JPH11514878A - アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエｒｔｘ毒素ａｐｘに対する免疫 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、部分的に、または完全に不活性化されているＲＴＸ毒素を産生する修飾した微生物を提供する。本発明のさらなる態様において、該生物体のＲＴＸ構造遺伝子を含むＲＴＸ毒素遺伝子および／または翻訳後アクチベーターが部分的にまたは完全に不活性化されている修飾した微生物を提供する。本出願者らはＲＴＸ毒素の前駆体がその毒素活性を低減することを見いだした。驚くべきことに、ＲＴＸ毒素前駆体は、該ＲＴＸ毒素を産生する微生物に異種攻撃に対する交差保護を与える動物中における免疫応答を誘発することができる。もともとＲＴＸ毒素を産生する微生物を操作して、前駆体産物の転写後アクチベーターを除去することによって不活性化ＲＴＸ毒素前駆体を産生することができる。従って、好ましい態様において、該微生物は該ＲＴＸ毒素前駆体の翻訳後のアクチベーターを産生するか、または該ＲＴＸ毒素前駆体の不活性化した翻訳後アクチベーターを産生することができない。該翻訳後アクチベーターはＲＴＸ Ｃ遺伝子であるかもしれない。さらなる局面において、本発明はアクチノバシラスまたは関連した生物体中の異種タンパク質の発現のための組換えプラスミドベクターを提供する。好ましい態様において、該組換えプラスミドベクターは、アクチノバシラス・プリウロニュウモニエ中の天然に存在するプラスミド由来である。該組換えプラスミドにはＲＴＸ毒素前駆体をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。該組換えプラスミドはＲＴＸ Ａ遺伝子を含むことができる。別法として該組換えプラスミドはＲＴＸ Ｃ遺伝子またはその断片を含むことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエＲＴＸ毒素ＡＰＸに対する免疫 本発明は生ワクチンとしての使用に適する修飾した微生物に関する。本発明は また、生物学的ベクターとしての修飾した微生物の使用に一般的に関する。本発 明はさらに、ワクチン組成に関する。特に、本発明はＲＴＸ毒素には対する免疫 応答を含むのに適している組成物に関する。 アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（Ａctinovacillus pleuropneumoni ae）（ＡＰＰ）はパスツレラ科の一員であり、ブタプリゥロニュウモニエ、出血 、線維および壊死肺障害によって特徴付けられたブタの急性または慢性感染の病 因的媒体である（ポール（Ｐohl）ら、１９８３；キリアン（Ｋilian）およびビ バスタイン（Ｂibersten）、１９８４）。該疾患は非常に伝染性が高く、成長し つつあるブタのすべての年齢層と関連があるので、ブタ産業に対する重篤な経済 的損失となる。ＡＰＰの伝達の直接的様式は、感染が、潜在的な感染源を低減さ せているブタにＡＰＰの宿主の範囲が幸運にも限定されている、強烈な交雑条件 の下、一層普及する。現在、ＡＰＰの１２の血液型亜型が世界中で同定されてお り、血液型亜型１、７、１２はオーストラリア単離物のほぼ９０％を埋める（カ ンプ（Ｋamp）およびショープ（Ｓhope）、１９６４）。多数の潜在的なビルレ ンス因子が外膜タンパク質（マルクス（Ｍulks）およびタッカー（Ｔhacker）、 １９８８；ラップ（Ｒapp）およびロス（Ｒoss）、１９８８）、リポ多糖（ウデ ゼ（Ｕdeze）ら、１９８７；フェンウィック（Ｆenwick）およびオズバーン（Ｏ sburn）、１９８６）、カプセル（インザナ（Ｉnzana）ら、１９８８；ローゼン デール（Ｒosendale）およびマクルンネス（Ｍaclnnes）、１９９０；レンザー （Ｌenser）ら、１９８８）および分泌毒素（リクロフト（Ｒycroft）ら、１９ ９１；バーチア（Ｂhatia）ら、１９９１；フェドルカ−クレイ（Ｆedorka-Ｃre y）ら、１９９０）を含み同定されている。分泌毒素またはＡＰＸ毒素はＲＴＸ 毒素ファミリーのメンバーである（フレイ（Ｆrey）ら、１９９３、１９９ ４）。 ＲＴＸ毒素はアクチノバシラス種（Ａctinobacillus）、プロテウス・ブルガ リス（Ｐroteus vulgaris）、モルガネラ・モルガニイ(Ｍorganella morganii) 、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂordetella pertussis）、パスツレラ・ヘモリ チカ（Ｐasteurella haemolytica）および大腸菌（Ｅ．coli）によって産生され る群で最も特徴つけられるものを含む多数のグラム陰性細菌によって産生される ものである（ウェルチ（Ｗelch））。すべてのＲＴＸ毒素は標的細胞中に孔を産 生することにより機能し、それによって浸透圧バランスを阻害し、標的細胞の破 裂へと導く。 作用の様式はＲＴＸ毒素と同一であるが、その標的細胞は型および交差種特異 性において非常に変化する。構造的に、この毒素のファミリーはカルシウムに結 合する毒素内のグリシンリッチリピートの素材によって特徴付けられ、標的細胞 認識、孔の形成、翻訳後の活性化の必要条件、および分泌のためのＣ末端シグナ ル配列への依存に関する疎水性ドメインの領域への結合に役割を果たす（概説： クーテ（Ｃoote）、１９９２）。 少なくとも３つの異なるＡＰＸ毒素はＡＰＰ、ＡＰＸ１と称されるもの、ＡＰ Ｘ２およびＡＰＸ３によって産生される。ＡＰＸ１は強く、ＡＰＸ２は相対的に 低く溶血活性を示し、両者は細胞毒性であり、異なる型および種の細胞の広範囲 な領域に対して活性である（フレイ（Ｆrey）およびニコレット（Ｎicolet）、 １９８８；ローゼンデールら、１９８８；カンプら、１９９１）。ＡＰＸ３は非 溶血性であるが、細胞毒性が強く、宿主の範囲はブタ肺胞マクロファージおよび ニュートロフィル（neutrophil）にわたる（チクロフトら、１９９１；カンプら 、１９９１）。ＡＰＰの血液型亜型は３つのすべてのＡＰＸ毒素を産生するもの は全くなく、該多数は２つ（ＡＰＸ１および２：血液型亜型１、５、９および１ １；ＡＰＸ２および３：２、３、４、６および１１）、少数（ＡＰＸ１：１０、 ＡＰＸ２：７および１２）は１つのＡＰＸのみ産生した（フレイおよびニコレッ ト、１９９０；フレイら、１９９２、１９９３、１９９４；カンプら、１９９１ ；リクロフトら、１９９１）。ＡＰＸ産生のパターンはビルレンスおよび最もビ ルレ ントであるＡＰＸ１および２を産生するそれらの血液型亜型に関係している（フ レイ（Ｆrey）ら、１９９４；コマル（Ｋomal）およびミッタル（Ｍittal）、１ ９９０）。活性化ＲＴＸ毒素の産生および分泌は少なくとも４つの遺伝子Ｃ、Ａ 、ＢおよびＤの活性を必要とする。該Ａ遺伝子は構造毒素をコードし、Ｃ遺伝子 は翻訳後アクチベーターをコードし、ＢおよびＤ遺伝子は活性化した毒素の分泌 を必要とするタンパク質をコードする（イッサータル（Ｉssasrtel）ら、１９９ １；ウェルチ、１９９１；フェルミー（Ｆelmee）ら、１９８５）。ＡＰＸおよ び３は４つのコンティグの遺伝子（ＣＡＢＤ）からなるオペロンによってコード されるが、ＡＰＸ２オペロンはＣおよびＡ遺伝子のみを含み、ある場合において はＢ遺伝子の残りを含む。ＡＰＸ２の分泌はＡＰＸ１ＢおよびＤ遺伝子産物の活 性に依存する（フレイら、１９９４に概説）。 自発的なおよび化学的に誘発され、非溶血性の変異体のビルレンス分析は、ビ ルレンス中のＡＰＸ毒素の役割を示唆し、それは最近、トランスポゾン突然変異 誘発を用いて確認されている（アンダーソン（Ａnderson）ら、１９９１；ゲー ラチ（Ｇerlach）ら、１９９２；インザナ（Ｉnzana）ら、１９９１；リクロフ トら、１９９１ａ、ｂ；タコン（Ｔacon）ら、１９９３、１９９４）。疾患およ び／またはキャリア状態からの完全な保護は化学的に不活性化された細菌または 外膜タンパク質、リポ多糖またはカプセルを含む精製したサブユニットワクチン を含むワクチンを用いて得ることはできない。対して、マウス中における疾患か らの完全な保護は、ホルマリン化（formalise）した細胞全体と組み合わせた精 製したＡＰＸを有する以下のワクチンにより得られ、それは保護免疫におけるＡ ＰＸ毒素の役割を示唆している（バーチアら、１９９１）。 プリゥロニュウモニエ、ブタのＡＰＰ感染から起こるが、これに対するワクチ ンは該細菌の多様な要素に基づく細菌ワクチンまたはワクチンサブユニットを利 用して明らかにし、不活性化ワクチンで得られた、結果はせいぜいワクチン物質 を調製するのに使用される血液型亜型に対する同種保護を提供する。多彩なビル レンスをもつＡＰＰの既知の１２の血液型亜型が存在し、各々は異なるワクチン 調製を必要とする。市販されているワクチンを決定するため、多数の血液型亜型 を含むよう製剤され、遺伝子位置において最も頻繁に観察された血液型亜型に対 する保護を提供する。不活性化ワクチンに対照的に、任意の１つの血液型亜型で の天然の感染は任意の他の血液型亜型での感染に対する保護を提供し、そのこと は生ワクチンのＡＰＰ血液型亜型に対する交差保護を提供する可能性を示唆して いる。 本発明の目的は、先行技術の問題を１またはそれ以上緩和することである。 従って本発明の１つの局面において該ＲＴＸ毒素が部分的または完全に不活性 化されるＲＴＸ毒素を産生する修飾した微生物を提供する。 「修飾した」なる後には、組換えＤＮＡ技術または他の、例えば化学的または 放射線誘発突然変異誘発などの技術による修飾を含む。 組換えＤＮＡ技術が、外来ＤＮＡの宿主細胞への導入に関する場合、該ＤＮＡ は任意の適当な方法により導入されることができる。適当な方法には、コンピテ ント細胞の形質転換、トランスダクション、コンジュゲーションおよびエレクト ロポレーションを含む。 本発明のさらなる態様において、ＲＴＸ構造遺伝子および／または生物体の翻 訳後アクチベーターを含むＲＴＸ毒素遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化さ れることが提供されている。 本明細書および請求の範囲で使用する「ＲＴＸ毒素遺伝子」は、ＲＴＸ毒素遺 伝子の産物であるＲＴＸ毒素の発現に関する遺伝子を含むよう意図されている。 該ＲＴＸ毒素遺伝子に含まれている遺伝子には、翻訳後アクチベーター遺伝子（ Ｃ）、構造遺伝子（ａ）、および活性化されたＲＴＸ毒素の分泌に必要であるタ ンパク質をコードするＢおよびＤ遺伝子を含む。 本明細書および請求の範囲で使用する「部分的にまたは完全に不活性化された 」なる語には、標的構築またはプラスミド分離を用いて、該遺伝子の完全または 部分的なる欠失を含む、単独または多数のヌクレオチド置換、付加および／また は欠失を含む遺伝子からのＤＮＡの導入および欠失を含む組換えＤＮＡ技術によ って遺伝子の修飾を含む。 本出願人らはＲＴＸ毒素の前駆体が毒素活性を低減することを見いだした。驚 くべきことに、本出願人らはまたＲＴＸ毒素前駆体は、ＲＴＸ毒素を産生する微 生物で異種挑戦に対する交差保護を付与する動物中における免疫応答を誘発する ことができる。 従って、本発明の好ましい態様において、不活性化したＲＴＸ毒素はＲＴＸ毒 素の前駆体である。該前駆体はＲＴＸ構造遺伝子の未処理発現産物であることが できる。該ＲＴＸ構造遺伝子はＲＴＸ Ａ遺伝子であることができる。 しかしながら、好ましい態様において、該微生物は本来ＲＴＸ毒素を産生する ものである。本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物はアクチノバシラス種、プロテウ ス・ブルガリス、モルガネラ・モルガニイ、ボルデテラ・ペルツッシス、大腸菌 およびパスツレラ・ヘモリチカから選択されることができる。好ましい態様にお いて微生物は、アクチノバシラス種である。該アクチノバシラス種は、アクチノ バシラス・プリゥロニュウモニエ（ＡＰＰ）であってよく、ついで該ＲＴＸ毒素 はＡＰＸ毒素である。ＡＰＸ毒素はＡＰＸ１、ＡＰＸ２またはＡＰＸ３であるこ とができる。 本出願人は、本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物は、操作されることによって、 前駆体産物の翻訳後アクチベーターを排除することによって不活性化ＲＴＸ毒素 前駆体を産生する。従って、好ましい態様に置いて、微生物はＲＴＸ毒素前駆体 の翻訳後アクチベーターを産生することまたはＲＴＸ毒素前駆体のは不活性化し た翻訳後アクチベーターを産生することができない。翻訳後アクチベーターはＲ ＴＸ Ｃ遺伝子の産物であることができる。 好ましい態様において、該微生物のＲＴＸ Ｃ遺伝子は不活性化されるかまた は部分的にまたは完全に欠失している。ＲＴＸ Ｃ遺伝子は部位特異的突然変異 誘発により不活性化されることができる。ＲＴＸ Ｃ遺伝子は単一または多数の ヌクレオチド置換、付加および／または欠失によって不活性化されることができ る。好ましくは、該ＲＴＸ Ｃ遺伝子は標的構築を用いて異種の組合せによって 不活性化される。該標的構築物は望ましい挿入部位をフランキングする配列に類 似の配列によってフランキングされる選択マーカーを含むことができる。該選択 可能なマーカーは、水銀などの毒性物質に耐性を付与する遺伝子であってよく、 または抗生物質耐性決定因子であることができる。該抗生物質耐性決定遺伝子は アンピシリン耐性ンカナマイシン耐性またはストレプトマイシン耐性をコードす る遺伝子である。 ある場合においては、修飾した微生物に包含された機能的な抗生物質耐性遺伝 子を有することは望ましくないかもしれない。従って、本発明は繰り返し配列な どの遺伝子要素を含む標的構築物を考え、そしてそれは抗生物質耐性遺伝子の切 り出しを容易にし、一度標的構築物は、宿主染色体を有する同種組合せを経験す る。 本発明はまた、選択可能なマーカーを含まない標的構築物をも考える。例えば 、標的構築物は欠失を含むＲＴＸ Ｃのセグメントを含むことができる。宿主の 染色体を有する標的構築物の同種組合せは、染色体ＲＴＸ Ｃに欠失を導入する ことになる。ついで組換え体の選択は、ＲＴＸ毒素の産生の不在に基づくことが できる。 標的構築物は、線形形態において宿主細胞に直接導入されることができる。別 法として、標的構築物は自殺または非複製ベクターを介して導入されることがで きる。自殺ベクターは宿主微生物中において複製しない任意のプラスミドである ことができる。本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物は、しばしばｐＥＰベクターの 任意ではない（non-permissive）宿主である。従って、ｐＥＰベクターは本発明 において使用されることができる自殺ベクターの例である。該自殺ベクターはｐ ＥＰ−Ｃ^-Ａｍｐ^rであってよい。 他の態様において、部位特異的突然変異誘発はプラスミド分離の技術によって 達成されることができる。例えば、選択可能なマーカー遺伝子によって邪魔され るＲＴＸ Ｃ遺伝子の断片を含むプラスミドは微生物に導入されることができる 。該微生物は第２の選択可能なマーカー遺伝子を含む第２プラスミドで引き続き 、形質転換される。ついで両者のプラスミドを含む宿主細胞は、第２プラスミド のみを選択する培地を介して継代培養することができる。第２プラスミドの選択 は第１プラスミドの維持に対して作用することができる。それゆえ、第１プラス ミドは消滅するが、ある場合、染色体中に選択可能なマーカーを含む邪魔された Ｒ ＴＸ Ｃ遺伝子断片の組合せは存在する。それゆえ、このプロセスは邪魔された ＲＴＸ Ｃ遺伝子の組合せを染色体ＲＴＸ Ｃ遺伝子へと促進させる。 本発明のさらなる局面において、ＲＴＸ毒素が部分的にまたは完全に不活性化 され、該ＲＴＸ毒素遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されるＲＴＸ構造お よび／または翻訳後アクチベーター遺伝子を含むＲＴＸ毒素遺伝子をコードする 、ＲＴＸ毒素をコードする発現ベクターを提供する。 本明細書および請求の範囲において「発現ベクター」なる語には、外在ＤＮＡ 配列を含むＤＮＡ配列を発現することができる染色体または染色体外要素を含む 。 ＲＴＸ Ａ遺伝子産物は染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子から発現されることができる。 染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子は染色体上のそのままの位置に存在し、またはそのまま の位置以外の位置にで染色体に挿入されることができる。さらに、ＲＴＸ遺伝子 産物はプラスミドなどの染色体外要素上に位置するＲＴＸ Ａ遺伝子から発現さ れることができる。それゆえ、ある１つの態様において、ＲＴＡ Ａ遺伝子を含 む染色体外要素は機能的な染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子および不活性化した染色体Ｒ ＴＸ Ｃ遺伝子を有する微生物に導入されることができる。染色体外要素から発 現されるＲＴＸ Ａ産物は染色体遺伝子から発現したＲＴＸ Ａ産物を補うことが できる。 従って、該ＲＴＸ Ａ遺伝子産物はプラスミドなどの染色体外要素に位置する １つまたは複数のＲＴＸ Ａ遺伝子から完全に発現される。染色体外要素に位置 するＲＴＸ Ａ遺伝子は、染色体外要素の選択の存在下または不在下にて発現さ れることができる。従って、１つの態様においてＲＴＸ Ａ遺伝子を含む染色体 外要素は機能的な染色体ＲＴＸ ＡおよびＲＴＸ Ｃ遺伝子を欠如する微生物に導 入されることができる。機能的なＲＴＸ ＡおよびＲＴＸ Ｃ遺伝子を欠如する微 生物は微生物の突然変異誘発によって産生される。突然変異誘発はＲＴＸ Ａお よびＲＴＸ Ｃまたはその一部のみの欠失となる。 染色体外要素はＲＴＸ Ａ遺伝子を含む組換え発現ベクターであってよい。好 ましくは組換え発現ベクターは本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物中でのＲＴＸ Ａの遺伝子発現を可能にする。該組換え発現ベクターはアクチノバシラスまたは 関連生物中のＲＴＸ Ａ遺伝子の発現を可能にする。該組換え発現ベクターはｐ ＩＧプラスミド由来であってよい。該組換えプラスミドはｐｌＧ３Ｂ由来であっ てよい。該組換えプラスミドはｐｌＧ３−ＴＩＫである。 ＡＰＰ８Ｐｈ）に基づく細菌ベクター系は「そのままのＤＮＡ」ワクチン分子 を宿主細胞へと運搬することを別に意図する。そのようなそのままのＤＮＡワク チン／発現系は、細菌系において複製可能なプラスミドまたは関心のある外在／ 組換え遺伝子の発現をコントロールする真核生物プロモーターであった。 好ましい態様において、該微生物はＲＴＸ毒素分子の分泌を促進する機能的タ ンパク質を産生することができる。該微生物は機能的なＲＴＸ Ｂおよび／また はＲＴＸ Ｄ遺伝子を有することができる。他の態様において、該微生物はＲＴ Ｘ毒素分子の分泌に関する少なくとも１つのタンパク質を産生することまたはＲ ＴＸ毒素分子の分泌に関する少なくとも１つの不活性化タンパク質を産生するこ とができない。該微生物は不活性化したＲＴＸ Ｂおよび／またはＲＴＸ Ｄ遺 伝子を有することができる。従って、該微生物は活性化または不活性化ＲＴＸ毒 素分子を分泌することができないかもしれない。 本発明のさらなる態様において、アクチノバシラスまたは関連生物中の異種タ ンパク質の発現のための組換えプラスミドベクターを提供する。好ましい態様に おいて、該組換えプラスミドベクターはアクチノバシラス・プリゥロニュウモニ エ中に天然に存在するプラスミド由来である。該組換えプラスミドはＲＴＸ毒素 前駆体をコードするＤＮＡ配列を含むことができる。該組換えプラスミドはＲＴ Ｘ Ａ遺伝子を含むことができる。別法として、該組換えプラスミドはＲＴＸ Ｃ 遺伝子またはその断片を含むことができる。該ＲＴＸ Ｃ遺伝子または遺伝子断 片は介在ＤＮＡ配列によって邪魔されることができる。該介在ＤＮＡ配列は抗生 物質耐性遺伝子などの選択可能なマーカーをコードすることができる。天然に存 在するプラスミドはｐＩＧ３である。好ましい態様において、組換えプラスミド ベクターはさらに大腸菌へとＤＮＡをトランスファーすることを容易にするヌク レオチド配列をさらに含む。該ヌクレオチド配列は少なくともマルチプル・クロ ーニング・サイト（multiple cloning site）およびlac遺伝子またはその一部 をさらに含むことができる。該組換えプラスミドベクターがｐＩＧ３１７、ｐＩ Ｇ３ＢまたはｐＩＧ３Ｂ−Ｔ１Ｋから選択されることができる。 本発明の他の局面において、ＲＴＸ毒素前駆体を含む組成物を接種された宿主 動物における免疫応答を誘発するためのワクチン組成物を提供する。該ＲＴＸ毒 素前駆体はＲＴＸ構造遺伝子の未処理発現産物であってよい。ＲＴＸ構造遺伝子 はＲＴＸ Ａ遺伝子であってよい。 本発明はさらに該ワクチン組成物を接種した宿主動物細胞における免疫応答を 誘発するためのワクチン組成物を提供し、該ワクチン組成物は、該ＲＴＸ毒素は 部分的にまたは完全に不活性化したＲＴＸ毒素を産生する修飾した微生物を含む 。好ましくは、該不活性化したＲＴＸ毒素はＲＴＸ毒素の前駆体である。該前駆 体はＲＴＸ構造遺伝子の未処理発現産物であってよい。ＲＴＸ構造遺伝子はＲＴ Ｘ Ａ遺伝子であってよい。好ましくは、該微生物は本来ＲＴＸ毒素を産生する ものである。好ましくは該微生物のＲＴＸ Ｃ遺伝子は不活性化されているか、 または欠失している。 好ましい態様において、修飾した微生物を含むワクチン組成物は生ワクチンで ある。 本発明のワクチン組成物は付加アジュバントまたは免疫刺激分子によるかまた はよらずに任意の製薬学的担体と組み合わされる。 該アジュバントは任意の適当なタイプであってよい。該アジュバントは植物油 またはそのエマルジョン、例えばヘキサデシルアミン、オクタデシルアミノエス テル、オクタデシルアミン、イソレシチン、ジメチル−ジオクタデシル−アンモ ニウムブロミド、Ｎ,Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ'Ｎ'ビス（２−ヒドロキシエチル −プロペンジアミン）、メトキシヘキサデシルクリセロールおよびプロニックポ リポール；例えば、ピラン、デキストダンサルフェート、ポリＩＣなどのポリア ミン、例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、ツフトシン（tuftsin） などのペプチド；免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）；オイルエマルジョン；ミネ ラルゲルおよび懸濁液などから選択されてよい。アルム（almum）、すなわち水 酸化アルミニウム（Ａl（ＯＨ）₃）、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウ ムが好ましい。アジュバントは、ワクチン組成物の総重量に基づき、約１〜７５ 重量％の量で存在する。 本発明によりＲＴＸ毒素前駆体を産生することができるＲＴＸ毒素前駆体また は微生物を含むワクチンは、対応するＲＴＸ毒素を産生する微生物の血液型亜型 の範囲に対する保護を提供する可能性を有する。 本発明の他の局面において、微生物は活性化ＲＴＸ毒素を産生することができ ないように修飾され、ＲＴＸ毒素を本来産生する微生物を含む生物学的ベクター を提供する。 本来ＲＴＸ毒素を産生する微生物は、アクチノバシラス種、プロテウス・ブル ガリン、モルガネラ・モルガニイ、ボルデテラ・ペルツッシスおよび大腸菌から 選択することができる。好ましい態様において、該微生物はアクチノバシラス種 である。アクチノバシラス種はアクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（ＡＰ Ｐ）であってよく、該ＲＴＸ毒素はＡＰＸ毒素であってよい。ＡＰＸ毒素はＡＰ Ｘ１、ＡＰＸ２またはＡＰＸ３であってよい。好ましくは、修飾した微生物は不 活性化ＲＴＸ毒素を産生する。好ましくは不活性化毒素はＲＴＸ毒素の前駆体で ある。好ましくは活性化ＲＴＸ毒素はＲＴＸ毒素の前駆体である。ＲＴＸ毒素の 前駆体はＲＴＸ Ａ遺伝子の産物である。 好ましい態様において、修飾した微生物はＲＴＸ毒素前駆体の翻訳後アクチベ ーターを産生すること、または不活性化したＲＴＸ毒素前駆体の翻訳後アクチベ ーターを産生することができない。翻訳後アクチベーターはＲＴＸ Ｃ遺伝子の 産物であってよい。好ましい態様において、修飾した微生物のＲＴＸ Ｃ遺伝子 は不活性化されるかまたは欠失している。ＲＴＸ Ｃ遺伝子は任意の単一または 多数のヌクレオチド置換、付加および／または欠失により不活性化されることが できる。 該ＲＴＸ Ｃ遺伝子は部位特異的組換えによりＲＴＸ Ｃ染色体遺伝子に選択可 能なマーカーを含む標的構築物の誘発によって不活性化されることができる。標 的構築物は繰り返し単位などのような遺伝的要素を含み、それは一旦標的構築物 が宿主染色体との同種組合せを経験すると抗生物質耐性遺伝子の切り出しを容易 にする。別法として、選択可能なマーカーを含まない標的構築物は、ＲＴＸ Ｃ 染色体遺伝子における欠失を導入するために使用することができる。 ＲＴＸ Ａ遺伝子産物は染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子から発現されることができる。 染色体ＲＴＸ Ａ遺伝子は染色体上の本来の位置に存在することができるかまた はその本来の位置以外の部位にて染色体へ挿入されることができる。さらに、Ｒ ＴＸ遺伝子産物はプラスミドなどの染色体外要素上に位置するＲＴＸ Ａ遺伝子 から発現されることができる。 別法として、ＲＴＸ Ａ産物はプラスミドなどの染色体外上に位置するＲＴＸ Ａ遺伝子または複数の遺伝子から完全に発現されることができる。 好ましい態様において、該微生物はＲＴＸ毒素分子の分泌を容易にする１また はそれ以上の機能的タンパク質を産生することができる。該微生物は機能的なＲ ＴＸ Ｂおよび／またはＲＴＸ Ｄ遺伝子を有することができる。別の態様におい て、該微生物はＲＴＸ毒素分子の分泌に関する少なくとも１つのタンパク質を産 生すること、またはＲＴＸ毒素分子の分泌に関する少なくとも１つの不活性化タ ンパク質を産生することができない。 「生物学的ベクター」なる語は、最も広範な意味において、生物学的に活性な 分子の発現に適当な生物学的な手段を含む。該生物学的な手段は、死亡した生物 体も使用することができるが、好ましくは生存している微生物である。該生物学 的ベクターは非病原性であり、または、ビルレントではないようにするかまたは 非病原性かまたはビルレントでない有効量にて与えられることができる。「生物 学的に活性な分子」には増殖因子、酵素、抗原またはその抗原の一部、インター ロイキン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子などのサイトカインなどの機能 的因子を含む。該分子は本来生物学的ベクターによって発現されるものである。 別法として、該分子は生物学的に活性である分子をコードする遺伝子または複数 の遺伝子を運搬するプラスミドで生物学的ベクターを形質転換することによって 発現された組換え分子であってよく、またはそれが発現される；または該プラス ミドおよび／または遺伝子および／またはその一部は宿主ゲノムに組み込まれ、 染色体および／または天然に存在するかまたは天然に不在の染色体外要素を含み 、 該遺伝子または複数の遺伝子またはその一部が発現される。 本発明の生物学的ベクターは１またはそれ以上の有用なタンパク質を宿主動物 に提供するのに使用されることができる。該タンパク質は宿主動物中に増強され た応答をもたらすのに相乗的に作用する。例えば、生物学的ベクターは抗原に体 する宿主動物中の免疫応答を増強する分子と組み合わせて抗原を産生することが できる。免疫応答を増強する分子はサイトカインであってよい。 本発明の生物学的ベクターは、多価ワクチンを提供するために使用することが できることを認識することができる。「多価ワクチン」なる語はその最も一般的 な意味において使用され、２またはそれ以上の異なる抗原エピトープにたいする 免疫応答を含むことができる修飾した微生物、または２またはそれ以上のエピト ープが修飾した微生物に固有である修飾した微生物によって発現される。しかし ながら一層一般的には、多価ワクチンは該微生物のビルレント形態ならびに該微 生物によって発現された異種抗原に対する免疫応答を含むことができる（トラン スダクション、コンジュゲーションまたは形質転換によって導入されるものなど ）ものを含み、それらは該微生物に固有のものではない。この点において多価ワ クチンは、２またはそれ以上の病原体媒介物にむける。好ましい多価ワクチンは ＲＴＸ毒素に対する免疫応答を誘発することができ、１またはそれ以上の病原対 からの少なくとも１つの抗原エピトープに対する免疫応答を誘発することができ る。病原体媒介物は、ヘモフィルス種、セルプリナ・ヒオジセンテリエ（Ｓerpu lina hyosenteriae）、パスツレラ種、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂordet ela bronchiseptica）、レプトスピラ種、ストレプトコッカス種、サルモネラ種 、大腸菌、マイコプラズマ・ヒョニュウモニエ、エリシペロスリクス・ルシオパ チエ（Ｅrysipelothrix rhusiopathiae）から選択されることができる。別法と して、病原媒介物はＨＣＶ、ＰＲＲＳＶ、ＰＲＶ、ＴＧＥＶ、ＰＰＶなどのウイ ルス病原体から選択されることができる。 本発明はさらに、部分的にかまたは完全に不活性化されたＲＴＸ毒素を産生す る修飾された生物体を産生する方法を提供し、その方法は活性化ＲＴＸ毒素を産 生する微生物を提供することおよびＲＴＸ Ｃ遺伝子を不活性化するかまたは欠 失させることを含む。 本発明はさらに部分的にかまたは完全に不活性化されたＲＴＸ毒素を産生する 修飾された生物体を産生する方法を提供し、その方法は活性なＲＴＸ毒素を産生 することができない微生物を提供することおよび機能的なＲＴＸ Ａ遺伝子を該 微生物に導入することを含む。 さらに別の局面において本発明は微生物を産生するＲＴＸ毒素に対する動物を ワクチン接種する方法を提供し、該方法は本発明により、該動物に免疫学的に有 効な量のワクチンを投与することを含む。 ワクチン接種の方法は、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギなどの産生動物の処理に利 用することができる。ワクチン接種の方法はマタ、ウマ、イヌおよびネコなどの 伴侶動物の治療に使用できる。ワクチン接種の方法はまた、ヒトの治療に使用で きる。好ましい態様において、ワクチン接種の方法はブタの処理に利用できる。 好ましいワクチン接種の方法は、ブタ・プリゥロニュウモニエの処理において利 用できる。 本発明により、ワクチンまたはワクチンベクターの投与は経口または非経口投 与などの任意の適当な経路である。該投与は鼻腔または膣粘膜による。別法とし て、筋肉内、皮内、皮下または腹腔内投与であってよい。該調製は乾燥または液 体形態であることができる。選択された投与経路はまたプロテアーゼインヒビタ ー、抗炎症剤などのさらなる要素を必要とすることができる。 さらなる局面において本発明は病原生物体に対する動物をワクチン接種する方 法を提供し、該方法は本発明により、該動物にワクチンベクターの有効量を投与 することを含み、該ワクチンベクターは該病原生物体の抗原の免疫学的な有効量 を合成する。 さらに別の局面において、本発明により修飾された微生物を培養し、ついで該 微生物によって産生された不活性化毒素を回収することを含む不活性化ＲＴＸ毒 素を産生する方法を提供する。本方法により産生された不活性化ＲＴＸ毒素は、 例えばＲＴＸ毒素に対する保護免疫応答を刺激するためのワクチン中における活 性化免疫原として使用することができる。 本明細書の記載および請求の範囲を通して、「含む」なる語およびその変形で ある「含んでいる」、「含む」などの語句は他の添加剤、要素、完全体または工 程を排除することを意図していない。 本発明が一層容易に理解されるために、本発明者らは以下の非制限的な例を提 供する。 図面の簡単な説明 図１は、ＡＰＰのオーストラリア株から単離されたストレプトマイシン耐性の ものをコードする４.２kbプラスミドｐＩＧ３（図１Ａ）の部分的な制限酵素地 図である。２.３kbのＰstＩ断片（ｐＩＧ３１７；図１Ｂ）はプラスミド複製を コードし、自己ライゲーションする場合にストレプトマイシン耐性を与えるのに 十分であることがわかり、ＡＰＰの大腸菌に形質転換する。マルチプル・クロー イング／サイト（ＭＣＳ）およびlac遺伝子の一部を含むｐＩＧ３Ｂプラスミド ベクターはｐＩＣ１９ＲのＨaeII断片をｐＩＧ３１７（図１Ｃ）の単独のＥcoＲ Ｉ部サイトに導入することによって構築された。単独制限酵素サイトはｐＩＧ３ Ｂ（図１Ｃ）を示唆する（ＭＣＳおよびプラスミド骨格中において切断するＰst Ｉを除く）。 図２は、ＡＰＰにおけるＡＰＸ１Ａ発現カセットの構築である。ＡＰＸ１Ａ発 現カセットはカナマイシン耐性遺伝子に結合し、ｐＱＷ−Ｔ１Ｋ由来であり、こ れはＳal Ｉ制限酵素断片として単離され、ついでｐＩＧ３Ｂの単独Ｓal Ｉ部位 にクローニングされることができる。 図３は、大腸菌のＡＰＸ１発現カセットの構造である。完全なＡＰＸ１Ａ遺伝 ＨindIIIサイトで産生される。完全遺伝子はｐＱＥにクローニングサれ、ポリＨ ＩＳリーダー配列でイン・フレームでクローニングされ、ＡＰＸ１Ａ精製を可能 にする。ｐＵＣ４Ｋからのカナマイシン耐性遺伝子は、ｐＱＥ−Ｔ１プロモータ ー／レギュレーター配列の５'側の単独ＸhoＩ制限部位にクローニングされる。 得られたプラスミドｐＱＥ−Ｔ１Ｋは、制御された発現下で、カナマイシン耐性 遺伝子に結合したＡＰＸ１Ａ遺伝子を含む。 図４は、ＡＰＰ組換え体のウエスタンブロット分析である。ＡＰＰＴox^-株で ＡＰＸＡ発現カセットを有する（Ｔox^-／３１７−ＱＥＴ１）および有さない（ ＨＳ９３Ｔox^-）もののサンプルを親株ＨＳ９３に沿ったウエスタンブロットに よって調べる。該ブロッティングはウサギ抗血清でプロービングし、本発明者ら の研究室で産生され、ＡＰＸ毒素に対する。図からＴox^-株は抗ＡＰＸ血清と反 応しないが、親株であるＨＳ９３およびＡＰＸＡ発現カセットを含むＴox^-株の 両者は該血清に特異的に反応する一本鎖ポリペプチドを産生する。 図５は、ＡＰＰ染色体の操作に使用する組換えカセットの構造である。 図５Ａ ＡＰＸ１Ｂ遺伝子はｐＩＧ−ＢＫ^rプラスミドを用いるＡＰＰ染色体 上で不活性化される。ＥcoＲＩ制限断片はＡＰＸ１ＢおよびＤ遺伝子の一部を含 み、ｐＩＣ１９Ｒにクローニングされる。カナマイシン遺伝子はＡＰＸ１Ｂ遺伝 子のＢamＨＩサイトに挿入される。内部カナマイシン遺伝子を有するＡＰＸ１Ｂ 遺伝子は組換えカセットｐＩＧ−３ＢＫ^rを形成するＥcoＲＩ断片としてｐＩＧ ３１７にサブクローニングする。分泌欠損変異体を特徴付けるのに使用されたオ リゴヌクレオチドの結合部位が示されている（Ｂ₅およびＢ₃）。ＥcoＲＩ断片の 外部に結合するこれらの両者のオリゴヌクレオチドは組換え体カセットにおいて 使用される。 図５Ｂ ＡＰＸ２Ｃ遺伝子がＡＰＸ２Ｃ遺伝子を含むプラスミドベクターＥＰ ２Ｃ^-Ａmp^rＡ ＰＣＲ断片を用いて染色体上に不活性化され、ＡＰＸ２Ａ遺伝子 がクローニングされ、Ａmp^r遺伝子がＡＰＸ２Ｃ遺伝子内の単独ＸbaＩサイトに 挿入される。得られたＥcoＲＩ断片をｐＥＰ２にサブクローニングして自殺カセ ットｐＥＰ２Ｃ^-Ａｍｐ^rを形成する。 図６ ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ）を用いて染色体変異 体ＨＳ２２Ｂ^-Ｋａｎ^r（図６Ａ）およびＨＳ９３Ｃ^-Ａｍｐ^r（図６Ｂ）を特徴付 ける。該変異体からのゲノムＤＮＡは単離され、鋳型としてＰＣＲに使用される 。挿入（図５）をスパニングするオリゴヌクレオチドは親株およびゲノム変異体 の各々の予想された大きさに一致する単独バンドを産生した。該変異体の各々は 親株より一層大きなＰＣＲ産物を産生し、挿入された抗生物質耐性遺伝子に等し い 大きさ増加した。得られたＰＣＲ産物はサザンブロッティングされ、挿入のため の標的化したＡＰＸ遺伝子または選択のために利用された抗生物質耐性遺伝子で プロービングされる。 図７ ＡＰＰＴox^-株（ＨＳ９３Ｃ^-Ａ^-）およびＨＳ９３Ｃ^-Ａｍｐ^r変異体の 分泌タンパク質（sup）、総培養タンパク質（son）は、親株ＨＳ９３とともにウ エスタン・ブロッテイングによって試験された。該ブロットは本発明者らの研究 室内にてＡＰＸ毒素に対してウサギ抗血清でプロービングした。図からＴox^-株 が抗ＡＰＸ血清と反応しないが、両親株であるＨＳ９３およびＨＳ９３ＣＡmp^r 組換え体は、分泌され、該血清に特異的に反応する一本鎖ポリペプチドを産生す る。 図８ ＡＰＰにおける外来タンパク質の発現のためのｐＩＧに基づいたカセッ ト。 ｐＩＧに基づく発現カセットのシリーズはＡＰＰからの外来タンパク質の発現 のために構築される。外来タンパク質をコードする遺伝子ＩＬ６（図８Ａ）およ びＣＡＴ（図８Ｂ）は適当なプロモーターによりｐＩＧに基づいたプラスミドに クローニングされ、ＡＰＰにおける発現を可能にすることができる。 図９ ＡＰＰからのブタＩＬ６の発現。ブタＩＬ５を適当なプラスミドベクタ ー（ｐＩＧ−ＩＬ６）にクローニングして大腸菌（Ｅ．coli／ｐＩＧ３−ＩＬ６ ）およびＡＰＰ（ＨＳ９３／ｐＩＧ−ＩＬ６）における発現を得る。ＡＰＰＨＳ ９３（１）、ＡＰＰＨＳ９３／ｐＩＧ−ＩＬ６（２）、Ｅ．coli／ｐＩＧ−ＩＬ ６（３および４）、精製ＩＬ６（５および６）とともにＥ．coli陰性コントロー ル（７）の一夜培養のサンプルをＩＬ６に特異的なモノクローナル抗体を用いて ウエスタンブロットにより分析する。 実施例１材料と方法 細菌株と増殖条件 本実験において使用するＡＰＰ細菌株パト・ビアッカリ（Ｐat Ｂiackali）博 士によって親切にも供給された（アニマル・リサーチ・インスチチュート (Ａnimal Ｒesearch Ｉnstitute)、ムーローカ（Ｍoorooka）、クイーンズラン ド（ＱＬＤ）、オーストラリア）。ＡＰＰの株はニコチナミドジヌクレオチドを 最終濃度１０μｇ／ｍｌにて補った脳心臓浸出物ブロスにおいて増殖させ（シグ マ・ケミカル・コ（Ｓigma Ｃhemical Ｃo.）、セントルイス、ミズーリ）、３ ７℃で持続的振盪させた。血液アガーを５％滅菌脱フィブリン化ウマ赤血球細胞 をＢＨＩアガーに加えることによって調製した。抗生物質を最終濃度がカナマイ シン２５μｇ／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌまたはアンピシリン５ μｇ／ｍｌにて特別に記載しない限り使用した。大腸菌株ＤＨ５αをサンブルッ ク（Ｓambrook）ら（１９８９）に概説されているような標準的技術を使用して 、本実験を通して使用した。 ＡＰＰゲノムＤＮＡの単離 ＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）を補ったＢＨＩ中で増殖させたＡＰＰＨＳ２５の一 夜培養の１ｍｌ中に存在する細菌を遠心によって回収し、ついでその上清を捨て た。そのペレットをライソザイム（７.５ｍｇ／ｍｌ）を含む１ｍｌのＴＥ（１ ０ｍＭＴris-ＨＣｌ、ｐＨ８．５／１ｍＭ ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、ついで持 続的に５０℃で一晩インキュベーションした。その翌日に、該調製物を０.５Ｍ ＮaＣlと合わせてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（１００： ９９：１、ｖ／ｖ／ｖ）で２回抽出し、ついで該ＤＮＡを０.６容量のイソプロ パノールを加えて沈殿した。 ＡＰＸ１Ａ遺伝子の単離およびクローニング ＡＰＸ１Ａ遺伝子の増幅をポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ） を用いて行った。反応を５０μｇのＡＰＰゲノムＤＮＡ（ＨＳ２５）、３μｇの オリゴヌクレオチドプライマー、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴris-ＨＣl（ ｐＨ８.３）、２.５ｍＭのＭｇＣｌ₂、２００ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２００ｍＭの 各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、および１単位のＴaq ＤＮＡ ポリメラーゼ（パーキン・エルマー・セタス（Ｐerkin Ｅlmer Ｃetus）、米国 ）を含む５０μｌ容量にて行った。反応液を等容量のパラフィンオイルの上に静 置し、９４℃で１分間加熱し、５５℃で２分間冷却し、ついで７２℃で５分間加 熱 した。このサイクルを３５回パーキン−エルマー−セタスＤＮＡサーマルサイク ラー（Ｐerkin-Ｅlmer-Ｃetus ＤＮＡ thermal Ｃycler）を用いて繰り返した。 特異的なオリゴヌクレオチドがＡＰＸ１遺伝子（フレイ（Ｆrey）ら、１９９１ ）の公開された配列に基づき設計された。２つのオリゴヌクレオチド配列は 5'GGA GGA TCC ATG GCT AAC TCT3' および 5'ACC TAC CCG GGA TAG GAT TGC TAT TT3' であり、クローニングが容易にできるように５'でＢamＨＩおよび３'末端でＳma Ｉ部位でＰＣＲ産物を産生するように設計された。該オリゴヌクレオチドは遺伝 子アセンブラー・プラス・ＤＮＡ・シンセサイザー（Ａssembler Ｐlus ＤＮＡ Ｓynthesiser）（ファルマシア（Ｐharmacia）、スウェーデン）を用いて合成し た。ＰＣＲ反応物の産物でＡＰＸ１遺伝子の予測される分子量に一致するものが 、ジーン・クリーニング（ＢＲＥＳＡＴech）、オーストラリア）によってアガ ロースゲルから単離し、ＢamＨＩおよびＳmaＩで制限酵素消化し、ついでｐＵＣ １８のＢanＨＩおよびＳmaＩ部位にクローニングした（ヤニッシュ（Ｙanish） −ペロン（Ｐerron）ら、１９８５）。ＡＰＸ１遺伝子を含むクローンは２本鎖 シークエンシングによって達成された（結果は示さず）。ＡＰＰの染色体からの ＡＰＸ１Ａ遺伝子の単離 公開されたデータに基づき、３.２ｋｂのＡＰＸ１Ｓ遺伝子が約５ｋｂ（フレ イら、１９９３）のＨindIII断片上にコードされる。この断片を単離するために 、ＡＰＰ ＨＳ２５ゲノムＤＮＡを制限酵素ＨindIIIで枯渇するまで消化し、つ いでアガロースゲル上でサイズ分画した。消化したＤＮＡをエチジウムブロミド 染色によって可視化し、ついでＤＮＡ分子量標準（プロゲン（Ｐrogen）、オー ストラリア）を用いて推定するように、約５ｋｂに対応する領域を切り出し、ジ ーン・クリーンを用いて該ＤＮＡを精製した。そのサイズを選択したゲノムＤＮ ＡをｐＵＣ１８にクローニングし、ついで大腸菌に形質転換した。得たＤＮＡラ イブラリーをＡＰＸ１Ａ ＰＣＲ断片でプロービングし、ついで陽性クローンを 選択した。制限酵素消化を使用して、ハイブリダイゼーションによって同定され たクローンの確実性を確認した。 プラスミドベクターでのＡＰＰの形質転換 エレクトロコンポネント（electrocomponent）ＡＰＰの調製およびプラスミド ＤＮＡのこれらの細胞へのエレクトロポレーション（０.２ｃｍキュベット、４ ００ＳＬ、１.２５ｋＶおよび２５μＦ）の導入の条件は、エレクトロポレーシ ョンに使用した要素細胞のアリコートが２００μｌであることを除いて、フレイ （１９９２）によって記載された通りである。プラスミドＤＮＡをＡＰＰの一夜 培養物から単離し、抗生物質選択下でマジック・ミニプレップ（magic miniprep ）を用いて増殖させた。 ＡＰＰ染色体のＰＣＲ ＡＰＰ染色体の領域の増幅をポリメラーゼ・チェーン・リアクション（ＰＣＲ ）を用いて行った。反応を５０μｇのゲノムＤＮＡ、３μｇのオリゴヌクレオチ ドプライマー、５０ｍＭ ＫＣl、１０ｍＭ Ｔris-ＨＣl（ｐＨ８.３）、２.５ｍ ＭのＭgＣl₂、２００ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、２００ｍＭの各ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ 、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰおよび１単位のＴaqＤＮＡポリメラーゼ（パーキン・ エルマー・セタス、米国）を含む５０μｌ容量にて行った。ＡＰＰゲノムＤＮＡ の調製をプリドー（Ｐrideaux）に記載されるようにＳＤＳおよびプロテイナー ゼＫを用いて行った。反応液を等容量のパラフィンオイルの上に静置し、９４℃ で１分間加熱し、５５℃で２分間冷却し、ついで７２℃で５分間加熱した。特異 的オリゴヌクレオチドを遺伝子アセンブラー・プラス・ＤＮＡ・シンセサイザー （ファルマシア、スウェーデン）を用いて合成した。ＰＣＲ反応の産物をアガロ ースゲル上で分解してエチジウムブロミドで染色して可視化した。 ＡＰＸ１Ｂ遺伝子内のＡＰＰ染色体の突然変異誘発 ＡＰＸ１Ｂ遺伝素の不活性化のために設計された組換えプラスミドｐＩＧ３− ＢＫ^rをプリドーら（１９９７）によって記載されるようにＡＰＰ ＨＳ２２にエ レクトロポレーションし、ついでカナマイシンを含むＢＨＩ／ＮＡＤアガー上で トランスフォーマントを選択した。組換えプラスミドを含むＡＰＰトランスフォ ーマントをＡＰＰから単離されたｐＩＧ３−Ａmp^rでエレクトロポレーションし 、そのトランスフォーマントをカナマイシンおよびアンピシリンを含むＢＨＩ／ Ｎ ＡＤプレート上で選択した。両方のプラスミドの存在を、マジック・ミニプレッ ププロトコール（プロメガ）を用いて再度単離したプラスミドによって確認し、 制限酵素分析を行った。両方のプラスミドを含むトランスフォーマントをアンピ シリンおよびカナマイシンを含むＢＨＩ／ＮＡＤ中で一夜振盪して増殖させた。 その培養物をアンピシリン（５０μｇ／ｍｌ）を含む１０ｍｌのＢＨＩ／ＮＡＤ 中で１：１００に希釈し、一夜振盪した。そのサブカルチャー手法を、培養物の 希釈がカナマイシン含有ＢＨＩ／ＮＡＤ血液アガー上にプレーティングした後、 総計６回繰り返した。血液アガープレート上の溶血のゾーンを産生しないコロニ ーを同定し、さらなる特徴付けのために単離した。 ＰＣＲプロトコールのためのサザンブロット分析 ＰＣＲ反応の産物を１％アガロースゲル上で分解し、エチジウムブロミドで染 色した後ＤＮＡ分子量マーカー（プロゲン、オーストラリア）と共に流して大き さの推定を行う。分画したＤＮＡを、製造者の指示によりバキュームブロットシ ステム（ファルマシア）を用いて、Ｈybond-Ｎメンブレン（アマシャム（Ａmers ham）にトランスファーした。メンブレンを５×ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥ：０.１ ８ＭのＮaＣl、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１ｍＭのＥＤＴＡ(ｐＨ７.７)） 、５×デンハルト液（１×デンハルト：０.０２％ＢＳＡ、０.０２％フィコール および０.０２％ポリビニルピロリドン）および０.５％ＳＤＳを含むバッファー 中で６５℃で一晩ハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションのためのプロー ブを、製造者の指示に従って、ランダムヘキサマープライマーシステム（ブレザ テク（ＢＲＥＳＡｔｅｃｈ）、アデレード、オーストラリア）を用いて標識した ハイブリダイゼーションの後、メンブレンを０.１％ＳＤＳ／０.１×ＳＳＰＥの 最終ストリンジェンシーになるまで６５℃で１０分間洗浄し、Ｘ線フィルム（フ ジ（ＲＸ）にさらした。 抗血清の産生 ＡＰＰ ＨＳ２５の一夜培養を１：２０に希釈して、３７℃でＯＤ₆₀₀が０.８ に達するまで振盪した。この点にて培養液を、４℃で１２,０００回転で１２分 間遠心し、その上清タンパク質をフェドルカ（Ｆedorka）−クレイ(Ｃray)ら（ １ ９９０）を用いて精製した。ウサギを２週間隔で精製したタンパク質（１００μ ｇ）の３投与量を与え、最初はフロインド完全アジュバント中で、続いてフロイ ンド不完全アジュバント中でワクチン接種した。血清を最終ブーストの後２週間 後に使用するべく回収した。 ウエスタンブロット分析 ウエスタンブロット（免疫ブロット）をサンブルックら（１９８９）の方法に 従って行っている。ＡＰＰ ＨＳ２５の培養上清タンパク質に対して産生された ウサギ血清をＡＰＸタンパク質の検出のために１：５０希釈にて使用した。ウサ ギ血清を交差反応を除去するためにＡＰＰＴox^-に対して前吸収（pre-absorbed ）し、使用前の非ＡＰＸ抗体を除去した。１：１０００希釈にて使用したコンジ ュゲートを基質としてテトラメチルベンジジン（マッキム−ブレシュキン（Ｍc Ｋimm-Ｂreschkin）、１９９０）で抗血清（サイレヌス（Ｓilenus））をコンジ ュゲートした単離したＨＲＰによりヒツジ抗ウサギＩｇアフィニティーである。 ウエスタンブロット分析のための細菌サンプルを適当な増殖培地中に１：２０に て一夜培養物を希釈することによって調製し、３７℃でＯＤ₆₀₀が０.８に達する まで勢いよく振盪する。この点にて総培養物の２０μｌを含むサンプルをＳＤＳ −ＰＡＧＥによって分析し、ついでタンパク質をバイオラド・トランスブロット 細胞（Ｂio-Ｒad Ｔransblot Ｃell）を使用することによって、製造者の指示書 に記載されるようにしてニトロセルロース(バイオーラド)にトランスファーする 。 マウスのワクチン接種および攻撃 ウォルター・アンド・エリザ・ホール・インスチチュート・オブ・メディカル ・リサーチ（Ｗalter and Ｅlisa Ｈall Ｉnstitute of Ｍedical Ｒesearch） （パークビル（Ｐarkville）、ビクトリア）から得た６週齢の雌性Ｂalb-Ｃマウ スを水および食物を任意に与えるＰＣ２の施設のためにしたでＣＳＩＲＯ・ディ ビジョン・オブ・アニマル・ヘルス(ＣＳＩＲＯ Ｄivision Ａnimal Ｈealth)( パークビル、ビクトリア、オーストラリア)にて維持する。マウスは０日および １４日に２００μｌのＡＰＰ調製物を腹腔内（ＩＰ）注入され、２８日にＩＰ攻 撃を受 ける。コントロールマウスは２００μｌのＢＨＩブロスＩＰを受ける。攻撃の２ ４時間後生存しているマウスの数を記録し、ついで攻撃から保護されているかま たはサブ致死量の量(sublethal dose)から保護されていると見なした。 抗体アッセイ すべてのマウスをワクチン接種およびブーステイングまたは攻撃の前に尾から 出血させた。ＡＰＸ１Ａまたは２Ａに対する抗体応答を、プリドー（Ｐrideaux ）ら（１９９５）に記載のように、１ウエル当たり０.５μｇのポリ−Ｈis精製 ＡＰＸにて間接的な固相酵素免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。力価 は、非処理マウスからの血清よりさらに高い吸光度を与える最大の希釈として発 現されている。 実施例２ＡＰＰのためのプラスミドベクターの開発 １４のＡＰＰ株の調査（パット・ブラックオール（Ｐat Ｂlackall）博士によ って提供された；アニマル・リサーチ・インスティテュート、ムールーカ（Ｍoo rooka）、クィーンズランド、オーストラリア）はマジック・ミニプレップ・プ ラスミド単離（プロメガ（Ｐromega）とアガロースゲル／エチジウムブロミド検 出（結果は示さず）を用いて検出されることができるプラスミドを有する２つの 株を同定した。これらのうちの１つの株であるＨＳ２０５は、ストレプトマイシ ン耐性であり、この細菌から単離されたプラスミドＤＮＡは、エレクトロポレー ションによって導入される場合、大腸菌（Ｅ．coli）およびＡＰＰの両者にスト レプトマイシン耐性を付与することが見いだされた。 ＨＳ２０５から単離されたプラスミドＤＮＡで形質転換された大腸菌から単離 され、ストレプトマイシンで選択されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析は、独 自の複製およびストレプトマイシン耐性をコードする４.２kbプラスミド（ｐｌ Ｇ３）を同定した（図１Ａ）。ｐｌＧ３のために生産された制限酵素地図および 制限酵素消化およびライゲーションのプロセスによって、２.３kbのｐＩＧ３の ＰstＩ０サブフラグメントが自己ライゲーションし、大腸菌に形質転換する場合 、その結果得られるトランスフォーマントがストレプトマイシン耐性であるこ とが見出された（図１Ｂ）。 大腸菌およびＡＰＰの両者に外来ＤＮＡを運搬するプラスミドの多芸性（vers ality）を高めるために、マルチプル・クローニング・サイトおよびｌａｃ遺伝 子を含む（マーシュ（Ｍarsh）ら、１９８４）ｐＩＣ１９Ｒからの４５０ｂｐの ＨaeII断片をＰstＩ部位（pＩＧ３Ｂ；図１Ｂ）の３００bp下流に位置するpＩＧ ３１７の唯一のＥcoＲＩ部位にサブクローニングした。得られたプラスミド、ｐ ＩＧ３Ｂ（図１Ｃ）を外来ＤＮＡをプラスミドに挿入するのに適当なマルチプル ・クローニング・サイトおよび大腸菌中でのＸ−ｇａｌの存在下で青／白選択に 基づく外来ＤＮＡを運搬するプラスミドの迅速な選択を可能にするlac遺伝子を 有する。 実施例３大腸菌中のＡＰＸ１Ａの発現 ＰＣＲ中のＡＰＸ１Ａのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）に導入 されるであろう任意の過誤を最少にして発現ベクター内のＯＲＦの正確なアライ ンメントを可能にするため、そのゲノム断片をＰＣＲ断片とともに使用して図２ に概説された発現プラスミドｐＱＥ−ＴＩを構築した。この方策はＡＰＸ１ＡＯ ＲＦをｐＱＥ３０（キアゲン・インク（ＱＩＡＧＥＮ Ｉnc.）、チャタワース、 カリフォルニア、米国）にポリ−Ｈis精製シグナルとイン・フレームで挿入して 多数のゲノムＤＮＡを含ませることができる。 ｐＱＥ−Ｔ１からのＡＰＸ１Ａの発現は調節可能なプロモーター／オペレータ ー要素の調節下であり、大腸菌ファージＴ５プロモーターおよび２つのｌａｃオ ペレーター配列を含む。ｐＱＥ−ＴＩからのＡＰＸ１Ａの最適な発現は、アンピ シリン（１００μｇ／ｍｌ）の存在下での発現ベクターを含む大腸菌の一夜培養 を増殖させることがによって達成された。翌日、５０倍希釈の培養物を作成し、 ついでＯＤ₆₀₀が０.８を達成するまで激しく振盪して、３７℃でインキュベート した。この時点で、毒素の誘発は、ＩＰＴＧがさらに５時間増殖させ、大腸菌を ８,０００rpmで１２分間遠心することによって回収した後、培養物の最終濃度２ ｍＭに加えることによって達成した。 ＡＰＸ１Ａの精製を、製造者の指示書（キアゲン・インク、カリフォルニア、 米国）により、変性条件の下で不動化Ｎｉキレート・クロマトグラフィーを用い て達成した。この系はｐＱＥ系を用いて発現されたタンパク質上に存在する６− Ｈisタグを利用することができる。 実施例４ＡＰＰのためのＡＰＸ１Ａ発現カセットの構築 ＡＰＸ１発現カセットに基づくｐＩＧの構築を容易にするために、カナマイシ ン耐性遺伝子をｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア）から単離し、図３で概説するように ｐＱＥ−Ｔｉにクローニングする前にｐＩＣ２０Ｒを通して輸送（shuttle）し た。得られたプラスミドｐＱＥＴ１Ｋはカナマイシン耐性遺伝子を含み、ついで ＡＰＸ１Ａ遺伝子はＴ５プロモーターに結合し、ＳalＩ制限酵素部位によって両 方をフランキングした。ＳalＩ断片を単離し、ＳalＩで前に消化したｐＩＧ３Ｂ でライゲーションして、大腸菌に形質転換した。望ましいクローンを、カナマイ シン耐性でＸ−Ｇａｌの存在下で白コロニーを産生するトランスフォーマントを 選択することによって同定した。プラスミドＤＮＡを単離して制限酵素分析を使 用してｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの予測外形を確認した（図３）。 実施例５ＡＰＰワクチン株の構築 ＨＳ９３ＡＰＰ（血液型亜型７；ＡＰＸ２のみ産生）染色体の部位特異的突然 変異誘発のプロセスの間、ＡＰＸ２Ｃ遺伝子の小部位を欠失させるように設計し 、単離したものを溶血（haemolysis）区域を血液アガープレート上に産生するこ とに失敗した単離体を得た。この単離体（ＡＰＰＴox^-）のさらなる特徴付けは 、欠失の同定された部位の周辺の染色体の大部分を失っていることを示した。得 られたＡＰＰＴox^-株はＡＰＸ構造遺伝子または活性化遺伝子を全く含まないが 、ＡＰＸ選択に必要である必要タンパク質を産生するのは、これらの遺伝子はＡ ＰＰ染色体のどこか他に位置するからである。 ＡＰＰＴox^-株を物質および方法の項にて記載されるように、カナマイシン選 択ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫで形質転換した。プラスミドＤＮＡをカナマイシン耐性コ ローニから単離して、制限酵素消化により分析してｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの予想さ れた外形を確認した。 実施例６ＡＰＰワクチン株の特徴付け ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫを含むＡＰＰＴox^-株の一夜培養ならびにＡＰＰＴox^-株お よびＨＳ９３を選択されたＨＳ２５（すなわちＡＰＸ１および２）に体するウサ ギ抗体において作製された高血清を用いてウエスタン・ブロットによって試験し た。ウエスタンブロットから（図４）ＡＰＰＴox^-株が血清中に存在する任意の 抗体に結合せず、野生型ＨＳ９３およびＡＰＰＴox^-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの両 者はシングルバンドであることが分かるであろう。Ｔox-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫ で検出したバンドは、Ｔox^-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫはＡＰＸ１（見かけの分子量 １０５−１１０ｋＤａ）を産生するが、その親株ＨＳ９３はＡＰＸ２（見かけの 分子量２０３−１０５ｋＤａ）で見られるものより大きい。 実施例７マウス中でのＡＰＰの病原性の比較 ＡＰＰ ＨＳ９３、ＨＳ２５およびＴox^-の一夜培養はＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ ）を補ったＢＨＩブロス中で３７℃で激しく振盪して増殖させた。翌日２０倍希 釈した培養物を作製し、ついで新しい培養液をＯＤ₆₀₀が０.８に達するまでイン キュベートし、このＯＤ₆₀₀値でＡＰＰの生存数は１ｍｌ当たり１×１０⁹である （データ示さず）。培養液の多彩な希釈をＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）を補ったＢ ＨＩブロス中で調製し、ついで２００μｌをマウスＩＰに投与した。攻撃後、マ ウスを観察し、ついで２４時間後の総死亡数を記録した。本発明者らの条件下で は、この期間の後にＡＰＰ注入のために死亡したマウスは全くなく、その結果を 表１に示した。各血液型亜型で得られた死亡数の比較は、血液型亜型１に属し、 ＡＰＸ１と２の両方を産生するＨＳ２５は最も病原性を有するＡＰＰ株（１×１ ０⁷で１００％死亡）であり、血液型亜型７に属し、ＡＰＸ２のみを産生するＨ Ｓ９３（２×１０⁸で１００％死亡）が続くが、Ｔox^-（血液型亜型７）株は最も 高い用量においてでさえ、いかなるマウスも死亡させることができないことを示 した。 この結果は最も重篤な発病が、ＡＰＸ１およびＡＰＸ２を産生するＡＰＰ血液型 亜型に関連するブタのプリゥロニュウモニエからの観察と合致する。 表１．マウスに多様なレベルのＡＰＰ株であるＨＳ２５、ＨＳ９３またはＴox^- 株を含む２００μｌの細菌懸濁液を注入する。死亡数を２４時間後記録し、つい で総集団のパーセンテージとして表す。 実施例８致死ＡＰＰ攻撃からのマウスの保護 ＨＳ９３およびＴox^-の一夜培養を調製し、その翌日に２０倍希釈の培養を作 製し、ＯＤ₆₀₀が０.８になるまで増殖させた。各細菌の希釈は、２００μｌのワ クチン接種が２×１０⁷のＨＳ９３または２×１０⁸のＴox^-のいずれかを含むよ う、これらの値が、最大化するワクチン接種の用量を選択し、致死量より低い攻 撃を維持し、コントロールマウスは２００μｌのＢＨＩブロスを受けた。マウス は、０日および１４日でＩＰでワクチン接種され、ついで２８日に１×１０⁸Ｈ Ｓ２５または５×１０⁸ＨＳ９３で攻撃し、ついで２４時間後に死亡数を記録し た（表２）。これらから、ＨＳ９３とＴox^-の両方は類似攻撃に対して完全な保 護を提供し、ＨＳ９３は異種攻撃にいくぶんの保護を与えた。Ｔox^-株は異種攻 撃に対して全く保護を提供せず、それはまた不活性化したワクチンに基づく細菌 （bacterin）で観察され、そのことは血清型間の保護抗原としてＡＰＸ毒素の役 割を示唆する。 プラスミドからのＡＰＸ１の不活性化された形態を発現するＡＰＰＴox^-の、 ＡＰＰ致死異種攻撃に対するマウスを保護するための能力を査定するため、マウ スを以下のスケジュールによりＡＰＰＴox^-またはＡＰＰＴox^-／ｐＩＧ３Ｂ−Ｔ ＩＫでワクチン接種した。第１日に、マウスの尾から出血させ、ついでＩＰで２ ００μｌの２×１０⁸Ｔox^-またはＴox^-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫを含むＢＨＩをワ クチン接種した。その手法は１４日および２８日に繰り返されてマウスは尾から 出血させられ、ついで５×１０⁸または１×１０⁸のＡＰＰＨＳ２５で攻撃された 。マウスから回収された血清をＥＬＩＳＡに用いて材料および方法において概説 されているようにＡＰＸ１に対する抗体を測定した。コントロール血清は２週間 隔でＩＰによりＨＳ９３（２×１０⁸）またはＨＳ２５（２×１０⁶）の２用量を 受けた。 ＥＬＩＳＡの結果は表３に示し、Ｔox^-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫの単一用量はマ ウスにおいての抗体応答のよい反応を産生するのに十分であり、減弱レベルにお いて、ＨＳ２５の２用量の後に得られたものに等しかった。その抗ＡＰＸ１応答 をＴox^-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫで第２回ワクチン接種後に相当にブーストしたが 、ＨＳ９３またはＴox^-での多数のワクチン接種はバックグランドより高い抗体 価を産生しなかった。ＡＰＸ２を産生するＨＳ９３で多数のワクチン接種した後 ＡＰＸ１を認識する抗体を検出できない能力はＡＰＸと交差反応するＡＰＸ２に 対する抗体の不能性を指示するであろうし、これは異種攻撃に対する保護の程度 を提供するためのＡＰＸ２を発現しているＨＳ９３の能力に対照的に、Ａｇを発 現する大腸菌と由来するＡＰＰの間の差異を反映するであろう。 ＨＳ２５の１０ＩＤ₅₀でのマウスの攻撃は、Ｔox^-でのワクチン接種後の保護 は全くないが、Ｔox^-／３Ｂ−ＴＩＫでワクチン接種したものは６０％の保護を 証明したことを示す。攻撃のレベルがＨＳ２５の５ＩＤ₅₀に減じられた場合、再 び、Ｔox^-単独では全く保護は観察されず、一方プラスミド（Ｔox^-／ｐＩＧ３Ｂ −ＴＩＫ）からのＡＰＸ１Ａ遺伝子を発現するＴox^-は、１００％の保護を証明 した。 表２．マウスに２週間隔で２×１０⁸ＡＰＰＴox^-、または本株ＨＳ９３の２×１ ０⁷で腹腔内ワクチン接種し、ついでＨＳ９３（同種）またはＨＳ２５（異種） で２週間後に攻撃した。コントロールマウスは２００μｌのＢＨＩブロスを受け た。攻撃後の死亡は、２４時間内に死亡した各群内のマウスのパーセンテージと して記録された。 表３．マウスは２×１０⁸Ｔox^-またはＴox^-／ｐＩＧ３Ｂ−ＴＩＫ ＩＰで、２週 間隔で２回ワクチン接種され、血清はブーストの前および２週後に収集した。コ ントロールマウスは２×１０⁷ＨＳ９３または２×１０⁶ＨＳ２５の２回の用量を 受けた。ＡＰＸ１Ａ特異的抗体は、ＥＬＩＳＡで測定され、ついでバックグラン ドより高い値の吸光度を与える、最終の希釈の相互性として力価は発現する。 表４．マウスは２週間隔でＡＰＰのＴox^-株でまたはなしで、ＡＰＸ１Ａタンパ ク質の発現をコードするプラスミドｐＩＧ３Ｂ−Ｔ１Ｋで腹腔内投与でワクチン 接種した。コントロールマウスはＢＨＩブロスの投与を２回受けた。最終のワク チン接種２週間後、マウスに異種ＡＰＰ−ＨＳ２５の攻撃を与えた。 実施例９ＡＰＸ１Ｂ遺伝子の突然変異誘発 組換えプラスミドの構築 組換えカセットはＡＰＸ１Ｂ遺伝子の部位特異的突然変異誘発を可能にするよ う設計されたものは、ＡＰＸＢ（フレイ（Ｆrey）ら、１９９３）遺伝子を運搬 する２.４ｋｂＥcoＲＩ断片をｐＩＣ１９Ｒ（マーシュ（Ｍarsh）ら、１９８４ ）にクローニングすることによって構築された。ｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア）か らのカナマイシン耐性(Kan^r)遺伝子を運搬する１.２kbＢamＨＩ断片は、ＢamＨ Ｉで欠失したＡＰＸ１Ｂ遺伝子にクローニングした（図５Ａ）。ＡＰＸ１Ｂ遺伝 子は、内部のＫan^r遺伝子はＥcoＲＩ断片として単離されて、プラスミドベクタ ーｐＩＧ３１７（プリドーら、１９９５）のＥcoＲＩ部位にクローニングして組 換えカセットpＩＧ３−ＢＫ^rを形成する。 プラスミドpＩＧ３−ＡＭＰ^rをプラスミド分離に使用して、ｐＩＧ３−ＢＫ^r およびＡＰＰ染色体の間の組換えを容易にする。このプラスミドはアンピシリン 耐性遺伝子（Ａｍｐ^r）（マーフィー（Ｍurphy）ら）をｐＩＧ３１７のマルチプ ル・クローニング・サイトにクローニングすることによって構築した。 組換えｐＩＧ３−ＢＫ^rを利用したＡＰＸ１Ｂの突然変異誘発はＫan^r遺伝子マ ーカーによって邪魔されたＡＰＸ１Ｂ遺伝子のＥcoＲＩ断片をＡＰＰプラスミド ベクターｐＩＧ３１７（図５Ａ）に含む。野生型ＡＰＰ ＨＳ２２（血液型亜型 １：ＡＰＸ１およびＡＰＸ２）をｐＩＧ３−ＢＫ^rで、ついでｐＩＧ３１７（ｐ ＩＧ３−Ａｍｐ^r）のアンピシリン耐性誘導体で形質転換する。両方のプラスミ ドで形質転換した細胞をアンピシリンおよびカナマイシンの両方を含む配置で選 択した。ｐＩＧ３−Ａｍｐ^rを維持およびプラスミド分離を通してｐＩＧ３−Ｂ Ｋ^rの損失を促進するため、両プラスミドをアンピシリンのみを含む培地を通し て継代培養する。ｐＩＧ３−ＢＫ^rとＡＰＰ染色体間の組換えが起こる細胞を同 定するために、培養をカナマイシン含有ＢＨＩ／ＮＡＤ血液アガープレートにプ レーティングした。血液アガープレート上の溶血地帯を製造できなかった任意の 細菌コロニーはカナマイシン含有新鮮血液アガープレート上にパッチングした。 カナマイシン耐性でありかつ溶血地帯を製造しなかった１つのコロニーを同定し た（ＨＳ２２Ｂ^-）。カナマイシンおよび前記のように調製したゲノムＤＮＡ（ プリドーら、１９９７）を含むＢＨＩ／ＮＡＤブロスにおいて増殖させた。 ゲノムＤＮＡをＨＳ２２Ｂ^-から単離し、ついでｐＩＧ３−ＢＫ^rを含むＨＳ２ ２宿主株を組換えカセット内に含まれる領域のＡＰＰゲノムの外側にアニーリン グするよう設計された通常のオリゴヌクレオチド (B5’:GCATTTTGGAACAAG; B3': CGGTGATCAAATAGC) を用いてＰＣＲによって試験する（図５Ａ）。ＰＣＲ反応の産物をサザンブロッ ト分析によって材料および方法において記載したように、単離したＫan^rまたは ＡＰＸ１Ｂ遺伝子をプローブとして（図６Ａ）使用して分析した。図６ＡからＡ ＰＸ１Ｂ遺伝子（ＰＣＲによって増幅した）を含むＡＰＰ染色体の領域は非溶血 性／カナマイシン耐性組換えＨＳ２２Ｂ^-中において、ＨＳ２２親株においてよ り大きく約１.２kbである。サザンブロットによるＰＣＲ産物の分析は、その産 物はＡＰＸ１Ｂ遺伝子を含むＡＰＰ染色体の領域を増幅して表し、ついでＨＳ２ ２^- の場合には、この拡大化した領域もまたＫan^r遺伝子に特異的にハイブリダイズ もすることを確認した。これらの結果は、類似の組換えがＡＰＰ染色体とｐＩＧ ３−ＢＫ^r間で起こり、その結果Ｋan^r遺伝子のＡＰＰ染色体に部位特異的にトラ ンスファーすることになる。 実施例１０ＡＰＸ２Ｃ遺伝子の突然変異誘発 プラスミドｐＥＰ−Ｃ^-Ａｍｐ^r（図５Ｂ）ばＡＰＰＡＰＸ２Ｃ遺伝子の部位特 異的突然変異において使用するために構築した。ＡＰＸ２Ｃを含む３.４ｋｂ断 片、ＡＰＸ２Ａ遺伝子の最初の７００ｂｐ、ならびにＡＰＸ２オペロンの即時５ ’領域はＰＣＲを用いて単離され、オリゴをファルマシア・ジーン・アセンブラ ー・プラス・ＤＮＡ・シンセサイザー(Ｐharmacia Ｇnen Ａssembler Ｐlus Ｄ ＮＡ Ｓynthesiser)を用いて、(5'CGCACCATGGTCGGGC，3'ACGTGATCGACAATC)公開 された配列に基づいて合成した。ＰＣＲ断片をマイコバクテリウム（Ｍycobacte rium）／大腸菌シャトルベクターｐＥＰ２（ラドフォード（Ｒadford）およびホ ドグソン（Ｈodgson）、１９９１）にクローニングした。得られたプラスミドｐ ＥＰ−ＣＡはＡＰＸＣオペロン・リーディング・フレームのほぼ中間に存在した 唯一のＸbaＩ制限部位を含み、そこには組換えプラスミドｐＥＰ−Ｃ^-Ａｍｐ^rを 産生するためにアンピシリン耐性遺伝子を挿入する。 ＡＰＸ２Ｃ遺伝子の部位特異的突然変異誘発は組換えカセットｐＥＰ−Ｃ^-Ａ ｍｐ^r（図５Ｂ）を利用し、そのカセットはコリネバクテリウム（Ｃorynebacter ium）−大腸菌シャトルベクターｐＥＰ２に基づくものである。本出願人の研究 室内においても多数の試みがなされたが、ｐＥＰ２でＡＰＰを形質転換すること に失敗し、それにより、ＡＰＰはプラスミドベクターの非維持宿主であり、それ ゆえＡＰＰ内で使用する為に適当な自殺ベクターであると結論づけた。塩化カル シウム精製したｐＥＰ−Ｃ^-Ａｍｐ^rＤＮＡを大腸菌から単離し、ついでＣlaＩで 線形化した。消化後、そのＤＮＡをフェニール／クロロホルム抽出し、エタノー ル沈殿した。線形化したＤＮＡの総量３μｇを以前にプライドー（Ｐrideaux） ら、（１９９７）によって記載されたプロモトールを用いて、エ レクトロポレーションし、ついでエレクトロポレーション産物をアンピシリンを １μｇ／ｍｌの濃度でＢＨＩ／ＮＡＤ血液アガープレートに播種した。両アンピ シリン耐性である一つのコロニーを単離し、ついで血液アガープレートに溶血ゾ ーンを産生することを失敗させた。 ゲノムＤＮＡを非ゾーン形成／アンピシリン耐性突然変異ＨＳ９３Ｃ^-Ａ^r、お よび親株ＨＳ９３から抽出した。ポリメラーゼチェーンリアクションを使用して 、ＡＰＸ２Ｃ遺伝子を含むＡＰＰ染色体の領域を試験し、図５Ｂに示される領域 のＡＰＸ２オペロン(5'TACAGAACGTTGGTA，3'ACGTGATCGACAATC)に結合するオリゴ ヌクレオチドを利用した。ＰＣＲ反応の産物を材料および方法に記載のようにＡ ｍｐ^rまたはＡＰＸ２Ｃ遺伝子をプローブとして用いて（図６Ｂ）サザンブロッ トハイブリダイゼーションによとて特徴付けた。図６Ｂにおいて示された結果は ＨＳ９３Ｃ^-Ａ^r変異体が親株ＨＳ９３より大きい約１.５ｋｂ（Ａｍｐｒ遺伝子 の大きさ）であるＰＣＲ産物を産生することを示す。両細菌からのＰＣＲ産物は ＡＰＸ２Ｃ遺伝子にハイブリダイズするが、突然変異体の産物のみがＡｍｐ^r遺 伝子にハイブリダイズする。これらの結果は類似の組換えがＡＰＰ ＨＳ９３染 色体と自殺プラスミドベクターｐＥＰ−Ｃ−Ａ^r間に起こり、その結果、特異的 方法でＡｍｐ^r遺伝子のＡＰＰ染色体上でのトランスファーとなる。 各突然変異株の対数的（Ｌogarithmic）培養およびその親株は、材料と方法の 項目に記載のように、ＡＰＰ ＨＳ２５（すなわち血液型亜型Ｉ：ＡＰＸ１およ び２）の分泌タンパク質に体するウサギで作製された抗血清を用いてウエスタン ブロットによって試験した。 実施例１１マウスのＡＰＰ株の病原性の比較 ＡＰＰ ＨＳ９３、ＨＳ２２の一夜培養物およびその突然変異株を一夜ＮＡＤ （１０μｇ／ｍｌ）を補ったＢＨＩブロス中で３７℃にて激しく振盪して装飾さ せた。その翌日２０倍希釈したその培養物を作成し、ついで新しい培養物をＯＤ₆₀₀ が０.８に達するまでインキュベートし、ついでこのＯＤ₆₀₀値でのＡＰＰの 生存数は１×１０⁹ｃｆ.ｕ.／ｍｌ（データ示さず）である。培養物の多様な希 釈をＢＨＩブロス中で調製し、ついで２００μｌを６週齢マウスに腹腔内投与し た。マウスをそれから２４時間観察し、その後の死亡数を記録した。本発明者ら の条件下では、この期間の後のＡＰＰ注入で死亡したマウスは１匹もおらず、得 られた結果を表５に示す。 マウスにＡＰＰ親株および変異株を多様なレベルで腹腔内接種した。２４時間 以内に負けなかったマウスはサブ致死量投与を受けたとみなされる。結果を感染 に倒れなかった集団のパーセンテージとして記録した。 実施例１２ＡＰＰでの異種攻撃に対するブタの保護 ６週齢のブタを実験群に組み入れる前に、前以て交配させて、ＡＰＰ ＨＳ９ ３（血液型亜型７）およびＡＰＸに対する既存の抗体のスクリーニングをした。 ６週齢のブタ９匹は０日に、鼻腔内エアロゾル接種を介して１ｍｌの培地中でＡ ×１０⁹ｃ.ｆ.ｕ.のＡＰＰ ＨＳ９３Ｃ^-Ａ^rを受けた。そのワクチンを１つのコ ロニーのＨＳ９３^-Ａ^rでの１０ｍｌのＢＨＩ／ＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）接種に より調製し、ついでＯＤ₆₀₀が０.８に達するまで３７℃で激しく振盪して増殖さ せた。そのワクチン接種スケジュールを１４日に０日として繰り返した。 第２８日にブタを群（以下に概説される）に再分類し、ついで鼻腔内経路を介 して２ｍｌの増殖培地中に２×１０⁹ＡＰＰＨＳ２５（血液型亜型１）で攻撃す るか、または同様の方法にて与えられた２ｍｌのＢＨＩブロスで攻撃した。高激 化部をＨＳ２５の単一コロニーをＢＨＩ／ＮＡＤ（１０μｇ／ｍｌ）ブロスに接 種することによって調製し、ついでＯＤ₆₀₀が０.８に達するまで増殖させた。そ の時刻は生存数が１×１０⁹ｃ.ｆ.ｕ.／ｍｌであった。 各群のブタの数およびサクチン接種／攻撃の外形は以下である： グループ１ ワクチン接種なしおよび攻撃なし ３頭 グループ２ ワクチン接種ありおよび攻撃なし ３頭 グループ３ ワクチン接種なしおよび攻撃あり ６頭 グループ４ ワクチン接種ありおよび攻撃あり ６頭 攻撃５日後、検死された各群において存在する肺傷害の数および重篤度は表６ に示す。これらの結果は明らかにＨＳ９３Ｃ^-Ａ^rでのワクチン接種がＡＰＰ、Ｈ Ｓ２５の異種株での攻撃からブタを保護する。ワクチン接種も攻撃もない３頭は 剖検で存在する検出可能な肺傷害は全く有さず、そのことは他のグループのブタ において存在する肺傷害が剖検の時に、ワクチン接種試行の開始後の処理から生 じるものであることを示している。ワクチン接種され、かつ攻撃されない３頭の ブタもまた剖検の差異に全く傷害がなく、そのことはブタにおける肺傷害を誘発 せず、接種後２週間での証拠である。以前に、本発明者らはＡＰＰの毒素欠損株 をブタに投与し、本実験で使用した攻撃したものと同様の用量であり、５日で剖 検したブタと傷害は全く観察されなかった。ＨＳ２５で攻撃した６頭のワクチン 接種しなかったブタすべては、剖検で多数の肺傷害を示した。ＨＳ２５で攻撃し た６頭のワクチン接種していないブタは、すべて、剖検で多数の肺傷害を示し、 それは本実験で使用された攻撃レベルが脱保護動物における傷害を誘発するのに 十分であることを示した。６頭のワクチン接種していないコントロールにおいて 、攻撃前にＨＳ９３Ｃ^-Ａ^rでワクチン接種した６頭のブタのうち、１頭だけか剖 検で全く傷害のサインを有さなかった。これは単一の接着の形態において、１頭 のブタにおいて肺と肋骨ケージ間に一層密な検査においてこの接着は攻撃以来５ 日 より古いものであったようである。細菌はこの接着から単離され、ＡＰＰ（すな わち増殖にＮＡＤを必要としていなかった）であるとは分かっていない。この傷 害がＡＰＰＨＳ２５での攻撃から生じるか否かにもかかわらず、この結果は明ら かにＨＳ９３Ｃ^-Ａ^rが病原性ＡＰＰの異種攻撃に対するブタの保護の可能性を証 明する。 議論 ＡＰＰ血液型亜型７株ＨＳ９３は、部位特異的突然変異誘発によってＡＰＸＣ 遺伝子を不活性化し、Ａｍｐ遺伝子の挿入を通して、ＡＰＸ Ａ、ＢまたはＤの 発現を邪魔せずにワクチン株ＨＳ９３Ｃ^-Ａ^rを産生する。マウスにおけるワクチ ン株の評価は親株ＨＳ９３（表５）に比較して低減した病原性であることを示し た。ワクチンの唯一の真実の評価は、標的種における疾患に対する保護できる能 力である。これを示すため、本発明者らはブタに鼻腔内経路を介してＢＳ０３Ｃ^- Ａ^rでワクチン接種し、交差血液型亜型攻撃を行った。使用された攻撃株はＨＳ ２５であり、それは血液型亜型１に属し、ついでＡＰＸ１およびＡＰＸ２を産生 した。このＡＰＸの組合せはプリゥロニュウモニエの最も重篤な激増と関連する ことが知られている。ワクチン接種されていないブタは、肺接着および存在する 傷害の両方で剖検に関するＡＰＰ感染の多数のサインを有している（表６）。対 して、６頭のワクチン接種したブタのうちのただ１頭は、単独の肺接着で、全く 感染のサインがなく、そのことは攻撃の結果であることは稀である。この結果は 明らかにブタプリゥロニュウモニエに対する生ワクチンとして使用されるべきＨ Ｓ９３Ｃ^-Ａ^r株の安定性を証明している。そのワクチンの鼻腔内経路を介して由 来するべき能力は、また証明され、交差血液型亜型の攻撃に対するブタの保護能 力と一緒である。これはブタにおいて、交差血液型亜型保護を提供するため使用 するのに適しているＡＰＰの生ワクチン株の最初の報告である。 実施例１３ＡＰＰベクターからの外来タンパク質の発現 ＡＰＰからの外来遺伝子の発現の可能性はＡＰＸ１がＡＰＰ，ＨＳ２５の血液 型亜型１株からの単離およびＡＰＰ、ＨＳ９３Ｔoxin^-の修飾した血液型亜型７ 株におけるプラスミドから発現される本明細書において前に証明した。ＡＰＰの 血液型亜型７株はＡＰＸ１遺伝子をコードせず、ついでそのＴox-／pＩＧ３Ｂ− ＴＩＫ株の構築およびその査定は、ＡＰＰからの外来遺伝子発現を表す（図４） 。この株はさらに特徴付けられ、ついで野生型ＨＳ９３または修飾したＨＳ９３ Ｔoxin^-（表３）に比較して、マウス中の抗ＡＰＸ１抗体を誘発することができ ることが示されている。Ｔox^-株からのＡＰＸ１遺伝子の発現はまた、また親Ｔo x^-株（表４）に比較して、ＡＰＰの異種攻撃に対してマウスを保護できることを 示している生ワクチンを産生する。 細菌ベクターとしてＡＰＰが作用する可能性をさらに証明するために、一連の ｐＩＧに基づく発現カセットは、図８に概説したようにＡＰＰから外来タンパク 質の数の発現のために構築される。外来タンパク質をコートする遺伝子は適当な プロモーターの傍らに共にｐＩＧに基づくプラスミドにクローニングされ、ＡＰ Ｐ中で発現を可能にする。大腸菌中の構築および特徴付けの後、発現プラスミド は材料と方法において記載されるようにＡＰＰに形質転換した。プラスミドＤＮ Ａを抗生物質耐性コロニーから単離され、予測された外形を確認するための制限 酵素消化によって分析した。 サイトカインは、感染およびワクチン接種の後に免疫応答の有効性をコントロ ールおよび決定する免疫系のホルモンである。サイトカインは保護免疫を誘発す るのに最も適した（体液性または細胞性）方向での免疫応答を指令するため、与 えられた抗原に対する免疫応答を増加させるために使用されることができる。Ａ ＰＰベクターからのサイトカインの発現は、ＡＰＰおよび任意の付加的な同時発 現する（co-expressed）外来抗原に対する免疫応答を最適化する手段を提供する ことができる。ブタＩＬ６遺伝子はＣＳＩＲＯ・ディビジョン・オブ・アニマル ・ヘルス（ＣＳＩＲＯ Ｄivision of Ａnimal Ｈealth）のデービッド・ストロ ム（Ｄavid Ｓtrom）博士から入手し、ついで適当なプラスミドベクターにクロ ーニング（図８、ｐＩＧ−ＩＬ６）してＡＰＰ内の発現を得た（ＨＳ９３／ｐＩ Ｇ−ＩＬ６）。ブタＩＬ６の場合、ＡＰＰベクターからの発現はモノクローナル 抗体（デービッド・ストロム博士、ＣＳＩＲＯ・ディビジョン・オブ・アニマル ・ ヘルスにより提供された）を用いて検出した。図９からそのモノクローナル抗体 は、ＡＰＰ／３Ｂ−ＩＬ６において期待された大きさ（２２ｋダルトン）でらり かつ大腸菌由来物質い大きさが同一である単一のタンパク質と反応することが分 かる。対して発現カセットなしのＨＳ９３はそのモノクローナル抗体と反応しな い。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子は抗生 物質クロラムフェニコールに耐性を付与する酵素をコードし、および酵素反応に おいて容易に定量化される。プラスミドが構築されて高レベルのＡＰＰからのＣ ＡＴ発現を達成し（図８Ｂ）、ついでこのクロラムフェニコールに対するプラス ミド耐性を有するＡＰＰ株を提供する。 細菌ベクターとしてのＡＰＰの開発はブタの軌道への商業的に有意義な分子を 運搬するための手段を提供するであろう。これらの分子はサイトカインを誘発し 、免疫系を調節し、多病原性ワクチンを構築する手段を提供する。そのようなワ クチンは以下の１回のワクチン接種の後に１より多くの疾患に対する保護を提供 する可能性を有する。 表６：剖検でのブタにおいて存在する肺の損傷 ブタを２週間隔でＡＰＰ ＨＳ９３Ｃ^-Ａ^rで２回ワクチン接種し、ついで最終 のワクチン接種の２週間後にＡＰＰＰ ＨＳ２５で攻撃された交差血液型亜型を 与えられた。攻撃後５日でポスト・モーテム（post mortems）が行われて、肺損 傷が記録された。 剖検でのブタにおける肺の損傷 グループ１ ワクチン接種していないかつ攻撃していない １．全く損傷がない ２．全く損傷がない ３．全く損傷がない グループ２ ワクチン接種しているが攻撃していない １．全く損傷がない ２．全く損傷がない ３．全く損傷がない グループ３ ワクチン接種しておりかつ攻撃している １．全く損傷がない ２．全く損傷がない ３．全く損傷がない ４．全く損傷がない ５．全く損傷がない ６．肺の左側に小さな接着があり、５日より経過しているように見え、仕切られ ている（細菌は単離され、ＡＰＰでないことがわかった） グループ４ ワクチン接種していないが攻撃している １．右隔膜葉（diaphragmatic lobe）の癒着 ５ｃｍの直径の左心膜葉（cardiac lobe）傷害 ２．２つの右隔膜葉の癒着 局在化した右隔膜葉の傷害（膿腫） 右腹側隔膜葉傷害 左背側隔膜葉の癒着 ２つの背側の心膜葉の傷害（０.５cm） 中左隔膜葉の傷害 ３．右後頂葉（posterior apical lobe）の傷害 左背側隔膜葉全体の胸膜炎 ４．右後頂葉の小さな癒着 右背側隔膜葉の傷害（４cm） 右心膜葉の膿腫（１cm） 肺の左側全体にわたる傷害（７×１cm） ５．滲出性胸膜炎および心膜の炎症 （diffuse pericarditis） 右隔膜葉の癒着 ６．右隔膜葉の癒着性胸膜炎 左腹側隔膜葉の傷害（１cm） 最終的に、本発明の精神および目的から逸脱せずに、多様な変更、修飾および ／または付加が構築物および以前に記載された部分のとりきめに導入されること ができる。 参考文献 Ａnderson，Ｃ.，Ｐotter，Ａ.Ａ.，and Ｇerlach，Ｇ.-Ｆ．(1991)．Ｉsolatio n and molecular characterization of spontaneously occurring cytolysin-ne gative mutants of Ａctinobacillus pleuropneumoniae serotype 7．Ｉnfect． Ｉmmun．59:4110-4116． Ｂhatia，Ｂ.，Ｍittal，Ｋ.Ｒ，and Ｆrey，Ｊ．(1991)．Ｆactors involved i n the immunity against Ａctinobacillus plueropneumoniae in mice．Ｖet． Ｍicrob．28:147-158． Ｃoote，Ｊ.Ｇ．(1992)．Ｓtructural relationships among the ＲＴＸ toxin determinants of Ｇramnegative baceria．ＦＥＭＳ Ｍicro．Ｒev．88:137-162 ． Ｆedorka-Ｃray，Ｐ.Ｊ.，Ｈuether，Ｍ.Ｊ.，Ｓtine，Ｄ.Ｌ.，and Ａnderson ，Ｇ.Ａ．(1990)．Ｅfficacy of a cell extract from Ａctinobacillus(Ｈaemo philus)pleuropneumoniae Ｓerotype 1 against disease in swine．Ｉnfect． Ｉmmun．58:358-365． Ｆelmlee，Ｔ.，Ｐellet，Ｓ.，Ｌee，Ｅ.Ｙ.，and Ｗelch，ＲＡ．(1985)．Ｅs cherichia colihemolysin is released extracellularly without cleavage of a single peptide．Ｊ．Ｂacte．163: 88-93． Ｆenwick，Ｂ.Ｗ.，and Ｏsburn，Ｂ.Ｙ．(1986)．Ｉmmune responses to the l ipopolysaccharides and capsular polysacharides of Ｈaemophilus pleuropne umoniae in convalescent and immunized pigs．Ｉnfect．Ｉmmun．54:575-582 Ｆrey，Ｊ.，and Ｎicolet.，Ｊ．(1988)．Ｒecognition of hemolysin express ion in Ａctinobacillus pleuropneumoniae serotype 1 by Ｃa2+．Ｉnfection and Ｉmmunity 26:2570-2575． Ｆrey，Ｊ.，and Ｎicolet，Ｊ．(1990)．Ｈemolysin patterns of Ａctinobaci llus pleuropneumoniae．Ｊ．Ｃlin．Ｍicrobiol．28: 232-236． Ｆrey，Ｊ.，Ｍeier，Ｒ，Ｇygi，Ｄ.，and Ｎicolet，Ｊ．(1991)．Ｎucleotid e sequence ofthe hemolysin Ｉ gene from Ａctinobacillus pleuropneumoniae ．Ｉnfect．Ｉmmun．59: 3026-3032． Ｆrey，Ｊ.，van den Ｂosch，Ｈ.，Ｓegers，Ｒ，and Ｎicolet，Ｊ．(1992)． Ｉdentification of a second hemolysis(Ｈlyll)in Ａctinobacillus pleuropn uemoniae serotype 1 and expression ofthe gene inＥscherichia coli．Ｉnfe ct immun．60: 1671-1676． Ｆrey，Ｊ.，Ｂeck，Ｍ.，Ｓtucki，Ｕ.，and Ｎicolet，Ｊ．(1993a)．Ａnalys is of hemolysin operons in Ａctinobacillus pleuropneumoniae．Ｇene 123: 51-58． Ｆrey，Ｊ.，Ｂosse，Ｊ.Ｔ.，Ｃhang，Ｙ.-Ｆ.，Ｃullen，Ｊ.Ｍ.，Ｆenwick， Ｂ.，Ｇerlach，Ｇ.Ｆ.，Ｇygi，Ｄ.，Ｈaesebrouck，Ｆ.，Ｉnzana，Ｔ.Ｊ.， Ｊansen，Ｒ，Ｋamp，Ｅ.Ｍ.，Ｍacdonald，Ｊ.，Ｍaclnnes，Ｊ.Ｌ，Ｍittal， Ｋ.Ｒ，Ｎicolet，Ｊ.，Ｒycroft，Ａ.Ｎ.，Ｓegers，ＲＰ．Ａ.Ｍ.，Ｓmits， Ｍ.Ａ.，Ｓtenbaek，Ｅ.，Ｓtruck，Ｄ.Ｋ.，van den Ｂosch，Ｊ.Ｆ.，Ｗillso n，Ｐ.Ｊ.，and Ｙoung，Ｒ．(1993b)．Ａctinobacillus pleuropneumoniae Ｒ ＴＸ-toxins: uniform designation of haemolysins，cytolysins，pleurotoxin s and their genes．Ｊ．Ｇen．Ｍicro．139: 1723-1728． Ｆrey，Ｊ.，Ｂeck，Ｍ.，and Ｎicolet，Ｊ．(1994)．ＲＴＸ-toxins of Ａcti nobacillus pleuropneumoniae．Ｉn Ｂacterial Ｐrotein Ｔoxins．Ｆreer，Ｊ .，Ａitken，Ｒ.，Ａlouf，Ｊ.Ｅ.，Ｂoulnois，Ｇ.，Ｆalmagne，Ｐ.，Ｆehren bach，Ｆ.，Ｍontecucco，Ｃ.，Ｐiemont，Ｙ.，Ｒappuoli，Ｒ.，Ｗadstrom， Ｔ.，and Ｗitholt，Ｂ．(eds)．Ｓtuttgart: Ｇustav Ｆischer Ｖerlag，pp． 322-332． Ｇerlach，Ｇ.-Ｆ.，Ａnderson，Ｃ.，Ｒossi-Ｃampos，Ａ.，and Ｐotter，Ａ. Ａ．(1992)．Ｔhe role ofthe 103 kd Ａctinobacillus pleuropeumoniae cytol ysin in virulence and the association of the gene encoding the insertion sequence-like elements．Ｉn Ｐroc 12 Ｉnt Ｐig Ｖet Ｓoc Ｃongr，Ｔhe Ｈague，Ｔhe Ｎetherlands，p 199． Ｉnzana，Ｔ.Ｊ.，Ｔodd，Ｊ.，Ｍa，Ｊ.，and Ｖeit，Ｈ．(1991)．Ｃharacter iasation of a non-hemolytic mutant of Ａctinobacillus pleuropneumoniae s erotype 5; role of the 110 kilodalton hemolysin in virulence and immunop rotection．Ｍicrob．Ｐathogen 10: 281-296． Ｉssartel，Ｊ.Ｐ.，Ｋoronakis，Ｖ．and Ｈughes，Ｃ．(1991)．Ａctivation of Ｅscherichia coli prohaemolysin to the mature toxin by acyl carrier p rotein-dependent fatty acylation．Ｎature，Ｌondon，351:759-761． Ｋamp，Ｅ.Ｍ.，Ｐopma，Ｊ.Ｋ.，Ａnakotta，Ｊ.，and Ｓmits，Ｍ.Ａ．(1991) Ｉdentification of hemolytic and cytotoxic proteins of Actinobacillus pl europneumoniae by use of monoclonal antibodies．Ｉnfect Ｉmmun．59: 3079 -3085． Ｋilian，Ｍ.，and Ｂiberstein，Ｅ.Ｌ．(1984)．Ｇenus II．Ｈaemophilus，p ．558-569．Ｉn Ｎ.Ｒ．Ｋrieg and Ｊ.Ｇ．Ｈolt(ed.)，Ｂergey's manual of systematic bacteriology，vol．1．Ｔhe Ｗilliams ＆ Ｗilkins Ｃo.，Ｂalti more． Ｋomal，Ｊ.Ｐ.Ｓ.，and Ｍittal，Ｋ.Ｒ．(1990)．Ｇrouping of Ａctinobacil lus pleuropneumoniae strains of serotypes 1 through 12 on the basis of t heir virulence in mice．Ｖet Ｍicrobiol．25: 229-240． Ｌaemmli，Ｕ.Ｋ．(1970)．Ｃleavage of structural proteins during the ass embly of the head of bacteriophage Ｔ4．Ｎature 227:680-685． Ｌenser，Ｄ.Ｋ.，ＭcＤonald，Ｔ.Ｌ.，and Ｍiller，Ｎ.Ｇ．(1988)．Ｐrotec tion of miceagainst Ｉethal effects of an intraperitoneal infection with Ｈaemophilus(Ａctinobacillus)pleuropneumoniae after vaccination with ca psular proteins．Ｖet．Ｍicrobiol．18:335-348 Ｍarsh，Ｊ.Ｌ.，Ｅrfle，Ｍ.，and Ｗykes，Ｅ.Ｊ．(1984)．Ｔhe plＣ plasmi d and phage vectors with versatile cloning sites for recombinant selecti on by insertional activation．Ｇene 32:482-485． ＭcＫimm-Ｂreschkin，Ｊ.Ｌ．(1990)．Ｔhe use ofteramethylbenzidine for s olid phaseimmunoassays．Ｊ．Ｉmmunol．Ｍethods 135:277-280． Ｍulks，Ｍ.，and Ｔhacker，Ｂ．(1988)．Ｅfficacy of Ｈaemophilus pleurop neumoniae outer membrane subunit vaccine in swine．Ｐroc．10th．Ｉnt．Ｐ ig Ｖeterinary Ｓociety Ｃongress，Ｒio de Ｊaneiro，Ｂrazil，p．81． Ｍurphy，Ｇ.Ｌ．Ｗhitworth Ｌ.Ｃ．(1994)Ｃonstruction of isogenic mutant s of Ｐasteurella haemolytic by allelic replacement，Ｇene 148: 101-105 ． Ｐohl，Ｓ.，Ｂerstchinger，Ｈ.Ｕ.，Ｆrederiksen，Ｗ.，and Ｍannheim，Ｗ ．(1983)．Ｔransfer of Ｈaemophilus pleuropneumoniae and the Ｐasteurell a haemdytica-like organisni causing porcine necrotic pleuropneumonia to the genus Ａctinobacillus(Ａctinobacillus pleuropneumoniae com．nov.)on the basis of phentoypic and deoxyribonucleic acid relatedness．Ｉnt．Ｊ ．Ｓyst．Ｂacteriol．33:510-514． Ｒadford，Ａ.Ｊ.，and Ｈodgson，Ａ.Ｌ.Ｍ．(1991)．Ｃonstruction and char acterisation of a Ｍycobacterium-Ｅscherichia coli shuttle vector．Ｐlas mid 25: 149-153． Ｒapp，Ｖ.Ｊ．and Ｒoss，ＲＦ．(1986)．Ａntibody response of swine to ou ter membrane components of Haemophilus pleuropneumoniae during infection ．Ｉnfect．Ｉmmun．54:751760． Ｒoendale，Ｓ.，and Ｍaclnnes，Ｊ.Ｌ(1990)．Ｃharacterisation of an atte nuated strain of Ａctinobacilluspleuropneumoniae，serotype 1．Ａm．Ｊ． Ｖet．Ｒes．51:711-717． Ｒosendale，Ｓ.，Ｄevenish，Ｊ.，Ｍaclnnes，Ｊ.Ｉ.，Ｌumsden，J.II.，Ｗa tson，Ｓ．and Ｘun，Ｈ．(1988)．Ｅvaluation of heat-sensitive，neutrophi l-toxic，and hemolytic activity of Ｈaemohilus（Ａctinobacillus）pleuorp neumoniae．Ａmerican Ｊournal of Ｖeterinary Ｒesearch 49:1053-1058． Ｒycroft，Ａ.Ｎ.，Ｗilliams，Ｄ.，Ｃullen，Ｊ.Ｍ．and Ｍacdonald，Ｊ．(1 99la)．Ｔhe cytotoxin of Ａctinobacillus pleuropneumoniae（pleurotoxin） is distinct from the haemolysin and is associated with a 120 kＤa polype ptide．Ｊ．Ｇen．Ｍicrobiol．137:561-568． Ｒycroft，Ａ.Ｎ.，Ｗilliams，Ｄ.，ＭcＣandlish，Ｉ.Ａ.Ｐ.，and Ｔaylor， Ｄ.Ｊ．(199lb)．Ｅxperimental reproduction of acute Ｉesions of porcine pleuropneumonia with a haemolysin-deficientmutant of Ａctinobacilluspleu ropneumoniae．Ｖet．Ｒec．16:441-443． Ｓambrook，Ｊ.，Ｆritsch，Ｅ.Ｆ.，and Ｍaniatis，Ｔ．(1989)．Ｍolecular cloning: aＩaboratory manual，2nd ed．Ｃold Ｓpring Ｈarbour Ｌaboratory Ｐress，Ｃold Ｓpring Ｈarbour，Ｎ.Ｙ． Ｔascon，ＲＴ.，Ｒodriguez-Ｆerri，Ｅ.Ｆ.，Ｇutierrez-Ｍartin，Ｃ.Ｂ.， Ｒodriguez-Ｂarbosa，Ｉ.，Ｂerche，Ｐ.，and Ｖazquez-Ｂoland，Ｊ.Ａ．(19 93)．Ｔransposon mutagenesis in Ａctinobacillus pleuropneumoniae with a ＴnlＯ derivative．Ｊ．Ｂacteriol．175: 5717-5722． Ｔascnn，ＲＴ.，Ｖazquez-Ｂoland，Ｊ.Ａ.，Ｇutierrez-Ｍartin，Ｃ.Ｂ.，Ｒ odriguez-Ｂarbosa，Ｉ.，and Ｒodriguez-Ｆerri，Ｅ.Ｆ．(1994)．Ｔhe ＲＴ Ｘ haemolysisns Ａpxl and Ａpxll are major virulence factors of the swin e pathogen Ａctinobacillus pleuropneumoniae: evidence from mutational an alysis．Ｍol．Ｍicro．14: 207-216． Ｕdeze，Ｆ.，Ａ.，Ｌatimer，Ｋ.Ｓ.，and Ｋadis，Ｓ．(1987)．Ｒole of Ｈa emophilus pleuropneumoniae Ｉipopolysaccharide endotoxin in the pathogen esis of porcine Ｈaemophilus pleuropneumonia．Ａrn．Ｊ．Ｖet．Ｒes．48:7 68-773． Ｗelch，ＲＡ．(1991)．Ｐore-forming cytolysins of Ｇram-negative bacteri a．Ｍol．Ｍicrobiol．5: 521-528． Ｙanisch-Ｐerron，Ｃ.，Ｖieira，Ｊ.，and Ｍessing，Ｊ．(1985)．Ｉmproved Ｍ13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of th e Ｍ13mpl8 and pＵＣ19 vectors．Ｇene 33: 103-119．

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 プライドー，クリストファー・トーマス オーストラリア3058ビクトリア州コバー グ・ノース、トンキン・アベニュー27エイ 番 (72)発明者 ホッジソン，エイドリアン・レスリー・マ ーク オーストラリア3220ビクトリア州ニュータ ウン、スキーン・ストリート62番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．部分的にまたは完全に不活性化されているＲＴＸ毒素を産生する修飾され た微生物。 ２．該微生物のＲＴＸ構造遺伝子および／または翻訳後アクチベーターを含む ＲＴＸ毒素遺伝子が部分的または完全に不活性化されている請求項１に記載の修 飾された微生物。 ３．該部分的にまたは完全に不活性化されたＲＴＸ毒素がＲＴＸ毒素の前駆体 である請求項１または２に記載の修飾された微生物。 ４．該部分的にまたは完全に不活性化されたＲＴＸ毒素がＲＴＸ構造遺伝子の 非処理の発現産物である請求項２または３に記載の修飾された微生物。 ５．該構造遺伝子がＲＴＸＡ遺伝子である請求項４に記載の修飾された微生物 。 ６．該翻訳後アクチベーターが部分的にまたは完全に欠失している請求項２か ら５のいずれか１つに記載の修飾された微生物。 ７．該翻訳後アクチベーターがＲＴＸＣ遺伝子の産物である請求項２から６の いずれか１つに記載の修飾された微生物。 ８．該翻訳後アクチベーターおよびまたは構造遺伝子が、翻訳後アクチベータ ーをコードする遺伝子および／または単一または複数のヌクレオチド置換、付加 および／または完全なまたは部分的な遺伝子の欠失を含む欠失を含む構造遺伝子 からのＤＮＡの導入および欠失、標的構築またはプラスミド分離を用いた同種組 換え：および化学的に誘発された、放射線で誘発されたまたは部位特異的突然変 異を用いた組換えを含む組換えＤＮＡ技術によって部分的または完全に不活性化 された請求項２から７のいずれか１つに記載の修飾された微生物。 ９．該微生物が天然でＲＴＸ毒素を産生する生物である請求項１から８のいず れか１つに記載の修飾された微生物。 １０．該微生物が天然にはＲＴＸ毒素を産生せず、部分的または完全に不活性 化されたＲＴＸ毒素遺伝子を導入された生物である請求項１から８のいずれか１ つに記載の修飾された微生物。 １１．アクチノバシラス種、プロテウス・ブルガリス、モルガネラ・モルガニ イ、ボルデテラ・ペルツッシス、大腸菌およびパスツレラ・ヘモリチカを含む群 から選択された請求項１から１０のいずれか１つに記載の修飾された微生物。 １２．該微生物がアクチノバシラス種である請求項１１に記載の修飾された微 生物。 １３．該アクチノバシラス種がアクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ（Ａ ＰＰ）であり、産生されたＲＴＸ毒素がＡＰＸ１、ＡＰＸ２またはＡＰＸ３を含 む群から選択されたＡＰＸ毒素である請求項１２に記載の修飾された微生物。 １４．該微生物がＲＴＸ毒素遺伝子産物の選択に関係する少なくとも１つのタ ンパク質を産生することができない請求項１から１３のいずれか１つに記載の修 飾された微生物。 １５．該微生物が部分的または完全に不活性化されたＲＴＸＢおよび／または 部分的または完全に不活性化されたＲＴＸＤ遺伝子を有する請求項１４に記載の 修飾された微生物。 １６．該ＲＴＸ毒素が部分的または完全に不活性化されており、該ＲＴＸ毒素 遺伝子が部分的または完全に不活性化されており、該ベクターがＲＴＸ構造およ び／または翻訳後アクチベーター遺伝子を含むＲＴＸ毒素をコードする発現ベク ター。 １７．該ＲＴＸ毒素遺伝子はＲＴＸ毒素の前駆体をコードする請求項１６に記 載の発現ベクター。 １８．該ＲＴＸ毒素遺伝子がＲＴＸ構造遺伝子の非処理発現産物の前駆体をコ ードする請求項１６または１７に記載の発現ベクター。 １９．該構造遺伝子がＲＴＸＡ遺伝子である請求項１８に記載の発現ベクター 。 ２０．該転写後アクチベーターが部分的または完全に欠失している請求項１６ から１９のいずれか１つに記載の発現ベクター。 ２１．該転写後アクチベーターがＲＴＸＣ遺伝子である請求項１６から１９の いずれか１つに記載の発現ベクター。 ２２．該転写後アクチベーターおよび／または構造遺伝子が、翻訳後アクチベ ーターをコードする遺伝子および／または単一または複数のヌクレオチド置換、 付加および／または完全なまたは部分的な遺伝子の欠失を含む欠失を含む構造遺 伝子からのＤＮＡの導入および欠失、標的構築またはプラスミド分離を用いた同 種組換え：および化学的に誘発された、放射線で誘発されたまたは部位特異的突 然変異を用いた組換えを含む、組換えＤＮＡ技術によって部分的または完全に不 活性化された請求項１６から２１のいずれか１つに記載の発現ベクター。 ２３．天然にＲＴＸ毒素を産生する微生物由来の染色体または染色体外要素で ある請求項１６から２２のいずれか１つに記載の発現ベクター。 ２４．該染色体または染色体外要素がプラスミドである請求項２３に記載の発 現ベクター。 ２５．アクチノバシラス種、プロテウス・ブルガリス、モルガネラ・モルガニ イ、ボルデテラ・ペルツッシス、大腸菌およびパスツレラ種を含む群から選択さ れる微生物由来の請求項２３または２４に記載の発現ベクター。 ２６．アクチノバシラス由来のプラスミドベクターである請求項２４または２ ５に記載の発現ベクター。 ２７．アクチノバシラス・プリゥロニュウモニエ由来のプラスミドベクターで ある請求項２６に記載の発現ベクター。 ２８．さらにＤＮＡを大腸菌へとトランスファーするのを容易にするヌクレオ チド配列を含み、該配列は少なくとも１つのマルチプル・クローニング・サイト 、ｌａｃ遺伝子またはその一部を含む請求項１６から２７のいずれか１つに記載 の発現ベクター。 ２９．ｐＩＧ３、ｐＩＧ３１７、ｐＩＧ３ＢおよびｐＩＧ３Ｂ−Ｔ１Ｋを含む 群から選択される請求項１６から２８のいずれか１つに記載の発現ベクター。 ３０．請求項１６から２９のいずれか１つに記載の発現ベクターによってコー ドされたＲＴＸ遺伝子産物。 ３１．宿主動物中でＲＴＸ毒素に対する免疫応答を誘発するワクチン組成物で あって、該ワクチン組成物が請求項３０に記載のＲＴＸ遺伝子産物を含む組成物 。 ３２．宿主動物中でＲＴＸ毒素に対する免疫応答を誘発するワクチン組成物で あって、該ワクチン組成物が、ＲＴＸ毒素を産生する修飾された微生物を含み、 該ＲＴＸ毒素が部分的または完全に不活性化されている組成物。 ３３．請求項１から１５のいずれか１つに記載の修飾された微生物を含む請求 項３１に記載のワクチン組成物。 ３４．対応するＲＴＸ毒素を産生する微生物の血液亜型の範囲に対する免疫応 答を誘発する請求項３１から３３のいずれか１つに記載のワクチン組成物。 ３５．該ＲＴＸ毒素がアクチノバシラス種から産生されたＡＰＸ毒素である請 求項３４に記載のワクチン組成物。 ３６．該ＡＰＸ毒素がＡＰＸ１、ＡＰＸ２およびＡＰＸ３を含む群から選択さ れる請求項３４または３５に記載のワクチン組成物。 ３７．請求項１から１５のいずれか１つに記載の修飾された微生物を含む生物 学的ベクター。 ３８．宿主動物中で応答を増強することができる生物学的に活性である分子を さらに提供する請求項３７に記載の生物学的ベクター。 ３９．該生物学的に活性である分子が増殖因子、ホルモン、酵素、抗原または その抗原部位、インターロイキン、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子などの サイトカインなどの機能的な分子を含む群から選択される請求項３８に記載の生 物学的ベクター。 ４０．該生物学的に活性である分子が、生物学的に活性である分子をコードす る遺伝子を運搬するプラスミドを有する生物学的ベクターによって発現される請 求項３８または３９に記載の生物学的ベクター。 ４１．該微生物が該微生物に固有の２またはそれ以上の抗原エピトープに対す る免疫応斉を誘発することができる請求項３７から４０のいずれかに記載の生物 学的ベクター。 ４２．該免疫応答が該微生物の病原性形態および該微生物によって発現される 異種抗原へと誘発される請求項４１に記載の生物学的ベクター。 ４３．該免疫応答がＲＴＸ毒素に対して誘発され、ヘモフィルス種、セルプリ ナ・ヒョディセンテリエ、パスツレラ種、ボルデテラ・ブロンキセプチカ、レプ トスピラ種、ストレプトコッカス種、サルモネラ種、大腸菌、マイコプラズマ・ ヒョニュウモニエ、エリシペロスリクス・ルシオパトエまたはＨＣＶ、ＰＲＲＳ Ｖ、ＰＲＶ、ＴＧＥＶまたはＰＰＶを含むウイルス病原体を含む細菌病原体から 選択される１またはそれより多くの病原製の媒体の少なくとも１つの抗原エピト ープに対して誘発される請求項４１または４２に記載の生物学的ベクター。 ４４．活性化ＲＴＸ毒素を産生する微生物を提供し；ついで ＲＴＸ構造遺伝子および／または翻訳後アクチベーターを部分的または完全に不 活性化する ことを含み、該ＲＴＸ毒素が部分的、または完全に不活性化されているＲＴＸ毒 素を産生する修飾された微生物を産生する方法。 ４５．該構造遺伝子がＲＴＸＡ遺伝子である請求項４４に記載の修飾された微 生物を産生する方法。 ４６．該翻訳後アクチベーター遺伝子がＲＴＸＣ遺伝子である請求項４４また は４５に記載の修飾された微生物の産生方法。 ４７．該構造遺伝子および／または該翻訳後アクチベーターが、翻訳後アクチ ベーターをコードする遺伝子および／または単独または複数のヌクレオチド置換 、付加および／または遺伝子の完全または部分的な欠失を含む欠失を含む構造遺 伝子をコードする遺伝子からのＤＮＡの導入および欠失、標的の構築またはプラ スミド分離を用いた同種組換え：および化学的に誘発した、放射線誘発した、ま たは部位特異的突然変異誘発を含む組換えＤＮＡ技術によって部分的または完全 に不活性化されている請求項４４から４６のいずれか１つに記載の方法。 ４８．請求項４４から４７のいずれか１つによって調製された修飾された微生 物。 ４９．生物学的ベクターを提供し：ついで 請求項１６から２９のいずれか１つに記載の発現ベクターを該生物学的ベクター に導入することを含み、ＲＴＸ毒素が部分的または完全に不活性化されるＲＴＸ 毒素を産生する修飾された微生物を産生する方法。 ５０．微生物を産生するＲＴＸ毒素に対する動物にワクチン接種する方法であ っ て、請求項３１から３６のいずれか１つに記載のワクチン組成物の免疫学的に有 効な量を投与することを含む方法。 ５１．請求項１から１５のいずれか１つに記載の修飾された微生物を培養し、 ついで該微生物によって産生された部分的または完全に不活性化された毒素を回 収することを含む不活性化ＲＴＸ毒素の産生方法。