質的に同一か、または少なくともこのＭＣＳＰプロフィールの主要部が同一である生物学的プロフィールを示す。インビトロおよびインビボにおける生物学的プロフィールは、抗原性、リガンド結合およびシグナル情報伝達を含む。本発明のタンパク質の生物学的プロフィール、または特にその生物学的活性は、精製形の該タンパク質またはＭＣＳＰを産生する宿主細胞を用いた適当なアッセイで評価し得る。どのような場合でも、本発明のタンパク質は、ＭＣＳＰに共通した少なくとも１つの免疫エピトープを有するか、または該エピトープと似る。このようなタンパク質は、ＭＣＳＰの免疫学的等価体と呼ぶ。ＭＣＳＰに共通した少なくとも１つの免疫エピトープを有するタンパク質は、配列番号２の少なくとも８から約１１個の連続したアミノ酸を含み、天然ＭＣＳＰに特異的な抗体と交差反応できる。このように、本発明のタンパク質は、抗− ＭＣＳＰ抗体、例えば黒色腫細胞またはその膜画分に対して産生される抗体への、天然ＭＣＳＰの結合と競合することができる。このような抗体の例は、ｍＡｂ９.２.２７(BumolおよびReisfeld、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1245-1249(1982) )、ｍＡｂ２２５.２８（欧州特許0 380 607号、ＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＢ10141 ）およびｍＡｂ７６３.７４(Giacomini et al.、J.Immunol.135、696(1985))である。ＭＣＳＰは、ヒトコラーゲンVI型の細胞表面レセプターとして作用する。それ故、本発明のタンパク質のリガンド結合活性を決定するに適当なアッセイは、本発明の該タンパク質とコラーゲンVI型間の相互作用を決定するアッセイである。このアッセイは当業者には既知であり(例えば、Stallcup et al.、J.Cell Biol. 111、3177-3188(1990)；NishiyamaおよびStallcup、Mol.Biol.Cell 4、1097-110 8（1993）参照)、本発明のタンパク質を産生する細胞をコラーゲンVI型と接触させ、例えば免疫蛍光染色などの適当な陰性の対照と比較しコラーゲンVI型の該細胞への結合を評価することを含む。例えば、内因性ＭＣＳＰまたはその相同体を産生しないが、VI型コラーゲンを分泌することのできる哺乳動物細胞、例えばＢ２８ラット神経細胞またはＵ２５１ＭＧヒト膠腫細胞を、本発明の膜結合タンパク質をコードするＤＮＡを用いてトランスフェクションさせる。細胞表面に本発明の該タンパク質を産生するトランスフェクション細胞を、コラーゲンVI型を細胞表面に固定する本発明のタンパク質の能力についてアッセイを行う。別に、リガンド結合アッセイを、有利には固体相に付着した精製コラーゲンVI型および単離した本発明のタンパク質を用いて行い得る。細胞表面ＭＣＳＰは、α４β１インテグリンの機能および／または活性を修飾することができる(Iida et al.、J.Cell Biol.118、431-444(1992))。従って、本発明のタンパク質のこの能力は、本発明のタンパク質をコードし、細胞表面に該タンパク質を産生するＤＮＡでトランスフェクションさせた適当な細胞を用いて、慣用的な細胞接着アッセイで試験し得る(例えば、Iida et al.、J.Cell Bio l.118,431-444(1992)参照)。本発明のタンパク質のシグナル形質導入は、当分野で使用される方法、例えばIida et al.(Cancer Research 55、2177-2185(1995)) に従って細胞拡大および点接触接着調節における、本発明の該タンパク質および α４β１インテグリンの間の相関を評価することにより試験し得る。本発明に記載のＭＣＳＰグリコシル化形は、例えば天然（ヒト）グリコシル化形態、例えば高マンノース型のアスパラギンＮ−結合オリゴ糖を含むＭＣＳＰ糖タンパク質、または部分的または完全コンドロイチン硫酸鎖を含むＭＣＳＰプロテオグリカン、または天然ＭＣＳＰにみられるものとは異なるグリコシル化形態を含むグリコシル化変異である。本発明に記載のＭＣＳＰの非グリコシル化形は、ＭＣＳＰのグリコシル化形の脱グリコシル化、例えばグリコシル残基の酵素的除去、または適当な原核細胞における本発明のタンパク質をコードする核酸の発現により得られ得る。本発明に従って、アミノ酸変異（mutein）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列をもつタンパク質の置換、挿入または欠失変異であり得る。天然に存在する対立または種間変異とは対照的に、このような変異は変異の以前に決定されている性質により特徴づけられている。置換、欠失および挿入を組み合わせて、本発明のアミノ酸変異をおこし得る。例えば、置換アミノ酸変異体は配列番号２に示される配列と実質的に同一なアミノ酸配列を有するあらゆるポリペプチドであり、ここで、１つ以上の残基は機能的に類似のアミノ酸残基で保存的に置換され、前記したようにＭＣＳＰエピトープを模擬できる。保存的置換には、例えば、１つの非極性（疎水性）残基、例えばメチオニン、バリン、ロイシン、イソロイシンを他で置換する、１つの極性（親水性）残基を他で置換、例えばグリシンおよびセリン間、アルギニンおよびリジン間、およびグルタミンおよびアスパラギン間を含む。置換または欠失変異を利用して、ＭＣＳＰからＯ−またはＮ−結合グリコシル化部位を削除し得る。ＭＣＳＰは１５個のＮ−結合グリコシル化部位を有し、これはトリペプチド配列Ａsn−Ｘ−Ｔhr（Ｓer）のアクセプターアミノ酸アスパラギン（Ａsn）の存在により特徴づけられ、ただし、Ｘはアスパラギン酸（Ａsp）を除く２０個の天然Ｌ −アミノ酸のいずれかであり得る(HubbardおよびIvatt、Ann．Rev.Biochem.50、 555-583(1981))。ＭＣＳＰ配列のＯ−結合グリコシル化部位は、セリン残基がグリシン残基の先にくるということを特徴とする。このようなＳer／Ｇly対は、配列番号２の５１／５２、１７８／１７９、５７０／５７１、９６６／９６７、１０２０／１０２１、１０６７／１０６８、１１３１／１１３２、１３０９／１３１０、１３５５／１３５６、１４７５／１４７６および１８７２／１８７３位に位置する。システインまたは他の化学変化を受け易いアミノ酸残基はまた、例えば本発明のタンパク質の酸化に対する安定性を増加させるのに望ましい。本明細書で定義したように、ＭＣＳＰの欠失アミノ酸変異体はまた、配列番号２の８個以上の連続アミノ酸、すなわち８から２２９２の連続アミノ酸からなる成熟全長ＭＣＳＰのフラグメントを含む。本発明に従って、このようなＭＣＳＰフラグメントは欠失変異体の好ましい態様である。好ましくは、配列番号２の約１０から約１００、特に、約１０から約５０個の連続アミノ酸を含む成熟ＭＣＳＰのフラグメントである。欠失変異体の主要なクラスは、ＭＣＳＰの膜貫通および／または細胞質領域を含むものである。膜貫通ドメインの次にＮ末端細胞外ドメインが続き、実質的に約２５個のアミノ酸からなる。配列番号２の約２１９３残基（Ｍet）から約２２１７アミノ酸残基（Ｌeu）まで延び、この高度に疎水性なドメインは細胞膜の脂質二重層に広がる適当なサイズである。ＭＣＳＰの細胞質ドメインに膜貫通ドメインが続き、配列番号２のおよそ２２１８位（Ａrg）で始まるアミノ酸残基のＣ末端配列である。細胞質および膜貫通ドメインの一方または両方の欠失または置換は、水性溶液中にタンパク質を維持する界面活性剤が必要でないように、細胞性または膜脂質親和性を減少させ、および水中または緩衝液中の溶解度を向上させることにより、本発明の組換えタンパク質の回収を促進する。ＭＣＳＰの膜貫通および細胞質領域を含む欠失変異体の例は、配列番号２のアミノ酸１（Ｍet）からアミノ酸１５９３（Ｖal）の配列をもつＭＣＳＰフラグメントである。配列番号２の少なくとも８個、特に約１０個から約５０個の連続したアミノ酸からなる、このような欠失変異体およびそのフラグメントが特に好ましい。本発明の好ましいタンパク質は、グリコシル化または非グリコシル化形の配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する成熟ＭＣＳＰ、および上記で定義したＭＣＳＰのフラグメントであるその欠失変異体である。本発明のタンパク質の誘導体は、他の化学的部分と、該タンパク質の共有結合または集合コンジュゲートであり、該誘導体は本発明の非誘導タンパク質と実質的に同じ生物学的プロフィールを示す。本発明に記載の具体例の共有結合コンジュゲートは、本発明のタンパク質と、他のタンパク質またはペプチド、例えば本発明のタンパク質を含むタンパク質、特にＭＣＳＰフラグメント、および本発明の該タンパク質のインビボにおける抗原性を亢進するに適当な担体タンパク質とのコンジュゲートである。本発明の共有結合コンジュゲートは、さらに、希土酸化物キレートまたはビオチンに共有結合した、または蛍光部分にコンジュゲートした、検知可能な基で標識した本発明のタンパク質、例えば放射標識した本発明のタンパク質を含む。本発明のタンパク質の集合誘導体は、例えば細胞膜と該タンパク質との吸着複合体である。本発明のタンパク質は天然源から、例えばヒト細胞またはＭＣＳＰを発現するヒト組織、例えばヒト黒色腫組織からの単離により、または、好ましくは、化学的合成または組換えＤＮＡ技術により得られる。また、これらの技術の組合せを使用して本発明のタンパク質が得られる。配列番号２で提供されるアミノ酸配列に基づき、本発明のタンパク質の化学的合成は、当分野で既知の慣用的な方法で行う。一般的に、これらの方法は１つ以上のアミノ酸残基を伸長（ポリ）ペプチド鎖に連続的に添加することを含む。必要であれば、反応性基、例えば遊離アミノまたはカルボキシ基は、適当な選択的に除去できる保護基により保護される。化学的合成は、約１００個以上、通常約２０から４０個のアミノ酸残基を有するＭＣＳＰのフラグメントに特に有利であり得る。本発明はまた、本発明のタンパク質の調製法を提供し、該方法は本発明のタンパク質を産生する適当な宿主細胞をインビトロまたはインビボで増殖させることを特徴とする。好ましくは、宿主細胞を、プロモーターおよび本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列（このＤＮＡはこのプロモーターにより制御される）を含む発現カセットを含むハイブリッドベクターを用いて形質転換またはトランスフェクションさせる。続いて、本発明のタンパク質を回収し得る。回収は、例えば宿主細胞から本発明のタンパク質を単離し、または例えば培養ブロスから、タンパク質を含む宿主細胞を単離することを含む。適当な宿主細胞は、真核細胞、例えば、動物細胞、植物細胞および真菌、及び原核細胞、例えばグラム陽性およびグラム陰性細菌、例えば大腸菌を含む。本明細書で使用しているように、インビトロは生体外を意味し、従って、例えば細胞培養および組織培養条件を含む。前記で定義したように、アミノ酸変異体は、例えば配列番号２のタンパク質をコードするＤＮＡ（このＤＮＡは、インビトロで部位特異的に突然変異誘発をおこしている）から産生され、結果、例えば１個以上のアミノ酸の添加、変換および／または欠失がおこる。アミノ酸変異を誘導する部位は前以て決定するが、変異自体は前以て決定する必要はない。しかし、ランダムな変異は標的コドンまたは領域でおこり得る。例えば、置換、欠失および挿入変異体は組換え法により調製され、本発明のタンパク質の天然形と免疫−交差反応で選抜する。別に、本発明の変異体は、当分野で慣用的に使用されている化学的合成により調製し得る。本発明の膜貫通および／または細胞質欠失または置換アミノ酸変異体は、組換え細胞培養物中で直接に、またシグナル配列、好ましくは宿主相同シグナルを用いた融合として産生できる。例えば、原核細胞発現ベクターの構築において、膜貫通および細胞質ドメインを、細菌アルカリ性ホスファターゼ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーにより削除し、および、酵母については、ドメインを酵母インベルターゼ、アルファ因子または酸性ホスファターゼリーダーで置換する。哺乳動物細胞発現においては、膜貫通及び細胞質ドメインを、哺乳動物細胞ウイルス分泌リーダーで置換し得る。膜貫通および細胞質領域を両方共欠く変異体の利点は、培養培地に分泌できることである。本発明のタンパク質はまた、当分野で慣用的な方法に従って、インビトロで誘導体化し得る。本発明のタンパク質またはその誘導体は、例えば、免疫源として、例えばＭＣＳＰ特異的免疫試薬を上昇させるための、免疫試薬として、薬物またはリガンドスクリーニングアッセイにおいて、または精製法、例えば結合リガンドのアフィニティー精製において使用し得る。インビボ投与に適し、内因性リガンドについて内因性ＭＣＳＰと競合することができる、本発明のタンパク質またはその誘導体、例えばコラーゲンVI型は、治療剤と考えられている。本発明はまた、ＭＣＳＰに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の産生のための、本発明のタンパク質またはその誘導体の使用に関する。このような抗−ＭＣＳＰ抗体は免疫血清を含むと理解される。この目的に特に有益なものは、配列番号２の少なくとも８個以上、好ましくは８から約２０個の連続したアミノ酸からなるＭＣＳＰフラグメントである。本発明のタンパク質に対して産生される抗体は、非グリコシル化またはグリコシル化形のＭＣＳＰ、またはその両方と反応し得る。本発明のタンパク質に対して産生されるモノクローナルおよび特にポリクローナル抗−ＭＣＳＰ抗体は、腫瘍関連ＭＣＳＰ発現検知に、例えばヒト悪性黒色腫の診断または黒色腫進行および処置のモニタリングに、免疫試薬として使用し得る。例えば、このような抗体は黒色腫病巣部位を埋め込んだ固定パラフィンにおけるＭＣＳＰ検知に適している。抗体は、当分野で良好に確立された方法に従って、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ヤギまたはウサギで産生される。免疫試薬として使用する抗−ＭＣＳＰ抗体を産生するために、抗原として使用する本発明のタンパク質がＭＣＳＰのグリコシル化部位または膜貫通ドメインのどの部分も含まないのであれば、有利である。免疫試薬として特に有益なものは、単一のＭＣＳＰ抗原決定基を示す本発明のペプチドに対して産生する抗体である。本発明はまた、ワクチンとしての、本発明の適当な免疫原性タンパク質、またはその適当な免疫原性誘導体の使用、およびヒトにワクチン接種する方法に関し、本発明の適当な免疫原性タンパク質の投与、またはその適当な免疫原性共有結合コンジュゲートを該ヒトに投与することを含む。この方法は、ヒトに抗腫瘍応答を誘導する方法にも関し、本発明の適当な免疫原性タンパク質、またはその適当な免疫原性誘導体の投与を含む。本発明の適当な免疫原性タンパク質、またはその適当な免疫原性誘導体は、インビボで抗ＭＣＳＰ応答を誘導することができる。本発明に記載のワクチンは、ＭＣＳＰ発現腫瘍の素因を有するか、または罹患している患者の予防および治療処置に適用できる。上記したように、ＭＣＳＰは黒色腫の効果のある免疫療法の適当な標的である。なぜなら、転移拡大に関与する高率の黒色腫病巣により発現されるからである。このように、本発明の適当な免疫原性タンパク質、またはその誘導体は、例えばＭＣＳＰ発現腫瘍、例えば黒色腫の制御、処置、またはアジュバント処置に有益な薬剤である。より具体的には、本発明の適当な免疫原性タンパク質、またはその誘導体は、例えば、初期病巣の手術後の転移性疾患の危険のある初期の黒色腫患者の腫瘍退行を引き起こすためおよび／または腫瘍再発を防ぐために、良好に使用できる。このようなタンパク質または誘導体は、ＭＣＳＰの特異的な抗原決定基を有するまたは疑似した「適するように調製したもの」であり得る。ワクチンとして使用するに好ましいものは、配列番号２の組換えＭＣＳＰ、または、少なくとも８個以上、好ましくは８から約５０個の連続したアミノ酸からなるフラグメントである。有利には、ワクチンとして使用するペプチドはグリコシル化部位がなく、ＭＣＳＰの細胞外ドメインの８から約４０個の連続アミノ酸からなる。このＮ末端ドメインは約２１９２アミノ酸からなり、配列番号２の１位のアミノ酸残基から約２１９２位のアミノ酸残基におよぶ。フラグメントサイズの好ましい限界値は、基本的に、現在のテクノロジーによる、合成ポリペプチドのサイズおよび精製限界による。ワクチンとして使用するに特に好ましいものは、上記で強調したフラグメントである。ビボ投与における適当なＴ細胞依存性（メモリー）応答の誘導は、本発明のタンパク質の免疫原性の亢進（例えば、このタンパク質を担体タンパク質にコンジュゲートさせることによる）、アジュバントの存在、または生ワクチン接種に適した物質、例えばウイルス、細菌または自己抗原提示細胞による発現の存在を要求し得る。ワクチン接種後におこる抗−ＭＣＳＰ免疫応答誘導は、当分野で既知の方法、例えば、ワクチン接種を受けた患者の体液（例えば血清）における抗− ＭＣＳＰ抗体滴定の測定により、固相酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるといった、当分野で既知の方法で解析し得る。担体タンパク質成分として、本発明の適当な免疫原性コンジュゲートは、例えば、無毒性、非発熱性、水溶性、医薬的に許容される担体タンパク質、好ましくはむきだしのアミノ基を有するタンパク質といった、ヒトに有益なあらゆる担体タンパク質を含み得る。担体タンパク質成分として適当なものは、幅広い範囲の多型ＨＬＡクラスＩおよびクラスII遺伝子産物、例えば、微生物、特に細菌、タンパク質、ポリペプチドまたはオリゴペプチドに結合する、高度に免疫原性の不規則なＴ細胞エピトープを含むあらゆるタンパク質分子である。特に好ましいものは、上記で説明したＭＣＳＰフラグメント、および細菌毒素、例えば破傷風毒素（例えば、B.Bizzini in Bacterial Vaccines、Academic Pr es s、1984：Tetanus、p.38-68参照）またはジフテリア毒素から得られる担体タンパク質成分(このタンパク質成分は毒素活性がないが、毒素に特有の抗原性特性、例えば強力な免疫原性を有する)、例えば毒素活性のない変異ジフテリア毒素を含む本発明の共有結合コンジュゲートである(Uchida et al.、J.Pharma Biol. Chem.218、3838-3844(1973))。このような無毒性担体タンパク質成分は、例えば破傷風毒素の場合、例えば毒素の解毒により、または、例えばジフテリア毒素の場合、突然変異により得られる。ジフテリア毒素はR.K.Holmes、Infect.Immun.12、1392(1975)により開示された方法に従って、コリネバクテリウム・ジフセリエＰＷ８の培養上清から得られる。本発明の共有結合コンジュゲートを形成するに好ましい担体タンパク質は、変異ジフテリア毒素ＣＲＭ１９７である。ＣＲＭ１９７はジフテリア毒素と免疫学的に交差反応する毒素タンパク質であり、Ｃ.ジフテリアＣ７の培養上清から得られる(R.K.Holmes、上記；米国特許4,925,792号、これは引用して本明細書に取り込む)。ＣＲＭ１９７タンパク質はジフテリア毒素と同じ分子量を有し、毒素の機能および構造と同一なフラグメントＢ、および、無毒性で元のフラグメントと１個のアミノ酸が異なるフラグメントＡからなる。担体タンパク質は、官能基を含む本発明のタンパク質に共有結合し得る。カップリング反応は、タンパク質の凝集を防ぐように、当分野で既知の方法で行う。別に、ＭＣＳＰ担体タンパク質コンジュゲートは組換え法により融合タンパク質として産生し得る。本発明はまた、本発明の適当な免疫原性タンパク質、好ましくは上記に特定した本発明好ましいペプチド、またはその誘導体を含む、哺乳動物に使用する免疫源にも関する。好ましくは、本発明に記載のペプチドのような単一のタンパク質および上記の担体タンパク質を含む免疫源である。本発明はまた、本発明に記載のタンパク質を含む医薬組成物にも関する。特に、本発明は、適当な免疫原性形、上記にように、例えば適当な担体タンパク質に結合した上記に特定した本発明の好ましいペプチドを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、例えば、医薬的に許容される無機または有機の固形または液状担体と共に、または混合した、適当な免疫原性形の、治療有効量の本発明のタンパク質を含む。好ましくは、追加的にアジュバント、すなわち免疫応答をさらに増大させる薬剤を含む医薬組成物である。利用可能なアジュバントは、フロイントの完全アジュバント(鉱油、水およびマイコバクテリウム抽出物のエマルション)、フロイントの不完全アジュバント(水および油のみのエマルション)、鉱物ゲル、例えば水酸化アルミニウムゲル、リゾレシチンなどの表面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、ＢＣＧ（Bacillus Calmette-Guerin）等である。特に好ましくは本発明の適当な免疫原性コンジュゲート、およびアジュバントのＭＦ５９(国際特許出願ＷＯ90/14837)、および所望により、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−[１,２−ジパルミトイル−sn− グリセロ−３−(ヒドロキシホスホリルオキシ]エチルアミド（ＭＴＰ−ＰＥ；国際特許出願ＷＯ90/14837）からなる医薬組成物である。好ましくは、非経腸適用の医薬組成物である。筋肉内、皮下または静脈内適用の組成物は、例えば、所望により使用する直前に凍結乾燥または濃縮製剤から調製した等張水溶液または懸濁液である。医薬組成物は滅菌し得、例えば成分を保存、安定化、湿潤、乳化または溶解するためのアジュバント、浸透圧を調節するための塩、粘度を調節する緩衝液および／または化合物、例えばカルボキシセルロースナトリウム、デキストラン、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを含み得る。これらは、例えば、慣用的な混合、溶解または凍結乾燥などの当分野で既知の方法で調製し、有効成分を約０.０１％から約５０％含む。注射用の組成物は処理し、アンプルまたはバイアルに充填し、当分野で既知の方法で無菌条件下で封をする。例えば、水溶液における溶解度から、本発明のコンジュゲートは上記のアジュバント、例えばＭＦ５９−０と共に「２つのバイアル系」で製剤化し得る。好ましくは、アジュバントと共に貯蔵製剤の筋肉内投与に適当な、上記に説明した本発明のコンジュゲートを含む医薬組成物である。他に好ましくは、本発明の適当な免疫原性タンパク質、好ましくは本発明のコンジュゲート(これは粘膜適用に適する)(H.F.Staats et al.、Current Opinion in Immunology 6,572-583(1994))、または経口免疫処置で飲むことのできる安定した医薬組成物を含む医薬組成物である。投与および用量の特定の形態は、医者が、個々の患者、状態および処置する疾患等を考慮して選択する。さらに、本発明のタンパク質またはその誘導体は、ＭＣＳＰに対して産生した抗体の定性的および定量的測定に使用することができる。これは、抗黒色腫ワクチン、例えばＭＣＳＰの細胞内イメージを有する抗イディオタイプ抗体、特に欧州特許出願ＥＰ−Ａ−0 428 485に開示された抗体、黒色腫細胞、またはその膜画分、黒色腫細胞溶解物、または本発明の適当な免疫原性タンパク質により誘導された抗−ＭＣＳＰ免疫応答の検知に特に有益である。例えば、本発明のタンパク質、または本発明に記載のその誘導体は、抗−ＭＣＳＰ抗体のイディオタイプおよび本発明の該タンパク質の間の結合相互作用を基本とする既知のあらゆるイムノアッセイで使用できる。このようなアッセイの例は、放射、酵素、蛍光、化学ルミネセンス、免疫沈降法、ラテックス凝集反応、および赤血球凝集イムノアッセイである。本発明はまた、ＭＣＰに対して産生される抗体の定性的および定量的測定の試験キットにも関し、本発明のタンパク質および／またはその誘導体および、所望によりアジュバントを含む。さらに別の態様では、本発明は、本発明のタンパク質をコードする、単離された、好ましくは組換え核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）、または少なくとも１４個のヌクレオチドからなる該核酸のフラグメントを含む核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ）に関する。本発明によると、本発明の単離ＭＣＳＰをコードする核酸は、天然とは違う形式または設定で存在するＭＣＳＰコード核酸を含み、従って、通常のＭＣＳＰ発現細胞におけるこのような核酸を包含し、ただし、核酸は天然細胞とは違う染色体位置にあるか、または天然とは異なるＤＮＡ配列でフランクされている。ＭＣＳＰ遺伝子はヒト染色体第１５に位置する。特に、本発明は、本発明のタンパク質をコードする精製または単離ＤＮＡ分子、または以後特定するスクリーニング・プローブとして使用するに適した該ＤＮＡのフラグメントを提供する。定義により、このようなＤＮＡは一本鎖コードＤＮＡ、該コードＤＮＡおよびその相補ＤＮＡからなる二本鎖ＤＮＡ、またはこの相補（一本鎖）ＤＮＡ自体を含む。好ましくは、好ましいと本明細書で同定した上記の本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ、または該ＤＮＡのフラグメントである。好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列を有する成熟タンパク質をコードするＤＮＡ、特に配列番号１で示されるヌクレオチド配列を実質的に有するＤＮＡ、または、それぞれ配列番号１の４８６７ｂｐから７８９８ｂｐの範囲の配列のＤＮＡおよび配列番号１の４８５８ｂｐから５３５７の範囲の配列のＤＮＡを除いた、配列番号１で示されるアミノ酸配列の少なくとも１４個の連続したアミノ酸からなる該タンパク質のフラグメントをコードするＤＮＡである。特に好ましくは、配列番号１で示される成熟ＭＣＳＰをコードするＤＮＡ、または上記で強調したＭＣＳＰフラグメントをコードするもの、例えば配列番号１のアミノ酸１からアミノ酸１５９３の範囲のＭＣＳＰフラグメントをコードするＤＮＡ、または該フラグメントの一部である。本発明の核酸は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入またはヌクレオチド伸長の反転、およびそれらのあらゆる組合せにより容易に修飾できる。このような修飾を受けた配列を使用して、天然でみられるＭＣＳＰ配列とは異なるアミノ酸配列を有する変異体を産生できる。変異誘発は、前以て決定（部位特異的）またはランダムであり得る。サイレント変異ではない変異はリーディングフレーム外に配列を配置してはならず、好ましくは、ハイブリダイズしてループまたはヘアピンなどの二次ｍＲＮＡ構造を形成する相補領域を作製する。本発明の説明をすると、本発明の核酸は当分野で既知の方法で得られる。本発明はさらに該核酸の調製法に関する。例えば、本発明のＤＮＡは、化学的合成、組換えＤＮＡ技術または複製連鎖反応（ＰＣＲ）により得られる。本発明のＤＮＡを調製する適当な方法は、例えば、数多くのオリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ法によるその増幅、およびそのスプライシングを含み、所望のＤＮＡ配列が得られる。組換えＤＮＡ技術による、本発明のＤＮＡまたはそのフラグメントの調製は、適当なｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることを含み得る。適当なライブラリーは市販されているか(例えば実施例に使用したライブラリーのように)、またはヒト黒色腫組織サンプル、細胞系およびその他から調製できる。例えば、実質的に全てのＭＣＳＰコード領域を含むＤＮＡまたは該ＤＮＡを基本とした適当なオリゴヌクレオチド（プローブ）を用いて、ライブラリーをスクリーニングした後、陽性クローンをハイブリダイゼーション・シグナルを検知することにより同定し；同定したクローンを制限酵素マッピングおよび／またはＤＮＡシークエンス解析により特徴づけ、次いで、例えば本明細書で前記した配列と比較することにより、それらが完全なＭＣＳＰをコードするＤＮＡを含むかどうか（すなわち、それらが翻訳開始および終止コドンを含むかどうか）を確認する。選択したクローンが不完全であれば、それらを使用して、オーバーラップするクローンを得るために同一または異なるライブラリーを再度スクリーニングし得る。ライブラリーがゲノムであれば、オーバーラップしたクローンは、エキソンおよびイントロンを含み得る。ライブラリーがｃＤＮＡライブラリーであれば、オーバーラップしたクローンはオープンリーディングフレームを含む。療法の場合には、完全なクローンはＤＮＡ配列および本明細書で提供した仮想アミノ酸配列と比較することにより同定し得る。内因性ＭＣＳＰの存在または異常の検出のために、遺伝子スクリーニングを、ハイブリダイゼーションプローブとして、本発明のヌクレオチド配列を使用して行い得る。また、本明細書に記載の核酸配列を基本にして、アンチセンスタイプ治療薬を設計し得る。本発明の上記の組み換えタンパク質の製造に有用であることに加えて、本発明の核酸はまたプローブとしても有用であり、従って、例えば、ＭＣＳＰをコードする核酸またはそれの新規非ヒト相同物の同定および／または単離を当業者に可能とする。このような本発明のプローブは、非ラベルか容易な検出に適した化学部分でラベルされ得る。スクリーニングプローブとして、ＭＣＳＰの実質的に完全なコード領域を含むＤＮＡまたはＲＮＡをを用いるか、または該ＤＮＡを基本にした適当なオリゴヌクレオチドプローブを用い得る。(ハイブリダイゼーションを伴うスクリーニングについて)適当なオリゴヌクレオチドプローブは、配列番号１に記載の１４またはそれ以上の隣接塩基対と同じ(または相補的な)、少なくとも１４、好ましくは少なくとも約２０から３０の隣接塩基対を含むヌクレオチドの配列を有する１本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。プローブとして選択される核酸は、疑似陽性結果が最小となるように、十分な長さであり、十分に明確でなければならない。例示的プローブは、配列番号１４から１９に記載の配列のオリゴヌクレオチドである。例えば、ＭＣＳＰまたはその新規非ヒト相同物をコードする核酸の同定に適当な方法は、ＭＣＳＰ候補ＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルと上記の核酸プローブを接触させ、プローブとハイブリダイズする核酸を同定する。特に、本発明の核酸は、例えば、ＭＣＳＰ−ｍＲＮＡの存在を測定する方法に有用であり、この方法は、本発明のタンパク質をコードする(または相補的な)ＤＮＡ(またはＲＮＡ)、またはそのＤＮＡのフラグメントを、試験サンプル核酸とハイブリダイズさせ、所望のｍＲＮＡの存在を測定するか、または本発明で提供される核酸配列由来のＭＣＳＰ特異的オリゴヌクレオチドを使用して、ＭＣＳＰ−ＲＮＡを、例えば、ＰＣＲにより増幅させることを含む。この方法は、例えば、ＭＣＳＰｍＲＮＡの腫瘍への局在化のために、腫瘍、特に初期黒色腫または悪性黒色腫の転移病巣の診断に使用し得る。例えば、本発明のアンチセンスＲＮＡプローブと得られる、ＭＣＳＰｍＲＮＡ発現の特異的なin situハイブリダイゼーションシグナルは、明らかに悪性黒色腫の転移領域で得られる細胞と明らかに関係している。非特異的背景シグナルのみが腫瘍浸潤細胞で見られる。センスコントロールＲＮＡとのハイブリダイゼーションは、非特異的背景シグナルのみを製造する。本発明のタンパク質をコードするＤＮＡは、更なる操作のためにベクターに挿入することができる。更に、本発明は上記ＤＮＡを少なくとも一つ含むハイブリッドベクターである組み換えＤＮＡに関する。本発明のハイブリッドベクターは、複製の起点または自律複製配列、１個またはそれ以上の優性マーカー配列および所望により、発現コントロール配列、シグナル配列および更なる制限部位を含む。好ましくは、本発明のハイブリッドベクターは、発現コントロール配列、特に以後記載のものに操作可能に結合した上記核酸挿入物を含む。ベクターは典型的に適合宿主細胞との協同において２機能性で働く。一つの機能は、本発明のタンパク質をコードする核酸のクローニングを促進すること、即ち、核酸(クローニングベクター)を使用可能な量製造することである。他の機能は、適当な宿主中で、染色体外エレメントとして維持するか、または宿主染色体 (発現ベクター)に取り込まれるかのいずれかにより、遺伝子構築物の複製および発現を提供することである。クローニングベクターは、上記のＤＮＡ、複製起点または自律複製配列、選択マーカー配列および所望により、シグナル配列および付加的制限部位を含む。発現ベクターは、更に、本発明のＤＮＡの転写および翻訳に必須の発現コントロール配列を含む。従って、発現ベクターは、適当な宿主細胞への導入において、クローンＤＮＡの発現をもたらすプラスミド、ファージ、組み換えウイルスまたは他のベクターのような組み換えＤＮＡ構築物を意味する。適当な発現ベクターは当分野で既知であり、真核および／または原核細胞で複製可能なものを含む。ほとんどの発現ベクターは少なくとも一つのクラスの生物で複製できるが、他の生物に発現のために形質導入できる。例えば、ベクターをE．coliにクローンし、次いで同じベクターを、宿主細胞染色体を独立しては複製できない場合でさえ、酵母または哺乳類細胞に形質導入する。ＤＮＡはまた宿主ゲノムへの挿入により増殖し得る。しかしながら、ＭＣＳＰをコードするゲノムＤＮＡの回収は、外因的に複製するベクターのものよりも複雑である。なぜなら、制限酵素消化がＭＣＳＰＤＮＡの切除に必要であるからである。ＤＮＡはＰＣＲで増幅でき、複製成分無しに宿主細胞に直接形質導入できる。有利には、本発明の選択遺伝子を含む発現およびクローニングベクターをまた選択可能マーカーとも呼ぶ。この遺伝子は、選択培養培地で生育する形質転換宿主細胞の生存または生育に必要なタンパク質をコードする。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されていない宿主細胞は培養培地で生存できない。典型的選択遺伝子は、抗生物質および他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンへの耐性、栄養要求性欠失の補い、または天然培地から利用できない重要な栄養素の供給を付与するタンパク質をコードする。ベクターの増幅が、簡便にはE．coli内で起こるため、E．coli遺伝子マーカーおよびE．coliの複製起点を有利には包含する。これらはpBR322、BluescriptベクターまたはｐＵＣプラスミドのようなE．coliプラスミドから得ることができる。哺乳類細胞のための適当な選択可能マーカーは、ジヒドロフォレートレダクターゼ(ＤＨＦＲ、メトトレキサート耐性)、チミジンキナーゼまたはＧ４１８またはヒグロマイシンへの耐性を付与するような、ＭＣＳＰ核酸の取り込みの能力がある細胞の同定が可能であるものである。哺乳類細胞形質転換体は、マーカーを取り込み、発現する形質転換体のみが特有に適合できる選択圧下に置く。発現およびクローニングベクターは、通常宿主生物により認識され、ＭＣＳＰ核酸に作業可能に結合しているプロモーターを含む。このようなプロモーターは誘導可能または構造的であり得る。プロモーターは、制限酵素消化により源ＤＮＡからプロモーターを除去し、単離プロモーター配列をベクターに挿入することにより、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡに作業可能に結合する。真核宿主での使用に適したプロモーターは、例えば、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(t rp)プロモーターシステムおよびtacプロモーターのようなハイブリッドプロモーターを含む。そのヌクレオチド配列は公開され、従って、当業者はそれらを本発明のタンパク質をコードするＤＮＡと、必要な制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して、ライゲートすることが可能である。細菌システムでの使用に適したプロモーターは、また一般にＭＣＳＰをコードするＤＮＡに作業可能に結合したShine-Delgarno配列も含む。哺乳類宿主細胞中のベクターからのＭＣＳＰ遺伝子転写は、宿主細胞システムと適合するプロモーター、例えば、ウイルスゲノム由来のプロモーターによりコントロールし得る。真核宿主細胞、特に哺乳類細胞で本発明のタンパク質を発現するのに適したプラスミドは、例えば、サイトメガロウイルス(ＣＭＶ)プロモーター含有ベクター、ＲＳＶプロモーター含有ベクターおよびＳＶ４０プロモーター含有ベクターおよびＭＭＴＶＬＴＲプロモーター含有ベクターである。それらの調節の性質に依存して、プロモーターは実験条件により、構造的または調節可能であり得る。高等真核生物における本発明のタンパク質をコードするＤＮＡの転写は、ベクターへのエンハンサー配列挿入により増加し得る。本発明のベクターの構築は、既知のライゲーション法を使用する。ベクターＤＮＡの種々のＤＮＡセグメントを作業可能に結合し、即ち、それらを違いに機能的関係であるように隣接して置く。単離プラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開裂し、切断し、必要なプラスミドの産生に所望の形に再ライゲートする。所望により、構築プラスミドにおける正確な配列を確認するための分析を当分野で既知の方法で行う。発現ベクターの構築、インビトロ転写物の製造、ＤＮＡの宿主細胞への挿入およびＭＣＳＰ発現および機能の評価のための分析の実施に適当な方法は当分野で既知である。遺伝子の存在、増幅および／または発現は、本明細書に記載の配列に基づいた適当な標識プローブ、結合検定、免疫検出および機能性検定を使用して、例えば、慣用のサザンブロット、ノーザンブロットにより、サンプルを直接測定し、例えば、ｍＲＮＡの転写、ドットブロッティング(ＤＮＡまたはＲＮＡ分析)、in situハイブリダイゼーションで定量する。本発明は、更に本発明のタンパク質が製造可能であり、該タンパク質をコードする異種(外来)ＤＮＡを含む宿主細胞も提供する。本発明の核酸は、適当な発現ベクターで形質転換または形質導入された広範囲の宿主細胞、例えば、上記のもので発現できる。本発明のタンパク質は融合タンパク質としても発現し得る。組換え細胞は、次いで、本発明のＤＮＡによりコードされるタンパク質が発現される条件下で培養できる。適当な原核細胞は、Ｅ．coli、例えばＥ．coli K-12株、ＤＨ５αおよびＨＢ１０１またはＢacilliのようなグラム陰性またはグラム陽性生物のような真正細菌を含む。ベクターをコードするＭＣＳＰに適した更なる宿主細胞は、線状真菌または酵母、例えばSaccharomyses cerevisiaeのような真核微生物を含む。高等真核細胞は昆虫、両性動物および脊椎動物細胞、特に哺乳類細胞を含む。近年、培養(組織培養)における脊椎動物の増殖は慣用法になっている。本明細書で記載する宿主細胞は、in vitro培養物および宿主動物内の細胞を含む。有利には、本発明の宿主細胞は、内因性ＭＣＳＰまたはその相同物を製造しない。安定に形質導入した哺乳類細胞は、細胞をマーカー遺伝子を有する発現ベクターで形質導入し、形質導入細胞をマーカー遺伝子を発現する細胞に選択的な条件下で成育させることにより製造し得る。一時的形質導入体を製造するために、哺乳類細胞をレポーター遺伝子で形質導入し、形質導入効率を追跡する。宿主細胞を、本発明の上記発現またはクローニングベクターで形質導入または形質転換し、プロモーターの誘導に適するように修飾した慣用の栄養培地で培養し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅する。異種ＤＮＡは、宿主細胞に、リン酸カルシウム共沈澱法、エレクトロポレーションまたはリポフェクチン媒体による異種ＤＮＡをコードするベクターでの形質導入のような当分野で既知の方法により挿入し得る。形質導入の多くの方法が当分野の技術者に既知である。十分な形質導入は、通常、このベクターの機能の指標が宿主細胞に現れた時に認識される。形質導入は、使用する特定の宿主細胞に適した標準法を使用して達成される。(例えば、Sambrook et al．(1989)Molecular C loning:A Laboratory Manual，第２版，Cold Spring Habor Laboratory Press参照)。本発明のＤＮＡはまた非ヒトトランスジェニック動物、特にトランスジェニック温血動物および非ヒトトランスジェニック腫瘍細胞でも発現し得る。マウス、ラット、ウサギ、ヒツジおよびブタを含むトランスジェニック動物の製造法は当分野で既知であり、例えば、Hammer et al．(Nature 315，680-683，(1985))に記載されている。例えば、ＭＣＳＰをコードする本発明のＤＮＡと適当に位置した発現コントロール配列を含む発現単位を、受精卵の前核または腫瘍細胞に導入する。導入は、例えば、マイクロインジェクションにより達成し得る。挿入ＤＮＡの統合は、例えば、適当な組織サンプル由来のＤＮＡのブロット分析により検出される。ＤＮＡが動物の生殖系に挿入され、動物子孫に継代されるのが好ましい。トランスジェニック腫瘍細胞を適当な動物に導入する。更に、ノックアウト動物を、内因性ＭＣＳＰ−相同物に変異を導入し、それにより、もはや機能的ＭＣＳＰ−相同遺伝子を発現しない動物を発生させることにより開発し得る。例えば、ラットにおいて、ＮＧ２遺伝子をノックアウトし得る。変異または非変異ＭＣＳＰ遺伝子をノックアウト動物に導入する。異種遺伝子ノックアウト背景におけるヒト対応物ＭＣＳＰの発現は、該タンパク質の種間配列相違によるあるタンパク質(この場合、ＭＣＳＰ)の医薬の効果の考えられる差異を排除できるという独特の利点がある。更なる態様において、本発明はＭＣＳＰと相互差用できる化合物の同定のための検定に関し、本発明のタンパク質をコードし、該タンパク質を製造する異種ＤＮＡを含む細胞を、ＭＣＳＰと相互作用する能力を試験する化合物の少なくとも一つと接触させ、リガンド結合またはシグナル伝達における差異について細胞を分析することを含む。適当な分析法は当分野で既知であるか、既知の方法および本明細書で提供するガイドラインに基づいて容易に計画できる。好ましくは、異種ＤＮＡは実質的に完全なコード領域を含む。このような検定で得られる結果を、陰性コントロールとして適当な検定と比較する。検定法は、一般に種々のコントロールとの比較を必要とする。ＭＣＳＰ活性または機能における変化は、このような効果が試験化合物の非存在下で起こらない場合、試験化合物により誘導されたと言える。本発明のタンパク質における試験化合物の効果は、この効果が、該タンパク質を製造しない細胞で観察されない場合、該タンパク質により媒体されると言える。例えば、ＭＣＳＰとの相互作用により、化合物は黒色腫細胞成育および拡散、細胞基底(cell-substratum)相互作用および細胞−細胞接触を含む細胞接着およびＭＣＳＰ関連シグナル伝達に影響を与え得る。従って抗癌剤の可能性がある。上記の検定は、コラーゲンVIのＭＣＳＰへの結合の阻害ができる化合物の同定に適している。本発明は特に実施例に記載の具体的態様(タンパク質、核酸、その製造法および使用)に関し、これは本発明を説明するものであるが、それを限定するものではない。実施例１：ＭＣＳＰｃＤＮＡの単離ラットＮＧ２転写体のカルボキシル末端をコードする放射標識した約４.０kb ｃＤＮＡ(Ｇ１１、Nishiyama et al.，J．Cell Biol．114，359-371(1991)の図２参照)を、Ｍ２１ヒト黒色腫細胞系から抽出したＲＮＡから製造した、λgt1 1ヒト黒色腫ｃＤＮＡライブラリー(Clontech Laboratories，San Fransisuco，C A)の、ＭＣＳＰ候補ＤＮＡクローンに関するスクリーニングに使用する。ｄＴ− 感作ｃＤＮＡを含む組換えファージの最初のスクリーニングは、数個のＮＧ２反応性クローンを製造する。組換えファージ(５×１０⁵)を、４×１０⁴プラーク／１５０mmペトリ皿の密度で置き、１２時間、３７℃でＹ1090ｒＥ．coli宿主株中で増殖させる。ファージＤＮＡをニトロセルロースフィルターに移し、０.５ＮＮａＯＨ、１.５mＭＮａＣｌで変性させ、続いて０.５Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８.０、１.５ＭＮａＣｌで中和する。非特異的核酸結合部位を、２× ＳＳＣ(ＳＳＣ：１５０mＭ塩化ナトリウム、１５mＭクエン酸ナトリウム)および５０μg／ml変性、剪断サケ精子ＤＮＡを含む予備ハイブリダイゼーション培地中で、５５℃で２時間ブロックする。ハイブリダイゼーション反応を、同条件下、８から１２時間、³²Ｐ adＣＴＰで放射標識した１０ngのＧ１１ＮＣ２ｃＤＮＡフラグメント(前掲)の存在下、無作為感作で４×１０⁸cpm／μgの特異的活性まで行う(Sambrook et al.，A Laboratory Manual，第２版，Cold Spri ng Habor Laboratory，Cold Spring Habor，NY(1989))。ハイブリダイゼーションに続いて、フィルターを２×ＳＳＣで５５℃で洗浄し、オートラジオグラフィーのためにＸＡＲフィルム(Eastman Kodak)にさらす。このスクリーニングは３. １kbのｃＤＮＡを含む λＭ３.１と名付けた一つのクローンを含む、７つのＮＧ２反応性クローンを製造する。この単離体の、Sanger et al.(Sambrook et al ，前掲)の鎖停止法によるヌクレオチド配列分析は、ＮＧ２タンパク質と約７９％相同性の７００カルボキシル末端アミノ酸残基をコードするオープンリーディングフレームを示す。 λＭ３.１クローン(前掲)の３.１kb単離体は、ｍＡｂ９.２.２７−反応性抗原を発現するヒト黒色腫細胞系由来のポリアデニル化ＲＮＡ抽出物のノーザン分析のプローブとして使用される。ＲＮＡゲルブロットおよびハイブリダイゼーションは、１.２％ホルムアルデヒト−アガロースゲル上の２μgのポリアデニル化ＲＮＡのサイズ分画により行い、ナイトロンに移す。予備ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション条件は上記の通りである。転写体サイズは、サイズ標準(Gibco-Bethesda Research Laboratories)との比較により概算する。Ｍ２１黒色腫細胞(Bumol et al.，J．Biol．Chem．267，12733-12741(1991))およびU AC903黒色腫細胞に存在する８.０kb転写体へのハイブリダイゼーションが観察され、該転写体はＮＧ２転写体と同様のサイズである。UAC903細胞系は、Ｍ２１細胞系よりも約５倍多いＭＣＳＰ転写体を発現し、これらの細胞系で製造されるＭＣＳＰコアタンパク質のレベルの同様の増加と一致する観察である。ｃＤＮＡは、ｍＡｂ9.2.27−非反応性ＲＡＪＩリンパ芽球細胞系由来のＲＮＡとハイブリダイズしない(Dierich et al.，J．Immunol．112，1766-1773(1974))。 λＭ３.１の５'末端から５００bpフラグメント(配列番号１のbp４８５８から５３５７に伸びる)をプローブとして使用し、更なる上流に伸びるｃＤＮＡクローンのオーバーラップに関して、ヒト黒色腫細胞系Ｍ２１由来の二つの独立した λgt11 ｃＤＮＡライブラリー由来の５×１０⁵クローンをスクリーニングした。４つの独立したλＭ３.１を有する黒色腫細胞ｃＤＮＡライブラリーの徹底的なスクリーニングは、λＭ３.１の５'末端の更なる上流に伸びるクローンの同定に失敗した。完全ｃＤＮＡ鎖を得ることが不可能なことは、恐らくＭＣＳＰＲＮＡ二次構造のためである。従って、小さなオーバーラップｃＤＮＡを得ることを可能とする方法を開発する。ＭＣＳＰコアタンパク質の完全コード配列の配列決定のためのｃＤＮＡ合成は、各個々の部分に適当な条件がサンプルに存在することを保証するために、広範囲の異なるプライマー(表１参照)および種々のＲＮＡ変性条件を使用したポリメラーゼ連鎖反応により達成する。このように、ＰＣＲ増幅に適したｃＤＮＡフラグメントを得る。ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡクローンの発生の実験的詳細は、下記の通りである：ＲＮＡをA375-Metヒト黒色腫細胞から(Kozlowski et al.，J．Natl．Cancer Inst．7 2，913-917(1984);細胞系A375は、受託番号ATCC CRL1619でアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ＡＴＣＣ)から得られる)、酸グアニジニウムチオシアナートフェノール−クロロホルム法(ChomzynskiおよびSacchi，Anal．Bioch em．162，156(1987))により製造する。ポリアデニル化ＲＮＡをQiagen Ologotex ｍＲＮＡ製造キット(Diagen，Hilden，Germany)から得る。第１鎖ｃＤＮＡをM- MuLV Reverse Transcriptaseキット(Ｌife Technologies，Gaithersburg，MD)および、平衡サンプル中のＭＣＳＰ配列特異的オリゴヌクレオチド、オリゴ(ｄＴ) またはランダムプライマーのいずれかで製造する。一般に最良の結果が、ＭＣＳＰ配列特異的オリゴヌクレオチドで得られる(上記表１参照)。幾つかの場合、一次生産物を入れ子型５'プライマーで再増幅し、特異性を改善する。ＰＣＲ増幅は、表２に示すプライマーで、標準プロトコールを適用して行う(Rolfs et al. ，PCR:Clinical Diagonistics and Research，Springer Verlag，Berlin(1992)) 。Taq、Pwo(Boehringer Mannheim，Germany)またはPfu ＤＮＡポリメラーゼ(St ratagene，La Jolla，CA)を熱安定性ポリメラーゼとして適用する。アンカーＰＣＲを、ｃＤＮＡのｄＧテイリングの後に行う(Pluschke et al.，Eur．J．Immu nol．21，2749-2757(1991))。テイリングの前に第１鎖ｃＤＮＡをRNAse H(Life Technologies)で処理し、Glass MAX DNA単離スピンカートリッジシステム(Life Technologies)で精製する。ｃＤＮＡを、Deoxynucleotidyl Terminal Transfera seキット(Life Technologies)を使用してｄＧ−端切断する。オリゴヌクレオチドをMicrosynth(Windisch，Switzerland)から得る。予期したサイズのＰＣＲ増幅生産物を１％アガロースゲルから単離し、プラスミドpBluescript KS(Stratag ene)またはpGEM-1(Promega，Madison，WI)に、HincII部位への平滑末端クローニング(表１)または指向性クローニング(表２)により挿入する。２本鎖プラスミドＤＮＡを、直接Sequenaseキット(US Biochemical，Cleveland，OH)で配列決定する。配列データは、ＧＣＧ Wisconsin Software Package(Genetics Comuting Gr oup， Madison，WI)の助けを借りて処理する。 ¹⁾ “位置”は配列番号１に記載のＭＣＳＰヌクレオチド配列を参考にした各クローンの長さおよびｂｐ位置を意味する。²⁾ ｃＤＮＡのｄＧテイリング後第１段階において、アンカーＰＣＲをan44(表１)と命名されたクローンを得るために使用し、これはλM3.1の５’を伸ばす。ｃＤＮＡのｄＧテイリング後、オリゴｄＣを５’プライマーとして適用し、λM3.1の５’末端に対応する配列をこの増幅の３’アンチセンスプライマーとして使用する。続いて、７つの付加的ｃＤＮＡクローンをＰＣＲにより製造し、全ＭＣＳＰコード配列をカバーする(上記表１参照)。オリゴｄＣ５’プライマーでのアンカーＰＣＲは、これらのオーバーラップクローンの３つ(an2、an38およびan1；表１)の増幅に適用するが、一方、ラットＮＧ２配列に対応する５’センスプライマーを使用した慣用のＰＣＲは、残りの４つのクローン(ra23、ra4、ra1およびra25；表１)の産生に用いる。ＴaqはＤＮＡポリメラーゼとして使用する。これらのＰＣＲクローンの産生に使用する３’アンチセンスプライマーの配列は、それぞれの先のクローンの５’末端と相補的である、５つの例(表１参照)において、１次生産物を入れ子型５’プライマーで再増幅し、特異性を改善する。この最初の一連のＰＣＲクローンおよびλgt11クローン由来のヌクレオチド配列を独立して由来するオーバーラップＰＣＲクローン由来の第２のセットの分析により再確認する(表２)。恐らくＰＣＲ増幅により誘導される間違い(KeohavongおよびThilly，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 86，9253(1989))による不一致は、独立して由来するＰＣＲクローンの更なる分析により解決される(表2)。 ¹⁾ “位置“は配列番号１に記載のＭＣＳＰヌクレオチド配列を参考にした各クローンの長和およびｂｐ位置を意味する。ＭＣＳＰコアタンパク質の完全コード配列および推定アミノ酸配列を配列番号１に示す。２３２２アミノ酸をコードするオープンリーディングフレームが見られる。３’非翻訳領域は９２６ヌクレオチドから成る。最初の２９アミノ酸(アミノ酸−２９から−１；配列番号１)は推定シグナル配列を示し、これはＮＧ２のものと４８％しか同一でない。１８アミノ酸の続く伸長は８９％同一である。カルボキシ末端に近い２５連続アミノ酸残基の疎水性セグメント(アミノ酸残基２１９３−２２１７、配列番号２)は、数個の塩基性アルギニンおよびリジン残基に続き、従って、膜通過ドメインの基準に合う。したがって、ＭＣＳＰコアタンパク質の推定アミノ酸配列は、２５アミノ酸の単一疎水性膜通過領域により、相対的に短い細胞質テイル(７５アミノ酸)から分離された大きな細胞外ドメインを含む膜タンパク質と予測される。２１９２アミノ酸にわたるＭＣＳＰの大きな細胞外ドメインは、大まかに３つの構造的ドメインに分けることができる：８つのシステインおよび３つのセリン／グリシン対を含むアミノ末端ドメイン(アミノ酸１−６１１、配列番号１)；グリコサミノグリカンのための７つのこのような可能性のある結合部位を含む、無システイン、セリン／グリシンに富むドメイン(アミノ酸６１２−１５６１、配列番号１)；および、二つのシステインおよび一つのセリン／グリシン対のみの第３の構造ドメイン(アミノ酸１５６２から２１９２、配列番号１)。ラットＮＧ２プロテオグリカンの対応するドメインと約８２％構造的相同性である、第１の構造ドメイン(アミノ酸１から６１１)は、１５個の可能性のあるＮ −架橋糖付加部位の３個を含む。このドメインはまた、全エクトドメインの１０個のシステインの内８個を含むため、すなわち、６１１アミノ酸わたる領域中の４個の可能性のあるジスルフィド結合を含むため、コンパクト立体配置を有するようである。ＭＣＳＰエクトドメインの２次構造ドメインの重要な特徴(アミノ酸６１２から１５６１；配列番号１)は、９５０アミノ酸にわたる領域のシステインの欠失である；しかしながら、このドメインはＭＣＳＰ細胞外ドメインの１１個のうち７個のセリン／グリシン対を含み、これは可能性のある硫酸コンドロイチン結合部位として作用できる；しかしながら、グリコサミノグリカン(ＧＡＧ)のためのシグナル配列SerGlyXGlyは一度しか起こらない(アミノ酸１３０８−１３４０、配列番号１)。１５個の可能性のあるＮ−架橋ＭＣＳＰ糖付加部位のうち６個がこのドメインで見られ、それはラットＮＧ２プロテオグリカンの対応物と７９％構造相同性である。６３０アミノ酸を含むＭＣＳＰの３次構造(アミノ酸１５６２から２１９２、配列番号１)は、ＮＧ２の対応ドメインと７５％構造相同性である。このドメインは、１０５アミノ酸で分離され、ジスルフィド結合を形成しているようである、２つのシステインから成る。このドメインは一つのセリン／グリシン対により示される一つの可能性のあるＧＡＧ結合部位のみを有し、１５個の可能性のあるＭＣＳＰエクトドメインのＮ−架橋糖部位の内６個を含む。これは８個のシステイン、一つのセリン／グリシン対および可能性のある１１個のＮ−架橋糖付加部位の内５個を含む対応するＮＧ２ドメインと対照的である。ＮＧ２およびＭＣＳＰの推定配列配列の大きな差は、アミノ酸残基２０４３と２０９１の間の事象である。従って、ＮＧ２に関して、６個のシステイン残基のクラスターがこの領域に存在することが報告されている(Nishiyama et al.，図３)。この領域をコードするＭＣＳＰおよびＮＧ２遺伝子部分は、ＭＣＳＰの３つの付加的塩基対を確認し、これはＮＧ２では見られない。６１２８位置(配列番号１)の最初の付加的塩基は、読み取り枠の差異によるものであり、これは６２４４位置の第２の付加的塩基の後に続くが、６２７３位置の第３の付加的塩基の後に解決される。３つの付加的塩基対はλgt11(??)ｃＤＮＡクローンおよび、ヒト黒色腫細胞系Ｍ２１およびA37 5-Metのそれぞれ由来の独立した数個のＰＣＲクローンの両方で見られる。実施例２：in situハイブリダイゼーションによる黒色腫領域内のＭＣＳＰコードｍＲＮＡの局在化ＭＣＳＰコアタンパク質コード配列の個となる領域に対応する３つのｃＤＮＡフラグメントをin situハイブリダイゼーション実験のリボプローブ鋳型として使用する。クローン１１、ra23およびan44(表１参照)は、それぞれ５５９bp(pGE M-1中の３７５６−４３１４)、８１１ｂｐ(pBluescript KS中の１４３１−２２４１)および６７７ｂｐ(pGEM-1中の４２１１３−４８８９)であるＭＣＳＰコア挿入物を担持する。センスおよびアンチセンスＲＮＡプローブが製造者の指示により、１０⁹dpm／μg以上の活性を特定するため、αＳ³⁵−ＵＴＰ(４００Ci／mm ol以上、Amersham)で標識されている。標識リボプローブをフェノール／クロロホルムで抽出し、遊離ヌクレオチドをSephadex G50カラムを通すことにより回収する。ＲＮＡを７７％エタノール中の２.２Ｍ酢酸アンモニウムで一晩−２０℃ で沈殿させ、２０ｍＭジチオスレイトール含有５０％v/v脱イオンホルムアミド中に約２５０,０００cpm／μlの活性で(５×濃縮貯蔵溶液)再懸濁し、−７０℃ で貯蔵する。黒色腫皮膚転移、初期黒色腫および良性ほくろの生検を、リン酸緩衝塩溶液( ＰＢＳ)中の４％パラホルムアルデヒドで固定し、次いでパラフィンに乗せる。パラフィン切片(８μm)を３−アミノプロフィルトリエトキシシラン処理スライドに乗せ、それはガラス表面に切片を共有結合で結合させ、実験工程中の切片の損失を防止する。パラフィン切片をキシレンおよび無水エタノール中で脱パラフィン化し、空気乾燥する。減少させた濃度のエタノール溶液での再水和に続いて、切片をＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに５分間固定させ、ＰＢＳおよび水で濯いで２０分、０.２ＮＨＣｌで室温で脱プリン化する。次いで、これらの切片を３０分、２×ＳＳＣ(０.３ＭＮａＣｌ、０.０３ＭＮａ−クエン酸、ｐＨ７.０)で７０℃で処理し、増加させたエタノール溶液で脱水し、最後に空気乾燥する。予備ハイブリダイゼーションを、５４℃で３時間、５０v/v脱イオン化ホルムアルデヒド、１０％w／v硫酸デキストラン、０.３ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６.８、２０ｍＭジチオステイトール、０.２×デンハード試薬、０.１mg／mlEherichia coli ＲＮＡおよび０.５ μＭ非放射活性αＳ−ＵＴＰの溶液で行う。ハイブリダイゼーションを、一晩、同じ溶液で、５×１０⁴cpm／μl αＳ³⁵−ＵＴＰ−標識ＲＮＡプローブを添加して、加湿チャンバーで５４℃で行う。スライドを硫酸デキストラン、ＲＮＡおよび非放射活性ＵＴＰを欠くが、５０％v／v脱イオン化ホルムアミドおよび１０ｍＭジチオスレイトールを含むハイブリダイゼーション溶液中、５５℃で、２回１時間洗浄し、０.５ＭＮａＣｌ、１０ｍＭトリス、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７.５からなる緩衝溶液中、１５分、平衡化する。次いで、切片を平衡緩衝液中で、５０μg／ml RNase Aで、３０分、３７℃で処理して非特異的結合プローブを除去する。続いて、２×ＳＳＣで１時間、次いで０.１×ＳＳＣで１時間、３７℃で洗浄する。スライドを、３００mＭ酢酸アンモニウム含有６５％、８５％および９５％(v/v)エタノール溶液および無水エタノールで連続して脱水し、続いて空気乾燥をする。切片をIlford K5フォトエマルジョンの１.２希釈で覆い、空気乾燥し、シリカゲル含有光セーフボックスで１２日間、４℃でさらす。次いで、スライドをＤ１９現像液(Kodak)に置き、３０％チオ硫酸ナトリウムで固定し、ヘマトキシリンおよびエオジンで染色する。オートラジオグラフ切片のハイブリダイゼーションシグナルのパターンを光顕微鏡および明野／暗野イルミネーションで分析する。ＭＣＳＰコード配列の全３つのプローブが同等の結果を確認する。ＭＣＳＰ− 特異的抗体mAb9.2.27(Morgan et al.，Hybridoma 1，27-36(1987))または763.74 (Giacomini et al.，J．Immunol．135，696(1985))と強く反応する黒色腫皮膚転移の生検は、全３アンチセンスＲＮＡプローブとの強いハイブリダイゼーションシグナルを癌細胞内で示し、コントロールセンスＲＮＡプローブとは背景ハイブリダイゼーションしか示さない。あるハイブリダイゼーションがまた良性ほくろおよび正常表皮でも検出され、これはＭＣＳＰ−特異的抗体での強い染色は示さない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ｇ０１Ｎ 33/574 ＤＧ０１Ｎ 33/574 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）と呼ばれ、実質的に配列番号２で示される成熟タンパク質のアミノ酸配列、または配列番号２の１５９４位のアミノ酸から２２９３位のアミノ酸の範囲のアミノ酸配列をもつ欠失アミノ酸変異を除いた該タンパク質のアミノ酸変異体を有する単離タンパク質、または該タンパク質または変異体の誘導体、特に適当な免疫原生形であるタンパク質、アミノ酸変異体、またはその誘導体。２．天然源からの単離、化学的合成および／または組換えＤＮＡ技術を含む、請求項１に記載のタンパク質、変異体または誘導体を調製する方法。３．請求項１に記載のタンパク質または変異体、またはその誘導体を哺乳動物に投与する段階を含む、ＭＣＳＰに特異的に結合する抗体を産生する方法。４．請求項１に記載のタンパク質または変異体、またはその誘導体、および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。５．請求項１に記載のタンパク質をコードする単離核酸、好ましくはＤＮＡである核酸を含む核酸。６．候補ＤＮＡまたはＲＮＡを含むサンプルを、配列番号１で示される１４個以上の連続塩基と同一の（または相補する）少なくとも１４個の連続した塩基を含む核酸と接触させ、該プローブにハイブリダイズする核酸を同定することを含む、ＭＣＳＰまたはその新規非ヒト相同体をコードする核酸を同定する方法。７．請求項１に記載のタンパク質、アミノ酸変異体、またはその誘導体を産生することができ、該タンパク質または変異体、またはその誘導体をコードするヘテロ核酸を含む宿主細胞。８．ヒトにおける予防または治療処置に使用する、特にＭＣＳＰ発現腫瘍、例えば黒色腫、肉腫および膠芽腫の制御または（アジュバント）処置に使用する、請求項１に記載のタンパク質、変異体または誘導体。９．医薬品、特にＭＣＳＰ発現腫瘍、例えば黒色腫、肉腫および膠芽腫の制御または（アジュバント）処置に適した医薬品の製造のための、請求項１に記載のタンパク質、変異体または誘導体、または該タンパク質、変異体または誘導体を含む組成物の使用。１０．タンパク質、変異体または誘導体、または、該タンパク質、変異体または誘導体を含む組成物を、該タンパク質、変異体または誘導体と相互作用する能力について試験すべき少なくとも１つの化合物と接触させる（ここで、タンパク質、変異体または誘導体の生物活性の変化は相互作用の指標となる）ことを含む、請求項１に記載のタンパク質、アミノ酸変異体、またはその誘導体と相互作用することのできる化合物を同定する方法。１１．単離核酸は、それぞれ、実質的に配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するＤＮＡ、または配列番号１の４８６７ｂｐから７８９８ｂｐの範囲の配列のフラグメントを除く該フラグメント、および配列番号１の４８５８ｂｐから５３５７の範囲の配列をもつＤＮＡである、請求項５に記載の核酸。１２．ハイブリッド・ベクターである、請求項５に記載の核酸。１３．欠失アミノ酸変異体、またはその誘導体である、請求項１に記載のアミノ酸変異体。１４．ヒトに請求項１に記載のタンパク質または変異体、またはその誘導体を投与する段階を含む、ワクチンが必要である該ヒトにワクチンを接種する方法。１５．請求項１に記載のタンパク質または変異体、またはその誘導体を含む、抗−ＭＣＳＰ抗体の定性的または定量的測定用試験キット。