JPH11514865A - アクチン重合を調節する生成物及び方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセンブリーを、炎症性応答、免疫応答、アレルギー応答及びニューロン応答に関与する細胞中のＧα₁₂及び／又はＧα₁₃活性を調節することにより特異的に調節することのできる化合物を同定するのに有用な方法、かかるアッセイを実施するためのキット及びかかる応答に関連する病気を制御する方法に関係する。

Description

【発明の詳細な説明】 アクチン重合を調節する生成物及び方法 政府の権利 この発明は、部分的に、ＧＭ−３０３２４の下で政府の支持により為された（ 国立衛生研究所により与えられた）。政府は、この発明に一定の権利を有する。 発明の分野 本発明は、ストレスファイバー形成を調節する化合物を同定する方法に関する ものである。特に、本発明は、外部刺激に応じてＲｈｏ蛋白質の活性化を特異的 に調節する化合物を同定するのに有用なアッセイ及び方法に関係する。 発明の背景 細胞は、細胞の原形質膜と会合した細胞骨格ネットワークを有している。この 細胞骨格は、アクチンフィラメントの密なネットワーク及び会合したアクチン結 合蛋白質からなる。細胞骨格ネットワークと原形質膜の両者の成分は、細胞シグ ナリングに重要である。細胞骨格の変化は、細胞形状及び調節応答（走化性及び 有糸分裂誘発を含む）を含む様々な細胞過程の変化を伴う。かかる変化は、部分 的に、アクチンフィラメントを含む３つの構造の型であるストレスファイバー、 偽足及び膜ひだ（ruffle）の形成による細胞形態及び細胞表面トポロジーの変化 によって特徴付けられる。ストレスファイバーは、局部的接着において原形質膜 にて一端が終端しているアクチンフィラメントの束である。膜ひだは、架橋した アクチンフィラメントの密なネットワークを含む。偽足は、細胞移動に関与する アクチンフィラメントを含む膜突出部である。 様々な病気が、制御されない細胞成長及び運動性から生じる。例えば、種々の 炎症性疾患において、ある種の組織に補充された活性化された好中球は、組織を 傷つけ又は破壊するスーパーオキシドアニオン及び蛋白質分解酵素を放出する。 更に、癌の発達は、癌蛋白質（oncogenic proteins）による細胞のトランスフォ ーメーションに際しての進行性の細胞成長及び転移により生じる。両方の場合に おいて、細胞骨格の再配置が、細胞を成長可能にし又はある種の組織に浸潤する ことを可能にし、それにより、かかる組織に損害を生じる。それ故、かかる成長 及び運動性を調節する細胞骨格再配置の調節は、病気の治療に有用であり得る。 生物学的機能例えばストレスファイバー形成又は局部的接着のアセンブリーに 関与する分子の活性を調節する化合物を間発することができる。それ故、かかる 化合物の開発は、かかる機能に関与する分子を理解することに依存している。前 の仕事は、Ｒｈｏ蛋白質がストレスファイバーの形成及び局部的接着のアセンブ リーを生じるアクチン重合を調節することを示した（Paterson等、J.Exp.Med.11 1:1001-1007,1991; Ridley等、Cell 70:389-399,1992; Ridley 等、EMBO J.13:2 600-2610,1994(a)；及びRidley等、J.Cell Science 補遺18:127-131,1994(b)参 照）。更に、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲ Ｐ）、ブラジキニン及びトロンビンに対するレセプターは、Ｒｈｏ依存性ストレ スファイバー及び局部的接着形成を刺激することが示された（Ridley等、同書、 1992; 及びRidley等、同書、1994(b)参照）。例えば、ＬＰＡ及びＧＲＰに対す るレセプターは、ヘテロ３量体のＧ蛋白質とカップルしていることが示された（ van Corven等、Cell 159:45-54，1989;及びRozengurt 等、Proc.Natl.Acad.Sci. USA 80:2936-2940,1983参照）。しかしながら、前の研究は、アクチン重合、局 部的接着アセンブリー及びストレスファイバー形成がＲｈｏ蛋白質により調節さ れ、それは更にＧ蛋白質又はチロシンキナーゼによって調節されるということを 教示することができなかった。 細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及び局部的接着アセンブ リーを調節する化合物を発見する長い間感じられてきた要求にもかかわらず、細 胞におけるシグナル変換ネットワークの複雑さは、細胞骨格再配置を調節するこ とのできる化合物を同定する迅速且つ効率的な方法の開発を妨げてきた。従って 、ストレスファイバー形成及び局部的接着アセンブリーを特異的に調節すること のできる化合物を同定する効率的な方法を開発することへの要求がある。 かかる化合物は、ストレスファイバー形成及び局部的接着アセンブリーへ導くシ グナル変換経路の特異的ステップの調節を可能にし、そうして、細胞の移動又は 成長を含む種々の病気の治療を可能にするであろう。 発明の要約 本発明は、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着アセ ンブリーを含む細胞機能を調節するのに用いることのできる調節化合物を同定す る複雑な問題の解決を提供する。細胞におけるシグナル変換ネットワークの複雑 さにもかかわらず、本発明は、Ｒｈｏ蛋白質の活性を特異的に調節することので きる化合物を同定するための効率的な方法を提供する。特に、本発明は、Ｇα₁₂ 及び／又はＧα₁₃蛋白質によるＲｈｏ蛋白質の活性化を阻止する化合物を同定す る方法を提供する。当業者は、直ちに、広範囲の病気の治療に有用な化合物の同 定及び利用を含むこの発明から生じる利点を認識するであろう。 本発明の一具体例には、細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成 又は局部的接着アセンブリーを調節することのできる化合物を同定する方法であ って、次を含む方法が含まれる：（１）細胞を推定上の調節化合物に接触させる こと（この細胞は、Ｒｈｏ蛋白質及びＲｈｏ蛋白質の活性を調節することのでき るＧ蛋白質を含む）；及び（２）この推定上の調節化合物の、アクチン重合、ス トレスファイバー形成又は局部的接着アセンブリーよりなる群から選択される生 物学的機能を調節する能力を評価すること。この評価のステップは、好ましくは 、細胞中でのＲｈｏ蛋白質の活性を調節するＧ蛋白質の能力を測定することを含 む。本発明の方法で用いるのに好適なＧ蛋白質には、Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃が 含まれる。 本発明の他の具体例には、細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形 成又は局部的接着アセンブリーを調節することのできる化合物を同定する方法で あって、次を含む方法が含まれる：（１）推定上の調節化合物を、Ｒｈｏレギュ レーター分子及びＲｈｏレギュレーター分子の活性を調節することのできるＧ蛋 白質を含む配合物と接触させること；及び（２）この推定上の調節化合物のＲｈ ｏレギュレーター分子の活性を調節する能力を評価すること。この評価の ステップは、好ましくは、Ｇ蛋白質のＲｈｏレギュレーター分子への結合を測定 することを含む。 本発明には又、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び局部的接着アセン ブリーを含む生物学的機能を阻止する方法であって、Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃の 活性を阻害することを含む方法も含まれる。特に、本発明には、Ｇα₁₂及び／又 はＧα₁₃の活性を阻害することによる細胞転移又は走化性を阻止する方法が含ま れる。この活性を、好ましくは、活性複合体中のＧα₁₂又はＧα₁₃蛋白質を封鎖 し、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質のヌクレオチド交換領域を調節し、Ｇα₁₂又はＧα₁₃ 蛋白質によるＧＴＰ加水分解を調節し、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質との細胞表面 レセプター相互作用を調節し、Ｇα₁₂又はＧａ₁₃蛋白質とＲｈｏレギュレーター 分子との間の相互作用を調節し、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質をコードする同種若し くは異種の核酸分子の発現を調節し、又はこれらの組合せにより阻害する。 本発明の一面は、細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成又は局 部的接着アセンブリーを調節することのできる化合物を同定する方法であって、 次を含む方法を含む：（１）細胞を推定上の調節化合物と接触させること（この 細胞は、Ｒｈｏ蛋白質並びにＧ蛋白質及びチロシンキナーゼを含む第１の蛋白質 を含む）；及び（２）この推定上の調節化合物の、細胞におけるアクチン重合、 ストレスファイバー形成及び局部的接着アセンブリーを含む生物学的機能を調節 する能力を、細胞におけるＲｈｏ蛋白質の活性を調節する第１の蛋白質の能力を 測定することにより評価すること。 本発明の他の面は、アクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着ア センブリーを調節することのできる化合物を同定する方法であって、次を含む方 法を含む：（１）Ｇ蛋白質及びチロシンキナーセを含む第１の蛋白質及びＲｈｏ レギュレーター分子を含む第２の蛋白質を推定上の調節化合物と接触させること ；（２）Ｒｈｏレギュレーター分子の活性を調節する推定上の調節化合物の能力 を評価すること。 本発明の更に別の面は、癌、呼吸障害症候群、炎症性腸疾患、パーキンソン病 、アルツハイマー病及び再狭窄を含む病気を有する動物を治療する方法を含 み、この方法は、アクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセン ブリーを含む生物学的機能を調節する化合物を含む有効量の治療用組成物を動物 に投与することを含む。 本発明には、アクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセンブ リーを調節することのできる化合物を同定するキットも又含まれ、このキットは 次を含む：（１）Ｒｈｏ蛋白質及びＧ蛋白質及び／又はチロシンキナーゼを含む 蛋白質を含む細胞；及び（２）Ｒｈｏ蛋白質の調節を検出するための手段。 図面の簡単な説明 図１は、構成的に活性化されたＲｈｏ、Ｇα₁₂及びＧα₁₃蛋白質をコードして いる発現プラスミッドをマイクロインジェクションしたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に おけるストレスファイバー形成を示している。 図２は、構成的に活性化されたＲｈｏ、Ｇα₁₂及びＧα₁₃蛋白質をコードして いる発現プラスミッドをマイクロインジェクションしたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞に おける局部的接着アセンブリーを示している。 図３は、構成的に活性化されたＧα₁₃、Ｇα₁₂、Ｇα_q、Ｇβ₁γ₂及びＧβ₂γ₂ 蛋白質をコードしている発現プラスミッドをマイクロインジェクションしたＳ ｗｉｓｓ３Ｔ３細胞におけるストレスファイバー形成の不在を示している。 図４は、ボツリヌス菌Ｃ３外酵素をマイクロインジェクションし且つＬＰＡ又 はＰＤＧＦで刺激したＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞におけるストレスファイバー形成を 示している。 図５は、構成的に活性化されたＧα₁₂又はＧα₁₃蛋白質をコードしている発現 プラスミッドをマイクロインジェクションしたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞における、 ボツリヌス菌Ｃ３外酵素の存在時及び不在時におけるストレスファイバー形成を 示している。 図６は、構成的に活性化したＧα₁₂蛋白質をコードしている発現プラスミッド をマイクロインジェクションしたＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞における、ボツリヌス菌 Ｃ３外酵素の存在時又は不在時における局部的接着アセンブリーを示してい る。 詳細な説明 本発明は、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着アセ ンブリーを調節する化合物を同定するための方法及びかかる方法を用いて同定さ れた生成物に関係する。アクチン重合は、アクチンポリマーを形成するアクチン モノマーの重合をいう。細胞骨格の特定の構造をストレスファイバーとして言及 する。ここで用いる場合、用語「ストレスファイバー」は、Darnell 等（Molecu lar Cell Biology，Scientific American Books，1990（参考として、本明細書 中に援用する））に一般的に記載されているように、アクチンフィラメントの束 を含む細胞構造をいう。ここで用いる場合、用語「細胞骨格」は、アクチンマイ クロフィラメント、微小管及び／又は中間体フィラメントを含む蛋白質繊維を含 む構造をいう。細胞骨格の他の構造は、局部的接着又は接着プラークとして言及 される。ここで用いる場合、熟語「局部的接着」又は「接着プラーク」は、アク チンフィラメントと細胞の原形質膜との間の接着点をいう（一般的に、前出のDa rnell 等に記載されている）。 細胞骨格フィラメントの重合及び解重合を、細胞におけるシグナル変換経路に 関与する分子によって調節することができる。ここで用いる場合、熟語「シグナ ル変換経路」は、細胞の刺激化合物との相互作用から生じる少なくとも１つの生 化学的反応をいい、一層一般的には、一連の生化学的反応をいう。刺激化合物の 細胞との相互作用は、シグナル変換経路を通って伝達され、最終的にストレスフ ァイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを生じる「シグナル」を生じる 。シグナル変換経路に対して阻害性の化合物（アンタゴニスト）も又有用であり 、本発明の方法によって同定することができる。 本発明のシグナル変換経路は、細胞の一部位から他の部位へのシグナルの伝達 において役割を演じる種々のシグナル変換分子を含むことができる。ここで用い る場合、用語「分子」は、蛋白質、脂質、核酸又はイオンをいい、ときにはかか る用語を交換可能に用いる。特に、シグナル変換分子は、シグナル変換経路に関 与する蛋白質、脂質、ヌクレオチド又はイオンをいう。本発明のシグナル変換分 子には、例えば、細胞表面レセプター及び細胞内シグナル変換分子が含まれる。 ここで用いる場合、熟語「細胞表面レセプター」には、シグナル及び細胞の原形 質膜を横切るかかるシグナルの伝達を受けることのできる分子及び分子複合体が 含まれる。熟語「細胞内シグナル変換分子」は、ここで用いる場合、細胞の原形 質膜からのシグナルを、その細胞の細胞質を通して、場合によっては細胞核中へ 伝達することに関与する分子又は分子複合体が含まれる。熟語「刺激化合物」に は、ここで用いる場合、細胞表面レセプターに結合してシグナル変換経路を開始 することのできるリガンド並びに細胞内からのシグナル変換経路を開始すること のできる細胞内イニシエーター分子が含まれる。 本発明の一つの面には、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局 部的接着アセンブリーを調節することのできる「推定上の調節化合物」と呼ばれ る化合物を同定するための細胞に基づくアッセイが含まれる。ここで用いる場合 、用語「推定上の」は、特定の過程において、未知の又は前に価値を認められて いない調節活性を有する化合物をいう。それ故、用語「同定する」は、本発明の 方法により、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着アセ ンブリーの調節化合物としての有用性が測定されるすべての化合物を含むことを 意図している。 本発明の一具体例は、細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及 び／又は局部的接着アセンブリーを調節する推定上の調節化合物を同定する方法 であって、次を含む方法に関係する：（１）細胞を推定上の調節化合物と接触さ せること（この細胞は、Ｒｈｏ蛋白質及びＲｈｏ蛋白質の活性を調節することの できるＧ蛋白質を含む）；及び（２）この推定の調節化合物の、アクチン重合、 ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを含む生物学的機能 を調節する能力を評価すること。 本発明での使用に適した細胞には、Ｇ蛋白質及びＲｈｏ蛋白質を有する任意の 細胞が含まれる。かかる細胞には、自然の生理的状況においてレセプターを発現 する正常細胞又はトランスフォームされた細胞（即ち、異種核酸分子で）が含ま れ得る（例えば、平滑筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、好塩基球、マスト細胞、好 酸球、好中球、マクロファージ、リンパ球、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、 形質細胞、神経芽細胞、幹細胞及び癌細胞）。或は、本発明での使用のための細 胞には、変化したシグナル変換活性（例えば、特定のリガンドに対する増大した 応答）を有する自然に生じる正常細胞の変異体又は遺伝子工学処理した細胞が含 まれ得る。正常細胞のシグナル変換変異体は、当業者に公知の方法を用いて同定 することができる。例えば、リガンドに対する応答における細胞によるカルシウ ム移動のレベルに基づく蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて変異 体を選択することができる。遺伝子工学処理した細胞には、例えば、本発明のシ グナル変換分子をコードしている組換え分子でトランスフォームした本発明の組 換え細胞が含まれ得る（以下に、詳述）。 本発明を用いる使用のための細胞には、哺乳動物、無脊椎動物、植物、昆虫、 カビ、酵母及び細菌細胞が含まれる。好適な細胞には、哺乳動物、両生類及び酵 母細胞が含まれる。好適な哺乳動物細胞には、霊長類、マウス及びラットが含ま れるが、ＨＥＬＡ、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３、繊維芽細胞、ラット好塩基球、ヒト好酸 球、ヒト内皮細胞、ヒトＴ細胞、ヒトＢ細胞、ヒト好中球、ヒトマクロファージ 、ヒト上皮細胞、メラニン細胞、白血病細胞、ＭｏｎｏＭａｃ６、Ｒａｔ１ａ、 ＨＥＫ２９３、ＫＵ８１２及びＢＪＡＢ細胞が一層好適である。 一具体例において、本発明における使用に適した細胞は、少なくとも１つの型 の細胞表面レセプターを有する。ここでいう細胞表面レセプターには、リガンド に結合することができる細胞表面レセプター（以下に、詳述）及びリガンド結合 に際して細胞中でシグナル変換経路を開始することができる細胞表面レセプター が含まれる。細胞表面レセプターは、典型的には、細胞の原形質膜の外面上に位 置する外部部分、原形質膜を貫通する膜貫通部分、及び原形質膜の内面に位置す る細胞質部分を含む。 細胞表面レセプターは、ここに記載のように、細胞表面レセプターをコードす る天然の遺伝子及び／又は細胞中にトランスフォームされた異種核酸分子の発現 によって生成することができる。細胞表面レセプターの例には、Ｇ蛋白質と結合 したレセプター、チロシンキナーゼと結合したレセプター及びリガンドゲーテッ ドイオンチャンネルを有するレセプターが含まれる（これらに限定しない）。本 発明の好適なＧ蛋白質と結合したレセプターには、７つの膜貫通セグメントを 含み、細胞質ドメインを介してＧ蛋白質と相互作用するヘビ状のレセプターが含 まれる。一層好適なＧ蛋白質と結合したレセプターには、化学誘引物質、ケモカ イン、アデニルシクラーゼカップルした、ムスカリン様アセチルコリン、カテコ ールアミン及びニューロペプチドレセプターが含まれる。更に好適なＧ蛋白質と 結合したレセプターには、トロンビンレセプター、リゾホスファチデートレセプ ター（ＬＰＡＲ）、Ｃ５ａレセプター（Ｃ５ａＲ）、インターロイキン８レセプ ター（ＩＬ−８Ｒ）、単球走化性蛋白質１αレセプター（ＭＩＰ１αＲ）、単球 走化性蛋白質１βレセプター（ＭＩＰ１βＲ）、単球化学誘引性蛋白質１レセプ ター（ＭＣＰ−１Ｒ）、単球化学誘引性蛋白質３レセプター（ＭＣＰ−３Ｒ）、 血小板活性化因子レセプター（ＰＡＦＲ）、Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイシ ル−［^3H］フェニルアラニンレセプター（ＦＭＬＰＲ）、ロイコトリエンＢ₄レ セプター（ＬＴＢ₄Ｒ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）レセプター（ＧＲ ＰＲ）（ボンベシンレセプターを含む）、ＲＡＮＴＥＳレセプター、サブスタン スＰレセプター、バソプレシンレセプター及びブラジキニンレセプターが含まれ る。本発明の好適なチロシンキナーゼと結合したレセプターには、ａｂ１若しく はＢＣＲ−ａｂ１に結合したレセプター、ＦｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲ ＩＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃαＲ、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）及びＢ細胞レセ プター（ＢＣＲ）が含まれる（これらに限定しない）。本発明の好適な細胞は、 細胞表面レセプター例えばＣ５ａＲ、Ｒａｎｔｅｓレセプター、ＬＰＡＲ、ＧＲ ＰＲ、トロンビンレセプター、ＩＬ−８Ｒ、サブスタンスＰレセプター、バソプ レシンレセプター及び／又はブラジキニンレセプターを有する。 他の具体例において、本発明における使用に適した細胞は、その細胞の細胞質 を通してシグナルを伝達してアクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は 局部的接着アセンブリーを生じることのできる１つ以上の細胞内シグナル変換分 子を有する。細胞内シグナル変換分子は、ここに記載のように、天然の遺伝子の 発現により及び／又は細胞中にトランスフォームされた異種核酸分子の発現によ って、細胞内で生成することができる。 本発明の好適な細胞は、他のシグナル変換分子の内、Ｇ蛋白質、チロシンキナ ーセ、低分子量Ｇ蛋白質調節分子及び／又は低分子量Ｇ蛋白質を有する。本発明 の適当なＧ蛋白質には、Ｒｈｏレギュレーター分子の活性を調節することができ る、例えばＲｈｏのグアニンヌクレオチド交換活性を刺激するＲｈｏレギュレー ター分子の能力を促進し又は制限することのできるＧ蛋白質が含まれる。ここで 用いる場合、熟語「グアニンヌクレオチド結合」は、Ｇ蛋白質のグアニンヌクレ オチド結合部位へのグアニンヌクレオチド結合をいう。グアニンヌクレオチドに は、グアニン三リン酸（ＧＴＰ）、グアニン二リン酸（ＧＤＰ）及びグアニン一 リン酸（ＧＭＰ）が含まれる。熟語「グアニンヌクレオチド交換」は、グアニン ヌクレオチドからのリン酸の喪失をいう。例えば、「グアニンヌクレオチド交換 」には、ＧＤＰのＧＴＰとの交換が含まれる。Ｇ蛋白質へのグアニンヌクレオチ ド結合を、ＧＴＰ結合アッセイ例えばVaillancourt等（Methods of Enzymology 238:255-258,1994（本明細書中に参考として援用する））に記載されたアッセイ 又は当業者に公知のアッセイを用いて測定することができる。Ｇ蛋白質によるグ アニンヌクレオチド交換を、ＧＴＰ交換アッセイ例えばVaillancourt等（同書） に記載されたアッセイ又は当業者に公知のアッセイを用いて測定することができ る。 本発明の好適なＧ蛋白質には、ＧＤＰ又はＧＴＰに結合することのできるαサ ブユニット及び互いに会合することができてαサブユニットの活性を調節するこ とのできる複合体を形成するβ及びγサブユニットを有する３量体Ｇ蛋白質が含 まれる。本発明の一層好適なＧ蛋白質サブユニットには、Ｇ₁₂及びＧ₁₃が含まれ る。本発明の更に好適なＧ蛋白質サブユニットには、Ｇα₁₂及びＧα₁₃が含まれ る。ここで用いる場合、Ｇ蛋白質サブユニットは、サブユニット単独の名称（例 えば、α₁₂又はα₁₃）により又はフルネームＧα₁₂及びＧα₁₃によって言及する ことができる。このサブユニットの名称及びＧ蛋白質のフルネームは、交換可能 に用いられ、同じ分子をいうことを意図する。 特定のＧ蛋白質は、本発明の方法で用いる場合に有用でない。特に、本発明の 好適なＧ蛋白質には、α_s、α_olf、α_i1、α_i2、α_i3、α_o1.2、α_{t rod}、α_{t c one} 、α_gust、α_z、α_q、α₁₁、α₁₄、α₁₅、α₁₆、β₁、β₂、β₃、β₄、γ₁、 γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₆、γ₇、γ₈、γ₉及びγ₁₀、Ｇβ２γ２又はＧβ１γ２ は含まれない。 好適な低分子量Ｇ蛋白質レギュレーター分子には、ｐ２１^ras、Ｒｈｏ及びＲ ａｃのレギュレーター分子が含まれる。一層好適な低分子量Ｇ蛋白質調節分子に は、Ｒｈｏのレギュレーター分子が含まれる。更に好適な低分子量Ｇ蛋白質レギ ュレーター分子には、Ｄｂ１相同性ドメインを含む蛋白質、１ｂｃ相同性ドメイ ンを含む蛋白質、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド解離インヒビター及びＲｈｏＧＴ Ｐアーゼ活性化蛋白質が含まれる。更に一層好適な低分子量Ｇ蛋白質レギュレー ター分子には、Ｄｂ１、Ｂｃｒ、Ｖａｖ、Ｅｃｔ２、Ｓｏｓ、ＲａｓＧＲＦ、Ｒ ｈｏＧＤＩ、ＬｙＧＤＩ、Ｄ４、ＲｈｏＧＡＰ、ｐ１９０、３ＢＰ−１、ｎ−キ マエリン、β−キマエリン及びｐ８５が含まれる。 好適な低分子量Ｇ蛋白質には、ｐ２１^ras、Ｒｈｏ又はＲａｃが含まれる。一 層好適な低分子量Ｇ蛋白質には、Ｒｈｏが含まれ、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ及びＲｈ ｏＣが更に一層好適である。 本発明の好適な細胞は、他のシグナル変換分子の内、Ｇ蛋白質及び／又はチロ シンキナーゼ及びＲｈｏ蛋白質を有する。本発明の一層好適な細胞は、他のシグ ナル変換分子の内、Ｇα₁₂、Ｇα₁₃及びＲｈｏ蛋白質を有する。 好適具体例において、本発明の細胞は：Ｃ５ａＲ、Ｒａｎｔｅｓレセプター、 ＬＰＡＲ、トロンビンレセプター、ＧＲＰＲ、ＩＬ−８Ｒ、サブスタンスＰレセ プター、バソプレシンレセプター及び／又はブラジキニンレセプター；Ｇα₁₂蛋 白質に加えてＧα₁₃蛋白質、Ｒｈｏレギュレーター分子及びＲｈｏ蛋白質を含む 。 ここで言及されるシグナル変換分子には、天然の完全長蛋白質が含まれ、又は 該シグナル変換分子は、改変された蛋白質が天然の蛋白質と実質的に類似の生物 学的活性及び／又は機能を有するようにアミノ酸が欠失され（例えば、蛋白質の 切り詰められたバージョン）、挿入され、逆向され、置換され及び／又は誘導体 化（例えば、リン酸化、アセチル化、グリコシル化、カルボキシメチル化、ミリ スチル化、プレニル化又はパルミチル化アミノ酸化）された機能的に同等な蛋白 質であってよい。改変は、蛋白質に対する直接的改変又は蛋白質をコードする遺 伝子に対する改変を含む（但し、これらに限定されない）当業者に公知の技術に より達成することができる。かかる蛋白質をコードする遺伝子に対する改変に は、例えば、ランダムな若しくは標的を定めた突然変異誘発を達成する古典的な 技術又は組換えＤＮＡの技術が含まれ得る（例えば、Sambrook等、Molecular Cl oning: A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Labs Press，1989 を参照さ れたい（参考として本明細書中に援用する））。 機能的に同等な蛋白質を、その蛋白質の生物学的活性を測定するために確立さ れたアッセイを用いて選択することができる。例えば、機能的に同等な細胞表面 レセプターは、対応する天然の細胞表面レセプター蛋白質が結合するであろう特 定のリガンドに結合する類似の能力を有するであろう。更なる例として、機能的 に同等な細胞内シグナル変換蛋白質は、対応する天然の細胞内シグナル変換蛋白 質と同様に、会合して他の細胞内分子の活性を調節する類似の能力を有するであ ろう。 ある具体例において、本発明の細胞を、少なくとも一の異種核酸分子でトラン スフォームする。核酸分子は、ここに記載のように、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ 若しくはＲＮＡの何れかのハイブリッド若しくは誘導体であってよい。ここで言 及される核酸分子は、核酸分子の発現を制御する調節領域（例えば、転写又は翻 訳制御領域）、完全長若しくは部分的コード領域、及びこれらの組合せを含むこ とができる。核酸分子の任意の部分を：（１）その分子をその自然の環境から単 離すること；（２）組換えＤＮＡ技術（例えば、ＰＣＲ増幅、クローニング）を 用いること；又は（３）化学合成法を用いることにより生成することができると いうことは理解されるべきである。遺伝子は、天然の細胞表面レセプター遺伝子 に関連するすべての核酸配列、例えば、その遺伝子によりコードされる細胞表面 レセプターの生成を制御する調節領域（例えば、転写、翻訳又は翻訳後制御領域 （但し、これらに限定されない））並びにコード領域自身を含む。 核酸分子には、蛋白質をコードする天然の核酸分子の機能的同等物が含まれ得 る。天然の核酸分子の機能的同等物には、改変が本発明の分子をコードする核酸 分子の能力を実質的に邪魔しないような仕方で、ヌクレオチドが挿入され、欠失 され、置換され及び／又は逆行された自然の対立遺伝子変異物及び改変された核 酸分子が含まれ得る（但し、これらに限定されない）。好適な機能的同等物には 、シグナル変換蛋白質をコードする核酸分子の少なくとも一部分に、Sambrook 等（同書）に記載された条件に従って、きつい条件下でハイブリダイズすること のできる配列（即ち、少なくとも約７０％同一性を有する配列）が含まれる。 如何なる特定の改変が如何なる特定の核酸分子に対して為され得るかの決定に おける手引きとして、当業者は、過度の実験を必要とせずに、本発明の実施可能 な具体例を評価することを可能にする幾つかの因子を考えるべきである。例えば 、かかる因子には、コードされる蛋白質の特定の機能的領域（リガンド結合部位 、標的結合部位、ヌクレオチド交換ドメイン、キナーゼ触媒ドメイン等）を維持 するような仕方で為される核酸分子に対する改変が含まれる。これらの種々の特 性についての機能試験（例えば、リガンド結合研究及びシグナル変換アッセイ例 えばキナーゼアッセイ、ＧＴＰ結合アッセイ及びここに詳述した他のアッセイ並 びに当業者に公知のもの）は、当業者が核酸配列に対する如何なる改変が適当で あり、どれが適当でないかを決定することを可能にする。 異種核酸分子（例えば、核酸分子をコードする異種細胞表面レセプター）の本 発明での使用に適した細胞へのトランスフォーメーションは、遺伝子を細胞に挿 入する任意の方法により達成することができる。トランスフォーメーション技術 には、トランスフェクション、レトロウイルス感染、エレクトロポレーション、 リポフェクション、細菌トランスファー及びスフェロプラスト融合が含まれる（ 但し、これらに限定しない）。本発明での使用に適した細胞にトランスフォーム された核酸分子は、染色体外ベクター上にとどまるか又は細胞ゲノム中にインテ グレートされ得る。 細胞における本発明の核酸分子の発現は、当業者に公知の技術を用いて達成す ることができる。簡単には、遺伝子が宿主細胞にトランスフォームされたときに その遺伝子の構成的又は調節された発現を達成することができるように核酸分子 を転写制御配列に機能的に結合されるように発現ベクターに挿入する。所望の発 現ベクターの構築を当業者に公知の方法によって行なうことができ、真核又は原 核生物の系において発現させることができる。発現系を、核酸配列と機能的に結 合された宿主細胞と両立し得る転写制御配列、翻訳制御配列、複製のオリジン及 び他の調節配列を含む制御要素から、当業者に公知の方法を用いて構築すること ができる（例えば、Sambrook等、同書参照）。 一具体例において、本発明における使用に適した細胞を、ここに詳述するよう に、少なくとも一つの型の細胞表面レセプターをコードする核酸分子でトランス フォームする。好適な細胞表面レセプターをコードする核酸分子には、Ｇ蛋白質 結合したレセプター及びチロシンキナーセとカップルしたレセプターをコードす る核酸分子が含まれるが、これらに限定しない。一層好適な細胞表面レセプター をコードする核酸分子には、ＬＰＡＲ、トロンビンレセプター、Ｃ５ａＲ、ＩＬ −８Ｒ、ＭＩＰ１αＲ、ＭＩＰ１βＲ、ＭＣＰ−１Ｒ、ＭＣＰ−１Ｒ、ＭＣＰ− ３Ｒ、ＰＡＦＲ、ＦＭＬＰＲ、ＬＴＢ₄Ｒ、ＧＲＰＲ、ＲＡＮＴＥＳレセプター 、サブスタンスＰレセプター、バソプレシンレセプター、ブラジキニンレセプタ ー、Ａｂ１リンクしたレセプター、ＢＣＲ−ＡＢＬ−リンクしたレセプター、Ｆ ｃεＲＩβ、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、ＲｃγＲＩＩＡ、ＦｃαＲ、ＴＣＲ 、ＢＣＲをコードする核酸分子が含まれるが、これらに限定されない。更に一層 好適な細胞表面レセプターをコードする核酸分子には、Ｃ５ａＲ、Ｒａｎｔｅｓ レセプター、ＬＰＡＲ、トロンビンレセプター、ＩＬ−８Ｒ、ＧＲＰＲ、サブス タンスＰレセプター、バソプレシンレセプター、ブラジキニンレセプターをコー ドする核酸分子及びこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。 本発明の他の具体例において、本発明における使用に適した細胞を、少なくと も一つの型の本発明の細胞内シグナル変換蛋白質をコードする核酸でトランスフ ォームする。好適な細胞内シグナル変換蛋白質をコードする核酸分子には、Ｇ蛋 白質、キナーゼ、低分子量Ｇ蛋白質レギュレーター分子及び低分子量Ｇ蛋白質を コードする核酸分子が含まれるが、これらに限定されない。一層好適な細胞内シ グナル変換蛋白質をコードする核酸分子には、Ｇα₁₂、Ｇα₁₃、ｐ２１^ras、Ｒ ｈｏ、Ｒａｃ、ＭＥＫＫ、ＰＡＫキナーゼ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、Ｙｅｓ、 Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ａｂ１及びＢＣＲ−Ａｂ１をコードする核酸分子が含 まれるが、これらに限定されない。更に一層好適な細胞内シグナル変換蛋白質を コードする核酸分子には、Ｇα₁₂、Ｇα₁₃、Ｒｈｏ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｂｌｋ、 Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ａｂ１、ＢＣＲ−Ａｂ１及びＲｈｏレギュレ ーター分子をコードする核酸分子が含まれるが、これらに限定されな い。 細胞を、少なくとも一つの型のシグナル変換分子をコードする核酸分子及び少 なくとも一つの型の細胞表面レセプターをコードする核酸分子の両者でトランス フォームできることは、本発明の範囲内にある。 一具体例において、本発明の方法は、細胞を推定上の調節化合物と接触させる ことを含む。本発明に従って、推定上の調節化合物には、アクチン重合、ストレ スファイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを調節することができると 推測される化合物が含まれる。用語「活性」は、例えば、ヌクレオチドの結合、 ヌクレオチドの交換、分子のコンホメーション変化（その分子による触媒活性の 獲得を生じるもの）；分子のリン酸化（それにより、その分子による触媒活性の 獲得又は喪失を生じる）；又は細胞の一の領域から他の領域への分子の移動（そ れにより、その分子は他の分子に結合することが可能になる）によるシグナル変 換分子の活性化の任意の段階をいう。用語「調節する」は、分子の活性及び／又 は生物学的機能を制御すること（例えば、かかる活性又は機能を増強し又は減じ ること）をいう。 ここで言及する推定上の化合物には、例えば、合理的薬物デザインの生成物、 天然物及び部分的に規定されたシグナル変換調節特性を有する化合物である化合 物が含まれる。推定上の化合物は、蛋白質に基づく化合物、炭水化物に基づく化 合物、脂質に基づく化合物、核酸に基づく化合物、天然有機化合物、合成により 誘導された有機化合物、抗イディオタイプ抗体及び／又は触媒抗体、又はこれら の断片であってよい。推定上の調節化合物を、例えば、天然又は合成の化合物の ライブラリーから、特に、化学的ライブラリー又は組合せライブラリー（即ち、 配列又はサイズにおいて異なるが同じビルディングブロックを有する化合物のラ イブラリー（例えば、Rutter及びSanti の米国特許第５，０１０，１７５号及び ５，２６６，６８４号参照。これらを参考として本明細書中に援用する））から 得ることができ或は合理的薬物デザインにより得ることができる。 合理的薬物デザインの手順において、シグナル変換分子等の化合物の三次元構 造を、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）又はＸ線結晶学によって分析することがで きる。次いで、この三次元構造を用いて、推定上の調節化合物等の潜在的化合 物の構造を例えばコンピューターモデリングによって予言することができる。次 いで、この予言された化合物構造を、例えば化学合成、組換えＤＮＡ技術により 、又は天然起源（例えば、植物、動物、細菌及びカビ）からミメトープを単離す るによって生成することができる。潜在的な調節化合物を、例えば、ＰＣＴ公開 番号ＷＯ９１／１９８１３号；ＷＯ９２／０２５３６号及びＷＯ９３／０３１７ ２号（これらを参考として本明細書中に援用する）に記載されたＳＦＬＥＸ技術 を用いて同定することもできる。 特に、天然の細胞内シグナル変換分子を、その構造及び機能の分析に基づいて 改変して適当な調節化合物を形成することができる。例えば、Ｇ蛋白質のαサブ ユニットの活性を調節することのできる化合物には、Ｇ蛋白質のβ又はγサブユ ニットに類似の構造を有する化合物（ここでは、β又はγサブユニットミメトー プという）を含むことができる。それ故、αサブユニット調節化合物は、改変さ れた又は改変されていないβ又はγサブユニットの少なくとも一部分を含むこと ができる。更に、Ｇ蛋白質のサブユニットのＲｈｏレギュレーター分子との会合 を邪魔することのできる化合物には、Ｇ蛋白質サブユニット上のＲｈｏレギュレ ーター分子結合部位（ここでは、Ｒｈｏレギュレーターミメトープという）と類 似の構造を有する化合物、或はＲｈｏレギュレーター分子上のＧ蛋白質サブユニ ット結合部位（ここでは、Ｇ蛋白質ミメトープという）に類似の構造を有する化 合物が含まれ得る。 酵素活性又はヌクレオチド交換活性を有する細胞内シグナル変換分子の統制解 除された形態も又、これらの分子の構造を分析することによって開発することが できる。例えば、統制解除された形態のキナーゼを、アミノ末端調節ドメインを カルボキシ末端キナーゼドメインから除去しそれによりＲｈｏ蛋白質の活性を調 節することのできる構成的に活性な化合物を造ることによりキナーゼを改変する ことによって形成することができる。或は、統制解除された形態のＧ蛋白質を、 例えばＧ蛋白質のα鎖のＧＤＰ／ＧＴＰ結合結合ドメインのＧ３配列に隣接する 保存されたグルタミン（Ｑ）をロイシン（Ｌ）に変異させることによりＧ蛋白質 を改変することによって形成することができる。このＱからＬへの変異は、この ポリペプチドのＧＴＰアーゼ活性を機能的に阻害して構成的に活性化されたＧ蛋 白質αサブユニットを生じる。この変異は、α₁₂中の残基２２９及びα₁₃中の残 基２２６に対応し、それにより、Ｒｈｏ蛋白質の活性を調節することのできる構 成的に活性な化合物を生じる。 推定上の調節化合物には、Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃とカップルしたレセプター を邪魔するようにデザインされた分子も含まれ得る。例えば、Ｇα₁₂及び／又は Ｇα₁₃のレセプターとのカップリングを邪魔するＧα₁₂及び／又はＧα₁₃とカッ プルした変異レセプターを造ることができる。推定上の調節化合物には、Ｇα₁₂ 及び／又はＧα₁₃とカップルしたレセプターのアゴニスト及びアンタゴニストが 含まれ得る。かかるアゴニスト及びアンタゴニストを、Ｇ蛋白質とカップルした レセプターに対する天然のリガンドの構造に基づいて選択することができる。 本発明の細胞を推定上の調節化合物と例えば混合により接触させる条件は、本 質的に、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着アセンブ リーを邪魔する他の調節化合物が存在しないならば、この細胞が、アクチンポリ マー、ストレスファイバーを形成し及び／又は局部的接着を集合させることので きる条件である。かかる条件を達成することは、当業者の範囲内にあり、細胞を その細胞が細胞骨格再配置を阻止することができるように培養することのできる 有効な培地を含む。例えば、哺乳動物細胞については、有効な培地は、典型的に は、１０％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含む水性培地であ る。 本発明の細胞は、組織培養フラスコ、試験管、ミクロ滴定ディッシュ及びペト リプレートを含む様々な容器にて培養することができる（これらに限定されない ）。培養は、細胞に適した温度、ｐＨ及び二酸化炭素含有量にて実施する。かか る培養条件も又、当業者の範囲内にある。例えば、ＨＥＬＡ細胞について、培養 を、３７℃で、５％ＣＯ₂環境中で行なうことができる。 有効な仕方で細胞を推定上の化合物に接触させるための許容し得るプロトコー ルには、接触させる容器当りの細胞数、細胞に投与される推定上の調節化合物の 濃度、推定上の調節化合物の細胞とのインキュベーション時間、細胞に投与され たリガンド及び／又は細胞内イニシエーター分子の濃度、並びにこのリガンド及 び／又は細胞内イニシエーター分子のこの細胞とのインキュベーション時間が含 まれる。かかるプロトコールの決定は、変数例えば容器のサイズ、容器内の液体 の容積、試験する細胞の型及び試験する推定上の調節化合物の化学的組成（即ち 、大きさ、電荷等）に基づいて、当業者により達成され得る。 本発明の方法の一具体例において、適当な数の細胞を、９６ウェル組織培養デ ィッシュに加える（培養培地中）。好適な細胞数には、本発明の検出方法（以下 に詳述）を用いて細胞骨格構造の変化を検出することを可能にする細胞数が含ま れる。一層好適な細胞数には、９６ウェル組織培養ディッシュのウェル当り約１ 〜１×１０⁶細胞が含まれる。細胞を組織培養ディッシュに加えてから、それら の細胞を、３７℃、５％ＣＯ₂で、約０〜２４時間予備インキュベートすること ができる。 培養培地に懸濁させた適当量の推定上の調節化合物（細胞内のシグナル変換分 子の活性を調節するのに十分なもの）を、その調節が本発明の検出方法を用いて 検出できるように細胞に加える。推定上の調節化合物の好適な量には、９６ウェ ルプレートのウェル当り約１ｎＭ〜約１０ｍＭの推定上の調節化合物が含まれる 。これらの細胞は、推定上の調節化合物が細胞に入ってシグナル変換分子と相互 作用することを可能にするために適当な時間インキュベートすることができる。 好適なインキュベーション時間は、約１分〜約１２時間である。 本発明の方法の他の具体例において、本発明における使用に適した細胞を、本 発明の細胞表面レセプターに結合することのできる刺激分子で刺激して、シグ ナル変換経路を開始し、細胞応答を引き起こす。好ましくは、細胞を、推定上の 調節化合物との接触の後に、刺激分子で刺激する。適当な刺激分子には、例えば ホルモン、成長因子、抗原、ペプチド、イオン、他の分化因子及び他の細胞型特 異的有糸分裂誘発因子が含まれ得る。好適な刺激分子には、ＬＰＡ、トロンビン 、Ｃ５ａ、ＩＬ−８、ＭＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＰＡ Ｆ、ＦＭＬＰ、ＬＴＢ₄、ＧＲＰ（ボンベシンを含む）、ＲＡＮＴＥＳ、サブス タンスＰ、バソプレシン、ブラジキニン、ＩｇＥ／抗原、ＩｇＧ／抗原、ＩｇＡ ／抗原及びこれらの混合物が含まれる（これらに限定されない）。特に好適な本 発明の刺激分子には、ＬＰＡ、トロンビン、Ｃ５ａ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１、Ｍ ＩＰ１α、ＦＭＬＰ、ＲＡＮＴＥＳ、ＰＡＦ、ＬＴＢ₄、ＧＲＰ（ボンベシンを 含む）、サブスタンスＰ、バソプレシン、ブラジキニン及びこれらの混合物が含 まれ、ＬＰＡ、トロンビン、ＩＬ−８、ＧＲＰ（ボンベシンを含む）及びこれら の混合物が更に一層好適である。細胞に加える刺激分子の適当な量は、用いるリ ガンドの型（例えば、単量体か多量体か；透過性等）及び標的とされるレセプタ ー（例えば、細胞上のレセプターの豊富さ及びレセプター当りのリガンド結合部 位の数）等の因子に依存する。好ましくは、約１．０ｎＭ〜約１ｍＭのリガンド を細胞に加える。 本発明の他の具体例において、本発明における使用に適した細胞を、アクチン 重合、ストレスファイバー形成及び／又は細胞の内側からの局部的接着アセンブ リーを開始することのできる細胞内イニシエーター分子で刺激する。ここでいう 細胞内イニシエーター分子の例には、Ｄｂ１カエルメイン（chaermein）、Ｉｂ ｃ、Ｒａｃ、Ｒａｃ交換因子、Ｒａｓ、Ｒａｓ交換因子、Ｒｈｏ及びＲｈｏ交換 因子が含まれるが、これらに限定されない。細胞に加える細胞内開始分子の適当 な量は、その分子がどれ位効率的に細胞に入り得るか及び細胞内開始分子が作用 する標的分子の濃度等の因子に依存する。好ましくは、約１ｎＭ〜約１ｍＭの細 胞内開始分子を細胞に加える。 これらの細胞は、刺激分子又は細胞内イニシエーター分子がシグナル変換経路 を刺激することを可能にするために適当な時間インキュベートすることができる 。好適なインキュベーション時間は、約１分間〜約２４時間である。 本発明の方法には、推定上の調節化合物がアクチン重合、ストレスファイバー 形成及び／又は局部的接着アセンブリーを調節することができるかどうかを測定 することが含まれる。かかる方法には：グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合アッ セイ（Vaillancourt等、同書に、一般的に記載されている）；アクチン重合分析 ；及びアクチン結合蛋白質リン酸化アッセイが含まれる。本発明の方法には、更 に、毒性試験を行なって推定上の調節化合物の毒性を測定するステップが含まれ る。 一具体例において、本発明の方法には、Ｒｈｏ蛋白質のＧＴＰ結合及び／又は ＧＴＰ交換活性を（Vaillancourt等、同書の方法を用いて）測定することによる 、細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着ア センブリーの検出が含まれる。好適な方法は、次を含む：（１）細胞を本発明の 推定上の調節化合物と接触させること；（２）その細胞を、アクチン重合、スト レスファイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを減じることのできる刺 激分子で刺激すること；及び（３）ＲｈｏＧＴＰ結合及び／又は結合活性を測定 すること。 他の具体例において、本発明の方法は、推定上の調節化合物と接触させた細胞 における変化を測定することによって、細胞におけるアクチン重合、ストレスフ ァイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを、同化合物と接触してない細 胞と比較して、検出することを含む。例えば、アクチン重合、ストレスファイバ ー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを制御するための推定上の調節化合物 の有効性を測定するために、接触させた細胞及び接触させてない細胞の接着、成 長、形状及び運動特性を観察することができる。細胞の接着性の程度を、細胞が 震盪により若しくは培養表面をたたくことにより基層から取り払われ得るかどう かにより、又は細胞を基層から取り払うのにトリプシン等の酵素処理を要するか どうかによって測定することができる。培養表面から細胞を取り払う方法は、当 分野で周知である。細胞成長の変化を、一定時間後に生細胞数を計数することに よって（例えば、クーマシーブルー染色により）、及び／又は一定時間後に細胞 の大きさを測定することによって測定することができる。細胞形状の変化を、細 胞を見て基層上で細胞が平らになっていること及び／又は細胞の伸張 例えば偽足、糸状仮足及び膜状仮足の形成を評価することにより測定することが できる。細胞運動性の変化を、一定時間中に基層上を細胞が移動した方向及び距 離を見ることにより測定することができる。典型的には、かかる移動は、細胞伸 張の形成と関係している。 他の具体例において、本発明の方法は、細胞におけるアクチン重合、ストレス ファイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを、アクチン重合及び／又は 組織化における変化を測定することにより検出することを含む。かかる方法にお いて、アクチン重合の程度及び／又はアクチンフィラメントの組織化を、推定上 の調節化合物と接触させた細胞及びかかる化合物と接触させてない細胞において 比較する。アクチンフィラメントを、細胞を標識したファロイジン（例えば、ロ ーダミン結合したファロイジン）と接触させることにより可視化する。該物質は 、ここに記載の技術を用いて、Ｆ−アクチンに特異的に結合する（下記の、実施 例１参照）。或は、アクチンフィラメントを、アクチンモノマー又はポリマーに 特異的に結合する標識した抗体を用いて、当業者に公知の方法を用いて可視化す ることができる。更なる方法には、電子顕微鏡によるアクチン重合の可視化が含 まれる。 更に他の具体例において、本発明の方法は、細胞におけるアクチン重合、スト レスファイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを、局部的接着キナーゼ （ＦＡＫ）、パクシリン及びビンキュリンを含む（但し、これらに限定しない） アクチン結合蛋白質のリン酸化を測定することにより検出することを含む。リン 酸化の検出には、当業者に公知の方法及び試薬が含まれ、例えば、リン酸化を、 リン酸化アミノ酸残基に特異的な抗体を用いて検出することができる。或は、重 合したアクチンを沈殿により単離することができ、アクチンと会合した蛋白質を 同定することができる。 本発明の別の具体例に関して、次のステップを含む無細胞アッセイにおいて、 調節化合物を同定することができる：（１）推定上の調節化合物を、Ｒｈｏレギ ュレーター分子及びＲｈｏレギュレーター分子の活性を調節することのできるＧ 蛋白質を含む配合物と接触させること；及び（２）推定上の調節化合物の、Ｒｈ ｏレギュレーター分子の活性を調節する能力を評価すること。本方法におけ る使用に適したＧ蛋白質及びＲｈｏレギュレーター分子には、ここに詳述したも のが含まれる。好ましくは、Ｒｈｏレギュレーター分子の活性を、ＲｈｏへのＧ ＴＰ結合の刺激により（Vaillancourt等、同書に記載された方法使用）又は増大 したアクチン重合により測定する。 アクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリーを 調節することのできる化合物を同定するのに有用な本発明の他の具体例には、次 を含む細胞に基づくアッセイが含まれる：（１）細胞を推定上の調節化合物と接 触させること（ここに、この細胞は、Ｒｈｏ蛋白質及びＧ蛋白質又はチロシンキ ナーゼを含む第１の蛋白質を含む）；及び（２）推定上の調節化合物の、細胞に おけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着アセンブリ ーを含む生物学的機能を調節する能力を、細胞におけるＲｈｏ蛋白質活性を調節 する第１の蛋白質の能力を測定することにより評価すること。本発明の適当なキ ナーゼには、チロシンキナーゼが含まれる。本発明の好適なチロシンキナーゼは 、直接又は間接に、Ｒｈｏレギュレーター分子の活性を調節することができる。 一層好適なチロシンキナーゼには、ｓｒｃファミリーキナーゼ例えばＦｙｎ、Ｌ ｙｎ、Ｂｌｋ、Ｙｅｓ、Ｌｃｋ、Ｂｔｋ、Ｈｃｋ、Ｓｒｃ（Ａｂ１及びＢＣＲ− Ａｂ１を含む）が含まれる。好ましくは、Ｒｈｏ蛋白質活性を、Ｒｈｏ蛋白質に 結合するグアニンヌクレオチド及び／又はＲｈｏ蛋白質によるグアニンヌクレオ チド交換をここに記載の方法を用いて測定することを含む方法により測定するこ とができる。 他の具体例には、次を含む無細胞アッセイが含まれる：（１）Ｇ蛋白質又はチ ロシンキナーゼを含む第１の蛋白質及びＲｈｏレギュレーター分子を含む第２の 蛋白質を推定上の調節化合物と接触させること；及び（２）推定の調節化合物の 、Ｒｈｏレギュレーター分子の活性を調節する能力を、Ｒｈｏレギュレーター分 子の活性を測定することにより評価すること。Ｒｈｏレギュレーター活性を、好 ましくは、ここに記載の方法を用いて測定する。 本発明の他の面は、細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及び ／又は局部的接着アセンブリー（かかる生物学的機能は、ある点で、Ｇα₁₂及び ／又はＧα₁₃蛋白質に関係する）を調節することのできる化合物を同定する キットを含む。かかるキットには：（１）Ｒｈｏ蛋白質及びＧ蛋白質又はチロシ ンキナーゼを含む蛋白質を含む細胞；及び（２）Ｒｈｏ蛋白質の調節を検出する 手段が含まれる。かかるＲｈｏ蛋白質の調節を検出する手段には、当業者に公知 の方法及び試薬が含まれ、例えば、Ｒｈｏ蛋白質へのＧＴＰ結合を、ここに詳述 したＧＴＰ結合アッセイを用いて検出することができる。本発明のキットでの使 用に適した細胞には、ここに詳述した細胞が含まれる。キットでの使用に好適な 細胞には、哺乳動物細胞、両生類細胞及び酵母細胞が含まれる。 本発明は又、推定上の調節化合物が哺乳動物における生物学的応答を調節する ことができるかどうかに関する測定をも含む。かかる方法は、推定上の調節化合 物を動物に投与することを必要とし、かかる化合物は、本発明のアッセイを用い て、細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的接着 アセンブリーを調節することが示されている。かかる測定は、推定上の調節化合 物を治療用組成物として動物に投与することのできる条件を決定するために有用 である。従って、動物において化合物を試験するためのここに述べた条件を、本 発明の治療用組成物を投与する際に用いることができることは、本発明の範囲内 にある。特に、推定上の調節化合物を、動物に投与して、その化合物が、例えば 、その動物における炎症性応答、病原菌に対する応答、自己免疫応答、代謝的応 答、心臓血管応答、アレルギー応答及び／又は異常細胞増殖応答を調節すること ができるかどうかを測定することができる。この化合物の有効性を試験するため の推定上の調節化合物を投与する許容し得るプロトコールには、個々の投与量、 投与数、投与の頻度及び投与方法が含まれる。かかるプロトコールの決定は、当 業者によって達成され得る。適当な単一投与量は、適当な期間（例えば、数分間 〜数日又は数週間）にわたって一回以上投与したときに動物における生物学的応 答を変えることのできる投与量である。好ましくは、一投与量は、この化合物を 体重１キログラム当り、約１ナノグラム（ｎｇ／ｋｇ）から約１グラム（ｇｍ／ ｋｇ）含み、一層好ましくは、１００ｎｇ／ｋｇから約１００ミリグラム／キロ グラム（ｍｇ／ｋｇ）、更に一層好ましくは、体重１キログラム当り、約１０マ イクログラムから約１０ｍｇ／ｋｇ含む。投与方法には、皮下、直腸、皮内、静 脈、鼻、経口、経皮及び筋肉内経路が含まれ得るが、これらに限定され ない。推定上の調節化合物を、動物に投与する前に、他の成分例えば製薬上許容 し得る賦形剤及び／又はキャリアーと組み合わせることができる。かかる賦形剤 の例には、水、塩溶液、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、及び 他の生理的に平衡化させた塩水溶液が含まれる。非水性ビヒクル例えば固定油、 胡麻油、エチルオレエート、又はトリグリセリドも又、用いることができる。他 の有用な配合物には、増粘剤例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソ ルビトール又はデキストランを含む懸濁液が含まれる。賦形剤は、少量の添加剤 例えば等張性及び化学的安定性を増大させる物質をも含むことができる。緩衝液 の例には、リン酸塩緩衝液、重炭酸塩緩衝液及びトリス緩衝液が含まれ、他方防 腐剤の例には、チメロサール、ｍ−又はｏ−クレゾール、ホルマリン及びベンジ ルアルコールが含まれる。標準的配合物は、液体の注射可能なもの又は注射のた めに懸濁液若しくは溶液として適当な液体中に取ることのできる固体の何れかで あってよい。キャリアーは、典型的には、治療される動物における化合物の半減 期を増大させる化合物である。適当なキャリアーには、高分子の制御された放出 用のビヒクル、生物分解性移植物、リポソーム、細菌、ウイルス、油、エステル 及びグリコールが含まれるが、これらに限定されない。好適な制御された放出用 の配合物は、本発明の組成物を動物中にゆっくりと放出することができる。適当 な制御された放出用ビヒクルには、生体適合性ポリマー、他の高分子マトリック ス、カプセル、マイクロカプセル、微小粒子、巨丸製剤、浸透ポンプ、拡散デバ イス、リポソーム、リポスフェア、及び経皮的送達システムが含まれるが、これ らに限定されない。他の本発明の制御された放出用ビヒクルには、動物への投与 に際してその場で固体又はゲルを形成する液体が含まれる。好適な制御された放 出用ビヒクルは、生物分解性（即ち、生物浸食性）である。 本発明の他の面において、本発明は、動物に毒性試験を行なって推定上の調節 化合物の毒性を測定することを含む。推定上の調節化合物についての毒性試験を 、例えば、推定上の調節化合物が細胞性炎症応答の調節等のシグナル変換におい て細胞レベルで効果を有することが測定された後で、動物において実施すること ができる。かかる毒性試験は、当業者の範囲内にあり、一般に、化合物の毒性を イン・ビボ又はイン・ビトロで試験することを含む。推定上の調節化合物の 毒性をイン・ビボで試験するのに適した方法は、推定上の調節化合物の何匹かの 動物への科学的に制御された投与、及びこの化合物のそれらの動物の生物学的機 能の様々な面（例えば、組織損傷の発生、臓器の機能及び死）に対する効果が示 される観察期間を含むことができる。推定上の調節化合物の毒性をイン・ビトロ で試験するのに適した方法は、推定上の調節化合物の細胞への科学的に制御され た投与、及び引き続いての細胞機能、細胞毒性又は細胞死の測定を含むことがで きる。細胞機能を、広範囲のアッセイ（例えば、チロシンリン酸化、カルシウム 流動化及びホスホイノシチドアッセイ）の何れか一つによって測定することがで き、それらは当業者に明らかとなろう（それらのいくつかをここに開示する）。 細胞毒性を測定する方法は、当分野で周知であり、他の多くの迅速に用いること のできるアッセイの内、発色性物質例えばテトラゾリウムベースのＭＴＴ又はス ルホローダミンブルーを還元する能力の測定、ＡＴＰ生物発光アッセイ及び蛍光 アッセイ（例えば、Fluorescent Green Protein使用）が含まれる（例えば、Bel lamy，Drugs 44(5):690-708，1992（参考として本明細書中に援用する）を参照 されたい）。細胞死を測定する方法には、例えば、クーマシーブルー染色、アク リジンオレンジ染色、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ ＴＤＴ）アッセイ（ＤＮＡ断片化測定用）、ニュートラルレッド排除、及びフロ ーサイトメーターにおけるフォワードライトスキャッタリングの変化を測定する ことが含まれる。 本発明の他の面は、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び／又は局部的 接着アセンブリーを調節する方法であってＧα₁₂及び／又はＧα₁₃を含む蛋白質 の活性を調節することを含む方法を含む。特に、本発明は、Ｇα₁₂及び／又はＧ α₁₃を含む蛋白質の活性を調節することにより細胞走化性を調節する方法を含む 。ここで用いる場合、用語「走化性」は、特異的化学物質による細胞の誘引をい う。例えば、白血球は、損傷を受けた細胞により放出される化学物質により誘引 されることにより傷の部位への走化性を受ける。 Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃の活性の調節は、Ｒｈｏ依存性経路（即ち、Ｒｈｏで ある一つのシグナル変換分子を有するシグナル変換経路）の活性を、不活性複合 体中のＧα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質を封鎖することにより調節すること、 Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質のヌクレオチド交換領域を調節すること、Ｇα₁₂ 及び／又はＧα₁₃蛋白質によるＧＴＰ加水分解を調節すること、細胞表面レセプ ターのＧα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂及び ／又はＧα₁₃蛋白質とＲｈｏレギュレーター分子との相互作用を調節すること、 Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質をコードする内因性及び／又は異種の核酸分子の 発現を調節すること、並びにこれらの組合せを含む。 不活性複合体中のＧα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質を封鎖するのに適した化合物 には、細胞外リガンド結合部位でのレセプターアンタゴニスト、Ｇα₁₂及び／又 はＧα₁₃カップルしたレセプターのアロステリックレギュレーター、レセプター のＧα₁₂及び／又はＧα₁₃へのカップリングを阻害する化合物、Ｇα12及び／又 はＧα₁₃へのＧＴＰ結合を阻害する化合物、又はＧα₁₂及び／又はＧα₁₃のＲｈ ｏ調節分子への結合を阻害する化合物が含まれる。 Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質のヌクレオチド交換領域を調節するのに適した 化合物には、ヌクレオチドアナログが含まれる。 細胞表面レセプターのＧα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質との相互作用を調節する のに適した化合物には、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターに対する細胞外リガ ンドのアンタゴニスト又は逆アゴニストが含まれる。 Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質をコードする内因性及び／又は異種の核酸分子 の発現を調節するのに適当な方法には、当業者に公知の方法が含まれる。例えば 、アンチセンス−、トリプレックス形成−、リボザイム−及び／又はＲＮＡ薬物 に基づく技術における使用のためのオリゴヌクレオチドを用いて、Ｇα₁₂及び／ 又はＧα₁₃蛋白質をコードする内因性核酸分子の発現を減じることができる。そ れ故、本発明は、かかるオリゴヌクレオチド及びかかる技術の１つ以上の使用に よりＧα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質の生成を邪魔する方法を含む。或は、Ｇα₁₂ 及び／又はＧα₁₃蛋白質をコードする核酸分子で細胞をトランスフォームして、 Ｇα₁₂及び／又はＧα₁₃蛋白質の発現を増大させることができる。トランスフォ ームされる細胞型によって、適当な発現ベクターを当業者により開発することが できる。 本発明の他の面は、動物に、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び／ 又は局部的接着アセンブリーを調節することのできる治療用組成物を投与するこ とを含む。本発明の治療用組成物は、異常成長又は動物中のある位置から他所へ の細胞の移動を含む病気を予防し又は治療するのに特に有用である。特に、治療 用組成物は、炎症性応答、免疫応答、アレルギー応答、ニューロン応答、アポト ーシス応答、腫瘍形成、血管形成、転移、過形成又は再狭窄を含む病気を予防し 又は治療するのに有用である。好ましくは、本発明の治療用組成物を用いて、癌 、呼吸障害症候群、炎症性腸疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病又は再狭 窄を含む病気を予防し又は治療する（但し、これらに限定されない）。 好ましくは、治療用組成物を、平滑筋細胞、内皮細胞、上皮細胞、好塩基球、 マスト細胞、好酸球、好中球、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、樹状 細胞、ナチュラルキラー細胞、形質細胞、神経芽細胞、幹細胞又は癌細胞を含む 細胞に投与するが、これらに限定されない。一層好ましくは、治療用組成物を、 小細胞肺癌、過剰発現された上皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターを含む（即ち、 非癌肺細胞で通常見出される数より多いＥＧＦレセプターを有する）非小細胞肺 癌、過剰発現されたＥＧＦレセプターを含む（即ち、乳房細胞で通常見出される 数より多いＥＧＦレセプターを有する）乳癌細胞、過剰発現されたＮｅｕレセプ ターを含む（即ち、乳房細胞で通常見出される数より多いＮｅｕレセプターを有 する）乳癌細胞、樹立された自己分泌ループの過剰発現された成長因子レセプタ ーを含む（即ち、非癌細胞で通常見出される数より多い成長因子レセプターを有 する）癌細胞又は樹立された傍分泌ループの過剰発現された成長因子レセプター を含む（即ち、非癌細胞で通常見出される数より多い成長因子レセプターを有す る）癌細胞を含む細胞に投与するが、これらに限定されない。 種々の治療用組成物を用いて、本発明の調節方法を実施することができる。か かる治療用組成物には、ここに詳細に記載した化合物特に本発明の方法を用いて 同定された化合物が含まれる。本発明の治療用組成物を、治療される動物が許容 することのできる賦形剤中で配合することができる。かかる賦形剤の例には、上 に詳述したものが含まれる。細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバーの 形成及び／又は局部的接着のアセンブリーを調節するために、本発明の治療用組 成物を、イン・ビボで（即ち、動物中で）又はエキソ・ビボで（即ち、動物の 体外例えば組織培養にて）、この組成物がアクチン重合、ストレスファイバー形 成及び／又は局部的接着アセンブリーを調節することができるような有効な方法 で投与することができる。 有効な投与プロトコール（即ち、治療用組成物を有効な様式で投与すること） は、病気の予防又は治療を生じる適当な投与量パラメーター及び投与方法を含む 。有効な投与量パラメーター及び投与方法を、特定の病気に対する当分野での標 準的方法を用いて決定することができる。かかる方法には、例えば、生存率、副 作用（即ち、毒性）及び病気の進行又は退行の測定が含まれる。例えば、本発明 の治療用組成物の投与量パラメーター及び投与方法の有効性を、応答率を評価す ることにより測定することができる。かかる応答率は、部分的又は完全な緩解を 伴って応答する患者の集団中の治療された患者のパーセンテージをいう。 本発明により、適当な単一投与量サイズは、適当な期間にわたって一回以上投 与したときに動物の病気を予防し又は治療することのできる投与量である。投与 量は、治療される病気に依存して変わり得る。例えば、癌の治療において、適当 な単一投与量は、治療する癌が原発性腫瘍であるか癌の転移型であるかに依存し 得る。 動物に投与される投与量の数が病気の程度及び治療に対する個々の患者の応答 に依存するということは、当業者に明らかとなろう。例えば、癌の場合、大きい 腫瘍は、小さい腫瘍より多い投与量を必要とし得る。しかしながら、幾つかの場 合には、大きい腫瘍を有する患者が、小さい腫瘍を有する患者より少ない投与量 しか要しないことは、もし大きい腫瘍を有する患者が小さい腫瘍を有する患者よ りも治療用組成物に対して一層順調に応答するならばあり得ることである。従っ て、適当な投与量並びに投与間の時間数には、病気の退行を引き起こすのに必要 な如何なる数も含まれるということは、本発明の範囲内にある。 治療用組成物を、直接細胞にイン・ビボで若しくはエキソ・ビボで投与し又は 全身投与することができる。好適な全身投与方法には、静脈注射、エーロゾル、 経口及び経皮的（局所的）送達が含まれる。静脈注射を、当分野で標準的な方法 を用いて行なうことができる。エーロゾル送達も、当分野で標準的な方法を用い て行なうことができる（例えば、Stribling 等、Proc.Natl.Acad.Sci．USA 189: 11277-11281，1992（参考として本明細書中に援用する）を参照されたい）。経 口送達を、本発明の治療用組成物を動物の消化管内の消化酵素による分解に耐え 得るキャリアーと複合体化することによって行なうことができる。かかるキャリ アーの例には、当分野で公知のプラスチックカプセル又は錠剤が含まれる。局所 的送達を、本発明の治療用組成物を皮膚を通過することのできる親油性試薬（例 えば、ＤＭＳＯ）と混合することによって行なうことができる。 下記の実施例を、説明の目的のために提供するが、本発明の範囲を制限するこ とを意図するものではない。 実施例実施例１ この実施例は、ＲｈｏＡ、Ｇα₁₂及びＧα₁₃のＧＴＰアーゼ欠損変異体でトラ ンスフォームした細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及び局部 的接着アセンブリーの刺激を記載するものである。 Ａ． ＲｈｏＡ、Ｇα₁₂及びＧα₁₃のＧＴＰアーゼ欠損変異体の調製 最初に、Ｇ₁₂の変異したαサブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを、Pr omega（ウィスコンシン、Madison在）により記載された方法に従って点突然変異により 調製し、発現ベクターｐＣＤＮＡ３（カリフォルニア、San Diego在、InVitrogenより入 手）中にライゲートして発現プラスミッドｐＣＮＤＡ３α₁₂ＱＬを形成した。 突然変異誘発に用いるオリゴヌクレオチドを、Applied Biosystemsヌクレオチド シンセサイザー（カリフォルニア、Foster City在、Applied Biosystems）を用いて合成 した。α鎖を、α₁₂中の残基２２９にある保存されたグルタミン（Ｑ）（Ｇ₁₂蛋 白質のα鎖のＧＤＰ／ＧＴＰ結合ドメインのＧ３配列に隣接）を、ここに記載し た点突然変異により、ロイシン（Ｌ）に変異させること（ＱからＬへの変異をこ こではＱ→Ｌとして言及する）によって変えた。このＱ→Ｌ変異は、このポリペ プチドのＧＴＰアーセ活性を機能的に阻害して構成的に活性化されたＧ蛋白質α サブユニットを生成し、それにより、構成的に活性な化合物を生成する。 同様に、Ｇ₁₃の変異したαサブユニットをコードするｃＤＮＡクローンを、点 突然変異により調製して発現ベクターｐＣＤＮＡ３（InVitrogenより入手）中 にライゲートし、発現プラスミッドｐＣＮＤＡ３α₁₃ＱＬを形成した。Ｇ₁₃蛋白 質のα鎖を、α₁₃中の残基２２６にある保存されたグルタミン（Ｑ）の点突然変 異（Promega）によって変えた。 変異したＲｈｏＡ蛋白質をコードするｃＤＮＡクローンを、残基６３にある保 存されたグルタミン（Ｑ）を点突然変異（Promega）によりロイシン（ＲｈｏＱ Ｌ）に変異させることにより変え、発現ベクターｐＣＭＶ（Southwestern，Texa s 大学、David Russell より入手）中にライゲートして発現プラスミッドｐＣＭ ＶＲｈｏＱＬを形成した。このＱ→Ｌ変異は、このポリペプチドのＧＴＰアーゼ 活性を機能的に阻害して構成的に活性化されたＲｈｏＡ蛋白質を生成し、それに より、構成的に活性な化合物を生成する。 発現プラスミッドｐＣＭＶβｇａｌを、InVitrogenから得た。 すべての発現プラスミッドを、塩化セシウム勾配遠心分離により、マイクロイ ンジェクション用に調製した。 Ｂ． 発現プラスミッドを用いる細胞のマイクロインジェクション Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を、ＤＮＡプラスミッドを用いて下記のようにマイクロ インジェクション用に調製した。Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を、約１０％の集密度で 、酸洗浄したカバーガラス上（５％仔ウシ血清（ＢＣＳ）及び５％新生仔ウシ血 清（ＮＣＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中）にプレートし た。翌日、細胞を、３度すすいで、０．１％ＢＣＳ／ＤＭＥＭ中に置いた。２４ 時間後、細胞を、血清非存在下でＤＭＥＭ中で３回すすいで、更に、マイクロイ ンジェクション前に１８時間インキュベートした。 マイクロインジェクションを、エッペンドルフ自動化マイクロインジェクショ ンシステムを用いて、垂直ピペットプラー（カリフォルニア、Tujunga在、Kopf）にてガ ラスキャピラリーから引いた針を用いて行なった。Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞の核に 、約１００ｎｇ／μｌのｐＣＭＶβｇａｌ及びｐＣＭＶＲｈｏＱＬ；ｐＣＭＶβ ｇａｌ及びｐＣＮＤＡ３α₁₂ＱＬ；又はｐＣＭＶβｇａｌ及びｐＣＮＤＡ３α₁₃ ＱＬプラスミッドを注入した。上首尾にマイクロインジェクションされた細胞を 、ウサギ抗−β−ガラクトシダーゼ抗体（カリフォルニア、Cappel）及び第２のＦＩＴ Ｃ結合したロバ抗ウサギ抗体（ミズーリ、St.Louis在、Pierce）を用いるβ− ガラクトシダーゼの間接免疫蛍光染色により、当分野の標準的方法を用いて検出 した。ｐＣＮＤＡ３α₁₂ＱＬ又はｐＣＮＤＡ３α₁₃ＱＬを上首尾に注入された細 胞を、それらの細胞をα₁₂又はα₁₃のＣ末端の１２アミノ酸部分を含むペプチド に特異的な抗血清を用いて、当分野の標準的方法を用いて免疫染色することによ って検出した。 Ｃ． 活性なＲｈｏＡ蛋白質、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質を構成的に発現する細 胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及び局部的接着アセンブリー 。 核への注入の２〜３時間後に、細胞を３％パラホルムアルデヒドにて１０分間 固定した。細胞をリン酸塩緩衝塩溶液にてすすぎ、０．２％トリトンＸ−１００ を５分間用いて透過性にした。これらの固定して透過性にした細胞を、次いで、 ＤＭＥＭ／５％、ＢＣＳ／５％ ＮＣＳと共に１５分間インキュベートした。マ イクロインジェクションされた発現プラスミッドの発現をβ−ガラクトシダーゼ 蛋白質の存在につき透過性にした細胞を免疫染色することにより上記の方法を用 いて確認した。注入された細胞におけるストレスファイバー形成を、透過性にし た細胞を約０．２単位／ミリリットルのローダミン−ファロイジン（オレゴン、Euge ne在、Molecular Probes）中で約３０分間２４℃でインキュベートすることによ り検出した。注入された細胞における局部的接着アセンブリーを、透過性にした 細胞をマウスモノクローナル抗ビンキュリン抗体（ミズーリ、St.Louis在、Sigma） 及び第２のＦＩＴＣ結合したヒツジ抗マウス（Cappel）抗体で免疫染色すること により当分野の標準的方法を用いて検出した。局部的接着アセンブリーは、細胞 の前縁におけるビンキュリン染色の局在化により表される。細胞をビンキュリン につき染色したとき、ローダミン結合したヤギ抗ウサギ抗体（Cappel）を、β− ガラクトシダーゼの検出のために用いた。カバーガラスをスライドに載せて、Ni kon Diaphot TMD 顕微鏡を用いてエピフルオレセンスを用いて試験した。細胞の イメージを、IPLAB スペクトルデジタルイメージ分析プログラム（バージニア、Vienn a 在、Signal Analytics Co.）を用いて捕らえた。すべての実験を、少なくとも ３〜４回行なって同様の結果を得た。 ｐＣＭＶＲｈｏＱＬ、ｐＣＮＤＡ３α₁₂ＱＬ又はｐＣＮＤＡ３α₁₃ＱＬの発現 のストレスファイバー形成に対する効果を、図１に示してある。Ｆ−アクチンの ローダミン−ファロイジン標識からの結果は、ロイシンに変異したグルタミン６ ３を有するＲｈｏＡ蛋白質が、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞においてストレスファイバ ー形成を誘導するということを示している。更に、Ｇ₁₂（α₁₂ＱＬ）及びＧ₁₃（ α₁₃ＱＬ）についてのαサブユニットのＱ→Ｌ変異体は、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞 で発現されたときには、ストレスファイバー形成の刺激において活性化されたＲ ｈｏＱＬを真似た。視野内の注入されてない細胞は、β−ガラクトシダーゼ染色 について陰性であり、僅かのストレスファイバーしか示していない。 ｐＣＭＶＲｈｏＱＬ、ｐＣＮＤＡ３α₁₂ＱＬ又はｐＣＮＤＡ３α₁₃ＱＬの局部 的接着アセンブリーに対する効果を、図２に示してある。ビンキュリンに特異的 な抗血清を用いる染色の結果は、休止中のＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞におけるＲｈｏ ＱＬの発現が局部的接着アセンブリーを刺激することを示している。更に、α₁₂ ＱＬ及びα₁₃ＱＬのマイクロインジェクション及び発現は、局部的接着アセンブ リーの刺激においてＲｈｏＱＬを真似た。従って、α₁₂及びα₁₃の活性化型は、 ＲｈｏＱＬを用いて観察されたのと同様に、アクチン重合及び局部的接着アセン ブリーを調節する。実施例２ この実施例は、活性化された、Ｇα_i2又はＧα_qのＧＴＰアーゼ欠損型は、ス トレスファイバー形成を誘導することができないことを記載するものである。 Ａ． Ｇ蛋白質のα_i2ＱＬα_qＱＬ、β１γ２又はβ２γ２サブユニットをコ ードする発現プラスミッドの調製。 Ｇ蛋白質のα_i2ＱＬ、α_qＱＬ、β１及びγ２又はβ２及びγ２サブユニット の変異型をコードするｃＤＮＡクローンを、Johnson 等（J.Cell.Biochem.47:13 6-146，1991）に記載されたようにして調製した。Ｇα_i2を、残基２０５にある 保存されたグルタミン（Ｑ）をロイシン（α_i2ＱＬ）に変異させることにより変 えて、ｐＣＭＶ５中にクローン化して発現プラスミッドｐＣＭＶα_i2ＱＬを形成 した。 Ｇα_qを、残基２０９にある保存されたグルタミン（Ｑ）をロイシン（α_qＱＬ ）に変異させることにより変えて、Qian等（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:4077-4 081,1993）に記載されたように、ｐＣＭＶ５中にクローン化して発現プラスミッ ドｐＣＭＶα_qＱＬを形成した。 Ｇβ１γ２及びＧβ２γ２をコードするｃＤＮＡを、それぞれ、ｐＣＭＶ５中 にクローン化して発現プラスミッドｐＣＭＶβ１γ２及びｐＣＭＶβ２γ２を形 成した。 すべての発現プラスミッドを、マイクロインジェクション用に、塩化セシウム 勾配遠心分離により調製した。 Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を用意して、ｐＣＭＶβｇａｌ及びｐＣＮＤＡ３α₁₃Ｑ Ｌ、ｐＣＭＶα_i2ＱＬ、ｐＣＭＶα_qＱＬ、ｐＣＭＶβ１γ２又はｐＣＭＶβ２ γ２を用いて、実施例１に記載のように核へのマイクロインジェクションを行な った。マイクロインジェクションした細胞を、実施例１に記載のように、β−ガ ラクトシダーゼについて染色することにより検出した。 マイクロインジェクションされた細胞を、実施例１に記載のように、透過性に して、抗−β−ガラクトシダーゼで染色し、ローダミン−ファロイジンで標識し た。ｐＣＮＤＡ３α₁₃ＱＬ、ｐＣＭＶα_i2ＱＬ、ｐＣＭＶα_qＱＬ、ｐＣＭＶ β１γ２又はｐＣＭＶβ２γ２の発現のストレスファイバー形成に対する効果を 図３に記載してある。Ｆ−アクチンのローダミン−ファロイジン標識からの結果 は、活性化された、α_i2（α_i2ＱＬ）又はα_q（α_qＱＬ）のＧＴＰアーゼ欠損型 はストレスファイバー形成を誘導することができなかったということを示してい る。α_qＱＬの発現は、ストレスファイバーを乱雑にし、原形質膜の細胞質表面 に沿った皮層アクチンの喪失を引き起こすようである。β１γ２又はβ２γ２の 発現もＳｗｉｓｓ３Ｔ３細胞においてストレスファイバー形成を誘導しなかった 。実施例３ この実施例は、Ｒｈｏ蛋白質活性のＧα₁₂ＱＬ及びＧα₁₃ＱＬによる調節がＲ ｈｏ依存性であったことを記載するものである。 Ａ． ボツリヌス菌Ｃ３外酵素は、Ｒｈｏ依存性のストレスファイバー形成を 刺激するための有効な試薬である。 組換えの、精製したボツリヌス菌Ｃ３外酵素を、下記のプロトコールを用いて 調製した。ボツリヌス菌Ｃ３外酵素は、Ｒｈｏ蛋白質中のＡｓｎ４１のＡＤＰ− リボシル化を触媒することによってＲｈｏ活性を阻害することができる。ｐＧＥ Ｘ２Ｔベクターに含まれるボツリヌス菌Ｃ３外酵素をコードするｃＤＮＡを用い た（Dillon等（Methods Enzymol.256:174-184，1995）に記載されたようにして 調製）。ボツリヌス菌Ｃ３外酵素融合蛋白質を、Dillon等（同書）に記載された 誘導、トロンビン開裂及び精製方法を用いて生成した。 Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を用意し、実施例１に記載した方法を用いて、ｐＣＭＶ βｇａｌ及び精製ボツリヌス菌Ｃ３外酵素（１００ｎｇ／μｌ）をマイクロイン ジェクションした。２〜３時間後、注入された細胞を、Ｒｈｏ依存性のストレス ファイバー形成を示すリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ；２００ｎｇ／ｍｌ）、Ｒ ｈｏ非依存性ストレスファイバー形成を示す血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ；３ ｎｇ／ｍｌ）、又は緩衝液のみ（対照用）の何れかで１０分間刺激した。次いで 、刺激された細胞を固定して、実施例１に記載した方法を用いて、β−カラクト シダーゼの存在について免疫染色した。 次いで、ＬＰＡ若しくはＰＤＧＦで処理したマイクロインジェクションされた 細胞、又は対照用細胞を、固定し、透過性にして、実施例１に記載した方法を用 いて、ローダミン−ファロイジン又は抗−β−ガラクトシダーゼ抗体で標識した 。ボツリヌス菌Ｃ３外酵素のマイクロインジェクションのストレスファイバー形 成に対する効果を、図４に示してある。これらの結果は、ボツリヌス菌Ｃ３外酵 素のマイクロインジェクションがＬＰＡ刺激されたストレスファイバー形成を阻 害することを示している。ＬＰＡ刺激されたストレスファイバー形成は、対照用 細胞において観察された。 ＰＤＧＦは、膜ひだと会合したＲａｃｌ依存性アクチン重合を刺激することが できる。ＰＤＧＦ刺激された膜ひだの波打ち運動は、ボツリヌス菌Ｃ３外酵素を 注入された細胞において影響を受けなかった。 従って、ボツリヌス菌Ｃ３外酵素は、Ｒｈｏ依存性ストレスファイバー形成の ための有効な試薬である。 Ｂ． ボツリヌス菌Ｃ３外酵素は、活性化α₁₂及びα₁₃刺激されたストレスフ ァイバー形成及び局部的接着アセンブリーを阻害する。 Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞を用意し、ｐＣＭＶβ−ｇａｌ及びｐＣＮＤＡ３α₁₂Ｑ Ｌ又はｐＣＮＤＡ３α₁₃ＱＬを実施例１に記載のように、ボツリヌス菌Ｃ３外酵 素（１００ｎｇ／μｌ）の存在時又は不在時に核にマイクロインジェクションし た。マイクロインジェクションされた細胞を、実施例１にも記載したようにβ− ガラクトシダーセについて染色することにより検出した。 ボツリヌス菌Ｃ３外酵素のストレスファイバー形成に対する効果を測定するた めに、マイクロインジェクションされた細胞の試料を、実施例１に記載した方法 を用いて、固定し、透過性にし、ローダミン−ファロイジン及び抗−β−ガラク トシダーゼ抗体で標識した。ボツリヌス菌Ｃ３外酵素及びα₁₂ＱＬ又はα₁₃ＱＬ のマイクロインジェクションのストレスファイバー形成に対する効果を、図５に 示してある。これらの結果は、ボツリヌス菌Ｃ３外酵素のマイクロインジェクシ ョンがα₁₂ＱＬ及びα₁₃ＱＬの両者に刺激されたストレスファイバー形成を、Ｌ ＰＡ刺激されたアクチン重合の阻害と同様に阻害したことを示している（図４に 示した通りである）。 ボツリヌス菌Ｃ３外酵素の局部的接着アセンブリーに対する効果を測定するた めに、ボツリヌス菌Ｃ３外酵素及びα₁₂ＱＬをマイクロインジェクションした細 胞の試料を、この実施例のＡ節に記載した方法を用いて、ＬＰＡ（２００ｎｇ／ ｍｌ）で処理し、固定し、透過性にして、実施例１に記載した方法を用いて抗− β−ガラクトシダーゼ抗体で標識した。ボツリヌス菌Ｃ３外酵素のＬＰＡ刺激さ れたα₁₂ＱＬ依存性局部的接着アセンブリーに対する効果を図６に示してある。 これらの結果は、ボツリヌス菌Ｃ３外酵素がＬＰＡ及びα₁₂ＱＬ刺激された局部 的接着形成を阻害したことを示している（図６）。上段パネルの未注入の細胞は 、ＬＰＡに対して局部的接着のアセンブリーを伴って応答したが、他方、ボツリ ヌス菌Ｃ３外酵素を注入された細胞においては局部的接着は存在していない。他 の実験において、ボツリヌス菌Ｃ３外酵素は又、α₁₃ＱＬ刺激された局部的接着 アセンブリーをも阻害した（示してない）。 合わせてみると、前述の実験は、Ｇα₁₂及びＧα₁₃が、ストレスファイバー形 成及び局部的接着アセンブリーを生じるＲｈｏ依存性アクチン重合を調節するこ とを示している。従って、これらの結果は、明らかに、α₁₂及びα₁₃がヘテロ３ 量体のＧ蛋白質とカップルしたレセプターをＲｈｏの調節と統合するということ を示している。これらの結果は、更に、Ｇα₁₂及びＧα₁₃がＲｈｏ依存性のスト レスファイバー形成及び局部的接着アセンブリーを刺激する類似の能力を有する ということを示している。従って、Ｇα₁₂及びＧα₁₃は、Ｒｈｏ活性化を調節す る一般的レギュレーターと相互作用することができる。 本発明の種々の具体例を詳細に述べてきたが、これらの具体例の改変及び適合 が当業者に思い浮かぶであろうことは明らかである。しかしながら、かかる改変 及び適合が、後述の請求の範囲に示すように本発明の範囲内にあることは、明確 に理解されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/00 ６２６ Ａ６１Ｋ 31/00 ６２６Ｎ ６３５ ６３５ ６４３ ６４３Ｄ 31/70 31/70 38/00 39/00 Ａ 38/45 45/00 39/00 48/00 45/00 Ｃ１２Ｑ 1/37 48/00 1/42 Ｃ１２Ｑ 1/37 Ａ６１Ｋ 37/52 1/42 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセン ブリーを調節することのできる化合物を同定する方法であって、下記を含む当該 方法： （ａ）細胞を推定上の調節化合物と接触させ、該細胞は、Ｒｈｏ蛋白質及び該 Ｒｈｏ蛋白質の活性を調節することのできるＧ蛋白質を含み；そして （ｂ）該推定上の調節化合物の、アクチン重合、ストレスファイバー形成又は 局部的接着アセンブリーよりなる群から選択する生物学的機能を調節する能力を 評価する。 ２．前記の評価のステップが、前記のＧ蛋白質の前記の細胞におけるＲｈｏ蛋白 質活性を調節する能力を測定することを含む、請求項１に記載の方法。 ３．前記の評価のステップが、前記のＧ蛋白質のＲｈｏレギュレーター分子の活 性を調節する能力を測定することを含む、請求項１に記載の方法。 ４．前記のレギュレーター分子を、Ｄｂ１相同ドメインを含む蛋白質、１ｂｃ相 同ドメインを含む蛋白質、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド解離インヒビター及びＲ ｈｏＧＴＰアーゼ活性化蛋白質よりなる群から選択する、請求項３に記載の方法 。 ５．前記のＲｈｏレギュレーター分子を、Ｄｂ１、Ｂｃｒ、Ｖａｖ、Ｅｃｔ２、 Ｓｏｓ、ＲａｓＧＲＦ、ＲｈｏＧＤＩ、ＬｙＧＤＩ、Ｄ４、ＲｈｏＧＡＰ、ｐ１ ９０、３ＢＰ−１、ｎ−キマエリン、β−キマエリン及びｐ８５よりなる群から 選択する、請求項３に記載の方法。 ６．前記の評価のステップが、前記のＲｈｏ蛋白質のＧＴＰ結合活性を測定する ことを含む、請求項１に記載の方法。 ７．前記の評価のステップが、前記のＲｈｏ蛋白質のＧＴＰ交換活性を測定する ことを含む、請求項１に記載の方法。 ８．前記の評価のステップが、前記の細胞が、接着、成長、形状及び運動特性の 変化よりなる群から選択する性質が変化したことを測定するステップを含む、請 求項１に記載の方法。 ９．前記の評価のステップが、前記の細胞におけるアクチン重合の程度を測定す るステップを含む、請求項１に記載の方法。 １０．前記の評価のステップが、局部的接着キナーゼリン酸化、パクシリンリン 酸化及びビンキュリンリン酸化を測定することを含む、請求項１に記載の方法。 １１．前記の方法が、更に、前記の細胞を、前記の評価のステップの前に、該細 胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成及び局部的接着アセンブリー よりなる群から選択する生物学的機能を誘導することのできる刺激化合物で刺激 することを含む、請求項１に記載の方法。 １２．前記の方法が、更に、前記の細胞を、前記の評価のステップの前に、トロ ンビン、ガストリン放出蛋白質、リゾホスファチジン酸、Ｃ５ａ、ＩＬ−８、Ｍ ＩＰ１α、ＭＩＰ１β、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＰＡＦ、ＦＭＬＰ、ＬＴＢ₄ 、ＲＡＮＴＥＳ、バソプレシン、ブラジキニン及びサブスタンスＰよりなる群か ら選択する刺激化合物で刺激することを含む、請求項１に記載の方法。 １３．前記のＧ蛋白質を、Ｇ₁₂及びＧ₁₃よりなる群から選択する、請求項１に記 載の方法。 １４．前記のＧ蛋白質を、Ｇα₁₂及びＧα₁₃よりなる群から選択する、請求項１ に記載の方法。 １５．前記のＧ蛋白質が、α_s、α_olf、α_i1、α_i2、α_i3、α_o1,2、α_{t rod}、 α_{t cone}、α_gust、α_z、α_q、α₁₁、α₁₄、α₁₅、α₁₆、β₁、β₂、β₃、β₄、 γ₁、γ₂、γ₃、γ₄、γ₅、γ₆、γ₇、γ₈、γ₉及びγ₁₀、Ｇβ２γ２及びＧβ １γ２よりなる群から選択するＧ蛋白質サブユニットでない、請求項１に記載の 方法。 １６．前記のＲｈｏ蛋白質を、ＲｈｏＡ、ＲｈｏＢ及びＲｈｏＣよりなる群から 選択する、請求項１に記載の方法。 １７．前記の細胞を、哺乳動物、無脊椎動物、植物、昆虫、カビ、酵母及び細菌 細胞よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。 １８．前記の細胞を、哺乳動物、両生類及び酵母細胞よりなる群から選択する、 請求項１に記載の方法。 １９．前記の細胞を、霊長類、マウス及びラット細胞よりなる群から選択する、 請求項１に記載の方法。 ２０．前記の細胞を、ＨＥＬＡ、繊維芽細胞、ラット好塩基球、ヒト好酸球、ヒ ト内皮細胞、ヒトＴ細胞、ヒトＢ細胞、ヒト好中球、ヒト上皮細胞、ヒトマクロ ファージ、Ｓｗｉｓｓ３Ｔ３細胞、メラニン細胞、白血病細胞、ＭｏｎｏＭａｃ ６、Ｒａｔ１ａ、ＨＥＫ２９３、ＫＵ８１２及びＢＪＡＢ細胞よりなる群から選 択する、請求項１に記載の方法。 ２１．前記の細胞が、刺激分子が結合したときに、アクチン重合、ストレスファ イバー形成又は局部的接着アセンブリーよりなる群から選択する生物学的機能を 開始する少なくとも１つのクラスの細胞表面レセプターを含む、請求項１に記載 の方法。 ２２．前記の細胞が、Ｇ蛋白質結合したレセプター、チロシンキナーゼ結合した レセプター及びリガンドゲーテッドイオンチャンネルを有するレセプターよりな る群から選択する細胞表面レセプターを含む、請求項１に記載の方法。 ２３．前記の細胞が、ガストリン放出蛋白質レセプター、トロンビンレセプター 、リゾホスファチデートレセプター、Ｃ５ａＲ、ＩＬ−８Ｒ、ＭＩＰ１αＲ、Ｍ ＩＰ１βＲ、ＭＣＰ−１Ｒ、ＭＣＰ−３Ｒ、ＰＡＦＲ、ＦＭＬＰＲ、ＬＴＢ₄Ｒ 、ＲＡＮＴＥＳレセプター、バソプレシンレセプター、ブラジキニンレセプター 及びサブスタンスＰレセプターよりなる群から選択する細胞表面レセプターを含 む、請求項１に記載の方法。 ２４．前記の細胞が、ヒト細胞に由来する細胞表面レセプターを含む、請求項１ に記載の方法。 ２５．前記の推定の調節化合物を、蛋白質ベースの化合物、炭水化物ベースの化 合物、脂質ベースの化合物、核酸ベースの化合物、天然有機化合物、合成により 誘導された化合物、抗イディオタイプ抗体及び／又は触媒抗体又はこれらの断片 よりなる群から選択する、請求項１に記載の方法。 ２６．細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセ ンブリーよりなる群から選択する生物学的機能を調節する前記の化合物の能力に より同定される調節化合物であって、細胞の原形質膜を透過することができ、 該細胞におけるＲｈｏ蛋白質活性を調節するＧ蛋白質の能力を阻害することので きる上記の調節化合物。 ２７．前記の化合物がＧα₁₂及びＧα₁₃よりなる群から選択する蛋白質の活性を 調節することができる、請求項２６に記載の調節化合物。 ２８．前記の調節が、不活性複合体中のＧα₁₂又はＧα₁₃蛋白質を封鎖すること 、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質のヌクレオチド交換領域を調節すること、Ｇα₁₂又は Ｇα₁₃蛋白質によるＧＴＰ加水分解を調節すること、細胞表面レセプターのＧα₁₂ 又はＧα₁₃蛋白質との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質とＲ ｈｏレギュレーター分子との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質 をコードする内因性又は異種核酸分子の発現を調節すること、及びこれらの組合 せよりなる群から選択するステップを含む、請求項２７に記載の化合物。 ２９．細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセ ンブリーを調節することのできる化合物を同定する方法であって、下記を含む当 該方法： （ａ）推定の調節化合物を、Ｒｈｏレギュレーター分子及び該Ｒｈｏレギュレ ーター分子の活性を調節することのできるＧ蛋白質を含む配合物と接触させ；そ して （ｂ）該推定上の調節化合物の該Ｒｈｏレギュレーター分子の活性を調節する 能力を評価する。 ３０．前記の評価のステップが、前記のＧ蛋白質の前記のＲｈｏレギュレーター 分子への結合を測定することを含む、請求項２９に記載の方法。 ３１．細胞を前記の推定上の調節化合物と接触させ、該化合物のアクチン重合、 ストレスファイバー形成及び局部的接着アセンブリーよりなる群から選択する生 物学的機能を調節する能力を評価することを更に含む、請求項２９に記載の方法 。 ３２．前記のＧ蛋白質を、Ｇα₁₂及びＧα₁₃よりなる群から選択する、請求項２ ９に記載の方法。 ３３．前記のＲｈｏレギュレーター分子を、Ｄｂ１、Ｂｃｒ、Ｖａｖ、Ｅｃｔ２ 、Ｓｏｓ、ＲａｓＧＲＦ、ＲｈｏＧＤＩ、ＬｙＧＤＩ、Ｄ４、ＲｈｏＧＡＰ、 ｐ１９０、３ＢＰ−１、ｎ−キマエリン、β−キマエリン及びｐ８５よりなる群 から選択する、請求項２９に記載の方法。 ３４．Ｇα₁₂及びＧα₁₃よりなる群から選択する蛋白質の活性を阻害することを 含む、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び局部的接着アセンブリーより なる群から選択する生物学的機能を阻害する方法。 ３５．前記の阻害される活性を、活性複合体中のＧα₁₂又はＧα₁₃蛋白質を封鎖 すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質のヌクレオチド交換領域を調節すること、Ｇ α₁₂又はＧα₁₃蛋白質によるＧＴＰ加水分解を調節すること、細胞表面レセプタ ーのＧα₁₂又はＧα₁₃蛋白質との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋 白質とＲｈｏレギュレーター分子との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃ 蛋白質をコードする内因性又は異種核酸分子の発現を調節すること並びにこれ らの組合せよりなる群から選択する、請求項３４に記載の方法。 ３６．前記の活性を、βサブユニットミメトープ、γサブユニットミメトープ、 Ｒｈｏレギュレーターミメトープ、Ｇ蛋白質ミメトープ、統制解除された蛋白質 キナーゼ、統制解除されたＧ蛋白質、変異したＧ蛋白質とカップルしたレセプタ ー、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターアゴニスト、Ｇ蛋白質とカップルしたレ セプターアゴニスト、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターアンタゴニストＧ蛋白 質とカップルしたレセプターリバースアゴニスト、ヌクレオチドアナログ、Ｇカ ップルしたレセプターのアロステリックレギュレーター、アンチセンスオリゴヌ クレオチド、リボザイム及びＧα₁₂又はＧα₁₃をコードする発現プラスミッドよ りなる群から選択する化合物を用いて阻害する、請求項３４に記載の方法。 ３７．Ｇα₁₂又はＧα₁₃よりなる群から選択する蛋白質の活性を阻害することを 含む細胞転移を阻止する方法。 ３８．前記の阻害される活性を、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び局 部的接着アセンブリーよりなる群から選択する、請求項３７に記載の方法。 ３９．前記の阻害される活性を、活性複合体中のＧα₁₂又はＧα₁₃蛋白質を封鎖 すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質のヌクレオチド交換領域を調節すること、Ｇ α₁₂又はＧα₁₃蛋白質によるＧＴＰ加水分解を調節すること、細胞表面レセプ ターのＧα₁₂又はＧα₁₃蛋白質との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃ 蛋白質とＲｈｏレギュレーター分子との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂又はＧ α₁₃蛋白質をコードする内因性又は異種核酸分子の発現を調節すること並びにこ れらの組合せよりなる群から選択する、請求項３７に記載の方法。 ４０．前記の活性を、βサブユニットミメトープ、γサブユニットミメトープ、 Ｒｈｏレギュレーターミメトープ、Ｇ蛋白質ミメトープ、統制解除された蛋白質 キナーゼ、統制解除されたＧ蛋白質、変異したＧ蛋白質とカップルしたレセプタ ー、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターアゴニストＧ蛋白質とカップルしたレセ プターアンタゴニスト、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターリバースアゴニスト 、ヌクレオチドアナログ、Ｇカップルしたレセプターのアロステリックレギュレ ーター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びＧα₁₂又はＧα₁₃蛋 白質をコードする発現プラスミッドよりなる群から選択する化合物を用いて阻害 する、請求項３７に記載の方法。 ４１．Ｇα₁₂又はＧα₁₃よりなる群から選択する蛋白質の活性を阻害することを 含む細胞走化性を阻止する方法。 ４２．前記の阻害される活性を、アクチン重合、ストレスファイバー形成及び局 部的接着アセンブリーよりなる群から選択する、請求項４１に記載の方法。 ４３．前記の阻害される活性を、活性複合体中のＧα₁₂又はＧα₁₃蛋白質を封鎖 すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質のヌクレオチド交換領域を調節すること、Ｇ α₁₂又はＧα₁₃によるＧＴＰ加水分解を調節すること、細胞表面レセプターのＧ α₁₂又はＧα₁₃蛋白質との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白質と Ｒｈｏレギュレーター分子との相互作用を調節すること、Ｇα₁₂又はＧα₁₃蛋白 質をコードする内因性又は異種核酸分子の発現を調節すること並びにこれらの組 合せよりなる群から選択する、請求項４１に記載の方法。 ４４．前記の活性を、βサブユニットミメトープ、γサブユニットミメトープ、 Ｒｈｏレギュレーターミメトープ、Ｇ蛋白質ミメトープ、統制解除された蛋白質 キナーゼ、統制解除されたＧ蛋白質、変異したＧ蛋白質とカップルしたレセプタ ー、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターアゴニスト、Ｇ蛋白質とカップルしたレ セプターアンタゴニスト、Ｇ蛋白質とカップルしたレセプターリバースアゴニ スト、ヌクレオチドアナログ、Ｇカップルしたレセプターのアロステリックレギ ュレーター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム及びＧα₁₂又はＧα₁₃ をコードする発現プラスミッドよりなる群から選択する化合物を用いて阻害す る、請求項４１に記載の方法。 ４５．細胞におけるアクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセ ンブリーを調節することのできる化合物を同定する方法であって、下記を含む当 該方法： （ａ）細胞を推定上の調節化合物と接触させ、該細胞はＲｈｏ蛋白質及び、Ｇ 蛋白質及びチロシンキナーゼよりなる群から選択する第１の蛋白質を含み；そし て （ｂ）該推定上の調節化合物の、該細胞におけるアクチン重合、ストレスファ イバー形成及び局部的接着アセンブリーよりなる群から選択する生物学的機能を 調節する能力を、該第１の蛋白質の該細胞におけるＲｈｏ蛋白質活性を調節する 能力を測定することにより評価する。 ４６．前記の第１の蛋白質がｓｒｃファミリーチロシンキナーゼである、請求項 ４５に記載の方法。 ４７．前記のＲｈｏ蛋白質活性を、グアノシンヌクレオチド結合及びグアノシン ヌクレオチド交換よりなる群から選択する、請求項４５に記載の方法。 ４８．アクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセンブリーを調 節することのできる化合物を同定する方法であって、下記を含む当該方法： （ａ）Ｇ蛋白質及びチロシンキナーゼよりなる群から選択する第１の蛋白質及 びＲｈｏレギュレーター分子を含む第２の蛋白質を推定上の調節化合物と接触さ せ；そして （ｂ）該推定上の調節化合物の該Ｒｈｏレギュレーター分子の活性を調節する 能力を評価する。 ４９．前記のＲｈｏレギュレーター活性が、前記のＧ蛋白質の前記のＲｈｏレギ ュレーター分子への結合を測定することを含む、請求項４８に記載の方法。 ５０．癌、呼吸障害症候群、炎症性腸疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病 及び再狭窄よりなる群から選択する病気を有する動物を治療する方法であっ て、アクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセンブリーよりな る群から選択する生物学的機能を調節する化合物を含む有効量の治療用組成物を 動物に投与することを含む、上記の方法。 ５１．アクチン重合、ストレスファイバー形成又は局部的接着アセンブリーを調 節することのできる化合物を同定するためのキットであって、下記を含む当該キ ット： （ａ）Ｒｈｏ蛋白質及び、Ｇ蛋白質及びチロシンキナーゼよりなる群から選択 する蛋白質を含む細胞；及び （ｂ）該Ｒｈｏ蛋白質の調節を検出する手段。 ５２．前記の細胞を、哺乳動物細胞、両生類細胞及び酵母細胞よりなる群から選 択する、請求項５１に記載のキット。