JPH1164271A

JPH1164271A - 電流増幅型酵素センサー

Info

Publication number: JPH1164271A
Application number: JP9237669A
Authority: JP
Inventors: Akira Aoyama; 陽青山
Original assignee: NAGOYASHI
Current assignee: NAGOYASHI
Priority date: 1997-08-18
Filing date: 1997-08-18
Publication date: 1999-03-05

Abstract

(57)【要約】【課題】ペルオキシダーゼおよびメディエーターを用い
た酵素センサーにおいて、従来よりも感度の良いセンサ
ーを提供することを目的とする。【解決手段】微小な二つの電極を交互にかみ合わせたく
し形電極上に、ペルオキシダーゼおよび水に難溶性の電
子供与性メディエーターを固定化した膜をのせ、膜中の
酵素反応によって生じた酸化型メディエーターについ
て、二つの電極間で電気化学的な電流増幅を行うことに
より、センサーの感度をあげる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は酵素センサーに関
し、さらに詳しくは酵素としてペルオキシダーゼを用
い、メディエーターと共に電極上に固定化した酵素セン
サーに関する。

【０００２】

【従来の技術】従来から、酵素の固定化膜を電極上に装
着し、膜中の酵素反応で生じた電極活物質を電極反応に
よって電気信号として検知するという酵素センサーの技
術は、酵素反応の高い基質特異性を巧みに利用するもの
として、グルコースセンサーやアルコールセンサーなど
様々なセンサーとして実用化されている。

【０００３】この酵素センサーの分野において、従来か
ら過酸化水素を基質とする酵素であるペルオキシダーゼ
を用い、メディエーターとなる物質を溶液に添加し、あ
るいはカーボンペースト電極中にメディエーターを練り
込んでおくことを特徴とする過酸化水素センサーが開発
され、発表されている（例えば、Ｂｉｏｓｅｎｓ．Ｂｉ
ｏｅｌｅｃｔｒｏｎ．，４２１〜４２８（１９９２）、
Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，２８１〜２８５（１
９９１）、Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌｙｓｉｓ，５７５〜
５７９（１９９３）等）。

【０００４】これらの技術は、メディエーターが酵素反
応と電極反応との間でレドックス反応を起こすことによ
り、その反応に起因した電流を検出するものであり、過
化水素を電極上で直接酸化させるのに比べて設定電位を
低くすることができるため、妨害物質の影響を受けにく
いという利点を有している。

【０００５】しかし、このセンサーにおいて過酸化水素
の濃度が低い場合は、測定電流が小さくなるため測定が
困難となるという欠点を有していた。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明はこのような事
情に鑑み、ペルオキシダーゼおよびメディエーターを用
いた過酸化水素センサーにおいて、従来よりも飛躍的に
感度の良いセンサーを提供することを目的とするもので
ある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者は、ペルオキシ
ダーゼおよびメディエーターを共存させた固定化酵素膜
を用いた過酸化水素センサーの高感度化について鋭意検
討した結果、二つの近接した電極を有するくし形電極を
もちいて、電極反応の電気化学的増幅を行うことによ
り、センサーの感度を飛躍的に向上させることができる
ことを明らかにした。すなわち図１に示すような微小な
２つのくし形電極を交互にかみ合わせた電極（以下くし
形電極という）上に、ペルオキシダーゼおよび水に難溶
性の電子供与性メディエーターを固定化した膜をのせ
（図２参照）、膜中での酵素反応によって生じたメディ
エーターの酸化体について、一方の電極でメディエータ
ーを還元し、もう一方の電極で酸化するというレドック
ス反応を起こさせることにより電気化学的な電流増幅を
行えば（図３参照）、過酸化水素の検出感度を飛躍的に
向上できることがわかった。以下本発明を詳細に説明す
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明に係る酵素センサーは、二
つの近接した電極を有するくし形電極と、ペルオキシダ
ーゼおよび水に難溶性のメディエーターが膜中に固定化
された膜（５）とから構成されているおり、固定化膜
（５）は、くし形電極上に密着させた構造となっている
（図２）。この場合において、固定化膜（５）と、くし
型電極との密着方法については特に限定はないが、たと
えばナイロンメッシュなどで固定化膜を覆い、マジック
テープを用いて固定させる方法などをとることができ
る。

【０００９】測定に際しては、デュアルポテンシオスタ
ットによって、くし形電極のジェネレーター電極（３）
は酸化型メディエーターが還元される電位に設定され、
コレクター電極（４）は還元型メディエーターが酸化さ
れる電位に設定される。

【００１０】本発明に係る酵素センサーの作動原理を図
３に示す。測定液中に過酸化水素を添加した場合、メデ
ィエーターおよびペルオキシダーゼ共存膜中で酵素反応
が起こり、酸化型メディエーターが生成する。これがく
し形電極のジェネレーター電極（６）で還元され還元型
にもどる。この再生された還元型メディエーターは、す
ぐ隣のコレクター電極（７）で再酸化される。このた
め、くし形電極のジェネレーター電極（６）とコレクタ
ー電極（７）との間でレドックスサイクリング反応が起
こり、センサーの出力電流を増幅させことができる。

【００１１】この場合、メディエーターの酸化体と還元
体は拡散によって電極間を移動するため、コレクター電
極とジェネレーター電極間の距離が小さいほど、増幅率
が大きくなる。

【００１２】本発明に係る酵素センサーによる実際の測
定方法を図４に示す。測定セルには本発明に係るセンサ
ー（１２）、対極となる電極（１３）、および参照電極
（１４）が装着される。測定に際してはデュアルポテン
シオスタット（１５）によって、センサーのジェネレー
ター電極をメディエーターが還元される電位に設定し、
コレクター電極をメディエーターが還元される電位に設
定する。このときにジェネレーター電極に流れる電流を
測定することによって、基質の濃度を知ることができ
る。

【００１３】本発明に係る酵素センサーにおいては、酵
素およびメディエーターを固定化する膜の種類について
は特に限定されないが、たとえば感光性ポリビニルアル
コールを用いて紫外線硬化させる方法や、アルブミンの
グルタルアルデヒドによる架橋反応など、従来から知ら
れている酵素固定化膜の作成方法を利用して作ることが
できる。また、メディエーターの種類については、ペル
オキシダーゼによる過酸化水素の還元反応が可能な電子
供与体であり、電極反応で可逆的に酸化還元される物質
であって、さらには測定溶液中への溶出を防止するため
水に難溶性の物質であれば、特に限定はされない。この
ような条件を満たすメディエーターとして、たとえばフ
ェロセンやシクロヘキシルフェロセン、ジメチルフェロ
センなどのフェロセン誘導体等を用いることができる。

【００１４】なお本発明において、ペルオキシダーゼお
よびメディエーター固定化膜（１９）上に、オキシダー
ゼ系酵素の固定化膜（２０）をのせた複合型のセンサー
とすれば、オキシダーゼ系酵素の基質となる物質の高感
度センサーとすることができる（図５）。すなわち、オ
キシダーゼ系酵素の酵素反応においては、基質と酸素の
反応によって過酸化水素が発生するため、オキシダーゼ
系酵素の固定化膜（２０）中で過酸化水素が発生する。
この過酸化水素をさらにその下にあるペルオキシダーゼ
およびメディエーター固定化膜（１９）中でメディエー
ターと反応させることにより、結果としてオキシダーゼ
系酵素反応の基質を高感度に検出することになるからで
ある。

【００１５】このような、複合型センサーにおけるオキ
シダーゼ系酵素の種類については、特に限定はされない
が、グルコースオキシダーゼと組み合わせれば、高感度
グルコースとすることができ、フルクトースオキシダー
ゼと組み合わせれば高感度フルクトースセンサーとする
ことができる。

【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに詳細に示
すが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではな
い。

【００１６】実施例１フェロセンをメディエーターと
した高感度過酸化水素センサーペルオキシダーゼ１０ｍｇをｐＨ７の０．１Ｍリン酸緩
衝液100μＬに溶解し、フェロセンの粉末10ｍｇを加
え、分散剤として２−スルホコハク酸ビス（２−エチル
ヘキシル）のナトリウム塩水溶液（1ｇ／Ｌ）を50μＬ
加え懸濁させる。これに感光性ポリビニルアルコールの
１１．５％水溶液（東洋合成株式会社製）を200ｍｇ加
え、混合液をテフロン板上に注ぎ、冷暗所で乾燥する。
この乾燥物を高圧水銀ランプで１０分間紫外線照射して
光架橋反応を行い、ペルオキシダーゼおよびフェロセン
が固定化されたポリビニルアルコール膜を得た。

【００１７】この膜をくし型カーボン電極（ビー・エー
・エス株式会社製、電極幅５μｍ、電極間隔５μｍ）に
のせ、テトロンメッシュとマジックテープを用いて電極
上に装着し高感度過酸化水素センサーを作製した。

【００１８】このセンサーにおいて、デュアルポテンシ
オスタットにより、くし形電極のジェネレーター電極を
Ａｇ／ＡｇＣｌ電極に対して０ｍＶに設定し、コレクタ
ー電極を＋４００ｍＶに設定すれば、電流増幅型過酸化
水素センサーとして作動する。またくし形電極のジェネ
レーター電極をＡｇ／ＡｇＣｌ電極に対して０ｍＶに設
定し、コレクター電極を自然電位のままとすれば、通常
のメディエーターを用いた過酸化水素センサーとして作
動する。両者の測定結果の比較を図６に示す。これから
わかるように、電流増幅型センサーは通常型センサーに
比べて出力が１０倍以上となり、飛躍的に感度を向上さ
せることができた。

【００１９】実施例２１，１´−ジメチルフェロセン
をメディエーターとした高感度過酸化水素センサーフェロセンの替わりに、１，１´−ジメチルフェロセン
の粉末を用いること以外は、実施例１と全く同様な方法
で高感度過酸化水素センサーを作製した。このセンサー
について実施例１と同様な比較試験を行ったところ、電
流増幅型センサーは通常型センサーに比べて出力が３倍
以上となり、飛躍的に感度を向上させることができた
（図７）。

【００２０】実施例３シクロヘキセニルフェロセン
をメディエーターとした高感度過酸化水素センサーフェロセンの替わりに、シクロヘキセニルフェロセンの
粉末を用いること以外は、実施例１と全く同様な方法で
高感度過酸化水素センサーを作製した。このセンサーに
ついて実施例１と同様な比較試験を行ったところ、電流
増幅型センサーは通常型センサーに比べて出力が２倍以
上となり、飛躍的に感度を向上させることができた（図
８）。

【００２１】実施例４ペルオキシダーゼおよびフェロ
セン共存固定化膜とグルコースオキシダーゼ固定化膜を
組み合わせた高感度グルコースセンサーグルコースオキシダーゼ１０ｍｇおよび感光性ポリビニ
ルアルコールの１１．５％水溶液（東洋合成株式会社
製）を200ｍｇをｐＨ７の０．１リン酸緩衝液100μＬに
加えて溶解してからテフロン板上に注ぎ、冷暗所で乾燥
する。この乾燥物を高圧水銀ランプで１０分間紫外線照
射して光架橋反応を行い、グルコースオキシダーゼ固定
化膜を得た。この膜を実施例１の方法で作製したペルオ
キシダーゼおよびフェロセン共存固定化膜と重ねあわ
せ、グルコースオキシダーゼ固定化膜が測定溶液側とな
るように、くし型カーボン電極（ビー・エー・エス株式
会社製、電極幅５μｍ、電極間隔５μｍ）にのせ、テト
ロンメッシュとマジックテープにより電極上に装着し高
感度グルコースセンサーとした。このセンサーに比較試
験を行ったところ、電流増幅型センサーはそうでない場
合に比較して出力が１０倍以上になっており、飛躍的に
感度を向上させることができた（図９）。

【００２２】

【発明の効果】本発明は、従来のペルオキシダーゼとメ
ディエーターを用いた過酸化水素センサーに比べて、は
るかに高感度なセンサーを提供することができる。ま
た、ペルオキシダーゼ固定化膜とオキシダーゼ系酵素固
定化膜とを組み合わせることにより、オキシダーゼ系酵
素の基質となる物質（例えばグルコースやフルクトース
など）についての高感度なセンサーを提供することがで
きる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明において利用されるくし形電極の模式図
である。

【図２】本発明による電流増幅型過酸化水素センサーの
模式図である。

【図３】本発明による電流増幅型過酸化水素センサーの
作動概念図である。

【図４】本発明センサーによる測定方法例の図である。

【図５】オキシダーゼ系酵素との組み合わせによる電流
増幅型センサーの断面の模式図である。

【図６】フェロセンをメディエーターとした場合の電流
増幅型過酸化水素センサーと通常型過酸化水素センサー
の応答性の比較。

【図７】１，１’−ジメチルフェロセンをメディエータ
ーとした場合の電流増幅型過酸化水素センサーと通常型
過酸化水素センサーの応答性の比較。

【図８】シクロヘキセニルフェロセンをメディエーター
とした場合の電流増幅型過酸化水素センサーと通常型過
酸化水素センサーの応答性の比較。

【図９】グルコースオキシダーゼ固定化膜とフェロセン
およびペルオキシダーゼ固定化膜を組み合わせた場合の
電流増幅型過酸化水素センサーと通常型過酸化水素セン
サーの応答性の比較。

【符号の説明】

１・・・ジェネレーター電極２・・・コレクター電極３・・・ジェネレーター電極４・・・コレクター電極５・・・ペルオキシダーゼ＋メディエーター共存固定化
膜６・・・ジェネレーター電極７・・・コレクター電極８・・・ペルオキシダーゼ＋メディエーター共存固定化
膜９・・・還元型メディエーター１０・・・酸化型メディエーター１１・・・測定液１２・・・センサー１３・・・参照電極１４・・・対極１５・・・デュアルポテンシオスタット１６・・・レコーダー１７・・・ジェネレーター電極１８・・・コレクター電極１９・・・ペルオキシダーゼ＋メディエーター共存固定
化膜２０・・・オキシダーゼ固定化膜

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】２つの近接した電極を交互にかみ合わせた
くし型電極上に、ペルオキシダーゼおよび水に難溶性の
メディエーターを共存させた固定化膜を装着することを
特徴とする過酸化水素センサー。
【請求項２】メディエーターがフェロセンまたはフェロ
セン誘導体であることを特徴とする請求項１の過酸化水
素センサー。
【請求項３】２つの近接した電極を交互にかみ合わせた
くし型電極上に、ペルオキシダーゼおよびメディエータ
ーを共存させた固定化膜を装着し、その上にオキシダー
ゼ固定化膜を重ねた構造とすることを特徴とする酵素セ
ンサー。
【請求項４】オキシダーゼがグルコースオキシダーゼ、
フルクトースオキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、
ラクテートオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ
からなる群れから選択されたものであることを特徴とす
る請求項３記載の酵素センサー。