JPH1169975A - ヒト ガンマ，デルタｔ細胞抗原レセプターポリペプチド及び核酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 分子量が約４０，０００ダルトンで、２
つのＣγＩＩエキソンコピーのみでコードされる配列を
含む定常領域を含むヒトγＴ細胞抗原受容体２ｂｃ型、
また、２ｂｃ型γポリペプチドを含むＴ細胞抗原受容体
ヘテロダイマー、及び２ｂｃ型γポリペプチドをコード
する核酸配列、及びそれらの部分配列を提供する。 ま
た、γδＴ細胞抗原受容体ヘテロダイマーの発現方法も
また提供する。 さらに、γ又はδポリペプチドのエピ
トープに特異的に反応するモノクローナル抗体をも提供
する。 【効果】 上記のＴ細胞抗原受容体、これらをコードす
る核酸配列およびそれらの部分を用いて、δ定常領域、
δ可変領域、又はγ定常領域と反応させることにより、
これらのＴ細胞抗原を検出し、ＣＤ３抗原のコモジュレ
ーションを検出することによって同定することができ
る。

Description

【発明の詳細な説明】 １．序 本発明は、分子量が約４０，０００ダルトンでフォーム
２ｂｃと称する１フォームのヒトγＴ細胞抗原レセプタ
ーポリペプチド、および二つのＣγ２ＣＩＩエキソンコ
ピーだけによってエンコードされた配列を有する不変部
に関する。また、本発明は、γフォーム２ｂｃを含むＴ
細胞抗原レセプターヘテロダイマー、およびγフォーム
２ｂｃおよびそれらの部分をエンコードする核酸配列に
関する。本発明は、１エピトープのγまたはδＴ細胞に
抗原レセプターポリペプチドと特異反応性を有するモノ
クローナル抗体を提供する。

２．発明の背景 Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）は、二種類のグリコシ
ルサブユニット、即ち１つがα鎖、他のものがβ鎖と称
されるものからなり、Ｔ細胞上のクローン特異ジスルフ
ィド結合ヘテロダイマーとして示されていた。αおよび
βＴＣＲサブユニットは、それぞれ相対分子塊（Ｍｒ）
約５０，０００および４０．０００を有する［アリソン
等（Ａｌｌｉｓｏｎｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ．１２９：２２９３−２３００；Ｍｅｕｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：
７０５−７１９；Ｈａｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９
８３，Ｊ．Ｅｘｐ．ｄＭｅｄ．１５７：１１４９−１１
６９）］。Ｔ細胞固体発生中に転位し、そしてβＴＣＲ
［ヤナギ等（Ｙａｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，
Ｎａｔｕｅｒ ３０８：１４５−１４９；Ｈｅｄｒｉｃ
ｋ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｅｒ ３０８：
１５３−１５８）］およびαＴＣＲ［チーン等（Ｃｈｉ
ｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｅｒ３１２：
３１−３５；Ｓａｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎ
ａｔｕｅｒ ３１２：３６−４０，Ｓｉｍ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｅｒ ３１２：７７１−７７
５）］をエンコードする遺伝子は、消去式ハイブリダイ
ゼーションかまたはオリゴヌクレオチドプローブのいず
れかによって単離された。 Ｔ細胞クローンのＴ細胞抗
原レセプターのアルファおよびベータ鎖は、それぞれ、
可変（Ｖ，ｖａｒｉａｂｌｅ）、多様性（Ｄ，ｄｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ）、結合（Ｊ．ｊｏｉｎｉｎｇ）および不変
（Ｃ，ｃｏｎｓｔａｎｔ）と称するドメインの独特の組
み合わせからなる［シュー等（Ｓｉｕ ｅｔａｌ．，１
９８４，Ｃｅｌｌ ３７：３９３； Ｙａｎａｇｉ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２； ３４３０）］。超可変部
は同定された［パテン等（Ｐａｔｔｅｎｅｔ ａｌ．，
１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：４０；Ｂｅｃｋｅｒ
ｅｔａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４３
０）］。各Ｔ細胞クローンにおいて、アルファおよびベ
ータ鎖のＶ、ＤおよびＪドメインの組み合わせはＴ細胞
クローン独特の特性方法で抗原認識に関与し、そしてＴ
細胞クローンイディオタイプとして既知の独特の結合部
を特定する。反対に、Ｃドメインは抗原結合には関与し
ない。ヒトα、βＴＣＲの独特な特性は、共転形［メイ
ヤー等（Ｍｅｕｅｒ ｅｔａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１５７：７０５−７１９）］，共免疫沈降
（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８８／００２０９，ｐｕｂ
ｌｉｓｈｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ １４，１９８８； Ｏ
ｅｔｔｇｅｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１２，０３９−１２，０４８）
およびα、βＴＣＲ分子とＣＤ３グリコタンパク質複合
体との所定の共発現［バイス等（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：１２８
４−１２９９）］であった。その後、二種類のタンパク
質複合体の直接的な物理的会合は、α、βＴＣＲ分子を
Ｔ３グリコタンパク質へ化学的に交差結合させ、そして
交差結合複合体成分をＴＣＲサブユニットおよびＴ３グ
リコタンパク質（Ｍｒ ２８，０００）サブユニット
［ブレナー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８
５，Ｃｅｌｌ ４０：１８３−１９０）］として同定す
ることによって示された。Ｔ３対応物は、ネズミα、β
ＴＣＲと類似的に会合する［アリソン等（Ａｌｌｉｓｏ
ｎ ｅｔ ａｌ，，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４；
１０７−１０９；Ｓａｍｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，，１
９８４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８１：１３１−１４
４）］。Ｔ細胞中で転位し、γＴＣＲと称される第３遺
伝子は、最初ネズミで［サイトー等（Ｓａｉｔｏ ｅｔ
ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：７５７−
７６２；Ｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１３：７６２−７５５；Ｈａｙｄａｙ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｃｅｌｌ ４０：２５９−２６
９）］、その後、ヒトで同定された［レフラック等（Ｌ
ｅｆｒａｃ ｅｔａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３
１６：４６４−４６６；Ｍｕｒｒｅ ｅｔａｌ．，１９
８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１６；５４９−５５２）］。ヒ
トγＴＣＲ遺伝子座は、５〜１０の可変部、５の結合部
および２の不変部遺伝子からなるだろう［ダイアリナス
等（Ｄｉａｌｙｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
３：２６１９）］。機能的な可変部および結合部の全数
は限定されるけれども、重要な多様性がＶ−Ｊ結合プロ
セスにおいて導入される［クランツ等（Ｋｒａｎｚ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：７５２
−７５５；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６，
Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６； Ｑｕｅｒｔｅｒｍ
ａｎｕｓ ｅｔａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２
２：１８４）］。γＴＣＲ遺伝子転位は、ヘルパー表現
型と同様にサプレッサー細胞障害表現型を有するリンパ
球で生ずる［レフランク等（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１６：４６４−４６
６；Ｍｕｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒ
ｅ３１６：５４９−５５２，Ｑｕｅｒｔｅｒｍａｕｓ
ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３１：２
５２−２５５；Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９８
６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６，Ｉｗａｍｏｔｏ
ｅｔａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
３；１２０３−１２１２；Ｚａｕｄｅｒｅｒｅｔ ａ
ｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３： １３
１４−１３１８）］。γＴＣＲ遺伝子生成物は、Ｔ３共
免疫沈降においてαβＴＣＲ−ＣＤ３^＋Ｔから同定され
ている［ブレナー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４５−１４９；Ｂ
ａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２
２ ：１７９−１８１；Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５，６８３−６８８：Ｍｏ
ｉｎｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２５，７２３−７２６，ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８
８／００２０９，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ
１４，１９８７）］。γＴＣＲポリペプチドは、γＴ
ＣＲペブチド配列に対して導かれたモノクローナル抗体
を使用して同定された。すなわち、これらのポリペプチ
ドは、δＴＣＲと称する他のポリペブチドを有するヘテ
ロダイマーに組み込まれることが見い出された［ブレナ
ー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６ Ｎａ
ｔｕｒｅ３２２；１４５−１６９）］。γ、δヘテロダ
イマーは、非共有結合的にＣＤ３と会合すると報告され
た。γＴＣＲ特異ペプチドに対して導かれた抗血清を使
用すると、末梢血液、胸腺および白血病性細胞系で起始
する細胞上でＣＤ３会合γＴＣＲポリペプチドを同定で
きる［ブレナ（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８
６，Ｎａｔｕｒｅ３２２：１４５−１４９；Ｂａｎｋ
ｅｔａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１７９
−１８１，Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒ
ｏｃ”．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
３：６９９８−７００２；Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９
４；Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３４；１４０１−１４０５）］。前記バンク等（Ｂ
ａｎｋ ｅｔ ａｌ．）は、ヒト胸腺細胞クローン表面
上で６２，０００ＫＤペプチドおよびＴ３と会合する４
４Ｋｄγフォームを開示した。また、類似γＴＣＲポリ
ペプチドは、ネズミＴリンパ球上で同定され、そして胸
腺細胞分化におけるこのペプチドの発現は、最近の研究
対象である［ローレット等（Ｒｏｕｌｅｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４；１０３−１０
７；Ｓｎｏｄｇｒａｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎ
ａｔｕｒｅ３１５：２３２−２３３；Ｌｅｗ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３４：１４０１−１
４０８；Ｐａｒｄａｕ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２６：７９−８１；Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：８２
−８４）］。γＴＣＲ^＋ヒト細胞系の研究によると、二
種類の異なるγＴＣＲポリペプチドは、分子量およびジ
スルフィド リンケージ形成能が異なることが認められ
る［ボースト等（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５ ：６８３−６８８；Ｂｒｅ
ｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４；Ｍｏｉｎｇｅｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２５：７２３−７２
６：Ｌａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１６５：１０７６）］。それぞれＣγ１お
よびＣγ２と称する２種類の異なるγＴＣＲ不変部遺伝
子セグメントが、対比される。すなわち、Ｃγ１の第２
エキソンでエンコードされたシステイン残基はＣγ２エ
キソンセグメントを欠き、その欠如はあるγＴＣＲペプ
チドのジスルフィド結合形成能がないことを明らかに説
明することを示唆する［クランゲル等（Ｋｒａｎｇｅ
ｌ，ｅｔａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：
１５０１−１０５５：Ｌｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ３２６：８５０８８）］。γＴＣＲが多
形態であることに対して、δＴＣＲは相対的に一様であ
り、δＴＣＲ不変部のみが存在する［ハタ等（Ｈａｔａ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：
６７８−６８２）］。Ｔ細胞個体発生の間に、γＴＣＲ
遺伝子転位はβおよびαＴＣＲ遺伝子転位に先行するこ
とが示された［ローレット等（Ｒｏｕｌｅｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１ ４：１０３−１
０７；Ｓｎｏｄｇｒａｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，
Ｎａｔｕｒｅ ３１５：２３２−２３３；Ｓａｎｇｏｔ
ｅｒｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
６３：１４９１−１５０８）］。成熟Ｔリンパ球を循環
させると、相対的に少ない部分がγδＴＣＲ^＋であり、
ＣＤ３^＋４⁻８⁻（二重負例）かまたはＣＤ３^＋４⁻８
^＋表面抗原を示す。ＣＤ３^＋４⁻８⁻Ｔ細胞は、約２％
の成熟ＣＤ３^＋Ｔ細胞を形成する。大部分の成熟ＣＤ３
^＋４^＋またはＣＤ３^＋８^＋主要組織適合性遺伝子座（Ｍ
ＨＣ）が細胞障害Ｔ細胞を制限するのと違って、ＣＤ３
⁻天然キラー細胞に類似して、γδＴＣＲ^＋ＣＤ３^＋４
⁻８⁻クローンリンパ球は、ＭＨＣ非制限細胞溶解活性
を現すことが示された。しかしながら、天然キラー細胞
と違って、これらのγδ^＋ＣＤ３^＋４⁻８⁻Ｔ細胞はＫ
−５６２のごとき天然キラー細胞標的を首尾一貫して殺
さなかった［ボースト等（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，
１９８７，３２５：６８３−６８８；Ｂｒｅｎｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８
９−６９４；Ｍｏｉｎｇｅｏｎ ｅｔａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７２３−７２６；Ｂｌｕｅ
ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２６：８２−８４）］。

３．発明の要約 本発明は、フォーム２ｂｃと称する１フォームのヒトγ
Ｔ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）ポリペプチドに関す
る。フォーム２ｂｃ γＴＣＲ鎖は、実質的に第１４図
に示される主要アミノ酸配列を有する。フォーム２ｂｃ
γＴＣＲ鎖は、分子量が約４０．０００ダルトンであ
り、２つのＣγ２ＣＩＩエキソンコピーだけでエンコー
ドされた配列を含有する不変部を含む。また、本発明
は、γＴＣＲポリペプチドフォーム２ｂｃを含むＴＣＲ
ヘテロダイマーに関する。また、本発明は、γＴＣＲフ
ォーム２ｂｃをエンコードする核酸配列および２つのＣ
ＩＩエキソンだけを有するＣγ２不変部を含む核酸配列
に関する。特殊な実施態様において、本発明の核酸は、
第１４図に示される少なくともある部分の核酸配列を含
む。本発明は、γまたはδＴＣＲポリペプチドのエピト
ープに特異反応性を示すモノクローナル抗体を提供す
る。かかる抗体は、γδＴＣＲおよびＣＤ３抗原の両方
を発現する細胞上のＣＤ３抗原を共転形する能力を検出
することによって同定し得る。特殊な実施態様におい
て、本発明はδＴＣＲ鎖可変部に反応性を示す抗体に関
する。さらに独特な実施態様において、かかる抗体は、
細胞における機能δＴＣＲ可変遺伝子転位体の検出に使
用し得る。他の実施態様において、本発明は、δＴＣＲ
ポリペプチド不変部に反応性を示す抗体に関する。その
他の実施態様において、本発明は、γＴＣＲポリペプチ
ド不変部に反応性を有する抗体に関する。本発明の他の
態様において、細胞中のγδＴＣＲ発現産生方法が提供
される。

３．１定義 本明細書で使用される用語の意味を次に示す。

ＴＣＲ＝Ｔ細胞抗原レセプター Ｖ ＝可変 Ｄ ＝多様性 Ｊ ＝結合 Ｃ ＝不変 ｍＡｂ＝モノクローナル抗体

【図面の簡単な説明】

第１図．抗ＴＣＲδ１を使用するＴ細胞系のシトフルオ
ログラフ分析（細胞ケイ光間接撮影分析）。 第２図．ｍＡｂ抗ＴＣＲδ１特異性の免疫化学分析。表
面^１２５Ｉ標識ＩＤＰ２細胞は、対照ｍＡｂＰ３（レー
ン１および２）、抗ロイシン（１ｅｕ）４（レーン３〜
５）、抗ＴＣＲδ１（レーン６〜８）または抗Ｃγ血清
（レーン９）を使用して免疫沈降させられ、その後ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）によ
って変化され、オートラジオグラフィーによって目視化
された。 Ｎ＝非還元条件、Ｒ＝還元条件。 第３図．δＴＣＲのＮ−グリカナーゼ消化。 第４図．ｐＧＥＭ３−０−２４０／３８地図。 第５図．ｍＡｂ抗ＴＣＲδ１によるｃＤＮＡクローンＩ
ＤＰ２ ０−２４０／３８のインビトロ翻訳生成物の免
疫沈降。 第６図．Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降およびＳＤＳ
−ＰＡＧＥ分析。白抜きの矢じりはδ鎖の位置を示す。
黒の矢じりはγ鎖の位置を示す。溶解産物は、δＴＣＡ
Ｒ−３抗体（奇数レーン）またはβＦ１抗体（偶数レー
ン）を使用して免疫沈降させられた。 第７図．δＴＣＡＲ−３抗体によるδ鎖の免疫沈降。モ
ルト−１３（Ｍｏｌｔ−１３）細胞は、０．３％ＣＨＡ
ＰＳ含有トリスーバッファー生理食塩水（ｐＨ８）（レ
ーン１）または１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１０
０（レーン２〜７）に溶解した。レーン１、δＴＣＡＲ
−３は、ＣＤ３タンパク質でγ、δＴＣＲヘテロダイマ
ーを免疫沈降する。レーン２，δＴＣＡＲ−３は、ＣＤ
３タンパク質を使用することなくγ、δＴＣＲヘテロダ
イマーを免疫沈降する。レーン３と４、δＴＣＡＲ−３
は、変性溶解産物からをそれぞれ非還元（Ｎ）および還
元条件（Ｒ）において単一δ鎖を免疫沈降する。レーン
５、ＵＣＨＴ−１は、ＣＤ３タンパク質を免疫沈降す
る。レーン６、βＦ１抗体は、モルト−１３細胞からヘ
テロダイマーを免疫沈降しない。レーン７、抗Ｃγ抗血
清は、単一γ鎖を免疫沈降する。 第８図．流通血球計算法による細胞表面染色分析。γ、
δＴＣＲ陽性細胞（モルト−１３、ＰＥＥＲ， ＩＤＰ
２）およびα、βＴＣＲ陽性細胞（ＨＰＢ−ＡＬＬ，
Ｊｕｒｋａｔ）は、δＴＣＡＲ−３、ＯＫＴ３、ＷＴ３
１および正常マウス血清（ＮＭＳ）でインキュベートさ
れ、流通血球計算法によって分析された。β細胞系、ダ
ウディー（Ｄａｕｄｉ）は、負対照であった。 第９図．δＴＣＡＲ−３^＋およびＯＫＴ３^＋末梢血液リ
ンパ球の二色シトフルオログラフ分析（細胞間接撮影分
析）。フルオレセイン イソチオシアネート（ＦＩＴ
Ｃ）ケイ光はＹ軸に、藻紅素（ＰＥ）ケイ光はＸ軸に示
される。このサンプル中のＣＤ３^＋γ、δＴＣＲ^＋細胞
は２．４％のＣＤ３^＋リンパ球を示す。 第１０図．細胞質内Ｃａ^２＋濃度（［Ｃａ^２＋］_ｉ）の
経時測定。上部パネル：δＴＣＡＲ−３。下部パネル：
抗ロイシン（Ｌｅｕ）抗体。矢印は、抗体添加時を示
す。 第１１図．３フォームのγ、δＴＣＲの免疫沈降。Ａ〜
Ｅに対して、免疫沈降に使用された抗体は、抗ロイシン
４（抗ＣＤ３）、βＦ１（抗ＴＣＲβ）、抗δ１ＴＣＲ
（抗δＴＣＲ）、抗Ｃγｂ血清（抗γＴＣＲ）およびＰ
３（非標識レーン、対照）であった。１２５１標識細胞
溶解産物からの免疫沈降物は、還元（Ｒ）または非還元
条件（Ｎ）においてＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアク
リルアミド）分 るδＴＣＲの位置を示す。大きさのマーカーＭｒは１０
００の単位であり、左側に示される。 Ａ）ＰＢＬ−Ｌ２上の非ジスルフィド結合γＴＣＲ（４
０ＫＤ）。レーン１〜６において放射性標識細胞はＴＣ
Ｒ−ＣＤ３会合を保存する０．３％ＣＨＡＰＳデタージ
ェントに溶解され、一方レーン７と８において免疫沈降
は、鎖分離後に行なわれた（方法を参照のこと）。 Ｂ）ＩＤＰ２細胞上の非ジスルフィド結合γＴＣＲ（５
５ＫＤ）。レーン１〜４において放射性標識細胞は０．
３％ＣＨＡＰＳデタージェントに溶解させられ、一方レ
ーン５と６において免疫沈降は鎖分離後に行なわれた。 Ｃ）ＷＭ−１４上のジスルフィド結合γＴＣＲ（４０Ｋ
Ｄ）。全てのレーンは、１％ジギトニン溶解放射性標識
細胞からの免疫沈降物に対応する。 Ｄ）胸腺クローンＩＩ細胞上の非ジスルフィド結合γＴ
ＣＲ（４０ＫＤ）。放射性標識細胞は、１％ジギトニン
（レーン１〜４）または０．１％トリトン（Ｔｒｉｔｏ
ｎ）Ｘ−１００（レーン５と６）に溶解させられ、一方
レーン７と８において鎖分離後免疫沈降は行なわれた。 Ｅ）モルト−１３白血病Ｔ細胞上の非ジスルフィド結合
γＴＣＲ（４０ＫＤ）。レーン１〜４において０．３％
ＣＨＡＰＳデタージェント細胞溶解後免疫沈降は行なわ
れ、一方レーン５と６において鎖分離後免疫沈降は行な
われた。 第１２図．それぞれ抗Ｃγｍ１抗体および抗ＴＣＲδ１
抗体によるγＴＣＲおよびδＴＣＲの免疫沈降。細胞表
面放射性標識モルト−１３細胞は、０．３％ＣＨＡＰＳ
デタージェントに溶解させられ、γ、δＴＣＲ−ＣＤ３
の複合体は抗ＣＤ３モノクローナル抗体で単離した。免
疫沈降物は、還元条件において１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
分析された。 レーン１：抗ロイシン４（抗ＣＤ３）ｍＡｂによる免疫
沈降。 レーン３：単離γ、δＴＣＲ−ＣＤ３複合体鎖の分離後
の抗Ｃγｍ１（抗ＴＣＲγ）による免疫沈降。 レーン４：単離γ、δＴＣＲ−ＣＤ３複合体鎖の分離後
の抗ＴＣＲδ１（抗ＴＣＲδ）による免疫沈降。 第１３図．ＰＥＥＲおよびモルト−１３細胞からのγお
よびδＴＣＲのペプチドバックホーン（主鎖）の大きさ
およびグリコシル化の測定。免疫沈降に使用されたモノ
クローナル抗体は、各レーン上部に示されるように抗Ｃ
γｍ１（抗ＴＣＲ“γ）、抗ＴＣＲδ１（抗ＴＣＲδ）
およびＰ３（標識対照）である。使用標識細胞系は、各
１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフまたはフル
オグラフの下部に示される。サンプルの全ては、還元条
件で分解した。大きさのマーカーＭｒは１０００の単位
である。 Ａ）ＰＥＥＲおよびモルト−１３細胞からのγＴＣＲペ
プチド主鎖の大きさ。細胞は、^３５Ｓ−システインおよ
び^３５Ｓ−メチオニンで１５分間、バイオ合成で標識化
された。サンプルは、エンド（Ｅｎｄｏ）Ｈ（＋）処理
またはみかけ処理のいずれかで行われた。抗Ｃγｍ１に
よる免疫沈降はＰＥＥＲ細胞（レーン３）およびモルト
−１３細胞（レーン７）の未熟γＴＣＲの位置を示す
が、対応するポリペプチド主鎖の大きさはエンドＨ（レ
ーン４と８）処理後目視化される。 Ｂ）モルト−１３細胞からのＴＣＲδのグリコシル化。
^１２５Ｉ標識細胞は抗ＣＤ３ｍＡｂで免疫沈降させら
れ、δＴＣＲポリペプチドは、Ｎ−グリカナ−ゼ（レー
ン４）、エンドＨ（レーン２）によるインキュベーショ
ンまたはみかけ処理（レーン１と３）前にゲル精製され
た（方法参照のこと）。 第１４図．モルト−１３（ＭＯＬＴ−１３）γＴＣＲの
核酸配列（フォーム２ｂｃ）。パートＡ：クローンＭ１
３Ｋ配列計画。１．１Ｋｂ ｃＤＮＡクローンＭ１３Ｋ
の部分制限地図が示される。パートＢ；クローンＭ１３
Ｋの核酸及び推定アミノ酸配列。シグナル配列（Ｓ）、
可変（Ｖ）、Ｎ−部（Ｎ）、結合（Ｊ）および不変（Ｃ
Ｉ、ＣＩＩｂ、ＣＩＩｃおよびＣＩＩＩ）部遺伝子セグ
メントは矢印によって示され、そしてゲノム配列の比較
によって同定された｛［レフランク等Ｌｅｆｒａｎｃ
ｅｔ ａｌ．，（１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−
２４６）（ＳとＶに対して），Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ
ａｌ．，（１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：４２０−
４２２）］、クオーターマウス等［Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏ
ｕｓ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３８：２６８７−２６９０）（Ｊに対して）］、レフラ
ンク等 ［Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，（１９８
６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ．８３−９５９６−９６００）］およびペリシー等
［Ｐｅｌｌｊｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，（１９８７，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ２３７：１０５１−１０５５）（Ｃに対し
て）］｝。イニシエーターメチオニンから始まる推定ア
ミノ酸配列は、核酸配列の下に示される。細胞外システ
インは四角で強調され、潜在的Ｎ−結合炭水化物付着部
位［Ｎ−Ｘ−ＳまたはＮ−Ｘ−Ｔ；マーシャル（Ｍａｒ
ｓｈａｌｌ，１９７７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，４１；６３７−７０２）］は括弧で示される。 １５図．γ、δＴＣＲフォーム１の優先的使用。３つの
健康体ドナーからの新鮮な単離末梢血液単核性細胞は、
^１２５Ｉ標識化され、そして１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０に可溶化された。Ｐ３（対照、レーン１と３）および
抗ＴＣＲδ１（抗ＴＣＲδ、レーン２と４）による免疫
沈降は、非還元（Ｎ）および還元条件で分析された。１
０００単位のマーカーＭｒは左側に示される。 第１６図．ヒトにおける三種のγ、δＴＣＲフォームの
図形。ＣＩＩエキソンエンコード コネクター ペプチ
ドは、ＣγＩＣＩＩエキソン エンコードペプチドとし
て黒 それぞれＣγ２ＣＩＩエキソンコピーａ、コピーｂそし
てコピーｃエンコードペプチドを示す。潜在的なＮ−結
合グリカン付着部位（Ｏ）、スルフヒドリル基（−Ｓ
Ｈ）および推定ジスルフィド橋（−Ｓ−Ｓ−）が示され
る。 第１７図．転位δＴＣＲ遺伝子地図。ＥｃｏＲＩ（Ｒ
Ｉ）、ＨｉｎｃＩＩ（Ｈｃ）、ＳｃａＩ（ｓ）とＰｖｕ
ＩＩ（Ｐ）部位を含むｒ１１９δ１地図およびサザンブ
ロット分析で使用されたプローブが示される。 第１８Ａｏモルト−１３細胞系へのトリンスフェクショ
ンに使用されたγＴＣＲ鎖を示す図面。図面は、報告さ
れた分析に基づく ［ブレナー、エム、ビー等（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．１９８６．Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２２：１４５−１４９；Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．
Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２
５：６８９−６９４ ：Ｋｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．，ｅ
ｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４
−６７）］。図中、Ｐｒｅｄ．は推定値、Ｏｂｓ．は実
測値を示す。推定グリコシル化ポリペプチドの大きさ
は、すべての有効なＮ−結合グリコシル化部位（棒つき
飴として示されている）は、各々３ＫＤの付着単数化物
を含んでいるものが使用され、そして、大きさの顕著な
相違は他のポスト−トランスフェクション修飾によって
導入されないと考えられる。鎖内ジスルフィドリンケー
ジは、Ｉｇ様分子の代表として示される。システイン残
基（ｃｙｓ）はＰＢＬＣ１γＴＣＲのＣＩＩエキソンに
よってエンコードされ、かかるシステインは二種の他の
γＴＣＲ鎖に使用されるＣＩＩエキソンの全コピーを欠
くことに注意すべきである。同様に５５ＫＤγＴＣＲタ
ンパク質を発現する［ブレナー、エム、ビー等（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３２５：６８９−６９４；Ｗｅｉｓｓ，Ａ．ｅ
ｔａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８３：６９９８−７００２）］γ、δＴ
白血病性細胞系ＰＥＥＲ［リットマン、ディー．アー
ル．等［（Ｌｉｔｔｍａｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：８５−８８）］のγ
ＴＣＲ不変部はＩＤＰ２のそれと同一である。 １８Ｂ図。発現プラスミド構成ｐＦｎｅｏ、ＰＢＬ Ｃ
ｌγおよびｐＦｎｅｏ． ＩＤＰ２γは、γＴＣＲクロ
ーンをモルト−１３細胞系に導入するために使用され
た。ＰＢＬ Ｃ１ γＴＣＲ ｃＤＮＡクローン（ＰＢ
Ｌ Ｃ１．１５）およひ修復ＩＤＰ２ γＴＣＲ ｃＤ
ＮＡ クローン（ＩＤＰ２．１１ｒ）［クランゲル．エ
ム．エス等（Ｋｒａｎｇｅｌ．Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）］
は、ＥｃｏＲＩ消化によって親プラスミドベクター（ｐ
ＵＣ１８）から分割され、末端はＤＮＡポリメラーゼＩ
クレノウ フラグメントで弱められ、そしてｃＤＮＡは
その後Ｓａ１Ｉ−カットおよびクレノウ処置ｐＦｎｅｏ
ママリン発現ベクターヘリゲートされた。ＳＦＦＶ（ｓ
ｐｌｅｅｎ ｆｏｃｕｓ ｆｏｒｍｉｇ ｖｉｒｕｓ）
ＬＴＲに関して適度に配向してｃＤＮＡ挿入物を含有
するクローンは、制限マップに基づいて選択された。ｐ
Ｆｎｅｏ［サイトー．ティー．等（Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：１２
５−１３０）］は、ＢａｍＨＩ消化によってネズミβＴ
ＣＲ ｃＤＮＡ挿入物を除き、続いてＴ４ ＤＮＡリガ
ーゼでリゲートすることによって得られたｐＴβＦｎｅ
ｏ誘導体［オーハシ，ピー．（Ｏｈａｓｈｉ，Ｐ．，ｅ
ｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１６：６０６
−６０９）］である。図示されているように、このベク
ターはＳＶ４０プロモーター制御のもので細菌ネオマイ
シン耐性遺伝子（ｎｅｏ^ｒ）を含有し、哺乳類感受性細
胞上の抗生物質Ｇ４１８に耐性を与える。カッコ内の制
限部位は構成中に破壊された。 第１９図．モルト−１３ γＴＣＲ トランスフェクタ
ント上のγ、δＴＣＲの免疫沈降分析。表面^１２５Ｉ標
識細胞は、鎖会合を保護するために０．３％ＣＨＡＰＳ
デタージェントに可溶化され、ｍＡｂ Ｐ３（対照）、
抗−ｌｅｕ−４（抗ＣＤ３）、抗ＴＣＲδ１（抗δＴＣ
Ｒ）または抗Ｔｉ−γＡ（抗Ｖγ２）で免疫沈降され、
その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ非還元（Ｎ）または還元（Ｒ）
条件下で分解され、前記オートラジオグラフィーで目視
化された［ブレナーエム．ビー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３
２２：１４５−１４９：Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅ
ｔａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−
６９４）］。抗ＴｉγＡ ｍＡｂは、Ｖγ２セグメント
の認識に一致する異なるＴ細胞クローンに関するあるパ
ターンの反応性を示す。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γ：ＰＢ
Ｌ Ｃ１誘導γＴＣＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトし
たモルト−１３細胞：クローン＃７は、分析用に使用さ
れた。Ｍ１３．ＩＤＰ２γ：ＩＤＰ２−誘導γＴＣＲ
ｃＤＮＡでトランスフェクトされたモルト−１３細胞：
クローン＃１０は、分析用に使用された。サイズ マー
カー，Ｍｒ（分子量）は、１０００ダルトン単位であ
る。白ぬき矢印はレジデントモルト−１３γＴＣＲ鎖
を、黒ぬり矢印はトランスフェクトされた（ＰＢＬ Ｃ
１またはＩＤＰ２誘導）γＴＣＲｃＤＮＡを、アスタリ
スクは、非還元条件下のモルト−１３ δＴＣＲ鎖を示
す。還元すると、δＴＣＲ鎖は移動性シフトを受け、４
０ＫＤγＴＣＲ鎖とともに移動する。しかしながら、δ
ＴＣＲ鎖は、Ｍ１３，ＩＤＰ２γの抗Ｖγ２免疫沈降
（第１９図レーン８）で見られるように、４０ＫＤγＴ
ＣＲタンパク質が共免疫沈降しないときに、還元条件下
で４０ＫＤバンドとして明確に目視化させられる。 第２０図．トランスフェクタントのγＴＣＲポリペプチ
ドの２次元ゲル分析。２×１０^７の細胞は、表面^１２５
Ｉ標識化され、ノイラミダーゼ（各々１ｍｇ／ｍｌのグ
ルコースと牛血清アルブミンを有する１．５ｍｌＰＢＳ
の１５０ユニットで２３℃において１．５時間）処理さ
れ、０．３％ＣＨＡＰＳデタージェントで可溶化され、
１μＩｇ抗−ｌｅｕ−４ｍＡｂで免疫沈降され、還元条
件下で２Ｄゲル分析された。非平衡ｐＨグラジェントゲ
ル電気泳動（ＮＥＰＨＧＥ）は、ｐＨ３．５〜１０のア
ンフォリン（ＬＫＢ スウェーデン）を使用して行な
い、その後１０．５％アクリルアミドゲルのＳＤＳポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を行なった［ブレナーエ
ム．ビー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ．Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９
４）］。ＣＤ３ 成分の位置（図示せず）は、異なる細
胞系で発現されたγＴＣＲ種を同定し、かつ比較するた
めに使用された。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γトランスフェ
クタント クローン＃１０とＭ１３．ＩＤＰ２γトラン
スフェクタント クローン＃１０が使用された。白ぬき
矢印はモルトー（ＭＯＬＴ）１３γＴＣＲ種を、黒ぬり
矢印はＩＤＰ２γＴＣＲ種を、アスタリスクはＰＢＬ
Ｃ１ γＴＣＲ種を示す。 第２１図．トランスフェクタントのγＴＣＲ鎖の主鎖ポ
リペプチドの大きさに関する分析。細胞は、^３５Ｓ−メ
チオニンおよび^３５Ｓ−システインで１５分間パルス標
識され、Ｐ３（対照）、抗−Ｃγｍ１（抗γＴＣＲ）ま
たは抗ＴｉγＡ（抗Ｖγ２）ｍＡｂで免疫沈降された。
免疫沈降物は、エンドクリコシダーゼＨ（エンドＨ，
＋）処理またはモックインキュベート（−）され、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分解させられ、フルオログラフィーで目視
化させられた。全サンプルは還元された。Ｍｒ．分子量
マーカーは１０００ダルトン単位である。アクチンバン
ドを含む４３ＫＤは、付加的な内部マーカーとして役立
つ。Ｍ１３．ＩＤＰ２γ：ＩＤＰ２ γＴＣＲ ｃＤＮ
Ａ、クローン＃１０でトランスフェクトされたモルト１
３細胞；Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γ：ＰＢＬ Ｃ１ γＴ
ＣＲ ｃＤＮＡ、クローン＃１０でトランスフェクトさ
れたモルト−１３細胞。 第２２図．γδＴ細胞クローンおよびポリクローナルヒ
トＴ細胞集団のサザンブロット分析。ゲノムＤＮＡはＥ
ｃｏＲＩで消化され、Ｖ−Ｊプローブされた。ＤＮＡ源
は次のようである：ＰＢＬ Ｔ細胞クローン（レーン
１、３−９）、ＰＢＬ（レーン１０）、新生胸腺リンパ
球（ＮＢＴ レーン１１）、ウシ胸腺リンパ球（ＦＴ，
レーン１２）およびＢ細胞（ゲルムリン、レーン２）で
ある。ゲルムリン３Ｋｂ Ｖδおよび６．７Ｋｂ Ｊδ
フラグメントはブロットの左側に示され、一方、５の通
常の転位、Ｉ−Ｖ番は、右側に示される。Ｉ〜Ｖの転位
の大きさは、それぞれ２．９Ｋｂ、３．５Ｋｂ、４．２
Ｋｂ、６．２Ｋｂおよび７．１Ｋｂである。 ５．１．γＴＣＲフォーム ２ｂｃポリペプチドおよび
核酸 本発明は、フォーム２ｂｃと称するあるフォームのヒト
γＴＣＲポリペプチドに関する（詳細は第８および９節
に記載する）。また、本発明は、ＤＮＡおよびＲＮＡの
如きγフォーム ２ｂｃをエンコードする核酸およびそ
れらの相補的核酸に関する。フォーム１とフォーム ２
ａｂｃ γＴＣＲポリペプチドは、以前に、ヒトγＴＣ
Ｒのフォームであると報告されている（ＰＣＴ国際公開
番号．Ｗ０８８／００２０９、１９８８年１月４日発
行）。フォーム１ γＴＣＲポリペプチドは、約４０．
０００ダルトンの分子量を有する。フォーム ２ａｂｃ
γＴＣＲポリペプチドは、約５５，０００ダルトンの
分子量を有する。フォーム ２ａｂｃγＴＣＲ鎖は、フ
ォーム１より若干長いペプチド主鎖を有し、かつ１個の
特別な潜在的なＮ−結合グリカンを有する。反対に、本
発明のγＴＣＲ鎖、フォーム２ｂｃは約４０．０００ダ
ルトンの分子量を有する。その上、フォーム ２ｂｃγ
ＴＣＲポリペプチドは、若干短いペプチド主鎖および２
〜３個少ないＮ結合グリカンを有する。γＴＣＲ鎖フォ
ーム ２ｂｃは、前記フォーム ２ａｂｃと比較して、
大きさが１５ＫＤ（４０ＫＤに対して５５ＫＤ）も相違
する。この相違は、５ＫＤ小さいポリペプチド主鎖（３
５ＫＤに対して４０ＫＤ）および炭水化物の減少（５Ｋ
Ｄに対して１５ＫＤ）によって説明される。フォーム
２ｂｃの約３５ＫＤポリペプチド主鎖は、フォーム１か
ら区別することに役立つ：ちなみにフォーム １の主鎖
は４０ＫＤである。同様に、γＴＣＲポリペプチドフォ
ーム ２ｂｃは、不変部（Ｃγ）遺伝子セグメント用途
においてフォーム１とフォーム ２ａｂｃと相異する。
フォーム１γＴＣＲ鎖は、単ＣＩＩエキソン含有Ｃγ１
遺伝子セグメントによってエンコードされる不変部を有
する［クランゲル等（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）］。
フォーム ２ａｂｃ γポリペプチドは、３つのＣＩＩ
エキソンコピー、すなわちコピーａ、コピーｂおよびコ
ピーｃ含有 Ｃγ２遺伝子セグメントによってエンコー
ドされる［クランゲル等（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６
７；Ｌｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３２６：８５−８８）］。これに対し、フォー
ム ２ｂｃは、フォーム ２ａｂｃのｃＤＮＡに存在す
るＣγ２第２エキソンによってエンコードされた配列の
１コピーを欠く。このように、フォーム ２ｂｃは２つ
のＣγ２ ＣＩＩエキソンコピー、すなわちコピーｂと
コピーｃを含有する。ＣＩＩのコピーａは、これはフォ
ーム２ｂｃには欠けているが、メンブラン橋かけ（ｓｐ
ａｎｎｉｎｇ）部と細胞外不変ドメイン間の結合部をエ
ンコードする。６の潜在的Ｎ結合炭水化物付着部位は、
フォーム ２ｂｃポリペプチド上に存在する。バイオケ
ミカルデータは、２−３のＮ結合グリカンだけがポリペ
プチド鎖に付着することを示唆するので、全ての潜在的
部位が使用されるわけではないことを示す。特殊な実施
態様において、γＴＣＲポリペプチドフォーム ２ｂｃ
は、モルト−１３［ロー等（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７２）］Ｔ
細胞系または胸腺誘導クローンＩＩ［バンク等（Ｂａｎ
ｋｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１
７９−１８１）］細胞から得られる。同様に、γＴＣＲ
鎖フォーム ２ｂｃは、γＴＣＲフォームを発現するヒ
ト実体Ｔリンパ球から得られる。フォーム ２ｂｃ ７
−ＴＣＲポリペプチドは、第１４図に示されるγＴＣＲ
ポリペプチドの主要アミノ酸配列またはＣγ２ ＣＩＩ
のコピーｂとコピーｃからなる不変部を含むそれらのい
かなる部分をも含む。また、本発明は、約４０，０００
ダルトン分子量のγＴＣＲフォーム ２ｂｃポリペプチ
ドをエンコードする核酸分子を提洪する。γＴＣＲフォ
ーム ２ｂｃポリペプチド不変部は、３つのＣγ２ Ｃ
ＩＩエキソンのうち２つだけ含有する核酸配列の翻訳か
ら生ずる。同様に、本発明は、２つのＣＩＩエキソンだ
けを含有するＣγ２不変部を含む核酸配列に関する。核
酸は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡおよび相補的核酸およ
びそれらの誘導体である。本発明の特殊な実施態様にお
いて、ＤＮＡ分子は、第１４図に示される核酸配列の少
なくとも１部を含む。第８節で論議される実施例におい
て、２ｂｃ γＴＣＲポリペプチドおよびそのエンコー
ド核酸配列が記載されている。第９節で論議される実施
例において、γＴＣＲポリペプチドのジスルフィド結合
またはグリコシル化の能力はその不変部主要配列によっ
て決定されることが示される。 ５．２．γＴＣＲフォーム ２ｂｃ含有ポリペプチド複
合体 また、本発明は、γＴＣＲ鎖フォーム ２ｂｃを含むポ
リペプチド複合体に関する。特殊な実施態様において、
ポリペプチド複合体はＴセル抗原レセプターダイマーか
らなる。特に、かかるダイマーはヘテロダイマー（γ、
δヘテロダイマー、γ、βヘテロダイマーおよびα、γ
ヘテロダイマーまたはγ´がγＴＣＲポリペプチドフォ
ーム１、２ａｂｃまたは２ｂｃであるγ、γ´ヘテロダ
イマーを含むがそれに限定されることはない）またはホ
モダイマーである。本発明の特殊な実施態様において、
γＴＣＲフォーム２ｂｃを含むポリペプチド複合体はγ
δＴＣＲヘテロダイマーである。このように、δＴＣＲ
ポリペプチドの少なくとも１部およびγＴＣＲフォーム
２ｂｃポリペプチドを含む精製複合体は、本発明によ
って提供される。δポリペプチドは、少なくとも１つの
鎖内共有結合ジスルフィド橋を有する。加えて、ポリペ
プチドは、４０．０００ダルトン分子量のδＴＣＲポリ
ペプチドを含む。下記実施例で詳細に示されるように、
γＴＣＲフォーム ２ｂｃ鎖は、δＴＣＲ鎖を有する複
合体と非共有結合的に会合する。このように、γフォー
ム ２ｂｃは、非ジスルフィド結合ＴＣＲ複合体を形成
する。同様に、γＴＣＲ鎖フォーム ２ａｂｃは、δＴ
ＣＲ鎖を有する非ジスルフィド結合複合体を形成し、
（例えば、ＩＤＰ２細胞上）、一方γＴＣＲ鎖フォーム
１は、δＴＣＲポリペプチドを有するジスルフィド結合
複合体を形成する。下記第９節の実施例に示されるよう
に、γＴＣＲ不変部ＣＩＩエキソンの使用（およびγＴ
ＣＲ鎖主要配列）は、ＴＣＲγおよびδ間のジスルフィ
ド結合の存在または不存在はかりでなく、細胞表面γＴ
ＣＲタンパク質の大きさの相違に大きく寄与するγＴＣ
Ｒに付着した炭水化物量をも決定する。このように、本
発明は、特別なγポリペプチドフォームをエンコードす
るγＴＣＲ遺伝子をγ遺伝子を発現する能力を有する細
胞（すなわち該細胞はδＴＣＲ鎖を発現する）へ導入す
ることを含む、ある定められた分子内リンケージ（ジス
ルフィドまた非ジスルフイド結合）のγδＴＣＲヘテロ
ダイマーの発現およびγＴＣＲグリコシル化を拡大産生
する方法を提供する。加えて、本発明は、他のγＴＣＲ
ポリペブチド（例えば、フォーム１、２ａｂｃまたは２
ｂｃ）と会合した本発明のγＴＣＲフォーム ２ｂｃポ
リペプチドを含む精製複合体を提供する。本発明のある
実施態様において、二種のγＴＣＲポリペプチドは少な
くとも１つの鎖内、共有ジスルフィドリンケージを介し
て互いに会合する。本発明の他の実施態様において、二
種のγＴＣＲポリペプチドは、互いに非共有結合的に会
合している。本発明のさらなる他の実施態様において、
二種のγＴＣＲポリペプチドは同一の不変ドメインを有
する。また、本発明の実施態様において、二種のγＴＣ
Ｒポリペプチドは異なる不変ドメインを有する。 ５．３．γδＴＣＲポリペプチドに反応性を有するモノ
クローナル抗体 γまたはδＴ細胞抗原レセプターのエピトープに対する
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培地中の連続細胞系
によって抗体分子の産生を提供するいかなる技術を使用
しても調製しえる。これらには、最初にコーラーとミル
シュタイン（ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉ
ｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９
７）によって記載されたハイブリドーマ技術、より最近
のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術［コーズボール等（Ｋ
ｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４：７２）］およびＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術［コール等（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１
９８５ ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＡｌａｎＲ．
Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ７７−９６）］を挙げること
ができるがこれらに限定されることはない。ある実施態
様においてモノクローナル抗体は、ヒトモノクローナル
抗体またはキメラヒトーマウス（または他の種類の）モ
ノクローナル抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、
当該技術分野における公知の多くのいずれかの技術によ
って作られる［例えばテン等（ｅ．ｇ．，Ｔｅｎｇ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０８−７３１２；
Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ Ｔｏｄａｙ４：７２−７９； Ｏｌｓｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．１９８２，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．
９２：３−１６）］。ヒト不変部を有するマウス（また
はラットまたは他の種類）抗原結合ドメイン含有キラメ
抗体分子が調製される［モリソン等（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１；Ｔａｋｅ
ｄａｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：
４５２）。また、本発明は、Ｔ細胞抗原レセプターと反
応性を有するモノクローナル抗体同定法に関する。かか
るｍＡｂは、Ｔ細胞抗原レセプターおよびＣＤ３複合体
の両方を発現する細胞にｍＡｂを結合させるとＣＤ３抗
原を共転形する能力を検出することによって同定し得
る。ＣＤ３共転形は、例えば、細胞と結合する標識抗Ｃ
Ｄ３抗体量を測定することによって検出し得る。この方
法は、後述の第７．１．１節の実施例によって示され、
そしてハイブリドーマ分泌抗Ｖ_δ ｍＡｂ δＴＣＡＲ
−３の同定に使用される。γまたはδＴＣＲポリペプチ
ド エピトープへの抗体の分子クローンは、既知の技術
によって調製し得る。組み換えＤＮＡ方法は、モノクロ
ーナル抗体分子、またはそれらの抗原結合部をエンコー
ドする核酸配列構成用に使用される［マニアチス等（ｓ
ｅｅ ｅ．ｇ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１
９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ，Ｃｏ
ｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒ
ｋ）］。抗体分子は、既知の方法、例えは免疫吸収また
は免疫親和クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ（高速液体ク
ロマトグラフィー）の如きクロマトグラフィー法または
それらを組み合わせた方法等によって精製される。イデ
ィオタイプの分子を含む抗体フラグメントは、既知の技
術によって作られる。次のようなフラグメントが含まれ
るがそれに限定されることはない。例えば、抗体分子の
ペプシン消化により産生し得るＦ（ａｂ´）_２フラグメ
ント、Ｆ（ａｂ´）２フラグメントのジスルフィド橋に
水素添加（還元）することによって生成し得るＦａｂ´
フラグメント、および抗体分子をパパインと還元剤処理
して生成し得るＦａｂフラグメントがある。本発明の一
実施態様は、δＴＣＲ鎖の可変部に反応性を有するモノ
クローナル抗体に関する。かかる抗体はδＴＣＡＲ−３
（アカＴＣＳδ１）（第７節参照のこと）であり、特異
δ遺伝子転位から発現しエピトープを認識する。第７．
２節で記載のようにｍＡｂ δＴＣＡＲ−３は、γ、δ
^＋Ｔリンパ球増殖を刺激できる。また、モノクローナル
抗体δＴＣＡＲ−３は、γ、δ^＋Ｔリンパ球の細胞質遊
離カルシウムイオン濃度上昇を刺激する。他の実施態様
において、本発明はγまたはδＴＣＲポリペプチド不変
部と反応性を有する抗体に関する。特別な実施態様にお
いて、本発明はδＴＣＲ鎖不変部と反応するｍＡｂ Ｔ
ＣＲδ１に関する（第６節参照のこと）。他の実施態様
において、本発明はγＴＣＲ鎖不変部と反応するｍＡｂ
抗−Ｃγｍ１に関する（第８．１．７節参照のこと）。 ６．ＴＣＲデルタ サブユニット 不変部と特異反応性
を有するモノクローナル抗体抗ＴＣＲδ１の生成 ６．１．実験方法 ６．１．１．抗ＴＣＲδ１によるＴ細胞系のシトフルオ
ログラフィー分析 δＴＣＲ鎖不変部と特異的に反応する抗ＴＣＲδ１ ｍ
Ａｂは、次のように作られた。ＰＥＥＲ細胞１ｇを０．
３％ＣＨＡＰＳ（３−［３−クロロアミドプロピル（Ｃ
ｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ジメチル−アンモニ
ノ］１−プロパンスルホネート）デタージェント５０ｍ
ｌに溶解し、ＵＣＨＴ１腹水１μｌ［ベバーリー，ピー
シーとカラード（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｐ．Ｃ．，ａｎｄ
Ｃａｌｌａｒｄ．１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１１：３２９−３３４）］、ｍＡｂ １８７．１
培養上澄５００μｌおよびＳＡＣＩ（スタフィロユッカ
スアウレウス コバンＩ菌株、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ ｓｔｒａｉ
ｎ）で免疫沈降した。６週間間隔で腹腔内注射が４回行
なわれ、２％トリトンＸ−１００を使用して免疫複合体
からγδＴＣＲの選択的溶出によって単離されたγδＴ
ＣＲ（ＣＤ３なしで）最終抗原（ｆｉｎａｌｂｏｏｓ
ｔ）が続いた。溶出物質は、静脈内および腹腔内投与さ
れた。すなわち、この抗原投与の４日後に、マウスは犠
牲にされ、前記の如く融合した［ブレナーエム．ビー等
（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０２−１５０
９）。γδＴＣＲ細胞系ＰＥＥＲおよびＩＤＰ２または
αβＴＣＲ細胞系ＨＰＢ−ＭＬＴおよびジャーカット
（ＪＵＲＫＡＴ）は、抗ＴＣＲδ１培養上澄５０μｌで
染色し、続いてオルソ シトフルオログラフ分析状態で
ＦＩＴＣ共役ヤギ抗マウスＩｇＦ（ａｂ）´_２フラグメ
ントを用いて染色した（第１図参照のこと）。対照は、
Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８ハイブリドーマ（Ｐ３）で分析し、
抗ＣＤ３ ｍＡｂは抗ロイシン４（Ｌｅｕ４）であった
［レッドベター、ジェイ．エイ．等（Ｌｅｄｂｅｔｔｅ
ｒ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｅｘｐ．
Ｍｅｄ．１５３：３１０）］。 ６．１．２．ｍＡｂ抗ＴＣＲδ１特異性免疫化学分析 表面１２５１標識ＩＤＰ２細胞を可溶化し、それらのタ
ンパク質を対照ｍＡｂＰ３、抗Ｌｅｕ４、抗ＴＣＲδ１
または抗Ｃγ血清を用いて免疫沈降した。沈降サンプル
をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、続いてオートラジオグラフ
ィーを行なった。ＣＨＡＰＳデタージェントにおいて、
γδＴＣＲとＣＤ３は会合して残留し、抗Ｌｅｕ４によ
って複合体として免疫沈降させられた（第２図、レーン
３と４）。しかしながら、２％トリトンＸ−１００デタ
ージェントへの可溶化後、抗ＴＣＲδ１はγδＴＣＲを
ＣＤ３なしでダイマー複合体として免疫沈降させ（レー
ン６）、抗Ｌｅｕ４はＣＤ３をγδＴＣＲなしで三量複
合体として免疫沈降させた（レーン５）。γδＴＣＲ−
ＣＤ３成分鎖分離後、抗ＴＣＲδ１はＴＣＲδだけを免
疫沈降させ（レーン７と８）、一方抗Ｃγ血清はＴＣＲ
γだけを免疫沈降させた（レーン９）。結合鎖分離実験
のため（レーン７〜９）、ＣＨＡＰＳ可溶化ＩＤＰ２細
胞からの抗Ｌｅｕ４免疫沈降物は１％ＳＤＳにおいて沸
騰され、その後２％トリトンＸ−１００ ４容積で希釈
され、抗ＴＣＲδ１または抗Ｃγ血清で免疫沈降を行っ
た。このことは、前記手段に続く［ブレナー．エム．ビ
ー．等（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４５）］。 ６．１．３．ＴＣＲδポリペプチドのＮ−結合グリコシ
ル化 ^１２５ Ｉ標識ＩＤＰ２細胞を０．３％ＣＨＡＰＳに溶解
し、抗Ｌｅｕ４免疫沈降し、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥに
よって分解し（第３図）。対照レーンは模倣消化ＩＤＰ
２δＴＣＲポリペプチドである。δＴＣＲポリペプチド
のＮ−グリカナーゼ消化は次のように行なわれた：δＴ
ＣＲをゲルスライスから溶出させ、３７℃において１６
時間、０．１７％ＳＤＳ、１．２５％ノニデット（Ｎｏ
ｎｉｄｅｔ Ｐ−４０）、０．２Ｍリン酸ナリトウムバ
ッファーｐＨ８．６、３０μｌでＮ−グリカナーゼ（Ｇ
ｅｎｚｙｍｅ Ｃｒｏｐ．）消化を行なった。［タレン
チノ．エイ．エル．，等（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．
Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ ２４：４６６５）］。消化または模擬インキュベ
ートδＴＣＲサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析
し、オートラジオグラフィーで目視化された。 ６．１．４．ｍＡｂ抗ＴＣＲδ１によるｃＤＮＡクロー
ンＩＤＰ２０−２４０／３８のインビトロ翻訳生成物の
評価 ｐＧＥＭ３−０−２４０／３８と称するプラスミドは、
次のように構成され、そしてインビトロ転写−翻訳に使
用された（第４図）。ＩＤＰ２ ０−２４０／３８（δ
ＴＣＲ） ｃＤＮＡクローン１．５Ｋｂ挿入は、コンポ
ジットグループ０配列のコドン７以内から始まり、そし
て残留コード部および３´非翻訳部の大部分を含む。こ
の挿入物は、部分ＥｃｏＲＩ消化によって（内部Ｅｃｏ
ＲＩ部開裂を防止することで）λｇｔ１０アームから単
一ＥｃｏＲＩフラグメントとして開裂された。このフラ
グメントは、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐ
ｔ）＋ベクター（層遺伝子ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ヘサ
ブクローンされた。その後挿入物は、ベクターから、Ｔ
７プロモーターのｐＧＥＭ（プロメガ バイオテック）
下流へ方向性クローニングを促進する単一ＢａｍＨＩ−
ＳａｌＩフラグメント（末端はブルースクリプトベクタ
ーポリリンカーからのものである）として削除された。
生成ｐＧＥＭ３−０−２４０／３８プラスミドはＳａ１
Ｉで直線化され、そしてキャップトランスクリプトはＴ
７ＲＮＡポリメラーゼを使用して合成された［クランゲ
ル、エム．エス．等（Ｋｒａｎｇｅｌ．Ｍ．Ｓ．，ｅｔ
ａｌ．，１９８７ ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６
４）］。トランスクリプトの完全性および大きさは、
^３２Ｐ−ＡＴＰを含有するアリコートの反応混合物を介
してモニターされた。１．５Ｋｂの単一ＲＮＡ種が観察
された。^３５Ｓ−メチオニン存在下でインビトロ翻訳が
ラビット網状赤血球溶解産物で行なわれた。インビトロ
翻訳後、サンプルをジチオスレイトール２ｍｌを有する
１％ＳＤＳで沸騰させ、トリスバッファー生理食塩水ｐ
Ｈ７．５の２％トリトンＸ−１００ １０容積を加え
た。サンプルを対照ｍＡｂ Ｐ３（第５図レーン１と
３）または抗ＴＣＲδ１ ｍＡｂ（レーン２と４）で免
疫沈降させ、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、続いてフ
ルオログラフィーにかけた［ボナー、ダブリュ．ジェイ
とラスキー．アール．エイ（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｗ．Ｊ．ａ
ｎｄ ＬａｓｋｅｙＲ．Ａ．，１９７４，Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：８３−８８）］。 ６．２．実験結果 我々は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、δＴＣＲ不変
部と特異反応性を有する抗ＴＣＲδ１を作った。ＰＥＥ
Ｒ細胞系からのγδＴＣＲ−ＣＤ３複合体［バイス，エ
イ．，等（Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
６，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８３：６９９８−７００２；Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４）］は、抗体分泌ハイブリドーマ
細胞系産生のイムノゲン（免疫原）として使用された。
ハイブリドーマは、細胞表面結合（細胞フルオログラム
分析）およびＰＥＥＲ細胞タンパク質免疫沈降の両者に
よってスクリーンされ、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析さ
れた。２種のハイブリドーマ上澄（５Ａ６と４Ａ１）
は、ＰＥＥＲ細胞表面に結合する。サブクローン後、ｍ
Ａｂ（５Ａ６．Ｅ９）は、さらに特徴化された。このｍ
ＡｂはγδＴＣＲリンパ球（ＰＥＥＲ，ＩＤＰ２）表面
に結合するが、αβＴＣＲ細胞（ＨＰＢ−ＭＬＴ、ＪＵ
ＲＫＡＴ）または非Ｔ白血球（第１図、データは示され
ていない）と反応しなかった。イムノゲンはγδＴＣＲ
とＣＤ３の複合体からなるけれども、γδＴＣＲ細胞系
に対するｍＡｂのより大きな親和性は、ｍＡｂはＣＤ３
決定基に影響を与えないことを示唆した。ｍＡｂ特異性
は、レセプター複合体を含むタンパク質の会合に影響を
与える各種デタージェントを使用する免疫沈降研究にお
いて測定された。^１２５Ｉ標識ＩＤＰ２細胞をＣＨＡＰ
Ｓデタージェントに溶解後、ＴＣＲγとδおよびＣＤ３
γ、δと（サブユニットは、抗ＣＤ３抗体によって免疫
沈降した会合複合体部分に残る（第２図、レーン３と
４）。しかしながら、放射性標識ＩＤＰ２細胞が２％ト
リトンＸ−１００デタージェントに可溶化すると、γδ
ＴＣＲとＣＤ３は大部分が解離し、抗ＣＤ３ ｍＡｂを
使用すると、ＣＤ３を選択的に沈降した（第２図、レー
ン５）。後者の条件において、ｍＡｂ ５Ａ６．Ｅ９は
会合ＣＤ３なしでヘテロダイマーとしてγδＴＣＲを免
疫沈降した（第２図レーン６）。この観察は、ＴＣＲγ
とＴＣＲδは非ジスルフィド結合ヘテロダイマーとして
存在するという最初の直接的な証拠を提供した。ｍＡｂ
５Ａ６．Ｅ９がγＴＣＲ鎖、δ鎖または組合わせ決定
基と反応するかどうか決定するために、分離ポリペブチ
ド鎖免疫沈降が行なわれた。放射性標識ＣＨＡＰＳ可溶
化ＩＤＰ２細胞からの抗Ｌｅｕ４免疫沈降物を１％ＳＤ
Ｓ中で沸騰してγＴＣＲ，δＴＣＲおよびＣＤ３タンパ
ク質を解離させた。２％トリトンＸ−１００ ４容積で
希釈後、ｍＡｂ５Ａ６．Ｅ９は特異的に４０ＫＤ（δＴ
ＣＲ）種を免疫沈降した（第２図、レーン７）。１アリ
コートの同一免疫沈降物が還元条件下で分析されると
（第２図、レーン８）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動の劇的な
シフトが観察された。この現象は、ＩＤＰ２とＰＥＥＲ
細胞系からのδＴＣＲ特性である［ブレナー、エム．ビ
ー．，等（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２５：６８９−６９４）］。
反対に、分離鎖が抗Ｃγ血清と免疫沈降すると、５５Ｋ
Ｄ種（γＴＣＲ）は免疫沈降したか、４０ＫＤ種は免疫
沈降しなかった（第２図、レーン９）。これらのバイオ
ケミカルおよび表面結合研究に基づいて、ｍＡｂ ５Ａ
６．Ｅ９は抗ＴＣＲδ１として引用される。ＰＥＥＲと
ＩＤＰ２に加えて、抗ＴＣＲδ１は、モルト−１３（Ｍ
ＯＬＴ−１３）およびＰＢＬ系２を含む他のγδＴＣＲ
細胞系からＴＣＲδを免疫沈降した。次の実験では、抗
ＴＣＲδ１はＴＣＲδ不変（Ｃ）遺伝子セグメントによ
ってエンコードされた決定基と反応することが判る。我
々は、ＴＣＲδサブユニットをエンコードする遺伝子を
表示する消去的手段によってＩＤＰ２細胞系からｃＤＮ
Ａクローンを単離した。サザンブロット実験においてＩ
ＤＰ２グループ０ｃＤＮＡクローンがハイブリダイズす
る遺伝子は、発現され、γδＴＣＲリンパ球において転
位するが、αβＴＣＲ細胞において決して発現しない
（しはしば削除される）。他のＴＣＲ遺伝子との配列比
較によって、ｃＤＮＡクローンは新規Ｖ．Ｄ（？），Ｊ
およびＣ遺伝子セグメントからなるようだ。ＩＤＰ２グ
ループ０コンポジットＤＮＡ配列は、２つの潜在的アス
パラギン結合グリコシル化部位を有するポリペプチドお
よび分子量が３１．３キロダルトンであることを予想す
る長い読み取り枠を含む。非グリコシル化δＴＣＲタン
パク質分子量と成熟ＩＤＰ２ δＴＣＲポリペプチド上に存在するアスパラギン結合炭
水化物数を決定するために、ゲル精製δＴＣＲはＮ−グ
リカナーゼ処理かまたは模倣インキュベートされ、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析された（第３図）。Ｎ結合炭水化物を
除くと見掛け分子量が５ＫＤ減少し（４０ＫＤから３５
ＫＤ）、ＩＤＰ２ δＴＣＲ上に２種類の（２．５−３
ＫＤ）Ｎ結合グリカンが存在することを示唆する。この
ことは、第５図の翻訳アミン酸配列によって予想される
Ｎ結合グリカン類とより相関性を有する。タンパク質の
見掛け分子量は一般に一致し、３．７ＫＤと予想された
ものと異なる。ＩＤＰ２細胞上の抗ＴＣＲδ１の反応
性、δＴＣＲポリペプチドに対する特異性および部分変
性（ＳＤＳ沸騰）δＴＣＲ認識を与えて、我々はこのｍ
ＡｂがδＴＣＲｃＤＮＡクローンによってエンコードさ
れたポリペプチドを直接的に認識するか否か試験した。
このように、ｃＤＮＡクローンＩＤＰ２ ０−２４０／
３８からの挿入物はｐＧＥＭ−３発現ベクターのＴ７プ
ロモーター下流にサブクローンした（第４図）。その
後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼでインビボ生成したトラ
ンスクリプトは、ラビット網状赤血球溶解産物システム
に使用されて^３５Ｓ−メチオニン存在下においてタンパ
ク質の合成を導いた。インビトロ転写−翻訳後、反応混
合物を１％ＳＤＳ中で沸騰させ、２％トリトンＸ−１０
０ １０容積で希釈し、イソタイプ適合対照ｍＡｂかま
たは抗ＴＣＲδ１のいずれかで免疫沈降した。抗ＴＣＲ
δ１ ｍＡｂは主要な種類を特異的に免疫沈降した（３
４ＫＤ）（第５図レーン４）。対照ｍＡｂｓが使用され
た場合（レーン３）、ＲＮＡトランスクリプトが除かれ
た場合（レーン１と２）、またはγＴＣＲ構造が使用さ
れた場合に免疫沈降物中にかかるバンドが観察されなか
った。このように、ｍＡｂ抗ＴＣＲδ１によって免疫沈
降した放射性標識種は、該合成物がＩＤＰ２ ０−２４
０／３８ｃＤＮＡクローンによって特異的に誘導された
δポリペプチドに対応する。このポリペプチド（３４Ｋ
Ｄ）は、Ｎ−グリカナーゼ処理ＩＤＰ２δＴＣＲ鎖（３
５ＫＤ）と比較して大きさが極めて小さい。ＩＤＰ２
０−２４０／３８クローンは、リーダー配列と同様に天
然ＡＴＧ開始コドンを欠いている。このクローンのＶ部
内に２つの潜在的内部ＡＴＧコドン（１２および４４残
基において）がある（第５図）。これらの合成開始コド
ンを使用すると、注目すべき小種類を説明可能な１以上
のポリペプチド種を生ずる（第５図レーン４）。このよ
うに、クローンＩＤＰ２ ０−２４０／３８によってエ
ンコードされたＩＤＰ２δＴＣＲサブユニットのｍＡｂ
抗ＴＣＲδ１による直接血清評価がある。 ７．ＴＣＲデルタサブユニット可変部と特異的に反応す
るモノクローナル抗体δＴＣＡＲ−３の生成 ７．１．実験方法 ７．１．１．Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降およびＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 δＴＣＲ鎖可変部に特異反応性を有するδＴＣＡＲ−３
ｍＡｂは、次のように生成された。１匹のマウスに２
×１０７モルト−１３細胞を用いる腹腔内注射によって
免疫性を与えた。１ケ月後、マウスは１×１０^７モルト
−１３細胞を用いて３日間連続して日々静脈注射され、
そして免疫脾臓細胞は５０％ポリエチレングリコール１
５００の存在下でマウス ミエローマ Ｐ３×６３Ａｇ
８．６５３細胞と融合させられた。ハイブリドーマはＣ
Ｄ３共転形を流通血球計算法を用いる分析によってスク
リーンされた。ＣＤ３共転形の分析は、細胞がインキュ
ベートされた場合にα、βＴ細胞抗原レセプターに対す
る抗体がＣＤ３複合体内在化を起こすという観察に基づ
いていた［ラニール．エル．エル等（Ｌａｎｉｅｒ，
Ｌ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３７：２２８６；Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ
ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：７０
５）］。モルト−１３、ＰＥＥＲ、およびＨＰＢ−ＡＬ
Ｌ細胞系は、ラクトパーオキシダーゼ技術を使用してヨ
ード化された。^１２５Ｉ −βＦ１標識細胞は、１％ト
リトンＸ−１００含有トリスバッファー生理食塩水（ｐ
Ｈ８）に可溶化された。溶解産物はδＴＣＡＲ−３抗体
またはβＦ１抗体を用いて免疫沈降した。βＦ１はβＴ
ＣＲ鎖の基質モノクローナル抗体であり、他に記載され
ている［ブレナー．エム．ビー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３８：１５０２−１５０９）］。全サンプルは、
還元または非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析された
（第６図）。モルト−１３とＰＥＥＲは両方ともＣＤ３
^＋４⁻８⁻ＷＴ３１⁻である。ＨＰＢはＣＤ３^＋４^＋８
^＋ＷＴ３１^＋である。第６図に示されるように、δＴＣ
ＡＲ−３はモルト−１３およびＰＥＥＲ細胞から非ジス
ルフィド結合γおよびδ鎖を免疫沈降させ、一方βＦ１
はＨＰＢ−ＡＬＬ細胞からジスルフィド結合αおよびβ
鎖を免疫沈降させた。δとγ鎖に対応するバンド間のオ
ートラジオグラフ強度の相違は、これら二種のタンパク
質のヨード化の程度の相違を表わす。 ７．１．２δＴＣＡＲ−３抗体によるδＴＣＲ鎖の免疫
沈降 第７図は、１２５１−標識モルト−１３細胞が０．３％
ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロロアミドプロピル（ｃｈ
ｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ジメチルアンモニ］１−
プロパンスルホネート）含有トリスバッファー生理食塩
水（ｐＨ８）または１％トリトンＸ−１００に溶解した
ことを示す。１％トリトンＸ−１００において、γδＴ
ＣＲはＣＤ３複合体から解離し、一方０．３％ＣＨＡＰ
ＳにおいてγδＴＣＲはＣＤ３複合体と会合して残る。
免疫沈降前に、第７図レーン３，４および７で使用され
た^１２５Ｉ−標識溶解産物は、ＳＤＳを最終濃度１％ま
で加えて変性し、続いて６８℃で５分間加熱した。冷却
後、ヨードアセトアミドを最終的に２０ｍＭまで加え
た。混合物をトリスバッファー生理食塩水（ｐＨ８）の
１．５％トリトンＸ−１００ ４容積で希釈した。この
変性プロセスは、互いにγ鎖、δ鎖およびＣＤ３タンパ
ク質を完全に解離する。サンプルの全てを、還元条件
（Ｒ）であるレーン４のサンプルを除いて、非還元条件
（Ｎ）下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。還元条件および
非還元条件下におけるδ鎖の移動性の相違に注意すべき
である。抗Ｃγ抗血清は、ラビットにγ不変部からの２
０アミノ酸合成ペプチドで免疫性を与えることによって
得られた（残基１１７−１３６）。 ７．１．３．流通血球計算法による細胞表面染色分析 ５×１０^５細胞を適切な抗体［ＮＭＳ（正常マウス血
清） δＴＣＡＲ−３、ＯＫＴ−３、またはＷＴ３１］で４℃
において３０分間インキュベートし、ＰＢＳ（ｐＨ７．
４）中の０．２％ＢＳＡで２回洗浄した。フルオレセイ
ン共役ヤギ抗マウスＩｇＧを用いて４℃で３０分間イン
キュベートした後、細胞をオルソ シトフルオログラフ
分析した（第８図）。 ７．１．４．δＴＣＡＲ−３^＋とＯＫＴ３^＋末梢血液リ
ンパ球の二色シトフルオログラフ分析 最初に末梢血液リンパ球をδＴＣＡＲ−３を用いて４℃
において３０分間インキュベートした。洗浄後、細胞を
フィコエリトリン（ＰＥ）共役ヤギ抗マウスＩｇＧを用
いて４℃の温度でさらに３０分間インキュベートした。
洗浄後、細胞をフルオレセイン共役ＯＫＴ３を用いて４
℃の温度で３０分間インキュベートし、そして細胞をオ
ルソ シトフルオログラフ分析した（第９図）。 ７．１．５．細胞質内ｃａ^２＋濃度（［Ｃａ^２＋］ｉ）
の経時測定 モルト−１３細胞を、温度３７℃で３０分間、ＲＰＭＩ
１６４０に１０％ウシ胎児血清を加えたものに対して１
０^７細胞／ｍｌの濃度でＣａ^２＋感受性プローブ フラ
２のアセトキシメチル エステル型（ジメチル スルホ
キシド中の１ｍＭ株から２μＭ、分子プローブス（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州コーゲ
ン）でインキュベートした。その後、細胞を洗浄し、１
０^７細胞／ｍｌ濃度でハンクス平衡食塩溶液（ＨＢＳ
Ｓ）に５％ウシ胎児血清を加えたものに再懸濁させ、使
用するまで室温、暗所で保存した。ケイ光測定直前に、
２×１０^６細胞を遠心分離にかけ、新しいＨＢＳＳ２ｍ
ｌに再懸濁させ、３７℃の温度で石英キュベットに入
れ、一定に撹拌した。ＳＰＦ−５００Ｃフルオロメータ
中の細胞懸濁液についてケイ光を測定し（イリノイ州、
アバーナ ＳＬＭアミンコ）、３４０（±２）と３８０
（±２）ｎｍの間で変化する励起波長および放出を５１
０（±５）ｎｍで検出した。３５０／３８０の比率を自
動的に計算し（２秒ごとに１の比率）、プロットし、Ｉ
ＢＭ ＰＣ ＡＴに保存した。ケイ光の比率からの［Ｃ
ａ^２＋］ｉのカウンテーション（ｑｕａｎｔｉｔａｉｔ
ｏｎ）は、グリンキービクツ等（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃ
ｓ，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２６０：３４４０）の記載の如く実施した。関連の
ない抗体を加えると［Ｃａ^２＋］ｉを変化させなかった
が、細胞溶解は１μＭの［Ｃａ^２＋］ｉであった。 ７．２．結果 我々は、ＴＣＲδ鎖可変部に影響を与え、かつδポリペ
プチドを特徴づけるために使用し得るモノクローナル抗
体、δＴＣＡＲ−３を生成した。このモノクローナル抗
体はγδＴＣＲを生ずるＴ細胞と結合し、またモルト−
１３細胞に結合するとフラ２Ｃａ^２＋信号を引き出す。
δＴＣＡＲ−３モノクローナル抗体は、マウスにＣＤ３
^＋４⁻８⁻ＷＴ３１⁻フェノタイプを有するモルト−１
３細胞系を用いて免疫性を与えることによつ生成され
た。最初にハイブリドーマはＣＤ３共転形によってスク
リーンされた。さらに陽性クローンは免疫沈降によって
スクリーンされた。^１２５Ｉ標識モルト−１３およびＰ
ＥＥＲ溶解産物からのγδＴＣＲヘテロダイマーのδＴ
ＣＲ−３免疫沈降は、第６図に示される。δＴＣＡＲ−
３は、ＨＰＢ−ＡＬＬからいずれのポリペプチドをも免
疫沈降させない（第６図）。反対に、βＦ１、すなわち
β鎖に特異的な基質モノクローナル抗体［ブレナー、エ
ム．ビー．等（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０
２−１５０９）］は、ＨＰＢ細胞系からαβヘテロダイ
マーを免疫沈降させる（第６図．レーン１０と１２）。
モルト−１３とＰＥＥＲ細胞からの免疫沈降γδレセプ
ターは、還元または非還元条件のいずれかで分析された
場合に、それら二種の細胞系において非ジスルフィド結
合（連鎖）γδＴＣＲを示唆するヘテロダイマー構造を
示す。非還元条件で観察されたものに対して還元条件に
おいてδ鎖の移動度が若干シフトし（第６図、レーン１
と３、５と７）、ＩＤＰ２とＰＥＥＲ細胞系で以前に注
目された減少［ブレナー，エム．ビールネ等（Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２５：６８９−６９４）］は、鎖内ジスルフィ
ド連鎖の存在を示唆する。δＴＣＡＲ−３抗体がＣＤ３
会合γδＴＣＲを認識することを示すために、０．３％
ＣＨＡＰＳデタージェントに溶解した^１２５Ｉ標識モル
ト−１３細胞溶解産物を使用して免疫沈降が行なわれた
（第７図、レーン１）。これらの条件下に、ＣＤ３複合
体はレセプターと会合して残り、γδヘテロダイマーと
ＣＤ３複合体の両方はδＴＣＡＲ−３によって免疫沈降
する。しかしながら、^１２５Ｉ標識溶解産物がγδレセ
プターからのＣＤ３複合体と大きく解離する１％トリト
ンＸ−１００デタージェントに溶解させられると、γδ
ヘテロダイマーだけがδＴＣＡＲ−３によって免疫沈降
する（第７図、レーン２）。比較として、抗ＣＤ３抗
体、ＵＣＨＴ−１［ベバーリー、ピー．シとカラード．
アール．イー．，（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ
Ｃａｌｌａｒｄ，Ｒ．Ｅ．，１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：３２９−３３４）］は、ＣＤ３
複合体だけを免疫沈降させるが、γδヘテロダイマーは
免疫沈降させない（第７図、レーン５）。δＴＣＡＲ−
３の特異性は、γδＴＣＲとＣＤ３タンパク質が完全解
離した変性^１２５Ｉ標識モルト−１３溶解産物の免疫沈
降を使用して分析された。δＴＣＡＲ−３は、非還元条
件下で見掛け分子量３８ＫＤ（第７図、レーン３）、還
元条件下で４０ＫＤ（レーン４）のδ鎖を特異的に免疫
沈降させる。抗Ｃγ抗血清は、還元条件下で分子量４２
ＫＤのγ鎖を免疫沈降させた。これらのデータはδＴＣ
ＡＲ−３がδ鎖特異性であることを示す。δＴＣＡＲ−
３はＰＥＥＲとモルト−１３細胞系からγ、δＴＣＲヘ
テロダイマーを免疫沈降させるばかりでなく、これらの
細胞系表面およびＩＤＰ２クローンに結合する［ブレナ
ー、エム．，等（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２５：６８９−６９
４）］。αβＴＣＲ生成ＨＰＢ−ＡＬＬとＪｕｒｋａｔ
細胞系には結合しない（第８図）。反対に、ＷＴ３１
［タックス、ダブリュ．ジェイ．エム．，等（Ｔａｘ，
Ｗ．Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ
３０４：４４５−４４７）］、すなわちαβＴＣＲに
対する基質モノクローナル抗体は、αβＴＣＲ陽性ＨＰ
Ｂ−ＡＬＬとＪｕｒｋａｔ細胞系と反応するがγδＴＣ
Ｒ陽性モルト−１３、ＰＥＥＲおよびＩＤＰ２細胞（第
８図）とは反応しない。正常な末梢血液リンパ球（ＰＢ
Ｌ）が試験されると、ＣＤ３^＋リンパ球副母集団（０．
９−２．４％）はδＴＣＡＲ−３陽性であった（第９
図）。組織培養プレート上に固定されたδＴＣＡＲ−３
が正常ヒトＰＢＬ培養に使用された場合に、γδＴＣＲ
陽性副母集団増殖を選択的に刺激する。培養４５日後、
γδＴＣＲ副母集団は全細胞カウント９６％を示した。
αβＴ細胞抗原レセプターに対する抗体は、細胞質遊離
カルシウムイオン濃度［Ｃａ^２＋］ｉ高揚を刺激する
［バイス．エイ．，等（Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，ｅｔａ
ｌ．，１９８６，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
４：５９３）］。モルト−１３細胞のδＴＣＡＲ−３に
よるインキュベーションは、抗Ｔ３抗体によって誘導さ
れた応答に類似する［Ｃａ^２＋］ｉの急速増加を引き出
す（第１０図）。加えて、δＴＣＡＲ−３は前記の如
く、ＰＥＥＲ細胞およびＰＢＬから生成したγδＴＣＲ
陽性細胞系中のＣａ２＋フラックスを同様に刺激した。
また、我々は、モルト−１３、ＰＥＥＲ、よびＩＤＰ２
細胞とδＴＣＡＲ−３とのインキュベーションはＣＤ３
タンパク質複合体の共転形を生ぜしめることを観察し
た。ｍＡｂ δＴＣＡＲ−３のエピトープ特異性の他の
特徴（ｍＡｂ ＴＣＳδ１と称される）は、後述の１
１．２．２．節に示される。 ８．ヒトＴ細胞レセプターγδの３つのフォーム：選択的に健康な個体における１フォームの好適な用途
この実施例において、ＴＣＲδ鎖と非共有結合的に会合
した４０ＫＤ ＴＣＲγグリコタンパク質からなる新し
いフォームのヒトＴ細胞レセプターγδ（γδ ＴＣ
Ｒ）構造が示される。フォーム ２ｂｃと称する新しく
確認されたγＴＣＲグリコタンパク質は、前記非ジスル
フィド結合ＴＣＲγフォーム（フォーム ２ａｂｃ）と
比較して１５ＫＤも（５５ＫＤに対して４０ＫＤ）大き
さが相違する。この相違は、５ＫＤ少ないポリペプタド
主鎖（４０ＫＤに対する３５ＫＤ）および炭水化物量の
減少（１５ＫＤに対する５ＫＤ）に相当する。フォーム
２ｂｃ対応 ｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列分
析は、フォーム ２ｂｃ ｃＤＮＡクローンが他の非ジ
スルフィド結合ＴＣＲγサブユニット（フォーム ２ａ
ｂｃ）のｃＤＮＡ中に存在する不変部（ｃγ２）第２エ
キソンの１コピーを欠くことを明らかにした。このＣＩ
Ｉエキソンコピーは、メンブランスパン部と細胞外不変
ドメイン間の結合部部分をエンコードする。潜在的Ｎ結
合炭水化物付着部位の数及び偏在が両方の非ジスルフィ
ド結合フォームと同じであるので、我々は結合部が多分
タンパク質の立体配座を与えることによって付着炭水化
物量に影響を与えると結論づける。反対に、γδＴＣＲ
フォームのδＴＣＲサブユニットはペプチド主鎖の大き
さまたはペプチド地図分析における多様性をほとんど示
さない。また、我々は末梢血液中におけるγδＴＣＲ複
合体の３つのフォーム用途について調べた。ジスルフィ
ド結合フォーム（フォーム１）のほぼ排他的な用途は、
ある健康体において観察された。ある個体において、フ
ォーム１はフォーム ２ｂｃとともに発現された。フォ
ーム２ａｂｃは、試験検体には認められなかった。 ８．１．実験方法 ８．１．１．抗体 使用されたモノクローナル抗体は、抗Ｌｅｕ４（抗体Ｃ
Ｄ３）［レッドベター等（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：３１
０−３２３）］、βＦ１（抗βＴＣＲ）［ブレナー等
（Ｂｒｅｎｎｅｒｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍ
ｕｎｏｌ．１３８：１５０２−１５０９）、抗ＴＣＲδ
１（抗δＴＣＲ）（前記第６節参照のこと、δＴＣＲ鎖
不変部と反応性を有する）、Ｐ３（対照）［Ｐ３×６
３．Ａｇ８によって分泌された、コーラーとミルシュタ
イン（Ｋｏｅｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１
９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）］、
１８７．１（ラット 抗マウスｋライト鎖）［エールト
ン等（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｈｙｂ
ｒｉｄｏｍａ １：５−１１）］、およびＷＴ３１（菌
株αβＴＣＲリンパ球輝いて）［スピッツ等（Ｓｐｉｔ
ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３５：１９２２−１９２８）］であった。抗Ｃγｂペプ
チド血清（抗γＴＣＲ）は、２２アミノ酸合成ペプチド
に対して得られた。（Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ
−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−
Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｓ ｅｒ−
Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ）
（ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８８／００２０９、１９８
８年１月１４日公開）］。 ８．１．２．細胞系 ＰＥＥＲ［バイス等（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９
８６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８３：６９９８−７００２）］およびモルト１
３［ジェイ．ミノワタ、ロー等によった単離された、
Ｊ．Ｍｉｎｏｗａｄａ．Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７２）］はＴ白
血病性細胞系である。へその緒血液誘導クローンＷＭ−
１４［アラーコン等（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：３８６１−３８６５）、末梢血液誘
導細胞系ＩＤＰ２［ブレナー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４５−
１４９：ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ ８８／００２０９．
１９８８年１月１４日公開）］、およひ胸腺誘導クロー
ンＩＩ［バンク等（Ｂａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８
６，Ｎａｔｕｒｅ３２２：１７９−１８１）］は、前記
の如く培養された。末梢血液誘導細胞系２（ＰＢＬ−Ｌ
２）は、ｍＡｂ ＷＴ３１で染色しない末梢血液単離リ
ンパ球を選別することによって単離された。その後、単
離細胞は、ＩＬ−２と１０％（Ｖ／Ｖ）ヒト血清含有１
０％（Ｖ／Ｖ）条件培地を追加させたＲＰＭ１１６４０
培地においてインビトロで増殖させられ、放射性自己由
来支持細胞によって３週間ごとに刺激された。 ８．１．３．ヨード化と免疫沈降 ２×１０^７細胞をフ
ィコル−ジアトリゾエート（オルガノン テクニカ コ
ーポレーション）遠心分離によって単離し、ラクトパー
オキシターゼ１００μｇ（８０−１００ｕ／ｍｇ、シグ
マ）とＮａ ^１２５Ｉ ｍＣ_ｉ（ニュー イングランド
ニュークリアー）を加えた１ｍＭ Ｍｇｃｌ_２、５ｍ
Ｍグルコース含有リン酸バッファー生理食塩水ｐＨ７．
４（ＰＢＳ）０．５ｍｌの氷上でヨード化した。０．０
３％過酸化水素１０μｌを３０分間の反応時間中５分間
間隔で加えた。細胞を１ｍＭのフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ、シグマ）と８ｍＭのヨード
アセトアミド（ＩＡＡ、シグマ）含有ＴＢＳ（５０ｍＭ
トリス−ベース ｐＨ７．６、１４０ｍＭ Ｎａｃｌ）
を追加したデタージェントで一夜溶解させた。この実験
で使用される異なるデタージェントは、０．３％（Ｗ／
Ｖ）３−［（３−クロロアミドプロピル（Ｃｈｏｌａｍ
ｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ジメチルアンモニ）］１−プロパ
ンースルフホネート（ＣＨＡＰＳ、シグマ）、１％（Ｗ
／Ｖ）シギトニン（アルドリッヒ）およびトリトンＸ−
１００（ＴＸ−１００、シグマ）であった。１０．００
０×ｇで２０分間遠心分離にかけて不溶物質を除いた
後、デタージェント溶解産物を正常ラビット血清（ＮＲ
Ｓ）４μｌおよび１８７．１ハイブリドーマ培地４００
μｌを用いて３０分間インキュベートし予清浄し、続い
て１０％（Ｗ．Ｖ）細胞懸濁液である固定スタフィロコ
ッカス アウレアス カバンＩ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｓ ａｕｒｅｕｓ ＣｏＷａｎＩ）（パンソルビン
カルビオケム）２００μｌを加えた。１時間のインキ
ュベーション後パンソルビンを遠心分離して除去した。
βＦ１腹水０．２５μｌ、１ｍｇ／ｍｌ抗Ｌｅｕ ４
１μｌまたはＰ３腹水０．２５μｌを１８７．１培養上
澄１５０μｌとともに各サンプルに加えて特異沈降を実
施し、続いて１時間インキュベーションした。１０％
（Ｖ／Ｖ）タンパク質Ａ−セファロース（ファーマシ
ア）１００μｌを加え、４℃の温度で１時間振動させ
た。免疫沈降物はＴＢＳ含有０．１％（Ｖ／Ｖ）トリト
ンＸ−１００を用いて５回洗浄し、ナトリウム ドデシ
ル スルフェート−ポリアクリルアミド ゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）［ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ，１
９７０，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５）］分
析した。抗Ｃγｂペプチド血清を用いる免疫沈降用に、
ヨード細胞をＴＢＳ含有１％（Ｗ／Ｖ）ナトリウム ド
デシル スルフェート（ＳＤＳ）で可溶化させ、３分間
沸騰した。冷却後、ＰＭＳＦおよびＩＡＡを含有するＴ
ＢＳの２％（Ｖ／Ｖ）トリトンＸ−１００ ５容積を、
１ｍｇ／ｍｌデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）
と５０ｍＭ Ｍｇｃｌ_２中の０．５ｍｇ／ｍｌＲＮＡｓ
ｅの混合物２００μｌとともに加えた。予清浄及び免疫
沈降は、前記のこどく、１８７．１ｍＡｂを添加せずに
行なわれた。免疫沈降物は、０．５％（Ｖ／Ｖ）トリト
ンＸ−１００、０．５％（Ｗ／Ｖ）デオキシコーレート
（ＤＯＣ）、０．０５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ含有ＴＢＳ中
で洗浄した。 ８．１．４．バイオ合成標識 ４×１０^７の指数的に成長する細胞を、４ｍｌのメチオ
ニンおよび１０％透析ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および２
０ｍＭヘペスを加えたシステインを含まないＲＰＭＩ１
６４０（セレクト アミノ キット、ギブコ）に再懸濁
させた。３７℃の温度における３０分間の飢餓期間後、
^３５Ｓ−メチオニン１ｍＣｉと^３５Ｓ−システイン１ｍ
Ｃｉを加え、１５分間ラベリング（標識化）した。細胞
を収穫し、２％（Ｖ／Ｖ）トリトンＸ−１００、ＴＢＳ
に可溶化させた。前記の如く予清浄及び免疫沈降を行な
った。免疫沈降物を０．５％（Ｖ／Ｖ）トリトンＸ−１
００、０．５％（Ｗ／Ｖ）デオキシコリック酸、０．０
５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、ＴＢＳで４回洗浄し、続いて、
０．５％（Ｖ／Ｖ）トリトンＸ−１００、０．５ＭＮａ
ｃｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ トリス、ｐＨ７．
６で３回洗浄した。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
し、標準的なフルオログラフィー手段によって目視化し
た［ボナーとラスキー（Ｂｏｎｎｅｒ ａｎｄ Ｌａｓ
ｋｅｙ，１９７４，Ｅ ｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４
６：８３−８８）］。 ８．１．５．δＴＣＲタンパク質のゲル精製 表面ヨード化細胞を０．３％（Ｗ／Ｖ）ＣＨＡＰＳ−Ｔ
ＢＳに溶解し、抗Ｌｅｕ４共役セファロースビーズ５０
μｌを用いて免疫沈降させた。免疫沈降種を非還元条件
下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し、ウエットゲルを
４℃の温度において２４時間ＸＡＲ−５フィルム（コダ
ック）に暴露して放射性標識δＴＣＲタンパク質を目視
化した。δＴＣＲに対応するゲル部を除去し、サンプル
バッファー含有５％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノー
ル中でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって２
回目の分解を行なった。還元すると特性ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ移動性シフトのため、δＴＣＲタンパク質は分離さ
れ、不純物から精製された。ＴＣＲタンパク質は、０．
０５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ、５０ｍＭ炭酸水素アンモニウ
ムバッファー中で３７℃の温度において１夜インキュベ
ートしてゲルスライスから除き、凍結乾燥した。 ８．１．６．エンドグリコシダーゼ消化 エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）消化用に、免
疫沈降物質またはゲル精製タンパク質を、０．１４Ｍ
２−メルカブトエタノール含有１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ溶
液４０μｌ中で３分間沸騰した。冷却後、混合物をＰＭ
ＳＦ１ｍＭ含有０．１５Ｍアセテート バッフアー、ｐ
Ｈ５．５、３６０μｌで希釈した。Ｅｎｄｏ Ｈ ５μ
ｌ （１Ｕ／ｍｌ−Ｅｎｄｏ−β−Ｎ−アセチルグルコ
サミニダーゼ Ｈ、ゲンザイム）を温度３７℃で１４時
間上記溶液の半分でインキュベートし、残りの半分を模
倣処理した。Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ＧＬＹ）消化用
に、ゲル精製物を３５μｌの０．５％（Ｗ／Ｖ）ＳＤ
Ｓ、０．１０Ｍ ２−メルカブトエタノール中で３分間
沸騰させた。その後、１００μｌの０．２Ｍ リン酸ナ
トリウム（ｐＨ８．６）、１．２５％（Ｖ／Ｖ）トリト
ンＸ−１００を加えた。混合物の半分をＮ−グリカナー
ゼ（２５０Ｕ／ｍｌ、ペプチド−Ｎ−［Ｎ−アセチル−
β−グリコサミニル］アスパラギン、アミダーゼ：ゲン
ザイム）１μｌを用いてインキュベートし、３７℃の温
度においてさらに１６時間インキュベートし、一方、残
りの半分を模倣処理した。消化後、ウシ血清アルブミン
１０μｇをキャリアーとして加え、トリクロロ酢酸沈降
によってサンプルを回収した。タンパク質ペレットは５
％（Ｖ／Ｖ）２−メルカプトエタノール含有サンプルバ
ッファーに取り込まれた。 ８．１．７．モノクローナル抗体抗Ｃγｍ１産生 ＨＰＢ−ＭＬＴ ｐＴγ−１のＣγＣＩとＣＩＩエキソ
ンの一部は、ヌクレオチド位置５７１と８４８において
ＢａｍＨＩとＰｓｔＩを使用して単離され［タイアリナ
ス等（Ｄｉａｌｙｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
３：２６１９−２６２３）］、そして発現ベクターｐＲ
ＩＴ２Ｔ（ファーマシア）ヘクローンされた。生成プロ
テインＡ融合タンパク質は、エ．コリ （Ｅ．Ｃｏｌ
ｉ）Ｎ４８３０で発現した。細菌をリゾチームを用いて
溶解し、融合タンパク質をＩｇＧセファロースカラムを
用いる精製によって単離した。０、７および２８日にフ
ロイントアジュバント中の融合タンパク質１００μｇを
マウスの腹腔内に注射した。２８日後ＰＢＳ中の融合タ
ンパク質１００μを静脈注射した。３日後、脾臓細胞を
単離し、ブレナー等の如くハイブリドーマＰ３×６３Ａ
ｇ８．６５３と融合した（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３８：１５０
２−１５０９）。ハイブリドーマをエリザ法（ＥＬＩＳ
Ａ，ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ａｂ
ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を用いてスクリーンし
た。９６ウエル平底プレート（リンブロ、フローラボラ
トリーズ）をＰＢＳ中の融合タンパク質または非融合タ
ンパク質０．４μｇを用いて１夜インキュベートした。
２３℃の温度において５０％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳ含有ＰＢ
Ｓ中の正常ラビットＩｇＧ（シグマ）０．２５ｍｇ／ｍ
ｌを用いて非特異結合部位を被覆した。ハイブリドーマ
上澄５０μｌを４℃で１時間かけて加え、続いて５μｇ
／ｍｌのパーオキシダーゼ共役抗マウスＩｇＧ（カペ
ル）５０μｌ中で同様にインキュベートした。記載のイ
ンキュベーションの全てに１０％（Ｖ／Ｖ）ＦＣＳ、
０．１％（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ、ＰＢＳを使用する洗浄ステ
ップによって変化を与えた。リン酸クエン酸塩バッファ
ーを含有する０．０１２％（Ｗ／Ｖ）過酸化水素中の
０．０８％（Ｗ／Ｖ）０−フェニレンジアミン（シグ
マ）ｐＨ５．０を用いてエリザを展開した。抗Ｃγｍ１
（ＩｇＧ_１）はシトフルオログラフ分析において天然γ
δＴＣＲ／ＣＤ３複合体を認識せず、また免疫沈降にお
いてトリトンＸ−１００溶解細胞からγδＴＣＲヘテロ
ダイマーを認識しないけれども、ＣＤ３／γδＴＣＲタ
ンパク質を個々の鎖へ分離後、バイオ合成標識γＴＣＲ
前駆体および成熟γＴＣＲタンパク質を認識する。この
方法において、抗ＣＤ３免疫沈降物をＴＢＳの１％（Ｗ
／Ｖ）ＳＤＳ中で沸騰することによってＣＤ３／γδＴ
ＣＲ複合体を個々の鎖へ分離した後、抗Ｃγｍ１はγＴ
ＣＲタンパク質を認識することが判った。 ８．１．８．モルト−１３γＴＣＲ ｃＤＮＡクローン
の単離および配列化 ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを尿素／リチウム クロライド沈降
によってモルト−１３細胞から調製し、続いてオリゴ
（ｄＴ）セルロース アフィニティ クロマトグラフ分
析を行なった。λｇｔ１０ ｃＤＮＡライブラリーをヘ
アーピン ループ開裂用マング ビーン（Ｍｕｎｇ Ｂ
ｅａｎ）ヌクレアーゼ［マカットチャム等（ＭｃＣｕｔ
ｃｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９８４．Ｓｃｉｅｎｃｅ
２２５：６２６−６２８）］を用いるヒューン等の方法
（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，１９８５ ＤＮＡ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ，Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｄ．ＩＲＬ Ｐ
ｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｉ：４９−７８）によってポ
リ（Ａ）^＋ＲＮＡから調製した。ｃＤＮＡライブラリー
をエー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ｃ６００Ｈｆｌ上に展
開し、^３２ｐ−標識ＰＴγＩを用いるプラーク フィル
ター ハイブリダイゼーション法によってスクリーンし
た［ダイアリナス等（Ｄｉａｌｙｎａｓ ｅｔａｌ．，
１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ ８３：２６１９−２６２３）］。陽性クロ
ーンを大きさおよび制限酵素地図用に分析し、ｃＤＮＡ
クローンＭ１３Ｋを配列用に選別した。Ｍ１３Ｋ ｃＤ
ＮＡを、エンドヌクレアーゼＥｃｏ ＲＩを用いてλｇ
ｔ１０ファージから誘出し、さらに適切な制限酵素で消
化した。フラグメントをＭ１３ベクターヘサブクローン
し、修飾Ｔ７ポリメラーゼ［セクエナーゼ、ユナイテッ
ド ステーツ バイオケミカル コーポレーテッド］を
使用するチェインターミネーター法（ｄｉｄｅｏｘｙ
ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｌｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）
によっ配列化した。クローンＭ１３Ｋは、５´未翻訳部
の３５ヌクレオチドおよび３´非コード部の７２ヌクレ
オチドを含有する枠内の全長γＴＣＲトランスクリプト
に対応する（第１４図）。Ｖ部のヌクレオチド配列は、
推定信号配列におけるヌクレオチド５３のＣからＴ（Ｉ
ｌｅからＶａｌ）の変化を除いて、ゲノムＶγ１．３配
列と同じである［用語法 レフランク等（Ｌｅｆｒａｎ
ｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６ａ，Ｃｅｌｌ ４５：２３
７−２４６：Ｓｔｒａｕｓｓｅｔ ａｌ．，１９８７．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１２７１−１２１９）］。Ｊ
部はＪγ２．３配列と同一である［レフランク等に基づ
く用語法（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６
ｂ，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：４２０−４２２：Ｑｕｅｒ
ｔｅｒｍｏｕｓｅｔ ａｌ，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１３８：２６８７−２６９０）］。驚くべきこと
に、８ヌクレオチドは、ゲノムＶまたはＪ配列によって
エンコードされず、かつ、恐らくＮ部を表わすＶ−Ｊ結
合において表われる。Ｃ部配列は、ヌクレオチド５５９
（ＧからＣ：ＶａｌからＩｌｅ）およびヌクレオチド９
０８（ＴからＣ；ＭｅｔからＴｈｒ）を除いて対応ゲノ
ム配列と一致する［レフランク等（Ｌｅｆｒｎａｃ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８６ｃ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３．９５９６−９６０
０）］。 ８．２．結果 ８．２．１．新規γδＴＣＲタンパク質複合体 末梢血液γδＴＣＲリンパ球の予備実験において、既知
のヒトγδＴＣＲフォームと異なるＣＤ３会合複合体が
存在することが示された。このフォームを叙述する試み
において、我々は正常ヒト ドナーから誘導された多く
の細胞系を生産し、かつ特徴づけた。末梢血液リンパ球
をモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＷＴ３１で染色した。
それは活動していないαβＴＣＲリンパ球を明らかに染
色するものである。染色しない細胞は細胞分類によって
単離され、培地含有ＩＬ−２中でインビトロで増殖させ
られた。この方法で得られた末梢血液リンパ球系２（Ｐ
ＢＬ−Ｌ２）は、均質にＣＤ３^＋ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻、γ
δＴＣＲリンパ球の細胞表面表現型特性であることが証
明された。ＰＢＬ−Ｌ２細胞上のγδ複合体を目視化す
るために、ＣＨＡＰＳまたはジギトニン溶解細胞表面
^１２５Ｉ標識細胞から抗ＣＤ３ｍＡｂを用いて免疫沈降
法を実施した。これらのデタージェント中において、Ｃ
Ｄ３複合体とγδＴＣＲサブユニット間に物理的会合が
保持された。ＰＢＬ−Ｌ２細胞からの抗ＣＤ３免疫沈降
物のＳＤＳ−ＰＡＧＥは、抗Ｃγｂ血清（γＴＣＲ不変
部ペプチドに対して誘導された抗血清）によってγＴＣ
Ｒサブユニットとして同定される４０ＫＤおよび４４Ｋ
Ｄタンパク質（４０ＫＤと引用する）を分解した（第１
１Ａ図、方法の節を参照のこと）。ＰＢＬ−Ｌ２上のこ
れらのγＴＣＲタンパク質は非共有結合的にδＴＣＲサ
ブユニットと会合しており、非還元条件下で分析された
抗ＣＤ３免疫沈降物中に弱いヨード化タンパク質として
目視される。（第１１Ａ図。レーン６、黒ぬり矢印）。
この弱いヨード化タンパク質は、抗Ｃγｂ血清によって
認識されないので、ＰＢＬ−Ｌ２細胞上のδＴＣＲサブ
ユニットを表わす（第１１Ａ図。レーン８）。加えて、
ＩＤＰ２またはＰＥＥＲ細胞上のδＴＣＲタンパク質で
注目したように（下記、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８８／
００２０９、１９８８年１月１４日公開）、非還元およ
び還元条件下における同じＳＤＳ移動シフト比較分析を
示す。δＴＣＲタンパク質は、移動性の４０ＫＤ（下
記）と移動し、そして類似形状のγＴＣＲタンパク質
（白ぬき矢印）によって見えなくさせられるので、還元
後見えないのであろう（第１１Ａ図。レーン３）。γδ
ＴＣＲフォームは、正常末梢血液Ｔリンパ球上に存在す
るばかりでなく、胸腺誘導クローンＩＩ細胞（第１１Ｄ
図）およびＴ白血病性細胞系モルト−１３（第１１Ｅ
図）上にも観察される。これら三種類の細胞は、ＰＢＬ
−Ｌ２（４０ＫＤと４４ＫＤ：第１１Ａ図、レーン８）
およびクローンＩＩ細胞（４０ＫＤと４４ＫＤ：第１１
Ｄ図、レーン８）上で観察されたγＴＣＲタンパク質ダ
ブレットまたはモルト−１３細胞上で観察された拡散性
標識γＴＣＲタンパク質バンド（４０〜４４ＫＤ：第１
１Ｅ図、レーン６）を生ずる特異的なグリコシル化を示
すγＴＣＲ種を有する。モルト−１３γＴＣＲタンパク
質バンドを二次元ゲル分析［ＳＤＳ−ＰＡＧＥに続く非
平衡ｐＨグラジェント電気泳動（ＮＥＰＨＧＥ）］する
と、４４ＫＤγＴＣＲ種が４０ＫＤ種に比較して付加高
マンノース（またはハイブリッド）Ｎ−結合グリカンを
含有する二種類の平衡γＴＣＲ種（４０ＫＤと４４Ｋ
Ｄ）に分解する。このように、３種類の異なる細胞源
（末梢血液、胸腺、および白血病）から単離されたレセ
プター複合体のγＴＣＲサブユニットは、δＴＣＲパー
トナー鎖と非共有結合的に会合した４０ＫＤの細胞表面
種を示した。ＰＢＬ−Ｌ２、クローンＩＩおよびモルト
−１３細胞上のγδＴＣＲフォームを比較するために、
ＩＤＰ２およびＷＭ−１４細胞系上の既知のフォームに
ついて調べた。ＩＤＰ２細胞系（ＰＣＴ国際公開番号Ｗ
Ｏ８８／００２０９、１９８８年１月１４日拡開、Ｂｒ
ｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３
２２；１４５−１４９）は、より大きな５５−６０ＫＤ
γＴＣＲタンパク質（５５ＫＤと引用する）を含有す
るが、それは抗Ｃγｂ血清によって認識される（第１１
Ｂ図）。抗ＣＤ３免疫沈降物が非還元条件で調べられる
と、ＩＤＰ２γＴＣＲタンパク質がδＴＣＲパートナー
鎖と非共有結合的に会合することが明らかである（第１
１Ｂ図、レーン４、黒ぬり矢印）。還元すると、δＴＣ
Ｒタンパク質は相対分子塊４０ＫＤに対してＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ移動度減少を示す（第１１Ｂ図、レーン４、黒ぬ
り矢印と第１１Ｂ図、レーン２、白ぬき矢印を比較のこ
と）。非共有結合的会合γδＴＣＲフォームに対して、
末梢血液誘導Ｔ細胞クローン、ＷＭ−１４は、７０ＫＤ
のジスルフィド結合ＴＣＲダイマーを生成し（第１１Ｃ
図、レーン７）、それは抗Ｃγ血清によって認識された
［アラルコン等（ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．
Ｓ．Ａ．８４：３８６１−３８６５）］。このタイマー
は、抗ＴＣＲδ１（δＴＣＲサブユニットに対して誘導
されたｍＡｂ）（第１１Ｃ図、レーン５）によっても認
識され、それ故にγδＴＣＲヘテロダイマーを表わす。
還元条件下で分析すると、３６ＫＤ，４０ＫＤおよび４
３ＫＤの３種類のγＴＣＲタンパク質を表わした（４０
ＫＤと引用する）。このように、ＰＢＬ−Ｌ２、クロー
ンＩＩおよびモルト−１３細胞上のＣＤ３会合複合体
は、ＴＣＲγサブユニットが４０ＫＤ（ＷＭ−１４細胞
上のジスルフィド結合Ｃγ１エンコードγＴＣＲタンパ
ク質の大きさに類似する）であるが、それはそのパート
ナー鎖（ＩＤＰ２細胞上の５５ＫＤＣγ２エンコードγ
ＴＣＲタンパク質に類似する）にジスルフィド結合しな
いので、既知フォームと比較して新規γδＴＣＲヘテロ
ダイマーを構成する。この複合体分子の基礎を理解する
ために、そのγＴＣＲとδＴＣＲサブユニットのより詳
細な構造分析は実施例としてモルト−１３細胞系を使用
して下記の如く行なわれた。 ８．２．２．モルト−１３γＴＣＲサブユニットのコア
ポリペプチドの大きさ モルト−１３細胞（４０ＫＤ γＴＣＲグリコタンパク
質）のγＴＣＲコアポリペプチドの大きさを決定し、か
つＰＥＥＲ細胞（５５ＫＤ γＴＣＲグリコタンパク
質）と比較するため、両細胞系を^３５Ｓ−メチオンおよ
びＳ−システインの存在下で１５分間バイオ合成的に標
識化し、トリトンＸ−１００に溶解し、その後抗Ｃγｍ
１（γＴＣＲ鎖を特異的に認識するモノクローナル抗
体）（１３Ａ図、方法を参照のこと）を用いて免疫沈降
させた。その後免疫沈降物質をエンドグリコシダーゼＨ
（Ｅｎｄｏ Ｈ）消化し、未熟Ｎ結合グリカンを除い
た。モルト−１３ γＴＣＲポリペプチド主鎖は３５Ｋ
Ｄの相対分子塊を有し（第１３Ａ図、レーン８）、それ
はＰＥＥＲ γＴＣＲ コアポリペプチド（４０ＫＤ：
第１３Ａ図、レーン４）またはＩＤＰ２ γＴＣＲコア
ポリペプチド（４０ＫＤ、国際公開番号 ＷＯ８８／０
０２０９、１９８８年１月１４日公開、参照のこと）よ
りも５ＫＤ小さい。モルト−１３細胞は、５ＫＤ小さい
ということに基づいてＩＤＰ２およびＰＥＥＲ γＴＣ
Ｒコア ポリペプチドから区別し得るγＴＣＲコア ポ
リペプチドを発現すると結論づけられる。加えて、成熟
モルト−１３γＴＣＲ細胞表面グリコタンパク質上の５
−１１ＫＤの大きさは翻訳後のプロセスによって説明さ
れ（４０−４６ＫＤ表面大きさから３５ＫＤコアの大き
さを引く）、一方、１５−２０ＫＤの相対分子塊はＰＥ
ＥＲとＩＤＰ２ γＴＣＲグリコタンパク質上の翻訳後
のプロセスによって説明し得る（５５−６０ＫＤ表面大
きさから４０ＫＤコアの大きさを引く）。翻訳後プロセ
ス（突起）がＮ結合グリカンであり、かつ、各グリカン
鎖が約３ＫＤの相対分子塊に相当すると仮定すると、２
−３のＮ結合グリカンがモルト−１３γＴＣＲタンパク
質に付着し、一方、５のＮ結合グリカンがＰＥＥＲおよ
びＩＤＰ２細胞上のポリペプチドに加わると予想され
る。Ｎ−グリカーゼを用いて細胞表面γＴＣＲタンパク
質からＮ−結合炭水化物を除く実験では、コアペプチド
に加えられる主要翻訳後プロセス（突起）が事実Ｎ−結
合グリカンであることが示される。 ８．２．３．モルト−１３γＴＣＲの主要配列 モルト−１３ γＴＣＲサブユニットをエンコードする
不変部遺伝子セグメントの構造を理解するために、モル
ト−１３ γＴＣＲトランスクリプトを表示するｃＤＮ
Ａクローン配列が測定された。モルト−１３誘導ポリＡ
^＋ＲＮＡからのλｇｔ１０ライブラリーが構成され、ヒ
トγＴＣＲ ｃＤＮＡクローン、ｐＴγ−１でプローブ
された［ダイアリナス等（Ｄｉａｌｙｎａｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：２６１９−２３）］。大きさお
よび限られた制限酵素地図に基づいて、１クローン、Ｍ
１３Ｋ、が選択され、そのヌクレオチド配列が決定され
た（第１４図）。クローンＭ１３Ｋは、Ｊγ２．３遺伝
子セグメントに結合したＶγ１．３遺伝子セグメントを
使用する全長、枠内γＴＣＲトランスクリプトを表わす
［レフランク等（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９
８６．Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６；Ｌｅｆｒａｎ
ｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：
４２０−４２２；ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｂａｓｅ
ｄ ｏｎ Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１２１７−１２１９；Ｑｕｅ
ｒｔｅｒｍｏｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１３８：２６８７−２６９０）］。不変部
配列は、最近報告された非機能γＴＣＲ［ペリシー等
（Ｐｅｌｌｉｃｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２８７：１０５１−１０５５）］および２種類
のＣＩＩエキソン コピーｂとｃ含有Ｃγ２ゲノム配列
［レフランク等（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９
８５．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８３：９５９６−９６００）］とほぼ同一であ
ることが見い出された（詳細に説明された方法を参照の
こと）。このこのとは、二種類のＣＩＩエキソン コピ
ーを有するＣγ２遺伝子セグメントを利用する細胞表面
上に発現したγＴＣＲタンパク質をエンコードする最初
の枠内トランスクリプトを表わす。このｃＤＮＡクロー
ンの推定アミノ酸配列は、前記バイオケミカルデータと
よく一致する３４．８ＫＤのポリペプチト主鎖の大きさ
を予測する。驚くべきことに、６の潜在的Ｎ−結合炭水
化物付着部位がこのトランスクリプトによってエンコー
ドされる。バイオケミカルデータでは２−３のＮ結合グ
リカンがポリペプチド鎖に付着することが示唆されるの
で、潜在的部位の全てが使用されることがないことを示
す。Ｃγ遺伝子セグメントの用途を示すために我々は、
かかるジスルフィド結合γＴＣＲ鎖がＣγ１遺伝子セグ
メントを利用するので、ＰＢＬ−Ｃ１およびＷＭ−１４
によって“フォーム１”として発現されるジスルフィド
結合γδＴＣＲフォームを支持した［グランゲル等（ｋ
ｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３７：６４−６７）］。ＩＤＰ２およびＰＥＥＲ
細胞上に発現したγδＴＣＲフォームの大きな（５５Ｋ
Ｄ）非ジスルフィド結合γＴＣＲサブユニットは、３種
類のＣＩＩエキソンコピー、すなわちコピーａ、コピー
ｂおよびコピーＣを含有するＣγ２遺伝子セグメントに
よってエンコードされ［クランゲル等（Ｋｒａｎｇｅｌ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：６
４−６７：Ｌｉｔｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，
Ｎａｔｕｒｅ ３２６：８５−８８）］、それ故このγ
δＴＣＲフォームは、ここで“フォーム ２ａｂｃ”と
称される。同様に、モルト−１３細胞上で特徴づけられ
たフォームは“フォーム ２ｂｃ”として引用される。 ８．２．４．好適なＣγ遺伝子セグメントの用途 新たに単離された末梢血液中に三種類のγδＴＣＲフォ
ームが存在することを測定するために、１０の健康体か
らの単核細胞をｍＡｂ抗ＴＣＲδ１（第６節、δＴＣＲ
不変部と反応性を有する）を用いるバイオケミカル分析
を使用して分析した。この抗体は、例えγ、δＴＣＲリ
ンパ球の全てではないとしても大部分と反応する。この
区切り（ｐａｎｅｌ）からの典型的な結果は第１５図に
示される。サブジェクト（Ｓｕｂｊｅｃｔ１）におい
て、抗ＴＣＲδ１免疫沈降物（非還元条件下で分析され
た）は、ジスルフィド結合γ、δＴＣＲ複合体を７０Ｋ
Ｄタンパク質バンド（フォーム１）として、非ジスルフ
ィド結合γ、δＴＣＲ複合体を幅広い４０ＫＤタンパク
質バンド（フォーム２ｂｃ）として示す（第１５図、レ
ーン２）。このことは、Ｃγ１およびＣγ２不変部の両
方が個々の発現γ、δＴＣＲにより使用されることを示
す。しかしながら、フォーム２ｂｃ量は個体中で変化し
た。両個体中の４０ＫＤバンド強度を比較することによ
ってサブジェクト１と比較してサブジェクト２のフォー
ム２ｂｃのより小さなフラクションに注目すべきである
（サブジェクト２のレーン２とサブジェクト１のレーン
２とを比較すること）。より厳密には、ジスルフィド結
合γ、δＴＣＲ複合体は、オートラジオグラフを長期暴
露した後であっても、検査した１０の個体のなかで３の
単核細胞上で検出された（サブジェクト３を参照のこ
と）。分析された個体のいずれも末梢血液中に５５ＫＤ
非ジスルフィド結合γ、δＴＣＲ複合体（フォーム２ａ
ｂｃ）を示さなかった。 ８．２．５．δＴＣＲサブユニットの特性付け γＴＣＲタンパク質の大きさおよびグリコシル化に関す
る大きな構造上の相違に対して、異なる細胞源からのδ
ＴＣＲサブユニットは、著しく類似することが明らかで
ある。モルト−１３細胞上のδＴＣＲグリコタンパク質
の相対分子塊は、抗δＴＣＲ ｍＡｂを使用し（第１２
図、レーン４）、大きさがＩＤＰ２細胞上のδＴＣＲグ
リコタンパク質に類似することを確認することにより、
直接的に４０ＫＤであること測定された（第１１Ｂ図、
レーン２、白ぬき矢印）。同様に、δＴＣＲポリペプチ
ド主鎖の大きさを比較するために、モルト−１３細胞か
らの細胞表面^１２５Ｉ標識δＴＣＲタンパク質をＮ−グ
リカナーゼ消化して［高マンノース、ハイブリッドおよ
び複合体タイプ ：タレンチノ等（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂｉｏｃｈｅｍ，２４：４
６６５−４６７１；ＩＩｉｒａｉ ｅｔａｌ．，１９８
７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６２：４８５−４９
２ ）］、アスパラギン結合グリカンを削除した。モル
ト−１３細胞のδＴＣＲコアポリペプチドは３５ＫＤ相
対分子塊を有し（第１３Ｂ図、レーン４）、それはＩＤ
Ｐ２細胞のδＴＣＲ主鎖に類似する（３５ＫＤ） ［バ
ンド等（Ｂａｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３８：６８２−６８４）］。加えて、細胞表
面^１２５Ｉ標識モルト−１３δＴＣＲタンパク質をエン
ドグリコシダーゼＨで消化すると［Ｅｎｄｏ Ｈ．高マ
ンノースとある種のハイブリッドＮ−グリカンのみを除
く；タレンチノ等（Ｔａｒｅｎｅｔｉｎｏ ｅｔ ａ
ｌ．，１９７４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：８
１１−８１７；Ｔｒｉｍｂｌｅ ａｎｄ Ｍａｌｅｙ，
１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１４１：５１４
−５２２）］、１炭水化物成分と一致する２．５ＫＤ相
対分子塊の減少を生じ（第１３Ｂ図、レーン２）、ポリ
ペプチドに付着したＥｎｄｏ Ｈ耐性炭水化物の２．５
ＫＤ相対分子塊を取り除いた。δＴＣＲ不変ドメインに
二種の潜在的Ｎ−グリカン付着部位が存在するので［ハ
タ等（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２：Ｌｏｈ ｅｔａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７
２）］、これらのデータは両方が使用されるが、Ｎ−グ
リカンは異なって加工される、すなわち１つは高マンノ
ースＮ−グリカン（Ｅｎｄｏ Ｈ感受性）、その他は複
合体Ｎ−グリカン（Ｅｎｄｏ Ｈ耐性、しかしＮ−グリ
カナーゼ感受性）であることを示す。γＴＣＲポリペプ
チド鎖上の付着Ｎ−結合炭水化物の異なる量に対して、
ＰＥＥＲ、ＩＤＰ２およびモルト−１３細胞上に発現し
たδＴＣＲサブユニットは同一ペプチドコアサイズおよ
び二種のＮ−結合グリカンの存在を示す（第１３Ｂ図、
データは示されない）。 ８．３．検討 この実施例において、ヒトγＴＣＲグリコタンパク質の
３種のタンパク質フォーム、すなわちジスルフィド結合
４０ＫＤγＴＣＲタンパク質（フォーム１）、非ジスル
フィド結合５５ＫＤγＴＣＲタンパク質（フォーム２ａ
ｂｃ）および非ジスルフィド結合４０ＫＤγＴＣＲタン
パク質（フォーム２ｂｃ）が比較される。３種類のフォ
ームの全てはδＴＣＲサブユニットと結合していること
が知られている。最初の２つのγＴＣＲフォームを表す
相補的ＤＮＡ配列は、報告されている［クランゲル等
（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３７：６４−６７；Ｌｉｔｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２６：８５−８
８）］。γＴＣＲポリペプチドフォーム１（ＰＢＬ−Ｃ
１上）の不変部は単ＣＩＩエキソン含有Ｃγ１遺伝子セ
グメントによってエンコードされ、一方γＴＣＲポリペ
プチド フォーム２ａｂｃ（ＩＤＰ２およびＰＥＥＲ細
胞上）はＣＩＩエキソンコピーａ、コピーｂおよびコピ
ーｃを含有するＣγ２遺伝子セグメントを利用する。フ
ォーム２ｂｃのγＴＣＲ鎖対応ｃＤＮＡ配列は、２種の
ＣＩＩエキソンコピー、即ちコピーｂとコピーｃを利用
するＣγ２遺伝子セグメントを含むことが示された。同
様に、クローンＩＩおびＰＢＬ−Ｌ２のγＴＣＲ結合部
遺伝子構造（非ジスルフィド結合、４０ＫＤγＴＣＲタ
ンパク質）がここで決定されたモルト−１３構造、即ち
フォーム２ｂｃに類似する。使用されたδＴＣＲ不変部
がこれらのフォームの全てに対して同じであるので［ハ
タ等（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２； Ｌｏｈ．Ｅ．
Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３
０：５６９−５７２）］、男性における３種類のγδＴ
ＣＲフォーム構造の完全な比較がなしえる（第１６
図）。２種類のＣγ２多形ゲノムフォームは男性に存在
する［レフランク等（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，
Ｎａｔｕｒｅ ３１９：４２０−４２２； Ｐｅｌｌｉ
ｃｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
７：１０５１−１０５５）］。２種類のトランスクリプ
トフォーム（フォーム ２ａｂｃとフォーム２ｂｃ）
は、多分これらの異なる対立タイプの生成物である。今
まで、γＴＣＲポリペプチドの対立フォームがマウスで
は発見されていなかった。我々は、フォーム２ａｂｃ
（５５ＫＤ）とフォーム２ｂｃ（４０ＫＤ）間のγＴＣ
Ｒ細胞表面タンパク質の大きさの劇的な相違は付着Ｎ結
合炭水化物量、最も好ましくはＮ結合グリカン量を示す
ことによって主に決定されると結論づける。ＩＤＰ２γ
ＴＣＲ（フォーム２ａｂｃ）およびモルト−１３γＴＣ
Ｒ（フォーム２ｂｃ）の主鎖の大きさは、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥに基づいてそれぞれ４０ＫＤおよび３５ＫＤである
と測定され、その値はｃＤＮＡ配列に基づいて計算され
たそれぞれの予想分子塊３６．６ＫＤおよび３５．８Ｋ
Ｄと十分に相関性を有する。主鎖の小さな相違（ＳＤＳ
−ＰＡＧＥで５ＫＤ）が１６アミノ酸のＩＣＩＩキソン
コードペプチドによつ主に説明され、それに寄与する
が、５５ＫＤおよび４０ＫＤの非ジスルフィド結合γＴ
ＣＲ表面フォームの分子塊の観察された相違を全て説明
することはできない。フォーム２ａｂｃ７γＴＣＲポリ
ペプチドは多分すべてが使用される５つの潜在的Ｎ結合
グリカン付着部位を有するが、これに対してモルト−１
３γＴＣＲポリペプチドは、２−３のＮ−結合グリカン
を運搬するけれども、１つの付加的な潜在的付着部位を
生ずる。潜在的付着部位のこの制限的使用に対する理由
は明らかではないが、γＴＣＲタンパク質立体配座に関
するＣＩＩエキソンエンコードペプチドの影響から生ず
るだろう。ＣＩＩエキソンエンコードペプチドおよびそ
の隣接アミノ酸はプラズマメンブランと免疫グロブリン
用不変部間の結合部を作る。この部分は大部分のＮ結合
グリカン付着部位を含む（第１７図）。我々は、ＣＩＩ
エキソンコピーが、ポリペプチド主鎖の大きさの決定、
ジスルフィド結合鎖生成能ばかりでなく付着炭水化物量
に影響を与えることによって、タンパク質のフォームを
決定すると結論づける。ＩＤＰ２［ハタ等（Ｈａｔａ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６
７８−６８２）］、ＰＥＥＲ［ロー等（Ｌｏｈ ｅｔ
ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５
７２）］およびモルト−１３細胞のδＴＣＲ相補的ＤＮ
Ａは配列化され、可変および不変部遺伝子セグメントの
間を占める多様性／Ｎ部を除いて、同一であることが見
い出された。ＷＭ−１４細胞上のδＴＣＲタンパク質は
４３ＫＤの相対分子塊を有し、これは前記δＴＣＲタン
パク質に類似する［ボースト等（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５ ：６８３−６
８８：Ｌａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１６５．１０７６−１０９４）］が他の
δＴＣＲ鎖よりも３ＫＤ大きい。これらの４３ＫＤδＴ
ＣＲタンパク質は異なるδ不変ドメインにおいて付加的
なＮ−結合グリコシル部位の存在を示す。γＴＣＲ不変
部セグメントに関して記載したものに比較しうる構造上
の相違はαＴＣＲおよびβＴＣＲ遺伝子に対して観察さ
れなかった［ヨシカイ等（Ｙｏｓｈｉｋａｉ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１６：８３７−８４
０；Ｔｏｙｏｎａｇａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
２：８６２４−８６２８；Ｒｏｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，
１９８４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６０：９４７−９５
３；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９８５，
Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６４７−６５３）］。ネズミＣ
γ部の長さを有するヒトＣＩＩエキソン繰り返し数とほ
ぼ構造上の類似性があり、そのＣγ１、Ｃγ２およびＣ
γ４不変部はそれぞれ１３、１０および３３アミノ酸結
合部をエンコードする［ガーマン等（Ｇａｒｍａｎｅｔ
ａｌ．，１９８６．Ｃｅｌｌ ４５：７３３−７４
２：Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１２０３−１２１２）］。し
かしながら、マウスの結合部は対応エキソンの大きさの
相違を示すが、ヒトのフォーム２ａｂｃ−γＴＣＲおよ
びフォーム２ｂｃγＴＣＲで見られるように、エキソン
の多用途を決して示さない。同様に、ネズミのγＴＣＲ
は、二種類の非ジスルフィド結合ヒトフォームに対して
ジスルフィド結合フォームにだけ存在する。重要なこと
は、ヒトγ、δＴＣＲフォームと同一には使用されない
ことである。ある個体（高い割合でγ、δＴＣリンパ球
に対して選択されたものである）において、単一フォー
ム（フォーム１）が優性であり、このフォームに対して
正の選択が生ずるかまたは他のγ、δＴＣＲフォームに
対する選択が存在するかどうか示唆される。 ９．別個の形質転換γＴＣＲ鎖を単−δＴＣＲ サブユニットを用いて対合することによって再構成され
た３種類のＴ細胞レセプターγ、δイソタイプフォーム
この実施例で記載されるように、γδヘテロダイマー
形成におけるγδＴＣＲポリペプチドの役割が調べられ
た。我々は、３種類のγδＴＣＲフォーム（フォーム
１、２ａｂｃおよび２ｂｃ）に対応するγＴＣＲ鎖の会
合によって形成したγδＴＣＲ複合体を単一固有δ鎖を
用いて形質転換することよって調べた。γＴＣＲポリペ
プチドのフォーム１かまたはフォーム２ａｂｃのいずれ
かをエンコードするγＴＣＲはモルト−１３細胞系へ形
質転換され、これはδＴＣＲポリペプチドと非共有結合
的に会合したフォーム２ｂｃから成るγδヘテロダイマ
ーを構造上発現する。形質転換細胞は、モルト−１３細
胞系のγδＴＣＲ特性とともに、δＴＣＲと非共有結合
的に会合したフォーム２ａｂｃγＴＣＲかまたはδＴＣ
Ｒと共有結合的に結合したフォーム１γＴＣＲから成る
γδヘテロダイマーを発現可能であった。その上、形質
転換γＴＣＲ遺伝子生成物のグリコシル化は、それらの
天然細胞系における遺伝子のグリコシル化と同じであっ
た。このように、グリコシル化度およびジスルフィド結
合能は、γＴＣＲ遺伝子によって決定された特性であ
る。γＴＣＲ不変部ＣＩＩエキソンの用途は、ＴＣＲγ
およびδポリペプチド間のジスルフィド結合の有無ばか
りでなく、γＴＣＲ鎖に付着した炭水化物量を決定し、
細胞表面γＴＣＲタンパク質の大きさの差に強く影響を
与える。 ９．１．原料及び方法 ９．１．１．細胞系 モルト−１３、ＴＣＲγδ^＋Ｔ白血病性細胞系［ハタ等
（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ ２３８：６７８−６８２：Ｌｏｈ，Ｅ．Ｙ．，
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６
９−５７２）］、および末梢血液誘導ＴＣＲγδ^＋細胞
系ＰＢＬ Ｃ１［ブレナー等（ＢｒｅｎｎｅｒＭ．
Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２
５：６８９−６９４）］およびＩＤＰ２［ブレナー等
（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２２：１４５−１４９）］は前記の如く培養さ
れた。 ９．１．２．抗体 使用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）
は次のようであった：抗ｌｅｕ−４（抗ヒトＣＤ３：Ｉ
ｇＧ１） ［レッドベター等（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ，
Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１５３：３１０−３２３）］、抗ＴＣＲδ１（抗ヒ
トＴＣＲδ鎖不変部：ＩｇＧ１）［第６節のバンド等を
参照のこと（Ｂａｎｄ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６８２−６８４）］、抗
Ｔｉ−γＡ（抗Ｖγ２；ＩｇＧ２ａ）［ジツカワ等（Ｊ
ｉｔｓｕｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１１９２−１１９７）、
抗−Ｃγ１（抗ヒトγＴＣＲ不変部：第８．１．７節参
照のこと）、Ｐ３（Ｐ３×６３Ａｇ８ミエローマによっ
て分泌されたＩｇＧ１） ［コーラーとミルシュタイン
（ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，
Ｃ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９
７）］、および１８７．１（ラット抗マウスｋ軽い鎖特
異性）［エルトン等（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ
ａｌ．，１９８１，ハイブリドーマ１：５−１１）］。 ９．１．３．モルト−１３δＴＣＲ ｃＤＮＡクローン
の単離および配列 ベクターλｇｔ１０中のモルト−１
３ポリＡ＋ＲＮＡから誘導された相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）ライブラリー［ヒューン等（Ｈｕｙｎｈ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５．ｉｎ ＤＡＮ ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅ
ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ．Ｏ
ｘｆｏｒｄ），ｖｏｌｕｍｅ ｌ，ｐｐ４９−７８）］
は、^３２ｐ標識ヒトδＴＣＲ ｃＤＮＡクローンＩＤ
Ｐ２ ０−２４０／３８を用いるハイブリダイゼーショ
ンによってスクリーンされた［ハタ等（Ｈａｔａ ｅｔ
ａｌ．，１９８７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８
−６８２）］。クローンは、大きさ及び限られた制限酵
素地図に基づいて詳細な分析用に選択された。核酸配列
は、修飾Ｔ７ポリメラーゼを用いるチェインターミネー
ター法［サンガー等（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．７４：５４６３−５４６７）］を使用してＭ１
３ベクター中で決定された［セクエナセ、ユナイテッド
ステーツ バイオケモカル コーポレーテッド）［ポ
ッター等（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
１：７１６１−７１６５）］ 。 ９．１．４．発現プラスミドおよび形質転換体の構成 γＴＣＲ ｃＤＮＡ（ＰＢＬ Ｃ１．１５とＩＤＰ２．
１１ｒ） ［クランゲル等（Ｋｒａｎｇｅｌ，Ｍ．
Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３
７：６４−６７）］は、第１０Ｂ図に示されるように、
ｐＦｎｅｏ哺乳動物発現ベクター［サイド等（Ｓａｉｔ
ｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：１２５ −１３０；ｏｈａｓｈｉ，Ｐ．，ｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１６：６０６−６
０９）］へ、フリード（Ｆｒｉｅｄ）ＳＦＦＶ（Ｓｐｌ
ｅｅｎ ｆｏｃｕｓ ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ）長
末端繰り返し（ＬＴＲ）下流へクローンさせられた。プ
ラスミド構成物をエレクトロポーレーション（ｅｌｅｃ
ｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）によってモルト−１３細胞へ
トランスフェクトした［ポッター等（Ｐｏｔｔｅｒ，
Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８１：７１７６−７１６５）］。形
質転換細胞を選択し、２ｍｇ／ｍｌのＧ４１８含有培地
（バイオアッセイによれば４８０μｇ／ｍｌの固形分。
ＧＩＢＣＯ）に保存し、希釈を制限してクローンした。 ９．１．５．ヨード化および免疫沈降 ラクトパーオキシダーゼを使用する^１２５Ｉとの細胞表
面ラベリング、３−［（３−コルアミドブロピル（ｃｈ
ｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））ジメチルアンモニ
オ）］１−プロパンスルホネートへの溶解（ＣＨＡＰ
Ｓ：シグマ ケミカルコーポレーテッド ミズーリー州
セントルイス）、各種抗体を使用する免疫沈降、非平衡
ｐＨグラジェントゲル電気泳動法（ＮＥＰＨＧＥ）およ
びＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）が行なわれた［第８．１．３．節参照のこ
と。ブレナー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６．Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４５−１４
９：Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ３２５：６８９−６９４）］。特異免
疫沈降は、１８７．１培養上澄１５０μｌとともに抗ｌ
ｅｕ−４ １μｇ、抗ＴＣＲδ１腹水０．１μｌまたは
Ｐ３腹水１μｌを用いて行なわれた。抗Ｔ９−γＡに対
しては、１８７．１なしで腹水１μｌが使われた。 ９．１．６．バイオ合成標識化 指数関数的に成長する細胞をメオチニンおよびシステイ
ンを含まない培地で３０分間インキュベートし、続いて
３７℃の温度において^３５Ｓ−メチオニンおよび^３５−
システインを用いて１５分間パルス標識化を行ない、そ
して前記第８．１．３節に記載の如く免疫沈降を行なっ
た。免疫沈降物をエンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏ
Ｈ）処理するかまたは模倣インキュベートし、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって分離し、フルオログラフィーによって
目視化した［ボナーとラスキー（Ｂｏｎｎｅｒ Ｗ．
Ｍ．ａｎｄ Ｌａｓｋｅｙ，Ｒ．Ａ．１９７４，Ｅｕ
ｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：８３−８８）］。 ９．２．結果 我々は、各種γＴＣＲイソタイプ間の構造上の相違を決
定する際にγＴＣＲ遺伝子、特にＴＣＲ ＣＩＩエキソ
ンの役割を示すために構造上明らかなγＴＣＲ遺伝子生
成物と単一δＴＣＲタンパク質との会合から生ずる生成
物を調べた。この目的のため、モルト−１３、すなわち
４０ＫＤ非ジスルフィド結合γＴＣＲポリペプチド（フ
ォーム２ｂｃ）を発現するＴ白血病性細胞系は、レセプ
ターの他のフォームに対応するγＴＣＲ鎖ｃＤＡＮクロ
ーン用受容体として使用された（フォーム１と２ａｂ
ｃ）。これらのγＴＣＲ鎖を示すｃＤＮＡクローンの完
全な配列は、第１４図（フォーム２ｂｃ）およびクラン
ゲル等（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）（フォーム１と２
ａｂｃ）に示され、第１８Ａ図に図示されている。 ９．２．１．単一機能δＴＣＲ鎖はモルト−１３細胞系
に存在する モルト−１３細胞系のδＴＣＲ遺伝子転位を研究すると
［ハタ等（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）］、単機能
δＴＣＲ遺伝子生成物だけがこの細胞系において発現さ
れることが示唆された。しかしながら、δＴＣＲに対す
る単一機能トランスクリプトがモルト−１３細胞内で作
られたことを直接的に示すために、δＴＣＲ ｃＤＮＡ
プローブとのｃＤＮＡクローン交差ハイブリッド［ハタ
等（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）］はλｇｔ１０中
で調製されたモルト−１３ライブラリーから単離され、
選択ｃＤＮＡクローン配列が決定された。この分析は、
モルト−１３細胞が機能的に転位したものおよびδＴＣ
Ｒ遺伝子を突然変異的に転位したものに対応するトラン
スクリプトを発現することを示した。機能的に転位した
δＴＣＲ遺伝子に対応するｃＤＮＡクローンは、ＩＤＰ
２細胞系に対して前記したと同じＶ（Ｖδ１）Ｊ（Ｊδ
１）とＣ遺伝子セグメントを有する［ハタ等（Ｈａｔ
ａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｓｃｊｅｎｃｅ
２３８：６７８−６８２）］。しかしながら、モルト−
１３δＴＣＲ ｃＤＮＡクローンは、Ｖ−ＤおよびＤ−
Ｊ結合部におけるＤセグメントの利用（モルト−１３は
恐らくＤδ２だけを使用する）、不正確な結合、および
Ｎ部多様性より生ずるＶおよびＪ遺伝子セグメント間の
明らかな核酸配列を有する［ハタ等（Ｈａｔａ，Ｓ．，
ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１
５４１−１５４４）］。モルト−１３δＴＣＲ ｃＤＮ
Ａは、同様に、Ｃγ１遺伝子セグメントを利用するγＴ
ＣＲ遺伝子生成物へのジスルフィド結合を有効とする不
変遺伝子セグメントのメンブラン基部コネクター部にお
ける、システイン残基を予測する。モルト−１３細胞系
が非ジスルフィド結合γ、δＴＣＲレセプターを発現す
るけれども、δＴＣＲ鎖のメンブラン基部コネクター部
におけるシステイン残基の存在は、δＴＣＲサブユニッ
トが非ジスルフィド結合かまたはジスルフィド結合複合
体のいずれかに関与できる可能性を明らかに残す。 ９．２．２．γＴＣＲ遺伝子生成物はレセプターのフォ
ームを決定する γＴＣＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトされたモルト−
１３細胞は、（ＰＢＬＣ１誘導γＴＣＲ ｃＤＮＡでト
ランスフェントされたモルト−１３細胞に対して）Ｍ１
３．ＰＢＬ Ｃ１γと、そして（ＩＤＰ２誘導γＴＣＲ
ｃＤＮＡでトランスフェクトされたモルト−１３細胞
に対して）Ｍ１３． ＩＤＰ２γと略称する。バルクト
ランスフェクタント細胞系及びこれらの系から誘導され
た典型的なサブクローンは、γＴＣＲ（ＶＪＣ）または
Ｖγ２−特異ｃＤＮＡプローブを用いるノザンブロット
分析法によって分析された。固有１．６Ｋｂモルト−１
３γＴＣＲトランスクリプトに加えて、約１．８Ｋｂの
第２γＴＣＲトランスクリプト（発現プラスミドのＳＦ
ＦＶ ＬＴＲにおいて開始するγＴＣＲトランスクリプ
トに対して期待された大きさ）は、トランスフェクタン
ト及びそれらのクローン中で観察された。Ｖγ１．３を
用いて交差ハイブリダイズされないＶγ２で特異的にハ
イブリダイズされた１．８Ｋｂのトランスクリプトは、
固有モルト−１３γＴＣＲトランスクリプト中に現わ
れ、このように１．８Ｋｂトランスクリプトはトランス
フェクトγＴＣＲ ｃＤＮＡのトランスクリプトを表わ
す（Ｖγ２セグメントを利用する）。トランスフェクタ
ント表面上で発現されたγＴＣＲタンパク質をバイオ化
学的に特徴づけるために、各系から誘導された典型的な
クローンは、Ｐ３（対照）、抗ｌｅｕ−４（抗ＣＤ
３）、抗ＴＣＲδ１（抗δＴＣＲ）または抗Ｔｉ−γＡ
ｍＡｂを用いる表面ヨード化細胞免疫沈降によって分析
された。抗Ｔｉ−γＡ［ジツカワ等（Ｊｉｔｓｕｋａｗ
ａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６６：１１９２−１１９７）］は、γＴＣＲ鎖可
変部としてＶγ２遺伝子セグメントを利用するγ、δＴ
ＣＲ細胞を特異的に認識するようだ。トランスフェクト
モルト−１３細胞（第１９Ｂ図および第１９ｃ図）と
同様に非トランスフェクト モルト−１３細胞（第１９
Ａ図）は期待された親γＴＣＲ（４０ＫＤ；白ぬき矢印
参照のこと）およびδＴＣＲサブユニットを発現する
（アスタリスク参照のこと）。抗Ｖγ２−特異ｍＡｂ
（抗Ｔｉ−γＡ）が固有モルト−１３γＴＣＲ鎖と反応
しないことに注意すべきである（第１９Ａ図．レーン７
と８）。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γトランスフェクタント
細胞の抗ＣＤ３免疫沈降は、非還元条件下で試験された
場合に、さらにＣＤ３会合種（６８ＫＤ）を示した（第
１９Ｂ図．レーン３、黒ぬり矢印参照のこと）。ＰＢＬ
Ｃ１細胞（第１９Ｄ図．レーン３と４）およひＭ１
３．ＰＢＬ Ｃ１γトランスフェクタント細胞系（１９
Ｂ図．レーン３と４）の両方に関して、還元すると６８
ＫＤ複合体は４０および３６ＫＤ種を産生した（Ｍ１
３．ＰＢＬ Ｃ１γトランスフェクタントの場合に、こ
れらのバンドは抗Ｖγ２免疫沈降において明らかに目視
化される。第１９Ｂ図．レーン７と８、黒ぬり矢印を参
照のこと）。これらの４０おび３６ＫＤ種は、異種のグ
リコシル化γＴＣＲポリペプチドを示す［ブレナー等
（Ｂｒｅｎｎｅｒ Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９４）］。これ
らの免疫沈降において、δＴＣＲ鎖（４０ＫＤ推定）は
４０ＫＤγＴＣＲポリペプチドとともに移動し、それ故
に見えない（しかしながら、下記参照のこと）。重要な
ことはこれらの実験は、モルト−１３細胞系の固有δＴ
ＣＲ鎖は通常非ジスルフィド結合複合体の一部であり、
ＰＢＬ Ｃ１ γＴＣＲタンパク質と会合してトランス
フェクタント細胞系中でジスルフィド結合γ、δＴＣＲ
ヘテロタイマーを形成する。反対に、Ｍ１３． ＩＤＰ
２トランスフェクタント細胞系におけるＩＤＰ２誘導γ
ＴＣＲタンパク質（５５ＫＤ）は、固有モルト−１３δ
ＴＣＲ鎖を使用して非ジスルフィド結合複合体を形成し
た（第１９Ｃ図、レーン３と４）。抗ＴＣＲδ１ ｍＡ
ｂを用いて実施された免疫沈降は（δＴＣＲペプチドに
特異性を有する）、これらの細胞系の全てからのトラン
スフェクトγＴＣＲ鎖（第１９Ｂ図と１９Ｃ図、レーン
５と６）と同様にエンドゲノス（内因性）のものが直接
的にδＴＣＲ鎖と会合することを立証した。抗Ｔｉ−γ
Ａは、Ｍ１３．ＰＢＬＣ１トランスフェクタント細胞か
ら６８ＫＤジスルフィド結合γ、δＴＣＲヘテロダイマ
ー（第１９Ｂ図、レーン７と８）をＭ１３．ＥＤＰ２γ
トランスフェクタント細胞から４０ＫＤδＴＣＲ鎖とと
もに５５ＫＤ−γＴＣＲ鎖（第１９Ｃ図、レーン７と
８）を特異的に免疫沈降し、これらの複合体の一部であ
るγＴＣＲがそれぞれトランスフェクタントされたＰＢ
ＬＣＩおよびＩＤＰ２誘導γＴＣＲ ｃＤＮＡに対応す
ることを示す。さらに各種γＴＣＲタンパク質を特徴づ
けるために、表面^１２５Ｉ標識細胞のバイオ化学的二次
元（２Ｄ）ゲル分析（ＮＥＰＨＧＥに続くＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）を行なった。ＣＤ・３成分の位置に関する固有
（モルト−１３）およびトランスフェクトした（ＰＢＬ
Ｃ１またはＩＤＰ２）γＴＣＲ鎖の２Ｄパターンの重
ね合せは、関係するγＴＣＲ種の比較を行なわせた。モ
ルト−１３細胞の免疫沈降物において、γＴＣＲ種の比
較を行なわせた。モルト−１３細胞からの免疫沈降物に
おいて、γＴＣＲ鎖はヨード化種の２つの離散性平行種
として分解した（第２０Ａ図、白ぬき矢印参照のこ
と）。ＰＢＬ Ｃ１またはＩＤＰ２ ＴＣＲ ｃＤＮＡ
でトランスフェクトされたモルト−１３細胞は、固有モ
ルト−１３γＴＣＲポリペプチドシリーズを示すが、加
えて、２Ｄゲルパターンにおいて、それぞれＰＢＬ Ｃ
１（第２０Ｂ図およびＤ図を比較のこと、第２０Ｂ図の
アスタリスクを参照のこと）またはＩＤＰ２（第２０Ｃ
図およびＤ図を比較のこと、第２０Ｃ図の黒ぬり矢印を
参照のと）細胞のγＴＣＲポリペプチドと一致する放射
性種を示した。このように、２Ｄゲルバイオケミカル分
析では、トランスフェクタントされたγＴＣＲ鎖が発現
され、モルト−１３トランスフェクトおよび親細胞系Ｐ
ＢＬＣＩとＩＤＰ２において同様に処理されることが認
められた。 ９．２．３．トランスフェクトされたγＴＣＲ鎖タンパ
ク質のポリペプチド主鎖の大きさ トランスフェクトされたγＴＣＲ鎖のペプチド主鎖の大
きさは、代謝的にパルス標識化された細胞から免疫沈降
した物質のエンドグリコシダーゼＨ処理によって決定さ
れた。抗ＣγＭ１（γＴＣＲ鎖に特異性を有する）を用
いる免疫沈降では、内因性モルト−１３γＴＣＲポリペ
プチドを表わす非トランスフェクト モルト−１３細胞
（第２１図、レーン４）中で３５．５および３４ＫＤが
同定された。これらの２種類のポリペプチドの小さなも
の（白ぬき矢印を参照のこと）はモルト−１３γＴＣＲ
ポリペプチドの期待ポリペプチドコアの大きさに対応
し、一方、より大きなポリペプチドは部分処理中間体を
表わす。これらの固有モルト−１３γＴＣＲポリペプチ
ドに加えて、４１ＫＤのデグリコシル化の大きさを有す
るポリペプチドはＭ１３， ＩＤＰ２γトランスフェク
タントからの抗ＣγＭ１を用いて免疫沈降された（第２
１図、レーン８、黒ぬり矢印を参照のこと）。トランス
フェクタント特異γＴＣＲポリペプチドの大きさは、前
にＩＤＰ２細胞で決定したデグリコシル化ＩＤＰ２γＴ
ＣＲポリペプチドコアの大きさによく一致する［ブレナ
ー等（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ｎａｔｕｒｅ３２５：６８９−６９４）］。期待
されたように、Ｍ１３，ＰＢＬ Ｃ１γトランスフェク
タント細胞は、前にＰＢＬ Ｃ１細胞系に対して報告さ
れたγＴＣＲポリペプチド主鎖にの大きさに十分に匹敵
する、３２ＫＤのデグリコシル化の大きさ（第２１図、
レーン１２、黒ぬり矢印参照のこと）を有する付加的な
γＴＣＲタンパク質を示す［ブレナー等（Ｂｒｅｎｎｅ
ｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２５：６８９−６９４）］。この３２ＫＤ種は、Ｖ
γ２特異ｍＡｂ、抗Ｔｉ−γＡ（第２１図、レーン１
３、黒ぬり矢印参照のこと）によって特異的に免疫沈降
させられるので、この細胞系における固有およびトラン
スフェトクされたγＴＣＲ種を明らかに指定する。この
ように、ＩＤＰ２およびＰＢＬ Ｃ１細胞系から誘導さ
れたトランスフェクトされたγＴＣＲ鎖の決定した主鎖
の大きさは、それらの親細胞系中のこられのポリペプチ
ド主鎖の大きさに合致する。γＴＣＲポリペプチドコア
の大きさと細胞表面タンパク質とを比較することによっ
て、我々は、モルト−１３、ＩＤＰ２およびＰＢＬ Ｃ
１誘導γＴＣＲ鎖がそれぞれ６、１４、および８ＫＤ
Ｎ結合炭水化物を運搬すると結論づける。 ９．３．検討 ヒトγδＴＣＲサブユニット構造における３種類のバイ
オケミカル的に明白なフォームが生ずる。今日の研究に
おいて、我々は、単一δＴＣＲポリペプチドが３種類の
レセプターフォームの各々を表わすγＴＣＲ鎖と会合し
て適切なγ、δＴＣＲヘテロダイマーを再構成すること
を示す。モルト−１３（フォーム ２ｂｃ）の固有γＴ
ＣＲポリペプチドは４０ＫＤであり、δＴＣＲサブユニ
ットと非共有結合的に会合する。ＰＢＬ Ｃ１のジスル
フィド結合レセプター（フォーム１）またはＩＤＰ２細
胞系の非ジスルフィド結合レセプター（フォーム２ａｂ
ｃ）に対応するγＴＣＲ ｃＤＮＡクローンがモルト−
１３細胞系へトランスフェクトした場合、ｃＤＮＡドナ
ー細胞系中に見いだされたそれらに対応するγδＴＣＲ
フオームが再構成された。今のトランスフェクションに
関する研究においてジスルフィド結合がγＴＣＲ不変セ
グメント用途によって指示されることが直接的に示され
る。その理由は、固有モルト−１３δＴＣＲ鎖がＰＢＬ
Ｃ１誘導γＴＣＲ鎖とともにジスルフィド結合レセプ
ター複合体（フォーム１）に参加し、ＩＤＰ２誘導γＴ
ＣＲ鎖とともに非ジスルフィド結合レセプター複合体
（フォーム ２ａｂｃ）に参加することが認められるか
らである。我々は、５５ＫＤ（フォーム２ａｂｃ）およ
び４０ＫＤ（フォーム２ｂｃ）非ジスルフィド結合γＴ
ＣＲポリペプチド間の大きさの顕著な相違が、主にγＴ
ＣＲポリペプチド主鎖に付着したＮ結合炭水化物量の相
違によることを示した（前記第８．２．２．節参照のこ
と）。このように、Ｎ結合グリカンアクセプター部位の
同数（各々５）がこれらのフォームの両方において使用
された不変部遺伝子セグメントによってエンコードされ
るけれども、Ｎ−結合炭水化物の１５ＫＤ（ＩＤＰ２ま
たはＰＥＥＲ上のフォーム２ａｂｃ）かまたは５ＫＤ
（モルト−１３上のフォーム２ｂｃ）はγＴＣＲポリペ
プチドに付着する。４個のＮ結合グリコシル化部位は、
ＣＩＩキソンエンコードコネクター部およびその周辺に
存在する。ここにおける実施例において、我々は、トラ
ンスフェクトしたγＴＣＲタンパク質に付着したＮ結合
炭水化物の量が、トランスフェクトしたγＴＣＲ ｃＤ
ＮＡクローンタンパク質生成物のペプチドコアの大きさ
および成熟細胞表面との大きさの比較に基づいて、それ
らの親細胞系に見られるものと一致することを示す。こ
のように、２種類のＣγ２エンコードタンパク質セグメ
ント立体配置はグリコシル化において劇的に相違する結
果と違う。これら２種類のフォームのＣγセグメント間
の主要な相違は、ＣＩＩエキソンのコピー“ａ”がフォ
ーム２ａｂｃの５５ＫＤγＴＣＲ鎖に存在し、フォーム
２ｂｃの４０ＫＤγＴＣＲ鎖に存在しないことにある。
このように、ＣＩＩエキソンコピーが存在するか否か
は、γＴＣＲポリペプチドの大きさを説明するグリコシ
ル化の相違に大きく関与する。ヒトγδＴＣＲイソタイ
プフォーム構造の変動は、かかる平行がαβＴＣＲにお
いて観察されないので、Ｔ細胞レセプターにおいて新規
である。 １０．ＣＤ３と会合しないＴ細胞レセプターγδ複合体
はヒト子宮内膜腺上皮において同定される 移植初期段階において単核細胞湿潤は、母性子宮組織に
おけるらせん状の動脈および子宮膜腺のすぐ近くに多
い。これらは、未知機能Ｔ結合細胞の通常にはない母集
団を含む。多くの絨毛外の栄養膜は、大部分の耐性細胞
上に発現したものと異なる新規なタイプのクラスＩ Ｍ
ＨＣ抗原を発現する。我々は、妊娠または非妊娠子宮に
おけるＴＣＲγδヘテロダイマー（γδＴＣＲ）に対す
る１パネルのモノクローナル抗体を実験した。驚くべき
ことに、γδＴＣＲ複合体は白血球では検出されなかっ
たが、妊娠子宮からの子宮内膜腺上皮細胞に分布してい
た。また、これらの抗体は非妊娠子宮からの腺上皮と反
応し、その反応性は月経周期の増殖フォームにおけるも
のよりも分泌フェースにおいてより強い。しかしなが
ら、γδＴＣＲは、ＣＤ３（ＯＫＴ３、抗Ｌｅｕ−４、
ＵＣＨＴ−１）にする３種類の異なるモノクローナル抗
体を使用して免疫沈降物を調べることで示されるよう
に、ＣＤ３複合体と会合しなかった。γδＴＣＲ陽性腺
上皮細胞はαβＴＣＲに対するモノクローナル抗体と反
応しなかった。同様に細胞はＣＤ４およびＣＤ８に陰性
であった。その上、腺上皮細胞は初期妊娠期間において
クラスＩ ＭＨＣ抗原を失なう。これらのデータは、γ
δＴＣＲ生成子宮内膜腺細胞が少なくとも遺伝子発現の
局所調節のもとで表現型変性を受けることを示唆する。 １１．実施例：ヒトδＴ細胞レセプター遺伝子およびＶ
δ特異モノクローナル抗体の特性化 我々は、ヒトγδＴ細胞クローン、ＡＫ１１９からδＴ
ＣＲ ｃＤＮＡおよび転位δＴＣＲ遺伝子を単離した。
これらのＤＮＡクローンから、_Ｋδプローブが得られ、
１パネルの１３のヒトγ、δＴ細胞クローンと３のγ、
δヒトＴ細胞腫瘍系におけるδＴＣＲ遺伝子転位多様性
を測定するために使用された。要するに、５つの異なる
転位が検出され、それらは２〜５の異なるＸ_δへ遺伝子
を使用する転位に対応した。ある特別な転位は、ｍＡｂ
ＴＣＳδ１（δＴＣＡＲ−３）と反応するヒトγ、δＴ
細胞において観察された、加えて、ＴＣＳδ１はγ、δ
腫瘍細胞系、モルト−１３からδＴＣＲポリペプチドを
免疫沈降させた。我々は、モノクローナル抗体ＴＣＳδ
１がＡＫ１１９Ｖδ遺伝子または転位ＡＫ１１９遺伝子
Ｖδ−Ｊδ遺伝子の組み合わせエピトープにおいてエン
コードされたエピトープを認識する証拠を提供する。 １１．１．原料および方法 １１．１．１．ＡＫ１１９δＴＣＲｃＤＮＡクローンの
単離と配列化 ｃＤＮＡライプラリーは、グブラーおよ
びホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，
１９８３，Ｇｅｎｅ ２５：２６３）の方法によって、
ＰＢＬ Ｔ細胞クローン（ＡＫ１１９）から生成した。
約１００，０００プラークの拡大ライブラリーを^３２ｐ
標識ニックトラスレートＣδプローブを使用してスクリ
ーンし、０−０２４と称するδＴＣＲクローンから単離
した［ハタ等（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８）］。長いハイブ
リダイズ ｃＤＮＡ クローン（１．３ｋｂクローンｃ
１１９δ３）はチェインターミネーション法（ｄｉｄｅ
ｏｘｙ ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄ）によって配列分析用に選択された。 １１．１．２．転位δＴＣＲ遺伝子のクローニング 転位Ｖδ遺伝子含有３．５ｋｂゲノムＤＮＡクローン
は、次のように、ＡＫ１１９細胞から得られた。すなわ
ち、ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを準備アガロースゲル上で細
分化し、λｇｔ１０へ連結し、そしてＥ． ｃｏｌｉへ
トランスフェクトした。組み換えファージは、ｃＤＮＡ
クローン、ｃ１１９δ３、から誘導された^３２ｐ標識ニ
ックトランスレート５５０ｂｐ ＥｃｏＲＩフラグメン
トを用いてスクリーンされた。γ１１９δ１と称され、
０．８Ｋｂ ＨｉｎｃＩＩフラグメント（Ｖ部特異性）
と１ｋｂ ＨｉｎｃＩＩ−ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｖ
−Ｊ部）を含有する転位クローンが単離された。 １１．１．３．ＤＮＡ調製 ウシおよび新生胸腺組織は、患者の権利と認証に関する
許容ガイドラインに沿って集められた。Ｔ細胞クローン
は、希釈を制限することによって、末梢血液、胸膜滲出
物または脳脊髄体液から得られ、インビトロで培養され
た［ハフラー等（Ｈａｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８
５．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１８：４５１，Ｖａｎ ｄ
ｅ Ｇｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．ｌｍ
ｍｕｎｏｌ ．１３８：１６２７）］。すべての場合に
おいて、ＤＮＡは１％ナトリウムドデシル スルフェー
トのプロティナーゼＫを使用する消化によって調製し、
続いてフェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈
降を行なった。 １１．１．４．サザンブロット分析 ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化し、０．９％アガロース
ゲル上で大きさに基づいて細分化し、ニトロセルロース
に移した。前記の如く^３２Ｐニックトランスレートプロ
ーブを用いてハイブリダイゼーションを行なった［マニ
アチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ；Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）］。 １１．１．５．シトフルオロメーター分析 有志から得られた正常末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）
は、フィコールグラジェントを用いて細分化することに
よつ単離された。ＰＢＭＣおよびＰＢＬＴ細胞は、ＴＣ
Ｓδ１ｍＡｂ（δＴＣＡＲ−３と引用された、第７節参
照のこと）およびフルオロセイン共役ヤギ抗マウスＩｇ
Ｇ（ベクトン ディキンソン）を用いて間接ケイ光によ
って染色し、そしてケイ光活性化流通シトメーターで分
析された。 １１．２結果 １１．２．１．δＴＣＲ遺伝子転移の多様性 Ｃδプローブを用いて、我々はＴ細胞クローンＡＫ１１
９λｇｔ１０ ｃＤＮＡ ライブラリーからｃ１１９δ
３と称する１．３ＫｂδＴＣＲ ｃＤＮＡクローンを単
離した。ｃ１１９δ３の５´端は配列化され、前に同定
したＶ_δとＪ_δ遺伝子を使用されることが見い出された
［ハタ等（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３８：６７８；Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９）］。Ｖ−Ｊ結
合配列は、Ｃ１１９δ３が枠内Ｖ−Ｊ結合を有すること
を示した。可変および結合部の全て及び一部の不変部
（Ｖ−Ｊ−Ｃプローブ）をエンコードする５５０塩基対
（ｂｐ）ＥｃｏＲＩフラグメントはＣ１１９δ３から単
離され、ＡＫ１１９からのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤＮＡ
サザンブロット分析に使用された。このプローブは、ゲ
ルムリン（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）３．２ｋｂ Ｖ_δおよび
ゲルムリン１．０ｋｂ Ｃ_δバンドを検出する。ＡＫ１
１９は、普通のδＴＣＲ転移と一致する特別の転位３．
５ｋｂバンドを示した［ハタ等（Ｈａｔａ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８；Ｌ
ｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔ ｕｒｅ ３３
０：５６９）（第２２図における転位ＩＩ）。この３．
５ｋｂバンドは、Ｖ−Ｊ−Ｃ ｃＤＮＡプローブを使用
してＥｃｏＲＩ大きさ細分化λｇｔ１０ゲノムライブラ
リーからクローンされた。γ１１９δ１と称するクロー
ン転位δＴＣＲ遺伝子の部分地図は、第１７図に示され
る。可変および結合部の偏在は、Ｊオリゴヌクレオチド
プローブおよび可変部特異プローブを用いて測定され
た。γ１１９δ１から１ｋｂＶ−Ｊプローブは、Ｈｉｎ
ｃＩとＥｃｏＲＩ酵素を使用して消化することによって
単離された（第１７図）。このＶ−Ｊプローブは、１パ
ネルの１３のヒトγδＴＣＲ陽性Ｔ細胞クローンと３の
ヒトγ−δＴＣＲ陽性腫瘍細胞系におけるδＴＣＲ遺伝
子転位の多様性を測定するために使用された。第２２図
に示されるように、ＩーＶと番号付けされた５つの普通
の転位はポリクローナル新生胸腺細胞サンプル中に見ら
れる（第１１レーン）。これらの転位はヒトγδＴ細胞
クローンによって使用された転位の代表的なものであ
る。転位ＩＩだけがＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｃＩＩＶ_δ特
異プローブにハイブリダイズする。我々はこれらの転位
の全てがＤ−Ｊ転位よりもＶ−Ｄ−Ｊを表わすことを知
らないけれども、これらの細胞が細胞表面上に機能δＴ
ＣＲポリペプチド鎖を発現するので、いくらかのもの
は、以前に特徴づけたＪ_δ遺伝子セグメントに対する新
しい可変部の転位を示す。我々は、新しい転位が他のＪ
_δ遺伝子に対する単一の新しいＶ_δ遺伝子の転位を示す
可能性を認めていないのだか、同定すべきである。我々
のデータは、δＴＣＲ遺伝子転位に使用し得る２−５の
可変部遺伝子が存在すべきであるとする事実と一致す
る。 １１．２．２．ｍＡｂＴＣＳδ１特異性の決定 以前にδＴＣＡＲ−３と引用したＴＣＳδ１は、ヒト腫
瘍γδＴＣＲ細胞系モルト−１３で免疫性を与えられた
マウスの牌臓細胞とマウスミエローマ系とを融合させる
ことによって生成された。ケイ光活性細胞ソーター（Ｓ
ｏｒｔｅｒ）分析に使用される場合は、ＴＣＳδ１はす
べてのヒトγδＴ細胞の一部にだけ反応し、全てとは反
応しない。これらの結果は第１表に示される。ＴＣＳδ
１によって陽性染色するとＡＫ１１９ Ｖ_δ遺伝子（転
位ＩＩ）の用途と完全に相関性を有する。このデータ
は、δＴＣＳ１によって認識されたエピコートがＡＫ１
１９Ｖ_δ遺伝子または転位ＡＫ１１０Ｖ_δ−Ｊ_δ遺伝子
の組み換えエピトープにおいてエンコードされる強い立
証を提供する。 １．第２２図に示すように１−Ｖと番号したＶ−Ｊプロ
ーブによって検出されたδＴＣＲ転位。 ２．ゲルムリンＪ_δが検出されないけれども各ケースに
おいて１転位だけが同定された。 ３．新生またはウシ胸腺細胞で見い出されない新しい転
位が観察された。この転位には転位ＶＩが与えられた。 ４．＋は陽性染色を示し、−は陰性染色を示し、ｎｄは
検出されなかったことを示す。 １２．ハイブリドーマの寄託 次のハイブリドーマ細胞系は、指示モノクローナル抗体
を産生し、記載された日にメリーランドロックビルのＡ
ＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託され、提示アクセッシ
ョン番号が与えられた。 本発明は、寄託実施態様が本発明の１態様の説明を意図
するものであり、機能的に等価であるいかなる細胞系も
本発明の範囲内にあるので、寄託細胞系による態様に限
定されることはない。事実、本書に示されかつ記載のも
のに加えて本発明の各種変更は、前記および添付図面か
ら当業者には明らかとなる。かかる変更は添付請求の範
囲の態様の範囲内に入ることが意図される。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１０年３月２６日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正内容】

【書類名】 明細書

【発明の名称】ヒト ガンマ，デルタＴ細胞抗原レセプ
ターポリペプチド及び核酸

【特許請求の範囲】

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、２ｂｃ型と称する
ヒトγＴ細胞抗原レセプターポリペプチドの１つの型に
関し、この型は分子量が約４０，０００ダルトン、かつ
２つのＣγ２ＣＩＩエキソンコピーのみによってコード
された配列を含む１つの定常領域を有する。また本発明
は、γ２ｂｃ型からなるＴ細胞抗原レセプターヘテロダ
イマー、及びγ２ｂｃ型及びそれらの一部分をコードす
る核酸配列に関する。本発明はまた、γ又はδＴ細胞抗
原レセプターポリペプチドのエピトープに特異的な反応
性を有するモノクローナル抗体を提供する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】Ｔ細胞
抗原レセプター（ＴＣＲ）は、一方がα鎖、他方がβ鎖
と呼ばれる二種類のグリコシルサブユニットからなり、
Ｔ細胞上でクローン特異的ジスルフィド結合ヘテロダイ
マーであるとされていた。α及びβＴＣＲサブユニット
は、それぞれ、約５０，０００及び約４０，０００の相
対分子質量（Ｍｒ）を有する（Ａｌｌｉｓｏｎ ｅｔ
ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：２２９３
−２３００；Ｍｅｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：７０５−７１９； Ｈａ
ｓｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍ
ｅｄ．１５７：１１４９−１１６９）。遺伝子は、Ｔ細
胞の個体発生の間に再編成され、そしてβＴＣＲ（Ｙａ
ｎａｇｉ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｅｒ ３
０８：１４５−１４９； Ｈｅｄｒｉｃｋ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３０８：１５３−１５
８）及びαＴＣＲ（Ｃｈｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８
４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３１−３５；Ｓａｉｔｏ
ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３１２：３６
−４０； Ｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１２：７７１−７７５）をコードする遺伝子
は、サブトラクティブハイブリダイゼーンョン又はオリ
ゴヌクレオチドによるつりあげのいずれかによって単離
された。

【０００３】Ｔ細胞クローンのＴ細胞抗原レセプターの
α及びβ鎖は、それぞれ、Ｖ（ｖａｒｉａｂｌｅ）、Ｄ
（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｊ（ｊｏｉｎｉｎｇ）及びＣ
（ｃｏｎｓｔａｎｔ）と呼ばれるドメインのユニークな
組み合わせから構成される（Ｓｉｕ ｅｔ ａｌ．，１
９８４，Ｃｅｌｌ ３７：３９３； Ｙａｎａｇｉｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２； ３４３０）。超可変領域が同
定された（Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３１２：４０； Ｂｅｃｋｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１７：４３０）。各
Ｔ細胞クローンにおいて、α及びβ鎖のＶ、Ｄ及びＪド
メインの組み合わせは、Ｔ細胞クローン抗原認識にユニ
ークな様式で関与し、そしてＴ細胞クローンのイディオ
タイプとしても公知のユニークは結合部位を定義する。
対照的に、Ｃドメインは抗原の結合には関与しない。

【０００４】ヒトα、βＴＣＲのユニークな特性は、観
察されたコモジュレーション（Ｍｅｕｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：７０５
−７１９）、同時免疫沈降（ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ
８８／００２０９号，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊａｎｕ
ａｒｙ １４，１９８８； Ｏｅｔｔｇｅｎ，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１
２，０３９−１２，０４８）であり、α、βＴＣＲ分子
とＣＤ３グリコタンパク質複合体との要求される同時共
発現（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１６０：１２８４−１２９９）であった。

【０００５】その後、二種類のタンパク質複合体の直接
的な物理的会合は、α、βＴＣＲ分子をＴ３グリコタン
パク質への化学的架橋と、ＴＣＲサブユニット及びＴ３
グリコタンパク質（Ｍｒ ２８，０００）サブユニット
のような架橋複合体成分を同定することによって証明さ
れた（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｃｅ
ｌｌ ４０：１８３−１９０）。Ｔ３のカウンタパート
は、マウスα、βＴＣＲと同様に会合する（Ａｌｌｉｓ
ｏｎ ｅｔ ａｌ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１４：１
０７−１０９； Ｓａｍｅｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９
８４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８１：１３１−１４
４）。

【０００６】Ｔ細胞中で再編成され、γＴＣＲと呼ばれ
る第３の遺伝子は、最初マウスで（Ｓａｉｔｏ ｅｔ
ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ ３０９：７５７−７
６２； Ｋｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１３：７６２−７５５； Ｈａｙｄａｙ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８５，Ｃｅｌｌ ４０：２５９−２６
９）同定され、ついでヒトで同定された（Ｌｅｆｒａｃ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１６：４
６４−４６６； Ｍｕｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８
５，Ｎａｔｕｒｅ ３１６；５４９−５５２）。

【０００７】ヒトγＴＣＲ遺伝子座は、５〜１０個の可
変領域遺伝子、５個の結合領域遺伝子及び２個の定常領
域遺伝子からなるらしい（Ｄｉａｌｙｎａｓ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：２６１９）。機能的な可変領域
及び結合領域の総数は限定されているが、重要な多様性
がＶ−Ｊ結合プロセスにおいて導入される（Ｋｒａｎｚ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：７
５２−７５５； Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９
８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６； Ｑｕｅｒｔ
ｅｒｍａｎｕｓｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ
３２２：１８４）。γＴＣＲ遺伝子の再編成は、サプ
レッサー表現型、細胞障害表現型並びにヘルパー表現型
を有するリンパ球で生ずる（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１６：４６４−４６
６； Ｍｕｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１６：５４９−５５２； Ｑｕｅｒｔｅｒｍａ
ｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
１：２５２−２５５； Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔａｌ．，
１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６； Ｉｗａ
ｍｏｔｏ ｅｔａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６３；１２０３−１２１２； Ｚａｕｄｅｒｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
３：１３１４−１３１８）。

【０００８】γＴＣＲ遺伝子産物は、Ｔ３同時免疫沈降
で、αβＴＣ−ＣＤ３⁻Ｔから同定されている（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３
２２：１４５−１４９； Ｂａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２ ：１７９−１８１；
Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３
２５，６８３−６８８： Ｍｏｉｎｇｅｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５，７２３−７２
６，ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／００２０９号，ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｄ Ｊａｎｕａｒｙ １４，１９８
７）。γＴＣＲポリペプチドは、γＴＣＲペプチド配列
に対するモノクローナル抗体を使用して同定され、これ
らのポリペプチドは、δＴＣＲと呼ばれる他のポリペプ
チドを有するヘテロダイマーに組み込まれることが見い
出された（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔａｌ．，１９８６ Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２２；１４５−１６９）。γ，δヘテロ
ダイマーは、非共有結合的にＣＤ３と会合することが報
告された。

【０００９】γＴＣＲ特異的ペプチドに対する抗血清を
使用すると、末梢血、胸腺及び白血病細胞系に起源を有
する細胞上でＣＤ３会合γＴＣＲポリペプチドを同定す
ることができる（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４５−１４９； Ｂａ
ｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２
２：１７９−１８１； Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８３：６９９８−７００２； Ｂｒｅｎｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６
８９−６９４；Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３４：１４０１−１４０５）。

【００１０】Ｂａｎｋら（前出）は、ヒト胸腺細胞クロ
ーン表面上で６２，０００ｋＤのペプチド及びＴ３と会
合した４４ｋＤのγ型を開示した。また、類似のγＴＣ
ＲポリペプチドがマウスＴリンパ球上で同定され、そし
て胸腺細胞の分化中におけるこのペプチドの発現は、最
近の多くの研究の対象である（Ｒｏｕｌｅｔ ｅｔａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：１０３−１０
７； Ｓｎｏｄｇｒａｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，
Ｎａｔｕｒｅ ３１５：２３２−２３３； Ｌｅｗ ｅ
ｔ ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１４
０１−１４０８； Ｐａｒｄａｕ ｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２６：７９−８１； Ｂｌｕｅ
ｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２６：８２−８４）。

【００１１】γＴＣＲ^＋ヒト細胞系の研究によると、２
種類の異なるγＴＣＲポリペプチドでは、分子量及びジ
スルフィド結合形成能が異なることが認められた（Ｂｏ
ｒｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２
５：６８３−６８８； Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９
４； Ｍｏｉｎｇｅｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎ
ａｔｕｒｅ ３２５：７２３−７２６： Ｌａｎｉｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６
５：１０７６）。それぞれＣγ１及びＣγ２と呼ばれる
２種類の異なるγＴＣＲ定常領域遺伝子セグメントを比
較し、Ｃγ１の第２エキソンでコードされたンステイン
残基はＣγ２エキソンセグメント中にはなく、その欠失
によっていくつかのγＴＣＲペプチドにジスルフィド結
合形成能がないことが説明されることが示唆された（Ｋ
ｒａｎｇｅｌ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ，２３７：１５０１−１０５５： Ｌｉｔｔｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２６：８５０８８）。

【００１２】γＴＣＲが多くの形態を有することとは対
照的に、δＴＣＲは比較的変化がなく、定常領域のみが
存在する（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）。Ｔ細胞個体発生
の間、γＴＣＲ遺伝子の再編成がβＴＣＲ遺伝子及びα
ＴＣＲ遺伝子の再編成に先行することが示された（Ｒｏ
ｕｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３
１４：１０３−１０７； Ｓｎｏｄｇｒａｓｓ ｅｔａ
ｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：２３２−２３
３； Ｓａｎｇｏｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１４９１−１５０８）。

【００１３】成熟した、循環しているＴリンパ球の比較
的少ない部分がγδ ＴＣＲ^＋であり、ＣＤ３^＋４⁻
８⁻（二重陰性）表面抗原又はＣＤ３^＋４⁻８^＋表面抗
原を示す。ＣＤ３^＋４⁻８⁻Ｔ細胞は、成熟ＣＤ３^＋Ｔ
細胞の約２％を構成する。大部分の成熟ＣＤ３^＋４^＋又
はＣＤ３^＋８^＋の主要組織適合性遺伝子座（ＭＨＣ）が
細胞障害Ｔ細胞を拘束するのとは異なり、ＣＤ３⁻ナチ
ュラルキラー細胞と同様に、γδ ＴＣＲ^＋ＣＤ３^＋４
⁻８⁻クローン化リンパ球は、ＭＨＣ非拘束細胞溶解活
性を現すことが示された。しかしながら、ナチュラルキ
ラー細胞と異なり、これらのγδ^＋ＣＤ３^＋４⁻８⁻Ｔ
細胞はＫ−５６２などのナチュラルキラー細胞の標的を
首尾一貫して殺さなかった（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，３２５：６８３−６８８；Ｂｒｅｎｎ
ｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２
５：６８９−６９４； Ｍｏｉｎｇｅｏｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：７２３−７２
６； Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９８７，
Ｎａｔｕｒｅ ３２６：８２−８４）。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は、２ｂｃ型と呼
ばれるヒトγＴ細胞抗原レセプター（ＴＣＲ）ポリペプ
チドの１型に関する。２ｂｃ型のγＴＣＲ鎖は、図１４
に実質的に示した一次アミノ酸配列を有する。２ｂｃ型
のγＴＣＲ鎖は、分子量が約４０，０００ダルトンであ
り、２つのＣγ２ＣＩＩエキソンコピーだけでコードさ
れた配列からなる定常領域を含む。また、本発明は、γ
ＴＣＲポリペプチド２ｂｃ型を含むＴＣＲヘテロダイマ
ーに関する。

【００１５】また、本発明は、γＴＣＲの２ｂｃ型をコ
ードする核酸配列及び２つのＣＩＩエキソンだけを有す
るＣγ２定常領域を含む核酸配列に関する。特別の実施
態様においては、本発明の核酸は、図１４に示した核酸
配列の少なくとも一部分を含む。

【００１６】本発明は、γ又はδＴＣＲポリペプチドの
エピトープに特異的な反応性を示すモノクローナル抗体
を提供する。かかる抗体は、γδＴＣＲ及びＣＤ３抗原
の両方を発現している細胞上でＣＤ３抗原をコモジュレ
ートする能力を検出することによって同定し得る。特別
の実施態様においては、本発明はδＴＣＲ鎖の可変領域
に反応性を示す抗体に関する。

【００１７】さらに特殊な実施態様においては、かかる
抗体は、細胞における機能的なδＴＣＲ可変遺伝子の再
編成の検出に使用することができる。他の実施態様にお
いては、本発明は、δＴＣＲポリペプチド定常領域に反
応性を示す抗体に関する。さらに別の実施態様におい
て、本発明は、γＴＣＲポリペプチド定常領域に反応性
を有する抗体に関する。本発明の他の態様において、細
胞中でγδＴＣＲを発現させる方法が提供される。

【００１８】すなわち、本発明は、ヒトＴ細胞抗原レセ
プターデルタ鎖の可変領域又は再編成された可変−結合
領域の１エピトープと反応性を有するモノクローナル抗
体である。上記抗体は、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号
ＨＢ９５７８が与えられたハイブリドーマによって産生
され、ヒトＴ細胞抗原レセプターデルタ鎖の定常領域の
１エピトープと反応性を有するモノクローナル抗体ＴＣ
Ｓδ１（δＴＣＡＲ−３）からなることを特徴とする。

【００１９】さらに、本発明は、ＡＴＣＣに寄託され、
受託番号ＨＢ９７７２が与えられたハイブリドーマによ
って産生されるモノクローナル抗体抗ＴＣＲδ１からな
るモノクローナル抗体であることを特徴とする。また、
本発明は、上記のいずれかに記載のモノクローナル抗体
のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａ’又はＦ（ａｂ’）_２フラグメン
トである。

【００２０】本発明はまた、上記のいずれかに記載のモ
ノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。本
発明は、細胞におけるヒトデルタＴ細胞抗原レセプター
可変遺伝子の機能的再編成の存在を検出する方法であっ
て、細胞又は細胞のポリペプチド含有サンプルを、再編
成された遺伝子によってコードされたポリペプチドの１
エピトープに特異的な反応性を有するモノクローナル抗
体と接触させることからなる方法である。ここで、モノ
クローナル抗体が、ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ
９５７８が与えられたハイブリドーマによって産生され
たＴＣＳδ１（δＴＣＡＲ−３）を含有することを特徴
とする。

【００２１】本発明はさらに、（ａ）生細胞表面上で
γ，δＴ細胞抗原レセプター及びＣＤ３抗原を発現する
細胞と抗体とを、ＣＤ３抗原がコモジュレーションを生
じるのに十分な時間接触させ、そして、（ｂ）ＣＤ３抗
原のコモジュレーションを検出する工程を含んでなる、
γ，δＴ細胞抗原レセプターと反応性を有するモノクロ
ーナル抗体の同定方法である。

【００２２】ここで、上記コモジュレーションの検出
が、（ａ）細胞とＣＤ３抗原に対する標識抗体とを、標
識抗体がＣＤ３抗原に結合するのに十分な時間接触さ
せ、そして（ｂ）結合した標識抗体の量を測定すること
からなることを特徴とする。本発明はまた、ＣＤ３抗原
をコモジュレーションさせる能力を有することを特徴と
する上記のモノクローナル抗体である。

【００２３】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本明細書で使用される用語の意味を次に示す。 ＴＣＲ＝Ｔ細胞抗原レセプター Ｖ ＝可変 Ｄ ＝ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｊ ＝結合 Ｃ ＝定常 ｍＡｂ＝モノクローナル抗体

【００２４】図１に、抗ＴＣＲ δ１を使用したＴ細胞
系のサイトフルオログラフ分析（細胞蛍光間接撮影分
析）の結果を示す。図２には、ｍＡｂ 抗ＴＣＲδ１の
特異性の免疫化学分析の結果を示す。表面^１２５Ｉ標識
ＩＤＰ２細胞を、対照ｍＡｂ Ｐ３（レーン１及び
２）、抗ｌｅｕ４（レーン３〜５）、抗ＴＣＲδ１（レ
ーン６〜８）又は抗Ｃγ血清（レーン９）を使用して免
疫沈降させ、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動）によって分離し、オートラジオグラ
フィーで可視化した。Ｎは非還元条件を表わし、Ｒは還
元条件を表わす。

【００２５】図３に、δＴＣＲのＮ−グリカナーゼ消化
の結果を示す。図４には、ｐＧＥＭ３−０−２４０／３
８の地図を示す。図５に、ｍＡｂ 抗ＴＣＲδ１による
ｃＤＮＡクローンＩＤＰ２ ０−２４０／３８のｉｎ
ｖｉｔｒｏ翻訳生成物の免疫沈降の結果を示す。図６
に、Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降及びＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ分析の結果を示す。白抜きの矢印はδ鎖の位置を示
す。黒い矢印はγ鎖の位置を示す。溶解物は、δＴＣＡ
Ｒ−３抗体（奇数レーン）又はβＦ１抗体（偶数レー
ン）を使用して免疫沈降させた。

【００２６】図７には、δＴＣＡＲ−３抗体によるδ鎖
の免疫沈降の結果を示す。ＭＯＬＴ−１３細胞は、０．
３％のＨＣＡＰＳ含有トリス−バッファー生理食塩水
（ｐＨ８）（レーン１）又は１％のＴｒｉｔｏｎｘ−１
００（レーン２〜７）に溶解した。レーン１では、δＴ
ＣＡＲ−３は、ＣＤ３タンパク質でγ，δＴＣＲヘテロ
ダイマーを免疫沈降させた。レーン２では、δＴＣＡＲ
−３は、ＣＤ３タンパク質なしでγ，δＴＣＲヘテロダ
イマーを免疫沈降させた。レーン３と４では、δＴＣＡ
Ｒ−３は、変性溶解物からの一本のδ鎖を、それぞれ非
還元条件（Ｎ）及び還元条件（Ｒ）において免疫沈降さ
せた。レーン５では、ＵＣＨＴ−１は、ＣＤ３タンパク
質を免疫沈降させた。レーン６では、βＦ１抗体は、Ｍ
ＯＬＴ−１３細胞からヘテロダイマーを免疫沈降させな
かった。レーン７では、抗Ｃγ抗血清は、一本のγ鎖を
免疫沈降させた。

【００２７】図８には、フロサイトメトリーによる細胞
表面染色分析の結果を示す。γ，δＴＣＲ陽性細胞（Ｍ
ＯＬＴ−１３，ＰＥＥＲ，ＩＤＰ２）及びα，βＴＣＲ
陽性細胞（ＨＰＢ−ＡＬＬ，Ｊｕｒｋａｔ）は、δＴＣ
ＡＲ−３、ＯＫＴ−３、ＷＴ３１及び正常マウス血清
（ＮＭＳ）とともにインキュベートし、フローサイトメ
トリーによって分析した。Ｂ細胞系のＤａｕｄｉを陰性
対照とした。図９に、δＴＣＡＲ−３^＋及びＯＫＴ３^＋
末梢血リンパ球の二色サイトフルオログラフ分析（細胞
間接撮影分析）結果を示す。フルオレセインイソチオシ
アネート（ＦＩＴＣ）の蛍光をＹ軸に、フィコエリトリ
ン（ＰＥ）のケイ光をＸ軸に示した。このサンプル中の
ＣＤ３^＋γ、δＴＣＲ^＋細胞は２．４％のＣＤ３^＋リン
パ球を示す。

【００２８】図１０には、細胞質内Ｃａ^２＋濃度（［Ｃ
ａ^２＋］_ｉ）を経時的に測定した結果を表す。上部パネ
ル：δＴＣＡＲ−３。下部パネル：抗Ｌｅｕ抗体。矢印
は、抗体添加時を示す。図１１に、３型のγ，δＴＣＲ
の免疫沈降の結果を示す。Ａ〜Ｅの部分について、免疫
沈降に使用した抗体は、抗Ｌｅｕ４（抗ＣＤ３）、βＦ
１（抗ＴＣＲβ）、抗δ１ＴＣＲ（抗δＴＣＲ）、抗Ｃ
γｂ血清（抗γＴＣＲ）及びＰ３（非標識レーン、対
照）であった。^１２５Ｉ標識細胞溶解物からの免疫沈降
物は、還元条件（Ｒ）又は非還元条件（Ｎ）において、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１０％ポリアクリルアミド）で分析
した。白い矢印は還元条件下におけるＴＣＲ δの位置
を示し、一方黒い矢印は非還元条件下におけるδＴＣＲ
の位置を示す。サイズマーカーのＭｒは１０００の単位
で、左側に示す。

【００２９】Ａ）ＰＢＬ−Ｌ２上でジスルフィド結合し
ていないγＴＣＲ（４０ｋＤ）。レーン１〜６において
放射性標識された細胞を、０．３％のＣＨＡＰＳ界面活
性剤で可溶化した。この界面活性は、ＴＣＲ−ＣＤ３会
合を保存する。一方、レーン７と８においては、免疫沈
降を鎖の分離後に行なった（方法を参照のこと）。 Ｂ）ＩＤＰ２細胞上でジスルフィド結合していないγＴ
ＣＲ（５５ｋＤ）。レーン１〜４では、放射性標識され
た細胞を０．３％のＣＨＡＰＳ界面活性剤で可溶化し、
一方、レーン５と６においては、免疫沈降を鎖の分離後
に行なった。 Ｃ）ＷＭ−１４上でジスルフィド結合したγＴＣＲ（４
０ｋＤ）。全てのレーンは、１％ジギトニン溶解放射性
標識細胞からの免疫沈降物に対応する。

【００３０】Ｄ）胸腺クローンＩＩ細胞上でジスルフィ
ド結合していないγＴＣＲ（４０ｋＤ）。放射性標識細
胞は、１％ジギトニン（レーン１〜４）又は０．１％の
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（レーン５と６）で可溶化
し、一方、レーン７と８においては、鎖の分離後に免疫
沈降を行なった。 Ｅ）ＭＯＬＴ−１３白血病Ｔ細胞上でジスルフィド結合
していないγＴＣＲ（４０ｋＤ）。レーン１〜４におい
て０．３％のＣＨＡＰＳ界面活性剤で細胞を可溶化した
後に免疫沈降を行ない、一方、レーン５と６では、鎖の
分離後に免疫沈降を行なった。

【００３１】図１２には、抗Ｃγｍ１抗体及び抗ＴＣＲ
δ１抗体のそれぞれによるγＴＣＲ鎖及びδＴＣＲ鎖
の免疫沈降の結果を示す。細胞表面放射性標識ＭＯＬＴ
−１３細胞を、０．３％のＣＨＡＰＳ界面活性剤で可溶
化し、γ，δＴＣＲ−ＣＤ３複合体を抗ＣＤ３モノクロ
ーナル抗体で単離した。免疫沈降物を、還元条件にて１
０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。 レーン１：坑Ｌｅｕ４（抗ＣＤ３）ｍＡｂによる免疫沈
降。 レーン３：単離されたγ，δＴＣＲ−ＣＤ３複合体の鎖
を分離した後の抗Ｃγｍ１（抗ＴＣＲγ）による免疫沈
降。 レーン４：単離されたγ，δＴＣＲ−ＣＤ３複合体の鎖
を分離した後の抗ＴＣＲδ１（抗ＴＣＲδ）による免疫
沈降。

【００３２】図１３には、ＰＥＥＲ及びＭＯＬＴ−１３
細胞からのγＴＣＲ及びδＴＣＲのペプチド骨格の大き
さ及びグリコシル化の測定の結果を示す。免疫沈降に用
いられたモノクローナル抗体は、各レーン上部に示した
ように抗Ｃγｍ１（抗ＴＣＲγ）、抗ＴＣＲδ１（抗Ｔ
ＣＲδ）及びＰ３（標識対照）である。使用した標識細
胞系は、各１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥオートラジオグラフ
又はフルオグラフの下部に示した。サンプルは全て還元
条件で分離した。サイズマーカーＭｒは１，０００の単
位である。

【００３３】Ａ）ＰＥＥＲ及びＭＯＬＴ−１３細胞から
のγＴＣＲペプチド主鎖の大きさ。細胞を^３５Ｓ−シス
テイン及び^３５Ｓ−メチオニンで１５分間、生合成的に
標識した。サンプルは、Ｅｎｄｏ Ｈ（＋）処理又はｍ
ｏｃｋ処理のいずれかの処理を行なった。坑Ｃγｍ１に
よる免疫沈降はＰＥＥＲ細胞（レーン３）及びＭＯＬＴ
−１３細胞（レーン７）の未成熟なγＴＣＲの位置を示
すが、対応するポリペプチド骨格の大きさはＥｎｄｏ
Ｈ（レーン４と８）処理後に可視化した。 Ｂ）ＭＯＬＴ−１３細胞からのＴＣＲδのグリコシル
化。^１２５Ｉ標識細胞は抗ＣＤ３のｍＡｂで免疫沈降
し、δＴＣＲポリペプチドは、Ｎ−グリカナーゼ（レー
ン４）、Ｅｎｄｏ Ｈ（レーン２）とインキュベーショ
ンするか、又はｍｏｃｋ処理（レーン１と３）の前にゲ
ル精製した（方法を参照のこと）。

【００３４】図１４に、ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲの核
酸配列（２ｂｃ型）を示す。パートＡ：クローンＭ１３
Ｋの配列決定の戦略。１．１ｋｂのｃＤＮＡクローンＭ
１３Ｋの部分制限地図を示す。パートＢ；クローンＭ１
３Ｋの核酸及び推定アミノ酸配列。シグナル配列遺伝子
セグメント（Ｓ）、可変領域遺伝子セグメント（Ｖ）、
Ｎ−領域遺伝子セグメント（Ｎ）、結合領域遺伝子セグ
メント（Ｊ）及び定常領域遺伝子（ＣＩ、ＣＩＩｂ、Ｃ
ＩＩｃ及びＣＩＩＩ）セグメントを矢印で示す。

【００３５】これらは、ＳとＶについてはＬｅｆｒａｎ
ｃら（１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６）に
よって記載されたゲノム配列と、ＪについてはＬｅｆｒ
ａｎｃら（１９８６，Ｎａｔｕｒｅ，３１９：４２０−
４２２）とＱｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓら（１９８７，Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１３８：２６８７−２６９０）によって記
載されたゲノム配列と、そしてＣについてはＬｅｆｒａ
ｎｃら（１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９６−９６００）及びＰ
ｅｌｌｉｃｃｉら（１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
７：１０５１−１０５５）によって記載された配列と比
較して同定された。イニシエーターであるメチオニンで
始まる推定アミノ酸配列は、核酸配列の下に示す。細胞
外システインは四角で囲み、潜在的なＮ−結合炭水化物
接着部位［Ｎ−Ｘ−Ｓ又はＮ−Ｘ−Ｔ；（Ｍａｒｓｈａ
ｌｌ，１９７７，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，４
１；６３７−７０２）］はかっこで示した。

【００３６】図１５には、γ，δＴＣＲ１型の優先的使
用の結果を示す。３人の健常ドナーからの新鮮な単離末
梢血液単核細胞を^１２５Ｉ標識し、１％のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００で可溶化した。Ｐ３（対照、レーン１と
３）及び抗ＴＣＲδ１（抗ＴＣＲδ、レーン２と４）に
よる免疫沈降物は、非還元条件（Ｎ）及び還元条件
（Ｒ）で分析した。１０００単位を有するマーカーのＭ
ｒを左側に示す。

【００３７】図１６は、ヒトにおける三種のγ，δＴＣ
Ｒ型の模式図である。ＣＩＩエキソンがコードするコネ
クターペプチドは、Ｃγ１ＣＩＩエキソンがコードする
ペプチドとして黒ぬり部分とした。細い斜線を付した部
分、細かい点を付した部分、太い斜線を付した部分は、
それぞれＣγ２ＣＩＩエキソンコピーａ、コピーｂそし
てコピーｃコードペプチドを示す。潜在的なＮ−結合グ
リカン付着部位（Ｏ）、スルフヒドリル基（−ＳＨ）及
び推定ジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−）を示した。

【００３８】図１７は、再配列されたδＴＣＲ遺伝子地
図である。ＥｃｏＲＩ（ＲＩ）、ＨｉｎｃＩＩ（Ｈ
ｃ）、ＳｃａＩ（Ｓ）とＰｖｕＩＩ（Ｐ）部位を含むｒ
１１９δ１地図及びサザンブロット分析で使用したプロ
ーブを示す。 図１８Ａは、ＭＯＬＴ−１３細胞系への
トランスフェクションに使用したγＴＣＲ鎖を示す模式
図である。模式図は、報告された分析に基づく（Ｂｒｅ
ｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２２：１４５−１４９； Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４： Ｋｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．，
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ２３７：６４
−６７）。図中、Ｐｒｅｄ．は予測値、Ｏｂｓ．は実測
値を示す。それぞれ３ｋＤの付着した炭水化物を含むと
推定される、すべての有用なＮ−結合グリコシル化部位
（頭に○をつけた棒で示した）が使用され、有意なサイ
ズの相違は他の翻訳後修飾によって導入されないという
ことが、予測されたグリコンル化ポリペプチドの大きさ
から仮定された。

【００３９】Ｉｇ様分子を代表とする鎖内ジスルフィド
結合を示す。システイン残基（Ｃｙｓ）はＰＢＬＣ１γ
ＴＣＲのＣＩＩエキソンによってコードされるが、この
ようなシステインは二種の他のγＴＣＲ鎖で使用された
ＣＩＩエキソンの全コピーには存在しないことに注意す
べきである。同様に５５ｋＤのγＴＣＲタンパク質を発
現する（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２５：６８９−６９４； Ｗｅ
ｉｓｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．， １９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：６９９８−
７００２）γ，δＴ白血病細胞系ＰＥＥＲ（Ｌｉｔｔｍ
ａｎ，Ｄ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２６：８５−８８）のγＴＣＲ定常領域はＩＤＰ
２のそれと同一である。

【００４０】図１８Ｂには、発現プラスミド構築物ｐＦ
ｎｅｏ．ＰＢＬ及びｐＦｎｅｏ．ＩＤＰ２γを示す。Ｉ
ＤＰ２γをγＴＣＲクローンをＭＯＬＴ−１３細胞系に
導入するために使用した。ＰＢＬＣ１ γＴＣＲのｃＤ
ＮＡクローン（ＰＢＬ Ｃ１．１５）及び修復されたＩ
ＤＰ２γＴＣＲのｃＤＮＡクローン（ＩＤＰ２．１１
ｒ）（Ｋｒａｎｇｅｌ．Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）を、Ｅｃｏ
ＲＩ消化によって親プラスミドベクター（ｐＵＣ１８）
から切断し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片で両
末端を末端切断型とし、ついでこのｃＤＮＡをＳａｌＩ
切断、及びクレノウ処理したｐＦｎｅｏ哺乳類発現ベク
ターへライゲートした。ＳＦＦＶ（ｓｐｌｅｅｎ ｆｏ
ｃｕｓ ｆｏｒｍｉｇ ｖｉｒｕｓ）のＬＴＲに関して
適切な方向でｃＤＮＡインサートを含むクローンを、制
限マッピングに基づいて選択した。ｐＦｎｅｏ（Ｓａｉ
ｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２５：１２５−１３０）は、ＢａｍＨＩ 消化し、マ
ウスのβＴＣＲのｃＤＮＡインサートを除き、その後Ｔ
４ ＤＮＡリガーゼでライゲートすることによって得ら
れたｐＴβＦｎｅｏの誘導体である（Ｏｈａｓｈｉ，
Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ３１６：
６０６−６０９）。図示したように、このベクターはＳ
Ｖ４０プロモーター制御下に細菌のネオマイシン耐性遺
伝子（ｎｅｏ^ｒ）を有し、哺乳類のレシピエント細胞に
抗生物質Ｇ４１８に対する耐性を付与する。カッコ内の
制限部位は構築中に破壊した。

【００４１】図１９は、ＯＬＴ−１３のγＴＣＲトラン
スフェクタント上のγ，δＴＣＲの免疫沈降分析の結果
を示す図である。表面^１２５Ｉ標識細胞を、０．３％の
ＣＨＡＰＳ界面活性剤で可溶化して鎖の会合を保護し、
ｍＡｂ Ｐ３（対照）、抗ｌｅｕ４（抗ＣＤ３）、抗Ｔ
ＣＲδ１（抗δＴＣＲ）又は抗Ｔｉ−γＡ（抗Ｖγ２）
で免疫沈降し、その後、非還元条件（Ｎ）又は還元条件
（Ｒ）下にてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、先に記載した
オートラジオグラフィーによって可視化した（Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２２：１４５−１４９： Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４）。抗ＴｉγＡのｍＡｂは、Ｖγ
２セグメントの認識と一致する、異なるＴ細胞クローン
上での反応性のパターンを示す。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１
はＰＢＬ Ｃ１由来のγＴＣＲ ｃＤＮＡでトランスフ
ェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞であり、クローン＃７を
分析用に使用した。Ｍ１３．ＩＤＰ２γは、ＩＤＰＳ由
来γＴＣＲ ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＭＯＬＴ
−１３細胞であり、クローン＃１０を分析用に使用し
た。サイズマーカー、Ｍｒ（分子量）は、１０００ダル
トン単位である。白い矢印は、固有のＭＯＬＴ−１３γ
ＴＣＲ鎖を示し、黒い矢印はトランスフェクトした（Ｐ
ＢＬ Ｃ１又はＩＤＰ２由来）γＴＣＲ ｃＤＮＡを氏
示し、星印は、非還元条件下のＭＯＬＴ−１３のδＴＣ
Ｒ鎖を示す。還元すると、δＴＣＲ鎖は移動度が変化
し、４０ｋＤのγＴＣＲ鎖とともに移動する。しかしな
がら、δＴＣＲ鎖は、Ｍ１３．ＩＤＰ２γの抗Ｖγ２免
疫沈降（図１９レーン８）で見られたように、４０ｋＤ
のγＴＣＲタンパク質が同時免疫沈降しないときに、還
元条件下で４０ｋＤのバンドとしてはっきりと可視化さ
れた。

【００４２】図２０には、トランスフェクタントのγＴ
ＣＲポリペプチドの二次元ゲル分析の結果を示す。２×
１０^７個の細胞を表面^１２５Ｉ標識し、ノイラミダーゼ
（各々１ｍｇ／ｍＬのグルコースとウシ血清アルブミン
とを含む１．５ｍＬのＰＢＳ中に１５０ユニット、２３
℃で１．５時間）処理し、０．３％のＣＨＡＰＳ界面活
性剤で可溶化し、１μｇの抗ｌｅｕ４ ｍＡｂで免疫沈
降し、還元条件下で二次元（２Ｄ）ゲル分析した。平衡
化していないｐＨグラジェントゲル電気泳動（ＮＥＰＨ
ＧＥ）を、ｐＨ ３．５〜１０のアンフォリン（Ａｍｐ
ｈｏｌｉｎｅ，ＬＫＢ，スウェーデン）を使用して行な
い、その後１０．５％のアクリルアミドゲル上でＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行なった（Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ．Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２５：６８９−６９４）。ＣＤ３成分の位置
（図示せず）を用いて異なる細胞系で発現されたγＴＣ
Ｒ種を同定し、比較した。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γトラ
ンスフェクタントのクローン＃１０とＭ１３．ＩＤＰ２
γの形質転換体のクローン＃１０を使用した。白い矢印
はＭＯＬＴ−１３ γＴＣＲ種を、黒い矢印はＩＤＰ２
γＴＣＲ種を、星印はＰＢＬ Ｃ１γＴＣＲ種を示す。

【００４３】図２１には、トランスフェクタントのγＴ
ＣＲ鎖の骨格ポリペプチドの大きさの分析の結果を示
す。細胞を^３５Ｓ−メチオニン及び^３５Ｓ−システイン
で１５分間パルス標識し、Ｐ３（対照）、抗Ｃγｍ１
（抗γＴＣＲ）又は抗ＴｉγＡ（抗Ｖγ２）ｍＡｂで免
疫沈降した。免疫沈降物を、エンドグリコシダーゼＨ
（Ｅｎｄｏ−Ｈ，＋）処理又はｍｏｃｋインキュベート
（−）処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、フルオログ
ラフィーで可視化した。全てのサンプルを還元した。Ｍ
ｒは分子量マーカーであり、１，０００ダルトン単位で
ある。アクチンのバンドに混入している４３ｋＤのもの
は、別の内部マーカーとして働く。Ｍ１３．ＩＤＰ２γ
はＩＤＰ２のγＴＣＲのｃＤＮＡ、クローン＃１０でト
ランスフェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞であり、Ｍ１
３．ＰＢＬ Ｃ１γは、ＰＢＬ Ｃ１のγＴＣＲのｃＤ
ＮＡである、クローン＃１０でトランスフェクトしたＭ
ＯＬＴ−１３細胞である。

【００４４】図２２には、γδＴ細胞クローン及びポリ
クローナルヒトＴ細胞集団のサザンブロット分析の結果
を示す。ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、Ｖ−Ｊプ
ローブでつりあげた。ＤＮＡ源は以下の通りである。Ｐ
ＢＬ Ｔ細胞クローン（レーン１、３〜９）、ＰＢＬ
（レーン１０）、新生児胸腺リンパ球（ＮＢＴ、レーン
１１）、胎児胸腺リンパ球（ＦＴ，レーン１２）及びＢ
細胞（胚細胞系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）、レーン２）であ
る。胚細胞系の３ｋｂのＶδ及び６．７ｋｂのＪδフラ
グメントをブロットの左側に示し、一方、５個の通常の
再編成、番号Ｉ〜Ｖを右側に示した。Ｉ〜Ｖの再編成の
大きさは、それぞれ、２．９ｋｂ、３．５ｋｂ、４．２
ｋｂ、６．２ｋｂ及び７．１ｋｂである。

【００４５】以下に本発明を詳細に説明する。 ５．１．γＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチド及び核酸 本発明は、２ｂｃ型と呼ばれるある型のヒトγＴＣＲポ
リペプチドに関する（詳細は第８節及び第９節に記載す
る）。また、本発明は、ＤＮＡ及びＲＮＡなどのγ２ｂ
ｃ型をコードする核酸及びそれらに相補的な核酸に関す
る。

【００４６】１型と２ａｂｃ型γＴＣＲポリペプチドと
は、以前に、ヒトγＴＣＲの型であると報告されている
（ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ０８８／００２０９、１９
８８年１月４日発行）。１型γＴＣＲポリペプチドは、
約４０，０００ダルトンの分子量を有する。２ａｂｃ型
γＴＣＲポリペプチドは、約５５，０００ダルトンの分
子量を有する。２ａｂｃ型のγＴＣＲ鎖は、１型より若
干長いペプチド骨格を有し、かつ１型より１個多い特別
な潜在的Ｎ−結合グリカンを有する。対照的に、本発明
のγＴＣＲ鎖である、２ｂｃ型は約４０，０００ダルト
ンの分子量を有する。その上、２ｂｃ型γＴＣＲポリペ
プチドは、若干短いペプチド骨格及び２〜３個少ないＮ
−結合グリカンを有する。

【００４７】γＴＣＲ鎖２ｂｃ型は、前述した２ａｂｃ
型と比較して大きさが１５ｋＤ以上も相違する（４０ｋ
Ｄに対して５５ｋＤ）。この相違は、５ｋＤ短いポリペ
プチド骨格（３５ＫＤに対して４０ｋＤ）及び炭水化物
量の減少（５ｋＤに対して１５ｋＤ）によって説明され
る。２ｂｃ型の約３５ｋＤのポリペプチド骨格は、１型
からそれを区別することに役立つ：ちなみに１型の骨格
は４０ｋＤである。

【００４８】同様に、γＴＣＲポリペプチド２ｂｃ型
は、定常領域（Ｃγ）遺伝子セグメントの使用において
１型及び２ａｂｃ型と相違する。１型のγＴＣＲ鎖は、
単一のＣＩＩエキソンを含むＣγ１遺伝子セグメントに
よってコードされる定常領域を有する（Ｋｒａｎｇｅｌ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：
６４−６７）。２ａｂｃ型γポリペプチドは、３つのＣ
ＩＩエキソンコピー、すなわちコピーａ、コピーｂ及び
コピーｃを含むＣγ２遺伝子セグメントによってコード
される（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７； Ｌｉｔｔｍａｎ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ３２６：８５
−８８）。これに対し、２ｂｃ型は、２ａｂｃ型のｃＤ
ＮＡに存在するＣγ２第２エキソンによってコードされ
た配列の１コピーを欠いている。このことにより、２ｂ
ｃ型は２つのＣγ２ＣＩＩエキソンコピー、すなわちコ
ピーｂとコピーｃとを含有する。ＣＩＩのコピーａは、
２ｂｃ型では欠失しているが、膜を貫く領域と細胞外定
常ドメインとの間の結合領域の一部分をコードする。

【００４９】６個の潜在的Ｎ結合炭水化物付着部位は、
２ｂｃ型ポリペプチド上に存在する。生化学データよ
り、２〜３個のＮ結合グリカンだけがポリペプチド鎖に
付着していることが示唆され、全ての潜在的部位が使用
されるわけではないことが示唆された。特別の実施態様
において、γＴＣＲポリペプチド２ｂｃ型は、ＭＯＬＴ
−１３（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３０：５６９−５７２）Ｔ細胞系又は胸腺由来ク
ローンＩＩ（Ｂａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２２：１７９−１８１）の細胞から得られ
る。また、γＴＣＲ鎖２ｂｃ型は、そのγＴＣＲ型を発
現している被験者のＴリンパ球から得られる。２ｂｃ型
のγＴＣＲポリペプチドは、図１４に示されるγＴＣＲ
ポリペプチドの一次アミノ酸配列又はＣγ２のＣＩＩの
コピーｂとコピーｃとからなる定常領域を含むそれらの
いかなる部分をも含む。

【００５０】また、本発明は、分子量約４０，０００ダ
ルトンのγＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチドをコードする
核酸分子を提供する。γＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチド
の定常領域は、３つのＣγ２のＣＩＩエキソンのうち２
つだけを有する核酸配列の翻訳によって生ずる。同様
に、本発明はまた、２つのＣＩＩエキソンだけを有する
Ｃγ２定常領域を含む核酸配列に関する。核酸は、ＤＮ
Ａ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらに相補的な核酸及びそ
れらの誘導体である。本発明の特別な実施態様において
は、ＤＮＡ分子は、図１４に示す核酸配列の少なくとも
一部を含む。第８節で議論する実施例では、２ｂｃのγ
ＴＣＲポリペプチド及びそのコード核酸配列を記載す
る。第９節で議論する実施例では、γＴＣＲポリペプチ
ドのジスルフィド結合を形成するかどうか、又はグリコ
シル化されるかどうかはその定常領域一次配列によって
決定されることを示す。

【００５１】５．２．γＴＣＲ ２ｂｃ型含有ポリペプ
チド複合体 また、本発明は、γＴＣＲ鎖２ｂｃ型を含むポリペプチ
ド複合体に関する。特別の実施態様において、ポリペプ
チド複合体はＴ細胞抗原レセプターダイマーからなる。
とりわけ、このようなダイマーは、ヘテロダイマー
（γ，δヘテロダイマー、γ，βヘテロダイマー、及び
α，γヘテロダイマー、又はγ’がγＴＣＲポリペプチ
ド１型、２ａｂｃ型又は２ｂｃ型であるγ，γ’ヘテロ
ダイマーなどを含むが、それらに限定されることはな
い）又はホモダイマーである。

【００５２】本発明の特別な実施態様において、γＴＣ
Ｒ ２ｂｃ型を含むポリペプチド複合体はγδＴＣＲヘ
テロダイマーである。このように、δＴＣＲポリペプチ
ド及びγＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチドの少なくとも一
部を含む精製された複合体が、本発明によって提供され
る。δポリペプチドは、少なくとも１つの鎖内共有結合
ジスルフィド結合を有してもよい。加えて、このポリペ
プチドは、分子量約４０，０００ダルトンのδＴＣＲポ
リペプチドを含んでもよい。

【００５３】下記実施例で詳細に示すように、γＴＣＲ
２ｂｃ型鎖はδＴＣＲ鎖を有する複合体と非共有結合
的に会合する。このようにして、γ２ｂｃ型は、ジスル
フィド結合していないＴＣＲ複合体を形成する。また、
γＴＣＲ鎖２ａｂｃ型は、δＴＣＲ鎖とジスルフィド結
合ではなく複合体を形成し、（例えば、ＩＤＰ２細胞上
で）、一方γＴＣＲ鎖１型は、δＴＣＲポリペプチドと
のジスルフィド結合複合体を形成する。

【００５４】下記第９節の実施例に示すように、γＴＣ
Ｒの定常領域ＣＩＩエキソンの使用（及びγＴＣＲ鎖の
一次配列）は、ＴＣＲγ及びδ間のジスルフィド結合の
存在の有無を決定するばかりでなく、γＴＣＲに付着し
た炭水化物量をも決定し、この炭水化物量は、細胞表面
のγＴＣＲタンパク質の大きさの相違に大きく寄与す
る。このようにして、本発明は、ある定義された分子内
結合（ジスルフィド結合又は非ジスルフイド結合）とγ
ＴＣＲグリコシル化の程度とを有するγδＴＣＲヘテロ
ダイマーの発現を促進する方法を提供し、そしてこれは
特別なγ遺伝子を発現することができる細胞中に特別な
γポリペプチド型をコードするγＴＣＲ遺伝子を導入
し、細胞がδＴＣＲ鎖を発現する工程を含んでなる。

【００５５】加えて本発明は、別のγＴＣＲポリペプチ
ド（例えば、１型、２ａｂｃ型又は２ｂｃ型）と会合し
た本発明のγＴＣＲ ２ｂｃ型ポリペプチドを含む精製
された複合体を提供する。本発明のある実施態様では、
２種のγＴＣＲポリペプチドが、少なくとも１つの鎖間
の共有ジスルフィド結合を介して互いに会合する。本発
明の別の実施態様では、２種のγＴＣＲポリペプチド
は、互いに非共有結合的に会合している。本発明のさら
に別の実施態様において、２種のγＴＣＲポリペプチド
は同一の定常ドメインを有する。また、本発明の異なる
実施態様では、２種のγＴＣＲポリペプチドは異なる定
常ドメインを有する。

【００５６】５．３．γδＴＣＲポリペプチドと反応性
のモノクローナル抗体 γ又はδＴ細胞抗原レセプターのエピトープに対するモ
ノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、培地中で継代可能な細
胞系によって抗体分子の産生を提供するいかなる技術を
使用しても調製することができる。これらの技術には、
最初にケーラーとミルンュタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎ
ｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５
６：４９５−４９７）によって記載されたハイブリドー
マ技術、より最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋ
ｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２）及びＥＢＶ−ハイブリ
ドーマ技術（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，１９８５ Ｍｏ
ｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓ
ｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ７７−９６）を挙げることができる
が、これらに限定されるものではない。

【００５７】ある実施態様では、モノクローナル抗体
は、抗ヒトモノクローナル抗体又はキメラのヒト−マウ
ス（又は他の種の）モノクローナル抗体であってもよ
い。抗ヒトモノクローナル抗体は、当該技術分野で公知
の多くの技術のいずれを用いて作製してもよい（例え
ば、Ｔｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：７３０
８−７３１２； Ｋｏｚｂｏｒ ｅｔ ａｌ．，１９８
３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ４：７２−７
９； Ｏｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｍｅｔ
ｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：３−１６）。ヒト定常領域
を有するマウス（又はラット又は他の種の）抗原結合ド
メイン含有キメラ抗体分子を調製してもよい（Ｍｏｒｒ
ｉｓｏｎ ｅｔａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１；
Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１４：４５２）。

【００５８】また、本発明は、Ｔ細胞抗原レセプターと
反応性を有するモノクローナル抗体の同定法に関する。
このようなｍＡｂは、Ｔ細胞抗原レセプターとＣＤ３複
合体の両方を発現する細胞にｍＡｂを結合させるとＣＤ
３抗原をコモジュレートする能力を検出することによっ
て同定するとができる。ＣＤ３のコモジュレーション
は、例えば、細胞が結合する標識抗ＣＤ３抗体の量を測
定することによって検出することができる。この方法
は、後述の第７．１．１節の実施例で示すが、そこでは
抗Ｖδ ｍＡｂであるδＴＣＡＲ−３を分泌するハイブ
リドーマを同定するために使用する。

【００５９】γ又はδＴＣＲポリペプチドのエピトープ
に対する抗体の分子クローンは、公知の技術によって作
製することができる。組み換えＤＮＡの方法（例えば、
Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ
ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）は、モノクローナ
ル抗体分子、又はそれらの抗原結合領域をコードする核
酸配列を構築するために使用してもよい。

【００６０】抗体分子は、公知の方法、例えば、免疫吸
着又はイムノアフィニティークロマトグラフィー、ＨＰ
ＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）などのクロマトグ
ラフィー法、又はそれらを組み合わせた方法等によって
精製してもよい。イディオタイプ分子を含む抗体のフラ
グメントは、公知の技術によって作製することができ
る。このようなフラグメントには、例えば、抗体分子の
ペプンン消化によって産生できるＦ（ａｂ’）_２フラグ
メント、Ｆ（ａｂ’）_２フラグメントのジスルフィド結
合を還元することによって作製できるＦａｂ’フラグメ
ント、及び抗体分子をパパインと還元剤とによって処理
して作製できるＦａｂフラグメントがあるが、これらに
限定されるのものではない。

【００６１】本発明の一実施態様は、δＴＣＲ鎖の可変
領域に反応性を有するモノクローナル抗体に関する。か
かる抗体はδＴＣＡＲ−３（ａｋａ ＴＣＳ δ１）
（第７節参照のこと）であり、特異的なδ遺伝子の再編
成によって発現されたエピトープを認識する。第７２節
で記載するようにｍＡｂ δ ＴＣＡＲ−３は、γ，δ
^＋Ｔリンパ球の増殖を促進することができる。また、モ
ノクローナル抗体δＴＣＡＲ−３は、γ，δ^＋Ｔリンパ
球の細胞質の遊離カルンウムイオン濃度の上昇を促進す
ることができる。

【００６２】別の実施態様においては、本発明は、γ又
はδＴＣＲポリペプチドの定常領域と反応性を有する抗
体に関する。特別な実施態様においては、本発明はδＴ
ＣＲ鎖定常領域と反応するｍＡｂ ＴＣＲδ１に関する
（第６節参照のこと）。また別の実施態様においては、
本発明はγＴＣＲ鎖の定常領域と反応するｍＡｂ抗Ｃγ
ｍ１に関する（第８．１．７節参照のこと）。

【００６３】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるも
のではない。 ６．ＴＣＲデルタサブユニット定常領域と特異的な反応
性を有するモノクローナル抗体抗ＴＣＲ δ１の生成 ６．１．実験手順 ６．１．１．抗ＴＣＲ δ１を有するＴ細胞系のサイト
フルオログラフィー分析 δＴＣＲ鎖の定常領域と特異的に反応する抗ＴＣＲ δ
１のｍＡｂを、以下のように作製した。１ｇのＰＥＥＲ
細胞を５０ｍＬの０．３％のＣＨＡＰＳ（３−［３−ク
ロロアミドプロピルジメチル−アンモニノ］１−プロパ
ンスルホネート）界面活性剤中で可溶化し、１μＬのＵ
ＣＨＴ１腹水（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｐ．Ｃ．，ａｎｄ
Ｃａｌｌａｒｄ．１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１１：３２９−３３４）］、５００μＬのｍＡｂ１
８７．１培養上清及びＳＡＣＩ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ株）で免疫沈
降させた。６週間間隔で４回、腹腔内注射を行ない、つ
いで、２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用して免疫複
合体からγδＴＣＲを選択的溶出により単離したγδＴ
ＣＲ（ＣＤ３なし）で最終の追加免疫を行なった。溶出
物質を、静脈内及び腹腔内の双方に投与した。この最終
免疫の４日後にマウスを殺し、前述のように融合を行な
った（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０２−１５０
９）。

【００６４】γδＴＣＲ細胞系のＰＥＥＲ及びＩＤＰ２
又はαβＴＣＲ細胞系のＨＰＢ−ＭＬＴ及びＪＵＲＫＡ
Ｔを５０μＬの抗ＴＣＲ δ１培養上清で染色し、続い
てＦＩＴＣ結合ヤギ抗マウスＩｇ Ｆ（ａｂ）’_２フラ
グメントを用いて染色し、オルソ社製のサイトフルオロ
グラフで分析した（図１参照のこと）。対照はＰ３Ｘ６
３．Ａｇ８ハイブリドーマ（Ｐ３）によって分泌される
ｍＡｂとし、抗ＣＤ３ｍＡｂは抗Ｌｅｕ４とした（Ｌｅ
ｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，１９８１，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：３１０）。

【００６５】６．１．２．ｍＡｂ 抗ＴＣＲ δ１の特
異性の免疫化学的分析 表面^１２５Ｉ標識ＩＤＰ２細胞を可溶化し、それらのタ
ンパク質を対照のｍＡｂであるＰ３、抗Ｌｅｕ４、抗Ｔ
ＣＲ δ１又は抗Ｃγ血清を用いて免疫沈降させた。沈
降サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いてオート
ラジオグラフィーを行なった。ＣＨＡＰＳ界面活性剤中
で残っているγδＴＣＲとＣＤ３とは会合し、抗Ｌｅｕ
４によって複合体として免疫沈降した（図２、レーン３
と４）。しかしながら、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１０
０界面活性剤中で可溶化した後、抗ＴＣＲ δ１はγδ
ＴＣＲをＣＤ３なしでダイマーの複合体として免疫沈降
させ（レーン６）、抗Ｌｅｕ４はＣＤ３をγδＴＣＲな
しで三量体の複合体として免疫沈降させた（レーン
５）。

【００６６】γδＴＣＲ−ＣＤ３成分鎖を分離した後、
抗ＴＣＲ δ１はＴＣＲ δだけを免疫沈降させ（レー
ン７と８）。一方、抗Ｃγ血清はＴＣＲγだけを免疫沈
降させた（レーン９）。鎖の分離実験のため（レーン７
〜９）、ＣＨＡＰＳ可溶化ＩＤＰ２細胞からの抗Ｌｅｕ
４免疫沈降物を１％ＳＤＳ中で煮沸し、その後４容の２
％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し、抗ＴＣＲ δ１
又は抗Ｃγ血清で免疫沈降を行った。この後、以前に、
用いた手順を行なう（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ
ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４
５）。

【００６７】６．１．３．ＴＣＲ δポリペプチドのＮ
−結合グリコシル化 ^１２５ Ｉ標識したＩＤＰ２細胞を０．３％のＣＨＡＰＳ
で可溶化し、抗Ｌｅｕ４で免疫沈降し、ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによって分離した（図３）。対照レーンはｍｏｃｋ消
化ＩＤＰ２のδＴＣＲポリペプチドである。δＴＣＲポ
リペプチドのＮ−グリカナーゼ消化は次のように行なっ
た。δＴＣＲをゲルスライスから溶出させ、３７℃で１
６時間、０．１７％のＳＤＳ、１．２５％のＮｏｎｉｄ
ｅｔ Ｐ−４０を含む３０μＬの０．２のＭリン酸ナリ
トウムバッファー（ｐＨ８．６）中でＮ−グリカナーゼ
（Ｇｅｎｚｙｍｅ Ｃｒｏｐ．）消化を行なった（Ｔａ
ｒｅｎｔｉｎｏ，Ａ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，１９８５，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ２４：４６６５）。消化した
δＴＣＲサンプル又はｍｏｃｋインキュベートδＴＣＲ
サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析し、オートラ
ジオグラフィーで可視化した。

【００６８】６．１．４．ｍＡｂ抗ＴＣＲ δ１による
ｃＤＮＡクローンＩＤＰ２０−２４０／３８のｉｎ ｖ
ｉｔｒｏ翻訳生成物の認識 ｐＧＥＭ−３−０−２４０／３８と命名したプラスミド
を次のように構築し、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写−翻訳に使
用した（図４）。ＩＤＰ２０−２４０／３８（δＴＣ
Ｒ）ｃＤＮＡクローンの１．５ｋｂのインサートは、成
分グループＯの配列のコドン７の範囲内で始まり、そし
て残っているコード領域及び大部分の３’非翻訳領域を
含む。このインサートを、部分ＥｃｏＲＩ消化によって
（内部のＥｃｏＲＩ部位の開裂を防止するために）λｇ
ｔ１０アームから単一のＥｃｏＲＩフラグメントとして
切断した。このフラグメントをＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ＋
ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）へサブクローニング
した。その後、このインサートをベクターから単一のＢ
ａｍＨＩ−ＳａｌＩフラグメント（末端はＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクターのポリリンカーからのものである）と
して削除し、ｐＧＥＭ−３（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔ
ｅｃｈ）のＴ７プロモーターの下流に方向性クローニン
グ（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｃｌｏｎｉｎｇ）した。
生成されたｐＧＥＭ３−０−２４０／３８プラスミドを
ＳａｌＩで直鎖状にし、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用
いて合成された転写物をキャップした（Ｋｒａｎｇｅ
ｌ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２３７：６４）。転写物の完全性及び大きさを、
^３２Ｐ−ＡＴＰを含有するアリコートの反応混合物によ
りモニターした。１．５ｋｂの一本鎖のＲＮＡ種が観察
された。^３５Ｓ−メチオニン存在下におけるｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ翻訳を、ウサギ網状赤血球溶解物中で行なった。

【００６９】ｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳の後、サンプルを２
ｍＭのジチオスレイトールとともに１％ＳＤＳ中で沸騰
させ、２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むトリス緩
衝生理食塩水（ｐＨ７．５）を１０容加えた。サンプル
を対照のｍＡｂ Ｐ３（図５のレーン１と３）又は抗Ｔ
ＣＲ δ１ ｍＡｂ（レーン２と４）で免疫沈降させ、
ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、続いてフルオログラフィー
を行なった（Ｂｏｎｎｅｒ，Ｗ．Ｊ．ａｎｄ Ｌａｓｋ
ｅｙ Ｒ．Ａ．，１９７４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．４６：８３−８８ ）。

【００７０】６．２．実験結果 我々は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である抗ＴＣＲ
δ１を作製した。これはδＴＣＲ定常領域と特異的な
反応性を有していた。ＰＥＥＲ細胞系からのγδＴＣＲ
−ＣＤ３複合体（Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，ｅｔａｌ．，１９
８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．８３：６９９８−７００２； Ｂｒｅｎｎｅ
ｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ
３２５：６８９−６９４）を、抗体分泌ハイブリドー
マ細胞系の産生における免疫原として使用した。ハイブ
リドーマを、細胞表面結合（細胞フルオログラフ分析）
及びＰＥＥＲ細胞タンパク質の免疫沈降の双方によって
スクリーニングし、続いてＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。

【００７１】２種のハイブリドーマの上清（５Ａ６と４
Ａ１）は、ＰＥＥＲ細胞表面に結合した。サブクローニ
ングの後、１つのｍＡ（５Ａ６．Ｅ９、このモノクロー
ナル抗体は、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ＡＴＣＣ）に１９８８年０７月２７日付けで寄託さ
れ、受託番号ＨＢ９７７２が付与されている）の特徴づ
けをさらに行なった。このｍＡｂはγδＴＣＲリンパ球
（ＰＥＥＲ，ＩＤＰ２）表面に結合するが、αβＴＣＲ
細胞（ＨＰＢ−ＭＬＴ、ＪＵＲＫＡＴ）又は非Ｔ白血球
（図１、データは示していない）とは反応しなかった。
免疫原はγδＴＣＲとＣＤ３との複合体からなるが、γ
δＴＣＲ細胞系に対するｍＡｂのより大きな親和性は、
このｍＡｂがＣＤ３の抗原決定基に対するものではない
こと示唆した。

【００７２】ｍＡｂの特異性は、各種の界面活性剤を使
用する免疫沈降の研究で決定されたが、これらの界面活
性剤はレセプター複合体を含むタンパク質の会合に影響
を与えるものである。^１２５Ｉ標識ＩＤＰ２細胞をＣＨ
ＡＰＳ界面活性剤で可溶化した後、ＴＲγとδ、及びＣ
Ｄ３のγ、δ及びεサブユニットの会合した複合体の残
存部分が抗ＣＤ３抗体によって免疫沈降した（図２、レ
ーン３と４）。しかしながら、放射性標識ＩＤＰ２細胞
を２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００界面活性剤で可溶化
すると、γδＴＣＲとＣＤ３とは大部分が解離し、抗Ｃ
Ｄ３ｍＡｂを使用すると、ＣＤ３の選択的な沈降が生じ
た（図２、レーン５）。後者の条件において、ｍＡｂ
５Ａ６．Ｅ９は会合されたＣＤ３なしでヘテロダイマー
としてγδＴＣＲを免疫沈降させた（図２レーン６）。

【００７３】この観察から、ＴＣＲ γとＴＣＲ δと
はジスルフィド結合していないヘテロダイマーとして存
在しているという最初の直接的な証拠が提供された。ｍ
Ａｂ５Ａ６．Ｅ９がγＴＣＲ鎖、δＴＣＲ鎖又は組合わ
せの抗原決定基と反応するかどうかを決定するために、
分離されたポリペプチド鎖の免疫沈降が行なわれた。放
射性標識され、ＣＨＡＰＳで可溶化されたＩＤＰ２細胞
からの抗Ｌｅｕ４免疫沈降物を１％ＳＤＳ中で沸騰さ
せ、γＴＣＲ、δＴＣＲ及びＣＤ３タンパク質を解離さ
せた。

【００７４】４容の２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希
釈した後、ｍＡｂ ５Ａ６．Ｅ９は特異的に４０ｋＤ
（δＴＣＲ）種を免疫沈降させた（図２、レーン７）。
１アリコートの同じの免疫沈降物を還元条件下で分析す
ると（図２、レーン８）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの移動度の
劇的なシフトが観察された。この現象は、ＩＤＰ２とＰ
ＥＥＲ細胞系からのδＴＣＲに特徴的である（Ｂｒｅｎ
ｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３２５：６８９−６９４）。対照的に、分離鎖が抗
Ｃγ血清とともに免疫沈降された場合には、５５ｋＤ種
（γＴＣＲ）は免疫沈降したが、４０ｋＤ種（δＴＣ
Ｒ）は免疫沈降しなかった（図２、レーン９）。これら
の生化学的研究及び表面結合の研究に基づいて、ｍＡｂ
５Ａ６．Ｅ９を抗ＴＣＲ δ１という。ＰＥＥＲとＩ
ＤＰ２に加えて、抗ＴＣＲ δ１もまた、ＭＯＬＴ−１
３及びＰＢＬ系２を含む他のγδＴＣＲ細胞系からＴＣ
Ｒ δを免疫沈降させた。次の実験では、抗ＴＣＲ δ
１はＴＣＲ δ定常（Ｃ）遺伝子セグメントによってコ
ードされる抗原決定基と反応することが示された。

【００７５】我々は、ＴＣＲ δサブユニットをコード
する遺伝子を表示するサブトラクティブアプローチによ
って、ＩＤＰ２細胞系（例えば、Ｏ−２４０／３８）か
らｃＤＮＡクローンを単離した。サザンブロット実験に
おいて、ＩＤＰ２グループＯのｃＤＮＡクローンがハイ
ブリダイズする遺伝子はγδＴＣＲリンパ球において、
発現され、再編成されるが、αβＴＣＲ細胞においては
発現されない（そして、しばしば欠損している）。他の
ＴＣＲ遺伝子との配列比較によると、これらのｃＤＮＡ
クローンは、新規なＶ、Ｄ、Ｊ及びＣ遺伝子セグメント
からなるらしい。ＩＤＰ２グループＯコンポジットのＤ
ＮＡ配列は、２つの潜在的アスパラギン結合グリコシル
化部位を有し、分子量が３１．３キロダルトンであるこ
とが予測される長いオープンリーディングフレームを含
む。グリコンル化されていないδＴＣＲタンパク質の分
子量と成熟したＩＤＰ２のδＴＣＲポリペプチド上に存
在するアスパラギン結合炭水化物の数を決定するため
に、ゲル精製δＴＣＲをＮ−グリカナーゼ処理又はｍｏ
ｃｋインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した（図
３）。Ｎ結合炭水化物を除くとみかけの分子量が５ｋＤ
減少し（４０ｋＤから３５ｋＤへ）、ＩＤＰ２のδＴＣ
Ｒ上に２種類の（２．５〜３ＫＤ）Ｎ結合グリカンが存
在することが示唆された。これは、図５の翻訳アミノ酸
配列から予想されるＮ結合グリカンの数とよく相関し
た。タンパク質のみかけの分子量は、３．７ｋＤと予想
されたものとは相違したが、一般的に一致した。

【００７６】ＩＤＰ２細胞上の抗ＴＣＲ δ１の反応
性、δＴＣＲポリペプチドに対する特異性及び部分変性
（ＳＤＳで煮沸）δＴＣＲの認識について、我々はこの
ｍＡｂがδＴＣＲのｃＤＮＡのクローンによってコード
されたポリペプチドを直接的に認識するはずであるか否
かを試験した。このようにして、ｃＤＮＡクローンＩＤ
Ｐ２ Ｏ−２４０／３８からのインサートをｐＧＥＭ−
３発現ベクター中、Ｔ７プロモーターの下流にサブクロ
ーニングした（図４）。その後、Ｔ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼでｉｎ ｖｉｖｏ生成された転写物を、ウサギの網
状赤血球溶解物系で使用し、^３５Ｓ−メチオニン存在下
におけるタンパク質の合成させた。ｉｎｖｉｔｒｏ転写
−翻訳の後、反応混合物を１％ＳＤＳ中で沸騰させ、１
０容の２％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で希釈し、イソ
タイプ適合型の対照のｍＡｂ又は抗ＴＣＲδ１のいずれ
かで免疫沈降させた。抗ＴＣＲ δ１ ｍＡｂは優先種
（３４ｋＤ）を特異的に免疫沈降させた（図５、レーン
４）。

【００７７】対照のｍＡｂを使用した場合（レーン
３）、ＲＮＡ転写物を除いた場合（レーン１と２）、又
はγＴＣＲ構築物を使用した場合には、免疫沈降物の中
にはこのようなバンドは観察されなかった。このように
して、ｍＡｂ抗ＴＣＲ δ１によって免疫沈降された放
射性標識種は、該合成物がＩＤＰ２ Ｏ−２４０／３８
のｃＤＮＡクローンによって特異的に合成されたδポリ
ペプチドに対応する。このポリペプチド（３４ｋＤ）
は、Ｎ−グリカナーゼ処理されたＩＤＰ２のδＴＣＲ鎖
（３５ｋＤ）と比較して、大きさが非常に近い。ＩＤＰ
２ Ｏ−２４０／３８クローンは、リーダー配列と同様
に天然のＡＴＧ開始コドンを欠損している。このクロー
ンのＶ領域の範囲内に、２つの潜在的な内部ＡＴＧコド
ン（１２番残基及び４４番残基）がある（図５）。これ
らのコドンを使用して合成を開始すると、注目すべきマ
イナーな種に起因する２種以上のポリペプチド種が生じ
る（図５レーン４）。このようにして、クローンＩＤＰ
２ Ｏ−２４０／３８によってコードされるＩＤＰ２の
δＴＣＲサブユニットのｍＡｂ、抗ＴＣＲδ１による直
接的血清学的認識が存在する。

【００７８】７．ＴＣＲ δサブユニットの可変領域部
と特異的に反応する モノクローナル抗体δＴＣＡＲ−３
の生成 ７．１．実験方法 ７．１．１．Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降及びＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析 δＴＣＲ鎖の可変領域に特異的な反応性を有するδＴＣ
ＡＲ−３ ｍＡｂを、次のように作製した。１匹のマウ
スに２×１０^７個のＭＯＬＴ−１３細胞を腹腔内注射し
て免疫した。１ケ月後に、１×１０^７個のＭＯＬＴ−１
３細胞を３日間連続してマウスに静脈注射し、免疫脾臓
細胞を５０％のポリエチレングリコール１５００の存在
下でマウスのミエローマであるＰ３ｘ６３Ａｇ８．６５
３細胞と融合させた。ＣＤ３のコモジュレーションをフ
ローサイトメトリーで分析することによってハイブリド
ーマをスクリーニングした（ここで得られたハイブリド
ーマは、１９８７年１０月２９日付けでＡＴＣＣに寄託
され、受託番号ＨＢ９５７８が付与されている）。

【００７９】ＣＤ３のコモジュレーンョンの分析は、
α，βＴ細胞抗原レセプターに対する抗体を細胞ととも
にインキュベートしたときに、これらがＣＤ３複合体の
インターナリゼーンョンを引き起こすという観察に基づ
くものであった（Ｌａｎｉｅｒ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：２２８
６； Ｍｅｕｅｒ，Ｓ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
３，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５７：７０５）。ＭＯＬＴ
−１３、ＰＥＥＲ、及びＨＰＢ−ＡＬＬ細胞系は、ラク
トパーオキシダーゼ技術を使用してヨード化した。
^１２５Ｉ−βＦ１標識細胞を１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００を含有するトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ８）で可
溶化した。溶解産物をδＴＣＡＲ−３抗体又はβＦ１抗
体を用いて免疫沈降した。βＦ１はβＴＣＲ鎖に対する
フレームワークモノクローナル抗体であり、他の文献に
記載されている（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０
２−１５０９）。全サンプルを還元条件下又は非還元条
件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した（図６）。ＭＯＬＴ−
１３とＰＥＥＲは両方ともＣＤ３^＋４⁻８⁻ＷＴ３１⁻
であった。ＨＰＢはＣＤ３^＋４^＋８^＋ＷＴ３１^＋であっ
た。

【００８０】図６に示したように、δＴＣＡＲ−３はＭ
ＯＬＴ−１３及びＰＥＥＲ細胞からのジスルフィド結合
していないγ鎖及びδ鎖を免疫沈降させ、一方、βＦ１
はＨＰＢ−ＡＬＬ細胞からのジスルフィド結合したα鎖
及びβ鎖を免疫沈降させた。δ鎖及びγ鎖に対応するバ
ンド間のオートラジオグラフ強度の相違は、これらの二
種のタンパク質のヨード化の程度の相違を表わす。

【００８１】７．１．２ δＴＣＡＲ−３抗体によるδ
ＴＣＲ鎖の免疫沈降 図７は、０．３％ＣＨＡＰＳ（３−［（３−クロロアミ
ドプロピル（ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）ジメチ
ルアンモニ］１−プロパンスルホネート）を含むトリス
緩衝生理食塩水（ｐＨ８）又は１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００で可溶化された^１２５Ｉ−標識ＭＯＬＴ−１３
細胞を示す。１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００中で、γ
δＴＣＲはＣＤ３複合体から解離し、一方０．３％のＣ
ＨＡＰＳ中ではγδＴＣＲはＣＤ３複合体と会合して残
る。免疫沈降の前に、図７のレーン３、４及び７で使用
した^１２５Ｉ−標識溶解物を、終濃度１％になるまでＳ
ＤＳを加えて変性させ、続いて６８℃で５分間加熱し
た。冷却後、ヨードアセトアミドを終濃度が２０ｍＭと
なるまで加えた。この混合物を、４容の１．５％のＴｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むトリス緩衝生理食塩水（ｐ
Ｈ８）で希釈した。この変性プロセスにより、γ鎖、δ
鎖及びＣＤ３タンパク質が相互に完全に解離する。

【００８２】全てのサンプルを、還元条件下（Ｒ）であ
るレーン４のサンプルを除いて、非還元条件（Ｎ）下で
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析した。還元条件下及び非還元条件
下におけるδ鎖の移動度の相違に注意すべきである。γ
定常領域からの２０アミノ酸の合成ペプチドでウサギを
免疫して、抗Ｃγ抗血清を得た（残基１１７番〜１３６
番）。

【００８３】７．１．３．フローサイトメトリーによる
細胞表面染色分析 ５×１０^５個の細胞を適切な抗体（ＮＭＳ（正常マウス
血清）、δＴＣＡＲ−３、ＯＫＴ−３、又はＷＴ３１）
とともに４℃で３０分間インキュベートし、０．２％の
ＢＳＡを含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄した。フ
ルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧとともに４℃で３
０分間インキュベートした後、細胞をオルソ社製のサイ
トフルオログラフで分析した（図８）。

【００８４】７．１．４．δＴＣＡＲ−３^＋とＯＫＴ３
^＋末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）の二色サイトフルオログ
ラフ分析 最初に末梢液リンパ球をδＴＣＡＲ−３とともに４℃で
３０分間インキュベートした。洗浄後、この細胞をフィ
コエリトリン（ＰＥ）結合ヤギ抗マウスＩｇＧとともに
４℃でさらに３０分間インキュベートした。洗浄後、細
胞をフルオレセイン結合ＯＫＴ３とともに４℃で３０分
間インキュベートし、そして細胞をオルソ社製のサイト
フルオログラフで分析した（図９）。

【００８５】７．１．５．細胞質内Ｃａ^２＋濃度（［Ｃ
ａ^２＋］_ｉ）の経時測定 ＭＯＬＴ−１３細胞を、１０％ウシ胎児血清を添加した
ＲＰＭＩ１６４０中１０^７個／ｍＬの濃度で、温度３７
℃にて３０分間、Ｃａ^２＋感受性プローブｆｕｒａ２の
アセトキシメチルエステル型（ジメチルスルホキシド中
１ｍＭ濃度のストックから２μＭを使用（Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇｏｎ）
で標識した。その後、細胞を洗浄し、５％のウシ胎児血
清を添加したハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に１０^７
個／ｍＬ濃度で再懸濁し、使用するまで室温にて、暗所
で保存した。蛍光測定の直前に、２×１０^６個の細胞を
遠心分離し、２ｍＬの新鮮なＨＢＳＳに再懸濁し、３７
℃で石英キュベットに入れ、コンスタントに撹拌した。
ＳＰＦ−５００Ｃ蛍光検出器（ＳＬＭ Ａｍｉｃｏ，Ｕ
ｒｂａｎａ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）で細胞懸濁液の蛍光
を、３４０（±２）〜３８０（±２）ｎｍの間の励起波
長を用い、放出を５１０（±５）ｎｍで検出した。３５
０／３８０の比を自動的に計算し（２秒ごとに１つの
比）、プロットし、ＩＢＭ ＰＣ ＡＴに格納した。蛍
光の比からの［Ｃａ^２＋］_ｉの定量化は、Ｇｒｙｎｋｉ
ｅｗｉｃｓら（１９８５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
６０：３４４０）が記載したように行なった。不適当な
抗体を加えても［Ｃａ^２＋］_ｉは変化しなかったが、１
μＭの［Ｃａ^２＋］_ｉで細胞溶解が生じた。

【００８６】７．２．結果 我々は、モノクローナル抗体、δＴＣＡＲ−３を作製し
た。このモノクローナル抗体は、ＴＣＲ δ鎖の可変領
域に対するものであり、かつδポリペプチドを特徴づけ
るために使用することができる。このモノクローナル抗
体はγδＴＣＲを有するＴ細胞と結合し、またＭＯＬＴ
−１３細胞に結合するとｆｕｒａ−２のＣａ^２＋ングナ
ルを顕在化させる。

【００８７】δＴＣＡＲ−３モノクローナル抗体は、Ｃ
Ｄ３^＋４⁻８⁻ＷＴ３１⁻表現型を有するＭＯＬＴ−１
３細胞系でマウスを免疫することにより生成させた。最
初に、ハイブリドーマをＣＤ３コモジュレーションによ
ってスクリーニングした。さらに陽性クローンを免疫沈
降によってスクリーニングした。^１２５Ｉ標識ＭＯＬＴ
−１３及びＰＥＥＲ溶解物からのγδＴＣＲヘテロダイ
マーのδＴＣＲ−３免疫沈降を、図６に示した。δＴＣ
ＡＲ−３は、ＨＰＢ−ＡＬＬからいずれのポリペプチド
をも免疫沈降させなかった（図６）。対照的に、βＦ
１、すなわちβ鎖に特異的なフレームワークモノクロー
ナル抗体（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０２−１
５０９）は、ＨＰＢＢ−ＡＬＬ細胞系からαβヘテロダ
イマーを免疫沈降させた（図６、レーン１０及び１
２）。ＭＯＬＴ−１３とＰＥＥＲ細胞からの免疫沈降γ
δレセプターは、還元条件下又は非還元条件のいずれか
で分析した場合にも、これら二種類の細胞系においてジ
スルフィド結合していないγδＴＣＲを示唆するヘテロ
ダイマー構造を示した。非還元条件下で観察した場合と
比べて、還元条件下ではδ鎖の移動度が若干シフトし
（図６、レーン１と３、５及び７）、ＩＤＰ２とＰＥＥ
Ｒ細胞系で以前に注目された現象（Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４）は、鎖内ジスルフィド結合の存
在を示唆した。

【００８８】δＴＣＡＲ−３抗体がＣＤ３と会合したγ
δＴＣＲを認識することを示すために、０．３％のＣＨ
ＡＰＳ界面活性剤で可溶化した^１２５Ｉ標識ＭＯＬＴ−
１３細胞溶解物を使用して免疫沈降を行なった（図７、
レーン１）。これらの条件下で、レセプターと会合した
ＣＤ３複合体が残り、γδヘテロダイマー及びＣＤ３複
合体の両方はδＴＣＡＲ−３によって免疫沈降した。し
かしながら、^１２５Ｉ標識溶解物をγδレセプターから
のＣＤ３複合体と大きく解離させる１％のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００界面活性剤で可溶化すると、γδヘテロダ
イマーだけがδＴＣＡＲ−３によって免疫沈降する（図
７、レーン２）。対照として、抗ＣＤ３抗体、ＵＣＨＴ
−１（Ｂｅｖｅｒｌｅｙ，Ｐ．Ｃ．ａｎｄ Ｃａｌｌａ
ｒｄ，Ｒ．Ｅ．，１９８１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１１：３２９−３３４）は、ＣＤ３複合体だけを免
疫沈降させるが、γδヘテロダイマーは免疫沈降させな
い（図７、レーン５）。

【００８９】δＴＣＡＲ−３の特異性を、γ，δＴＣＲ
とＣＤ３タンパク質とが完全に解離した変性^１２５Ｉ標
識ＭＯＬＴ−１３溶解産物の免疫沈降を使用して分析し
た。δＴＣＡＲ−３は、非還元条件下におけるみかけの
分子量は３８ｋＤ（図７、レーン３）、還元条件下では
４０ｋＤ（レーン４）のδ鎖を特異的に免疫沈降させ
た。抗Ｃγ抗血清は、還元条件下で分子量４２ｋＤのγ
鎖を免疫沈降させた。これらのデータは、δＴＣＡＲ−
３がδ鎖特異的であることを示す。

【００９０】δＴＣＡＲ−３は、ＰＥＥＲ及びＭＯＬＴ
−１３細胞系からγ，δＴＣＲヘテロダイマーを免疫沈
降させるばかりでなく、これらの細胞系の表面及びＩＤ
Ｐ２クローンにも結合した（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．，ｅ
ｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９
−６９４）。δＴＣＡＲ−３は、αβＴＣＲ担持ＨＰＢ
−ＡＬＬとＪｕｒｋａｔ細胞系には結合しなかった（図
８）。対照的に、ＷＴ３１（Ｔａｘ，Ｗ．Ｊ．Ｍ．，ｅ
ｔ ａｌ．，１９８３，Ｎａｔｕｒｅ ３０４：４４５
−４４７）、すなわちαβＴＣＲに対するフレームワー
クモノクローナル抗体は、αβＴＣＲ陽性ＨＰＢ−ＡＬ
Ｌ細胞系及びＪｕｒｋａｔ細胞系とは反応するが、γδ
ＴＣＲ陽性ＭＯＬＴ−１３、ＰＥＥＲ細胞及びＩＤＰ２
細胞（図８）とは反応しなかった。正常な末梢血液リン
パ球（ＰＢＬ）を試験すると、ＣＤ３^＋リンパ球のサブ
集団（０．９〜２．４％）はδＴＣＡＲ−３陽性であっ
た（図９）。組織培養プレート上に固定されたδＴＣＡ
Ｒ−３を正常ヒトＰＢＬの培養に使用した場合には、γ
δＴＣＲ陽性サブ集団の増殖を選択的に刺激した。培養
４５日後、γδＴＣＲサブ集団は全細胞数の９６％を示
した。

【００９１】αβＴ細胞抗原レセプターに対する抗体
は、細胞質の遊離カルシウムイオン濃度［Ｃａ^２＋］_ｉ
の上昇を刺激した（Ｗｅｉｓｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８６，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：５９
３）。ＭＯＬＴ−１３細胞とδＴＣＡＲ−３とのインキ
ュベーションにより、抗Ｔ３抗体によって誘導された応
答に類似する［Ｃａ^２＋］_ｉの急速な上昇を引き起こし
た（図１０）。さらに、δＴＣＡＲ−３は上述のよう
に、ＰＥＥＲ細胞及びＰＢＬから作られたγδＴＣＲ陽
性細胞系におけるのＣａ^２＋フラックスを同様に刺激し
た。また、我々は、ＭＯＬＴ−１３、ＰＥＥＲ、及びＩ
ＤＰ２細胞とδＴＣＡＲ−３とのインキュベーションに
よりＣＤ３タンパク質複合体のコモジュレーションが惹
起されることを観察した。さらにまた、ｍＡｂであるδ
ＴＣＡＲ−３のエピトープ特異性の他の特徴付け（ｍＡ
ｂ ＴＣＳ δ１という）を、後述の１１．２．２．節
に示す。

【００９２】８．ヒトＴ細胞レセプターγδの３つの
型： 選ばれた健常人における１の型の好適な用途 この実施例においては、ＴＣＲδ鎖と非共有結合的に会
合した４０ｋＤのＴＣＲγ糖タンパク質からなる、新し
い型のヒトＴ細胞レセプターγδ（γδＴＣＲ）の構造
を示す。２ｂｃ型という新たに同定されたγＴＣＲ糖タ
ンパク質は、上述したジスルフィド結合で架橋していな
いＴＣＲγ型（２ａｂｃ型）と比較して、大きさが１５
ｋＤ以上（５５ｋＤ対４０ｋＤ）相違する。この相違
は、ポリペプチド骨格が５ｋＤ小さく（４０ｋＤ対３５
ｋＤ）、炭水化物量が少ない（１５ｋＤ対５ｋＤ）によ
る。２ｂｃ型に対応するｃＤＮＡクローンのヌクレオチ
ド配列分析より、２ｂｃ型のｃＤＮＡクローンは、他の
ジスルフィド結合していないＴＣＲγサブユニット（２
ａｂｃ型）のｃＤＮＡ中に存在する、定常領域（ｃγ
２）の第２エキソンを１コピー欠いていることが明らか
になった。このＣＩＩエキソンコピーは、膜貫通領域と
細胞外定常ドメインとの間の結合部領域をコードする。
潜在的なＮ結合炭水化物付着部位の数及び局在はいずれ
のジスルフィド結合していない型と同じであるので、お
そらくはタンパク質のコンホメーションに影響を与える
ことによって、結合領域が付着炭水化物量に影響するも
のと結論された。対照的に、γδＴＣＲ型のδＴＣＲサ
ブユニットはペプチド骨格の大きさ又はペプチド地図分
析においては、ほとんど多様性を示さなかった。

【００９３】また、我々は末梢血におけるγδＴＣＲ複
合体の３つの型の使用について調べた。ジスルフィド結
合型（１型）は、ある健常被験者において、ほぼ排他的
に使用された。何人かでは、１型は２ｂｃ型とともに発
現された。２ａｂｃ型は、試験された被験者では同定さ
れなかった。

【００９４】８．１．実験方法 ８．１．１．抗体 使用したモノクローナル抗体は、抗Ｌｅｕ４（抗体ＣＤ
３）（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８１，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：３１０−３２３）、βＦ
１（抗βＴＣＲ）（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１
９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１５０２−１５
０９）、抗ＴＣＲδ１（抗δＴＣＲ）（前記第６節参照
のこと、δＴＣＲ鎖定常領域と反応性）、Ｐ３（対照）
（Ｐ３Ｘ６３．Ａｇ８によって分泌された抗体（Ｋｏｅ
ｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａ
ｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７）、１８７．１（ラ
ット抗マウスκ軽鎖）（Ｙｅｌｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，
１９８１，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ １：５−１１）、及び
ＷＴ３１（明るく染色するαβＴＣＲリンパ球）（Ｓｐ
ｉｔｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３５：１９２２−１９２８）であった。抗Ｃγｂ
ペプチド血清（抗γＴＣＲ）は、２２個からなるアミノ
酸合成ペプチドに対して得られた。（Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｌ
ｙｓ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｐｒ
ｏ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ
−Ｃｙｓ）（ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／００２０
９号、１９８８年１月１４日公開）。

【００９５】８．１．２．細胞系 ＰＥＥＲ（Ｗｅｉｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
３：６９９８−７００２）及びＭＯＬＴ−１３（Ｊ．Ｍ
ｉｎｏｗａｄａ，Ｌｏｈらによって単離された細胞、
Ｊ．Ｍｉｎｏｗａｄａ，Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７２）はＴ白血
病性細胞系である。臍帯血由来のクローンＷＭ−１４
（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：
３８６１−３８６５）、末梢血由来細胞系ＩＤＰ２（Ｂ
ｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ
３２２：１４５−１４９：ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ
８８／００２０９号、１９８８年１月１４日公開）、及
び胸腺由来クローンＩＩ（Ｂａｎｋ ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１７９−１８１）を、
前述のように培養した。末梢血由来細胞系２（ＰＢＬ−
Ｌ２）を、ｍＡｂ ＷＴ３１で染色されない末梢血単離
リンパ球を選別することによって単離した。その後、単
離細胞を、ＩＬ−２と１０％（ｖ／ｖ）ヒト血清とを含
有する１０％（ｖ／ｖ）馴化培地を添加したＲＰＭＩ１
６４０培地にて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させ、放射線
を照射した自己由来のフィーダー細胞で３週間ごとに刺
激した。

【００９６】８．１．３．ヨード化と免疫沈降 ２×１０^７細胞をフィコール−ジアトリゾエート（Ｏｒ
ｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋａ Ｃｏｒｐ．）遠心分離に
よって単離し、１００μｇのラクトパーオキシターゼ
（８０〜１００Ｕ／ｍｇ，Ｓｉｇｍａ）と１ｍＣｉのＮ
ａ^１２５Ｉ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ）を加えた、１ｍＭのＭｇＣｌ_２、５ｍＭのグルコー
スを含有する０．５ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ
７．４、ＰＢＳ）中で、氷上にてヨード化した。３０分
間の反応時間中、０．０３％の過酸化水素１０μＬを５
分間間隔で加えた。細胞を１ｍＭのフェニルメチルスル
ホニルフルオライド（ＰＭＳＦ，Ｓｉｇｍａ）と８ｍＭ
のヨードアセトアミド（ＩＡＡ，Ｓｉｇｍａ）を含有す
るＴＢＳ（５０ｍＭのトリス−ベース（ｐＨ７．６）、
１４０ｍＭ ＮａＣｌ）を添加した界面活性剤で、一夜
可溶化した。ここで示すように、この実験で使用する異
なる界面活性剤としては、０．３％（ｗ／ｖ）の３−
［（３−クロロアミドプロピルジメチルアンモニ）］１
−プロパン−スルホネート（ＣＨＡＰＳ，Ｓｉｇｍ
ａ）、１％（ｗ／ｖ）ジギトニン（Ａｌｄｒｉｃｈ）及
びＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＴＸ−１００，Ｓｉｇｍ
ａ）がある。

【００９７】１０，０００×ｇで２０分間遠心して不溶
性物質を除いた後、界面活性剤溶解物を４μＬの正常ウ
サギ血清（ＮＲＳ）と４００μＬの１８７．１ハイブリ
ドーマ培地とともに３０分間インキュベートすることに
よって予備清浄し、続いて固定化Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏ
ｃｃｓ ａｕｒｅｕｓ Ｃｏｗａｎ Ｉ（Ｐａｎｓｏｒ
ｂｉｎ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の１０％（ｗ／ｖ）細
胞懸濁液を２００μＬ加えた。１時間インキュベーンョ
ンした後、Ｐａｎｓｏｒｂｉｎを遠心分離により除去し
た。０．２５μＬのβＦ１の腹水、１μＬの１ｍｇ／ｍ
Ｌの抗Ｌｅｕ４又は０．２５μＬのＰ３の腹水を、１５
０μＬの１８７．１培養上清とともに各サンプルに加え
て特異沈降を行い、続いて１時間インキュベーションし
た。１００μＬの１０％（ｖ／ｖ）プロテインＡ−セフ
ァロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を加え、４℃で１時間
ロッキングした。免疫沈降物をＴＢＳを含有する０．１
％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて５回
洗浄し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）（Ｌａｅｍｍｌｉ，
１９７０，Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０−６８５）で
分析した。

【００９８】抗Ｃγｂペプチド血清を用いる免疫沈降用
のために、ヨード細胞をＴＢＳを含有する１％（ｗ／
ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化し、
ついで３分間沸騰させた。冷却後、ＰＭＳＦ及びＩＡＡ
を含み、２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含
むＴＢＳの５容量を、１ｍｇ／ｍＬのデオキンリボヌク
レアーゼ（ＤＮａｓｅ）と０．５ｍｇ／ｍＬのＲＮａｓ
ｅとを含む５０ｍＭ ＭｇＣｌ_２混合物２００μＬとと
もに加えた。予備清浄及び免疫沈降は、前記のように１
８７．１ｍＡｂを添加せずに行なった。免疫沈降物を
０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．
５％（ｗ／ｖ）のデオキシコレート（ＤＯＣ）、０．０
５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＢＳ中で洗浄した。

【００９９】８．１．４．生合成標識 ４×１０^７個の対数増殖期にある細胞を、１０％の透析
ウン胎児血清（ＦＣＳ）及び２０ｍＭへペスを加えた、
メチオニン及びシステイン不含ＲＰＭＩ１６４０（Ｓｅ
ｌｅｃｔ−Ａｍｉｎｅ ｋｉｔ，Ｇｉｂｃｏ）４ｍＬに
再懸濁した。３７℃で３０分間の欠乏状態に置いた後、
１ｍＣｉの^３５Ｓ−メチオニンと１ｍＣｉの^３５Ｓ−シ
ステインとを加え、１５分間標識した。細胞を集めて、
２％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＴＢ
Ｓで可溶化した。前記のように予備清浄及び免疫沈降を
行なった。免疫沈降物を０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔ
ｏｎ Ｘ−１００、０．５％（ｗ／ｖ）のデオキシコー
ル酸、０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含むＴＢＳで４
回洗浄し、続いて、０．５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００、０．５ＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＥＤＴ
Ａ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．６）で３回洗浄した。
このサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、標準的なフ
ルオログラフィー手順によって可視化した（Ｂｏｎｎｅ
ｒ ａｎｄ Ｌａｓｋｅｙ，１９７４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，４６：８３−８８）。

【０１００】８．１．５．δＴＣＲタンパク質のゲル精
製 表面ヨード化細胞を０．３％（ｗ／ｖ）のＣＨＡＰＳ−
ＴＢＳで可溶化し、５０μＬの抗Ｌｅｕ４結合セファロ
ースビーズを用いて免疫沈降させた。免疫沈降種を非還
元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、湿った
ゲルを４℃にて２４時間、ＸＡＲ−５フィルム（Ｋｏｄ
ａｋ）を感光させて、放射性標識δＴＣＲタンパク質を
可視化した。δＴＣＲに対応するゲル領域を除去し、５
％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエタノールを含むサンプ
ルバッファー中でインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
によって２回目の分離を行なった。還元による特徴的な
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度のシフトのために、δＴＣＲタ
ンパク質が分離し、夾雑物からの精製が可能となった。
ＴＣＲタンパク質を０．０５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含
有する５０ｍＭの炭酸水素アンモニウムバッファー中
で、３７℃にて、１夜インキュベートしてゲルスライス
から溶出させ、凍結乾燥した。

【０１０１】８．１．６．エンドグリコシダーゼ消化 エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ Ｈ）消化用のため
に、免疫沈降物質又はゲル精製タンパク質を、４０μＬ
の０．１４Ｍの２−メルカプトエタノールを含有する１
％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ溶液中で３分間沸騰させた。冷却
後、１ｍＭのＰＭＳＦを含有する０．１５Ｍの酢酸バッ
フアー（ｐＨ５．５）、３６０μＬで混合物を希釈し
た。５μＬのＥｎｄｏ Ｈ（１Ｕ／ｍＬのＥｎｄｏ−β
−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ Ｈ、Ｇｅｎｚｙｍ
ｅ）を、３７℃で１４時間、上記溶液の半量とともにイ
ンキュベートし、残りの半分をｍｏｃｋ処理した。

【０１０２】Ｎ−グリカナーゼ（Ｎ−ＧＬＹ）消化用
に、ゲル精製物を０．５％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含む
０．１０Ｍの２−メルカプトエタノール３５μＬ中で３
分間沸騰させた。その後、１００μＬの０．２Ｍのリン
酸ナトリウム（ｐＨ８．６）、１．２５％（ｖ／ｖ）の
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えた。混合物の半分を、
１μＬのＮ−グリカナーゼ（２５０Ｕ／ｍＬ、ペプチド
−Ｎ−［Ｎ−アセチル−β−グリコサミニル］アスパラ
ギン・アミダーゼ：Ｇｅｎｚｙｍｅ）とともにインキュ
ベートし、３７℃にてさらに１６時間インキュベート
し、一方、残りの半分をｍｏｃｋ処理した。消化後、ウ
ン血清アルブミン１０μｇをキャリアーとして加え、ト
リクロロ酢酸沈降によってサンプルを回収した。タンパ
ク質のペレットは、５％（ｖ／ｖ）の２−メルカプトエ
タノールを含有するサンプルバッファー中に集めた。

【０１０３】８．１．７．モノクローナル抗体抗Ｃγｍ
１産生 ＨＰＢ−ＭＬＴのｐＴγ−１のＣγＣＩエキソンとＣＩ
Ｉエキソンの部分を、ヌクレオチド位置５７１と８４８
でＢａｍＨＩとＰｓｔＩとを使用して単離し（Ｄｉａｌ
ｙｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：２６１９−
２６２３）、発現ベクターｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ）中にクローニングした。生じるプロテインＡ融
合タンパク質を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｎ４８３０で
発現させた。リゾチームを用いて細菌を溶解し、融合タ
ンパク質をＩｇＧセファロースカラムを用いた精製によ
って単離した。０、７及び２８日目に、融合タンパク質
１００μｇを含むフロイントアジュバントをマウスの腹
腔内に注射した。２８日後、融合タンパク質１００μｇ
を含むＰＢＳを静脈注射した。３日後、脾臓細胞を単離
し、ブレナー等の記載に従ってハイブリドーマＰ３×６
３Ａｇ８．６５３と融合させた（Ｂｒｅｎｎｅｒ ｅｔ
ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１３８：１
５０２−１５０９）。ハイブリドーマをＥＬＩＳＡ（ｅ
ｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏａｂｓｏｒｂ
ｅｎｔ ａｓｓａｙ）を用いてスクリーニングした（こ
こで得られたハイブリドーマは、１９８８年０７月２７
日付けでＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ９７７３が
付与されている）。９６ウエル平底プレート（ＬＩＮＢ
ＲＯ，Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、０．
４μｇの融合タンパク質又は非融合タンパク質を含むＰ
ＢＳを用いて一晩インキュベートした。２３℃にて、
０．２５ｍｇ／ｍＬの正常ウサギＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）
を含む、５０％（ｖ／ｖ）のＦＣＳ含有ＰＢＳを用いて
非特異結合部位をブロックした。５０μＬのハイブリド
ーマの上清を、４℃で１時間かけて加え、続いて５μｇ
／ｍＬのパーオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（Ｃａｐ
ｐｅｌ）５０μＬ中で、同様にインキュベートした。記
載したインキュベーションの全てに、１０％（ｖ／ｖ）
のＦＣＳ、０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含むＰＢＳを
使用した洗浄ステップを行った。０．０８％（ｗ／ｖ）
のｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）を含む０．０
１２％（ｗ／ｖ）過酸化水素含有リン酸−クエン酸塩バ
ッファー（ｐＨ５．０）を用いてＥＬＩＳＡを発色させ
た。

【０１０４】抗Ｃγｍ１（ＩｇＧ１）はサイトフルオロ
グラフ分析において天然のγδＴＣＲ／ＣＤ３複合体を
認識せず、また免疫沈降においてＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１
００可溶化細胞からのγδＴＣＲヘテロダイマーも認識
しないが、ＣＤ３／γδＴＣＲタンパク質を個別の鎖へ
分離した後、生合成標識γＴＣＲ前駆体及び成熟γＴＣ
Ｒタンパク質を認識する。この方法では、抗ＣＤ３免疫
沈降物を１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含むＴＢＳ中で沸騰さ
せることによって、ＣＤ３／γδＴＣＲ複合体を個々の
鎖へ分離させた後、抗Ｃγｍ１はγＴＣＲタンパク質を
認識することが示された。

【０１０５】８．１．８．ＭＯＬＴ−１３ γＴＣＲ
ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを尿素／塩化リチウム沈降によって
ＭＯＬＴ−１３細胞から調製し、続いてオリゴ（ｄＴ）
セルロースアフィニティクロマトグラフィーを行なっ
た。ヘアピンループ開裂用ナタ豆（Ｍｕｎｇ ｂｅａ
ｎ）ヌクレアーゼ（ＭｃＣｕｔｃｈａｍ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８４，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２５：６２６−６
２８）を用いるＨｕｙｎｈ等の方法（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｇｌｏ
ｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．ｅｄ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏ
ｒｄ，Ｉ：４９−７８）によって、λｇｔ１０ ｃＤＮ
Ａライブラリーをポリ（Ａ）^＋ＲＮＡから調製した。ｃ
ＤＮＡライブラリーを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｃ６０
０Ｈｆ１上で増幅させ、^３２Ｐ−標識ＰＴγＩをプラー
クフィルターハイブリダイゼーンョンによってスクリー
ニングした（Ｄｉａｌｙｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８
６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．
Ａ８３：２６１９−２６２３）。陽性クローンを大きさ
及び制限酵素地図について分析し、ｃＤＮＡクローンＭ
１３Ｋを配列決定のために選択した。Ｍ１３ＫのｃＤＮ
Ａを、エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩを用いてλｇｔ１
０ファージから切り出し、さらに適切な制限酵素で消化
した。フラグメントをＭ１３ベクターへサブクローニン
グし、修飾Ｔ７ポリメラーゼ（シーケナーゼ（Ｓｅｑｕ
ｅｎａｓｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．））を使用するジデオキシチ
ェインターミネーター法（ｄｉｄｅｏｘｙ ｃｈａｉｎ
ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって配列
決定した。

【０１０６】クローンＭ１３Ｋは、３６ヌクレオチドの
５’未翻訳領域と７２ヌクレオチドの３’非コード領域
とを含有する、フレーム内の、全長γＴＣＲ転写物に対
応する（図１４）。Ｖ領域のヌクレオチド配列は、推定
ングナル配列中におけるＣ〜Ｔ（Ｉｌｅ−Ｖａｌ）の５
３ヌクレオチド変化を除き、ゲノムＶγ１．３の配列と
同じである（Ｌｅｆｒａｎｃらに基づく命名：Ｌｅｆｒ
ａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６ａ，Ｃｅｌｌ ４５：
２３７−２４６：Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９
８７．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１２７１−１２１
９）。Ｊ領域はＪγ２．３の配列と同じである（Ｌｅｆ
ｒａｎｃらに基づく命名：Ｌｅｆｒａｎｃｅｔ ａ
ｌ．，１９８６ｂ，Ｎａｔｕｒｅ ３１９：４２０−４
２２： Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕｓ ｅｔ ａｌ，１９８
７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：２６８７−２６９
０）。驚くべきことに、８ヌクレオチドが、Ｖ−Ｊ結合
領域で生じた。これはゲノムＶ配列又はＪ配列によって
コードされていないらしく、かつ、おそらくＮ領域を表
わすＶ−Ｊ結合領域を表す。Ｃ領域の配列は、ヌクレオ
チド５５９（ＧからＣ：ＶａｌからＩｌｅ）及びヌクレ
オチド９０８（ＴからＣ；ＭｅｔからＴｈｒ）を除いて
対応ゲノム配列と一致する（Ｌｅｆｒｎａｃ ｅｔａ
ｌ．，１９８６ｃ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９６−９６００）。

【０１０７】８．２．結果 ８．２．１．新規γδＴＣＲタンパク質複合体 末梢血γδＴＣＲリンパ球の予備実験より、既知のヒト
γδＴＣＲ型と異なるＣＤ３会合複合体が存在すること
が示された。この型を叙述する試みにおいて、我々は正
常ヒトのドナー由来の多くの細胞系の作製と、特徴づけ
とを行なった。末梢血リンパ球はモノクローナル抗体
（ｍＡｂ）ＷＴ３１で染色され、それにより休止してい
るαβＴＣＲリンパ球が明るく染色される。染色されな
い細胞を細胞のソーティングによって単離し、ＩＬ−２
を含む培地中でｉｎ ｖｉｔｒｏで増殖させた。この方
法で得られた末梢血リンパ球系２（ＰＢＬ−Ｌ２）は、
均一にＣＤ３^＋ＣＤ４⁻ＣＤ８⁻であり、γδＴＣＲリ
ンパ球の細胞表面表現型の特徴であることが証明され
た。

【０１０８】ＰＢＬ−Ｌ２細胞上のγδ複合体を可視化
するために、ＣＨＡＰＳ又はジギトニンで可溶化した細
胞表面^１２５Ｉ標識細胞からの抗ＣＤ３ ｍＡｂを用い
て免疫沈降法を行なった。これらの界面活性剤中では、
ＣＤ３複合体とγδＴＣＲサブユニットとの間で物理的
会合が保持された。ＰＢＬ−Ｌ２細胞からの抗ＣＤ３免
疫沈降物のＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、４０ｋＤと４４ｋＤ
のタンパク質（４０ｋＤタンパク質という）が分離され
た。これらは、抗Ｃγｂ血清（γＴＣＲ定常領域ペプチ
ドに対する抗血清）によってγＴＣＲサブユニットとし
て同定されるタンパク質である（第１１Ａ図、方法の節
を参照のこと）。

【０１０９】ＰＢＬ−Ｌ２上のこれらのγＴＣＲタンパ
ク質は非共有結合的にδＴＣＲサブユニットと会合して
おり、非還元条件下で分析された抗ＣＤ３免疫沈降物中
に弱いヨード化タンパク質として可視化された（図１１
Ａ、レーン６、黒い矢印）。この弱いヨード化タンパク
質は、抗Ｃγｂ血清によって認識されないので、ＰＢＬ
−Ｌ２細胞上のδＴＣＲサブユニットを表わす（図１１
Ａ、レーン８）。加えて、ＩＤＰ２及びＰＥＥＲ細胞上
のδＴＣＲタンパク質について明記したように（下記、
ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／００２０９号、１９８
８年１月１４日公開を参照せよ）、非還元条件下及び還
元条件下において同じＳＤＳ移動度シフト比較分析を示
した。δＴＣＲタンパク質は、還元後は見ることができ
ない（図１１Ａ。レーン３）。なぜなら、４０ｋＤの移
動（下記）とともに移動し、そして類似の大きさのγＴ
ＣＲタンパク質（白い矢印）に妨害されるためである。

【０１１０】γδＴＣＲ型は、正常な末梢血Ｔリンパ球
上に存在するばかりでなく、胸腺由来クローンＩＩ細胞
（図１１Ｄ）及びＴ白血病細胞系ＭＯＬＴ−１３（図１
１Ｅ）上でも観察される。これら三種類の細胞系は、γ
ＴＣＲ種を有する。これらの３つの細胞系は、ＰＢＬ−
Ｌ２（４０ｋＤと４４ｋＤ：図１１Ａ、レーン８）及び
クローンＩＩ細胞（４０ｋＤと４４ｋＤ：図１１Ｄ、レ
ーン８）上で観察されたγＴＣＲタンパク質のダブレッ
ト、又はＭＯＬＴ−１３細胞上で観察された拡散的に標
識されたγＴＣＲタンパク質のバンド（４０〜４６ｋ
Ｄ：図１１Ｅ、レーン６）を生ずる差別的なグリコンル
化を表示するγＴＣＲ種を有する。ＭＯＬＴ−１３のγ
ＴＣＲタンパク質バンドを二次元ゲル分析［ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにかけ、ついで非平衡ｐＨグラジェント電気泳動
（ＮＥＰＨＧＥ）］すると、２つの平行なγＴＣＲ種が
分離され、その中で４４ｋＤのγＴＣＲ種は４０ｋＤ種
と比べて、別の高マンノース（又はハイブリッド）Ｎ−
結合グリカンを含有する。このように、３種類の異なる
細胞源（末梢血、胸腺及び白血病）から単離されたこの
レセプター複合体のγＴＣＲサブユニットから、δＴＣ
Ｒパートナー鎖と非共有結合的に会合した４０ｋＤの細
胞表面種が明らかにされた。

【０１１１】ＰＢＬ−Ｌ２、クローンＩＩ及びＭＯＬＴ
−１３細胞上のγδＴＣＲ型を比較するために、ＩＤＰ
２とＷＭ−１４細胞系上の既知の型について調べた。Ｉ
ＤＰ２細胞系（ＰＣＴ国際公開番号第ＷＯ８８／００２
０９号、１９８８年１月１４日公開、Ｂｒｅｎｎｅｒ
ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２；１４
５−１４９）は、より大きな５５〜６０ｋＤのγＴＣＲ
タンパク質（５５ｋＤという）を含有し、それは抗Ｃγ
ｂ血清によって認識される（図１１Ｂ）。抗ＣＤ３免疫
沈降物を非還元条件で調べたところ、ＩＤＰ２のγＴＣ
Ｒタンパク質がδＴＣＲパートナー鎖と非共有結合的に
会合することが明らかになった（図１１Ｂ、レーン４、
黒い矢印）。還元すると、δＴＣＲタンパク質は、ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ移動度において相対分子量４０ｋＤにを示
した（図１１Ｂ、レーン４、黒い矢印と図１１Ｂ、レー
ン２、白い矢印を比較のこと）。

【０１１２】非共有結合的に会合したγδＴＣＲ型とは
対照的に、末梢血由来Ｔ細胞クローン、ＷＭ−１４は７
０ｋＤのジスルフィド結合ＴＣＲダイマーを生成し（図
１１Ｃ、レーン７）、抗Ｃγ血清によって認識された
（Ａｌａｒｃｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：
３８６１−３８６５）。また、このダイマーは、δＴＣ
Ｒサブユニットに対するｍＡｂである抗ＴＣＲδ１（図
１１Ｃ、レーン５）によっても認識され、それゆえγδ
ＴＣＲヘテロダイマーを表わす。還元条件下で分析する
と、３６ｋＤ、４０ｋＤ及び４３ｋＤの３種類のγＴＣ
Ｒタンパク質を表わした（４０ｋＤという）。

【０１１３】このように、ＰＢＬ−Ｌ２、クローンＩＩ
及びＭＯＬＴ−１３細胞上のＣＤ３会合複合体は、既知
型と比較して新規なγδＴＣＲヘテロダイマーを構成す
る。その理由は、そのＴＣＲγサブユニットが４０ｋＤ
（ＷＭ−１４細胞上のジスルフィド結合Ｃγ１コードす
るγＴＣＲタンパク質の大きさに類似する）であるが、
そのパートナー鎖（ＩＤＰ２細胞上の５５ｋＤＣγ２コ
ードγＴＣＲタンパク質に類似する）にジスルフィド結
合しないことによる。この複合体分子の基礎を理解する
ために、そのγＴＣＲとδＴＣＲサブユニットのより詳
細な構造分析は、実施例としてＭＯＬＴ−１３細胞系を
使用して下記のように行なった。

【０１１４】８．２．２．ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲサ
ブユニットのコアポリペプチドの大きさ ＭＯＬＴ−１３細胞（４０ｋＤのγＴＣＲ糖タンパク
質）のγＴＣＲコアポリペプチドの大きさを決定し、か
つＰＥＥＲ細胞（５５ｋＤのγＴＣＲ糖タンパク質）の
ものと比較するために、両細胞系を^３５Ｓ−メチオン及
びＳ−システインの存在下で１５分間生合成的に標識
し、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で可溶化し、その後抗Ｃ
γｍ１（γＴＣＲ鎖を特異的に認識するモノクローナル
抗体）（図１３Ａ、方法を参照のこと）を用いて免疫沈
降させた。その後免疫沈降物質をエンドグリコシダーゼ
Ｈ（Ｅｎｄｏ Ｈ）消化し、未熟Ｎ結合グリカンを除い
た。ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲポリペプチド骨格は、３
５ｋＤの相対分子量を有し（図１３Ａ、レーン８）、Ｐ
ＥＥＲのγＴＣＲコアポリペプチド（４０ｋＤ：第１３
Ａ図、レーン４）又はＩＤＰ２のγＴＣＲコアポリペプ
チド（４０ｋＤ、国際公開番号第ＷＯ８８／００２０
９、１９８８年１月１４日公開、参照のこと）よりも５
ｋＤ小さい。ＭＯＬＴ−１３細胞は、５ｋＤ小さいため
にＩＤＰ２及びＰＥＥＲのγＴＣＲコアポリペプチドか
ら区別し得るγＴＣＲのコアポリペプチドを発現すると
結論される。加えて、成熟ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲ細
胞表面糖タンパク質における５〜１１ｋＤの大きさのみ
が、翻訳後プロセスによって説明される（４０〜４６ｋ
Ｄの表面の大きさから３５ｋＤのコアの大きさを引
く）。ここで、１５〜２０ｋＤの相対分子量はＰＥＥＲ
とＩＤＰ２のγＴＣＲ糖タンパク質における翻訳後プロ
セスによって説明し得る（５５〜６０ｋＤの表面大きさ
から４０ｋＤのコアの大きさを差し引く）。

【０１１５】すべての翻訳後プロセスがＮ−結合グリカ
ンであり、かつ、各グリカン鎖が約３ｋＤの相対分子量
であると仮定すると、２〜３本のＮ−結合グリカンがＭ
ＯＬＴ−１３のγＴＣＲタンパク質に付着し、一方、５
本のＮ−結合グリカンがＰＥＥＲ細胞及びＩＤＰ２細胞
上のポリペプチドに付加されることが予想される。Ｎ−
グリカナーゼを用いて細胞表面のγＴＣＲタンパク質か
らＮ−架橋炭水化物を除去する実験では、コアペプチド
に付加される翻訳後プロセスの大部分が実際にＮ−結合
グリカンであることが示された。

【０１１６】８．２．３．ＭＯＬＴ−１３ γＴＣＲの
一次配列 ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲサブユニットをコードする定
常領域遺伝子セグメントの構造を理解するために、ＭＯ
ＬＴ−１３のγＴＣＲ転写物を表すｃＤＮＡクローンの
配列を決定した。ＭＯＬＴ−１３由来ポリＡ^＋ ＲＮＡ
からのλｇｔ１０ライブラリーを構築し、ヒトγＴＣＲ
のｃＤＮＡクローン、ｐＴγ−１でつりあげた（Ｄｉａ
ｌｙｎａｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：２６１９
−２３）。大きさと限定された制限酵素地図に基づい
て、１つのクローン、Ｍ１３Ｋを選択し、そのヌクレオ
チド配列を決定した（図１４）。クローンＭ１３Ｋは、
Ｊγ２．３遺伝子セグメントに結合したＶγ１．３遺伝
子セグメントを使用した、全長の、フレーム内γＴＣＲ
転写物を表わす（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９
８６，Ｃｅｌｌ ４５：２３７−２４６； Ｌｅｆｒａ
ｎｃ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ３１９：
４２０−４２２； Ｓｔｒａｕｓｓらによる命名（Ｓｔ
ｒａｕｓｓｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３７：１２１７−１２１９）；Ｑｕｅｒｔｅｒｍｏｕ
ｓ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１
３８：２６８７−２６９０）。定常領域の配列が、最近
報告された非機能性γＴＣＲ（Ｐｅｌｌｉｃｉ ｅｔ
ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１０５１
−１０５５）及び２種類のＣＩＩエキソンコピーｂ及び
ｃを含有するＣγ２ゲノム配列（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：９５９６−９６００）とほ
ぼ同一であることが明らかになった（詳細に説明された
方法の節を参照のこと）。このこのとは、細胞表面上に
発現されたγＴＣＲタンパク質をコードする第一のフラ
ーム内転写物を表わし、これは二種類のＣＩＩエキソン
コピーを有するＣγ２遺伝子セグメントを利用するもの
である。

【０１１７】このｃＤＮＡクローンの推定アミノ酸配列
から３４．８ｋＤのポリペプチト骨格の大きさが予測さ
れ、これは前記の生化学データとよく一致した。驚くべ
きことに、６個のの潜在的なＮ−結合炭水化物付着部位
がこの転写物によってコードされる。生化学データによ
れば２〜３個のＮ−結合グリカンがポリペプチド鎖に付
着することが示唆されるため、潜在的な結合部位の全て
が使用されることはないことが示される。

【０１１８】Ｃγ遺伝子セグメントの使用を反映させる
ために、ＰＢＬ−Ｃ１及びＷＭ−１４によって“１型”
として発現されるジスルフィド結合γδＴＣＲ型に注目
した。これは、ジスルフィド結合したγＴＣＲ鎖がＣγ
１遺伝子セグメントを利用することによる（Ｋｒａｎｇ
ｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３
７：６４−６７）。ＩＤＰ２細胞及びＰＥＥＲ細胞上で
発現されたγδＴＣＲ型の大きな（５５ｋＤ）、ジスル
フィド結合していないγＴＣＲサブユニットは、３種類
のＣＩＩエキソンコピー、すなわちコピーａ、コピーｂ
及びコピーｃを含有するＣγ２遺伝子セグメントによっ
てコードされ（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔａｌ．，１９８
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７：Ｌｉｔｔｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２
６：８５−８８）、それゆえこのγδＴＣＲ型をここで
“２ａｂｃ型”という。同様に、ＭＯＬＴ−１３細胞上
で特徴づけられた型を“２ｂｃ型”という。

【０１１９】８．２．４．好適なＣγ遺伝子セグメント
の使用 新鮮な単離された末梢血中に三種類のγδＴＣＲ型が存
在することを決定するために、１０人の健常被験者から
の単核細胞を、ｍＡｂ抗ＴＣＲδ１（前記の第６節に記
載、δＴＣＲ定常領域と反応性を有する）による生化学
分析を用いて分析した。この抗体は、すべてがγ，δＴ
ＣＲリンパ球でないならば、大多数と反応する。このパ
ネルからの典型的な結果を図１５に示す。被験者１で
は、抗ＴＣＲδ１の免疫沈降物（非還元条件下で分析し
た）より、ジスルフィド結合γ，δＴＣＲ複合体を７０
ｋＤのタンパク質がバンド（１型）として、また、ジス
ルフィド結合していないγ，δＴＣＲ複合体がブロード
な４０ｋＤのタンパク質のバンド（２ｂｃ型）として存
在することが示された（図１５、レーン２）。このこと
から、Ｃγ１定常領域及びＣγ２定常領域の両方が、こ
れらの個別に発現されたγ，δＴＣＲにより使用される
ことが示された。しかしながら、２ｂｃ型の量は個々の
間で変動があった。被験者１と２における４０ｋＤタン
パク質のバンドの強度を比較することによって、被験者
１に比べたときの被験者２における２ｂｃ型のより小さ
なフラクションに注目すべきである（被験者２のレーン
２と被験者１のレーン２とを比較せよ）。より厳密に
は、ジスルフィド結合γ，δＴＣＲ複合体は、オートラ
ジオグラフで長時間感光させた後であっても、試験した
１０人の被験者中３人の被験者の単核細胞上で検出され
た（被験者３を参照のこと）。分析された個々の被験者
のいずれにおいても、末梢血中で５５ｋＤのジスルフィ
ド結合していないγ，δＴＣＲ複合体（２ａｂｃ型）は
示されなかった。

【０１２０】８．２．５．δＴＣＲサブユニットの特徴
付け γＴＣＲタンパク質の大きさ及びグリコンル化における
著しい構造上の相違とは対照的に、異なる細胞源からの
δＴＣＲサブユニットは、著しく類似することが証明さ
れた。ＭＯＬＴ−１３細胞上のδＴＣＲ糖タンパク質の
相対分子量は、抗δＴＣＲ ｍＡｂを使用して、大きさ
がＩＤＰ２細胞上のδＴＣＲ糖タンパク質と同様である
ことを確認しながら（図１１Ｂ、レーン２、白い矢
印）、直接的に４０ｋＤと決定した（図１２、レーン
４）。

【０１２１】同様に、δＴＣＲポリペプチド骨格の大き
さを比較するために、ＭＯＬＴ−１３細胞からの細胞表
面^１２５Ｉ標識δＴＣＲタンパク質をＮ−グリカナーゼ
消化して（高マンノース型、ハイブリッド型及び複合体
型の（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｂ
ｉｏｃｈｅｍ，２４：４６６５−４６７１； Ｈｉｒａ
ｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，１６２：４８５−４９２）アスパラギン結合グリカ
ンを除去した。ＭＯＬＴ−１３細胞のδＴＣＲコアポリ
ペプチドは３５ｋＤの相対分子量を有し（図１３Ｂ、レ
ーン４）、ＩＤＰ２細胞のδＴＣＲ骨格の相対分子量
（３５ｋＤ）と同様であった（Ｂａｎｄｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６８２−６８
４）。

【０１２２】加えて、細胞表面^１２５Ｉ標識ＭＯＬＴ−
１３ δＴＣＲタンパク質をエンドグリコシダーゼＨで
消化すると（Ｅｎｄｏ Ｈ、高マンノース型とある種の
ハイブリッドＮ−グリカンのみを除去；（Ｔａｒｅｎｅ
ｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９７４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２４９：８１１−８１７； Ｔｒｉｍｂｌｅａ
ｎｄ Ｍａｌｅｙ，１９８４，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ，１４１：５１４−５２２）、ポリペプチドに付着し
た、相対分子量２．５ｋＤのＥｎｄｏ Ｈ耐性の炭水化
物が除去され、１の炭水化物部分と一致する２．５ｋＤ
の相対分子量が減少した（図１３Ｂ、レーン２）。δＴ
ＣＲ定常ドメイン中に２箇所の潜在的なＮ−グリカン付
着部位が存在するため（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６
８２： Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒ
ｅ ３３０：５６９−５７２）、これらのデータは、い
ずれの部位も使用されたが、そこに付着したＮ−グリカ
ンは異なるプロセシングを受けること、すなわち、一方
は高マンノースＮ−グリカン（Ｅｎｄｏ Ｈ感受性）と
して、他方は複合体Ｎ−グリカン（Ｅｎｄｏ Ｈ耐性だ
がＮ−グリカナーゼ感受性）として別個のプロセシング
を受けることを示す。γＴＣＲポリペプチド鎖上に付着
したＮ−結合炭水化物の異なる量とは対照的に、ＰＥＥ
Ｒ細胞、ＩＤＰ２細胞及びＭＯＬＴ−１３細胞上で発現
されたδＴＣＲサブユニットは、すべて同一のペプチド
コアサイズを有し、２箇所のＮ−結合グリカンが存在す
ることを示す（図１３Ｂ、データは示していない）。

【０１２３】８．３．検討 この実施例において、ヒトγＴＣＲ糖タンパク質の３種
のタンパク質の型、すなわちジスルフィド結合した４０
ｋＤのγＴＣＲタンパク質（１型）、ジスルフィド結合
していない５５ｋＤのγＴＣＲタンパク質（２ａｂｃ
型）及びジスルフィド結合していない４０ｋＤのγＴＣ
Ｒタンパク質（２ｂｃ型）を比較した。３種類の型はす
べて、δＴＣＲサブユニットと結合していることが示さ
れた。最初の２つのγＴＣＲ型を表す相補的ＤＮＡ配列
が報告されている（Ｋｒａｎｇｅｌｅｔ ａｌ．，１９
８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７；６４−６７； Ｌｉｔ
ｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２６：８５−８８）。（ＰＢＬ−Ｃ１上の）γＴＣＲポ
リペプチド１型の定常領域は、単一のＣＩＩエキソンを
含有するＣγ１遺伝子セグメントによってコードされ、
一方、（ＩＤＰ２細胞及びＰＥＥＲ細胞上の）γＴＣＲ
ポリペプチドの２ａｂｃ型は、ＣＩＩエキソンコピー
ａ、コピーｂ及びコピーｃを含有するＣγ２遺伝子セグ
メントを利用する。２ｂｃ型のγＴＣＲ鎖に対応するｃ
ＤＮＡ配列は、２種のＣＩＩエキソンコピー、すなわ
ち、コピーｂとコピーｃのみを利用するＣγ２遺伝子セ
グメントを含むことが示された。同様に、クローンＩＩ
おびＰＢＬ−Ｌ２のγＴＣＲ結合領域の遺伝子構造（ジ
スルフィド結合していない、４０ｋＤのγＴＣＲタンパ
ク質）は、ここで決定されたＭＯＬＴ−１３の構造、す
なわち、２ｂｃ型に類似するようである。使用したδＴ
ＣＲ定常領域はこれらの型の全てについて同様であるた
め（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２；Ｌｏｈ．Ｅ．
Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３
０：５６９−５７２）、ヒトにおけるγδＴＣＲ型の３
つの構造を、完全に比較することができる（図１６）。

【０１２４】２種類のＣγ２多型ゲノム型はヒトに存在
する（Ｌｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ
３１９：４２０−４２２；Ｐｅｌｌｉｃｉ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１０５１−
１０５５）。２つの転写物型（２ａｂｃ型と２ｂｃ型）
は、多分これらの異なる対立遺伝子型の産物である。今
まで、γＴＣＲポリペプチドの対立遺伝子型はマウスで
は発見されていなかった。我々は、２ａｂｃ型（５５ｋ
Ｄ）と２ｂｃ型（４０ｋＤ）との間のγＴＣＲ細胞表面
タンパク質の大きさの劇的な相違は、付着したＮ−結合
炭水化物の量、最もありそうなこととしてＮ−結合グリ
カンの数を反映することによってほぼ決定されるものと
結論された。

【０１２５】ＩＤＰ２のγＴＣＲ（２ａｂｃ型）タンパ
ク質及びＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲ（２ｂｃ型）タンパ
ク質の骨格の大きさは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づいて、
それぞれ４０ｋＤと３５ｋＤであると測定された。それ
らの値は、ｃＤＮＡ配列に基づいて計算されたそれぞれ
の予想分子量３６．６ｋＤ及び３５．８ｋＤとよい相関
性を有する。骨格の大きさのわずかな相違（ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥで５ｋＤ）は、１６アミノ酸からなる１つのＣＩ
Ｉエキソンコードペプチドによって主に説明することが
でき、このような相違に関与するが、５５ｋＤ及び４０
ｋＤのジスルフィド結合していないγＴＣＲ表面型の間
における分子量の観察された相違の全てを説明すること
はできない。１箇所の付加的な潜在的付着部位を生ずる
ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲポリペプチドとは対照的に、
２ａｂｃ型のγＴＣＲポリペプチドは、おそらくすべて
を使用できる５箇所の潜在的なＮ結合グリカン付着部位
を有するが、わずか２〜３個のＮ−結合グリカンを有す
る。潜在的な付着部位について、このように使用が制限
されることに対する理由は明らかではないが、γＴＣＲ
タンパク質のコンホメーションに対するＣＩＩエキソン
コードペプチドの影響から生ずるものかもしれない。Ｃ
ＩＩエキソンコードペプチド及びその隣接アミノ酸は原
形質膜と免疫グロブリン様定常ドメインとの間の結合領
域を作る。この領域は大部分のＮ結合グリカン付着部位
を含む（図１７）。我々は、ＣＩＩエキソンコピーが、
ポリペプチド骨格の大きさを決定するばかりでなく、ジ
スルフィド結合鎖を形成する能力によって、付着した炭
水化物量にも影響を与えることによって、タンパク質の
型を決定するものと結論した。

【０１２６】ＩＤＰ２細胞（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８
２）、ＰＥＥＲ細胞（Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７２）及びＭＯ
ＬＴ−１３細胞のδＴＣＲに相補的なＤＮＡを配列決定
し、可変領域遺伝子セグメントと定常領域遺伝子セグメ
ントとの間をつなぐＤ／Ｎ領域を除いて、同一であるこ
とを見い出した。ＷＭ−１４細胞上のδＴＣＲタンパク
質は４３ｋＤの相対分子量を有し、これは前記のδＴＣ
Ｒタンパク質と同様であった（Ｂｏｒｓｔ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８３−６８
８： Ｌａｎｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅ
ｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：１０７６−１０９４）が、他の
δＴＣＲ鎖よりも３ｋＤ大きかった。これらの４３ｋＤ
のδＴＣＲタンパク質は、異なるδ可変ドメインに別の
Ｎ−結合グリコンル部位が存在することを示す。

【０１２７】γＴＣＲ定常領域セグメントに関して記載
した構造と比較しうる構造上の相違は、αＴＣＲ遺伝子
及びβＴＣＲ遺伝子については観察されなかった（Ｙｏ
ｓｈｉｋａｉ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１６：８３７−８４０；Ｔｏｙｏｎａｇａ ｅｔ
ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：８６２４−８６２８； Ｒｏ
ｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６０：９４７−９５３； Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ
ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１３：６
４７−６５３）。マウスＣγ領域の長さを有するヒトＣ
ＩＩエキソン反復配列の数と蓋然性の高い構造的な類似
性があり、そのＣγ１、Ｃγ２及びＣγ４定常領域はそ
れぞれ１５アミノ酸、１０アミノ酸及び３３アミノ酸か
らなる結合領域をコードする（Ｇａｒｍａｎ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８６．Ｃｅｌｌ ４５：７３３−７４２：
Ｉｗａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｅｘ
ｐ．Ｍｅｄ．１６３：１２０３−１２１２）。しかしな
がら、マウスの結合領域は適切なエキソンの大きさの相
違を反映するが、ヒトの２ａｂｃ型のγＴＣＲ及び２ｂ
ｃ型のγＴＣＲで見られたような、エキソンの汎用性の
用途を示さない。また、マウスのγＴＣＲは、２種類の
ジスルフィド結合していないヒトの型とは対照的に、ジ
スルフィド結合型にだけ存在する。重要なことは、ヒト
のγ，δＴＣＲ型と全く同じようには使用されないこと
である。数人（高率のγ，δＴＣリンパ球のために選択
した）において、単一の型（１型）が優性であり、この
型のための陽性選択が生じるか、又は別のγ，δＴＣリ
ンパ球の型に対する選択が存在するかどうかが示唆され
る。

【０１２８】９．個別にトランスフェクトしたγＴＣＲ
鎖と一本鎖δＴＣＲサブユニットとの対形成によって再
構成した３種類のＴ細胞レセプターγ，δイソタイプ型 この実施例で記載するように、γδヘテロダイマー形成
におけるγδＴＣＲポリペプチドの役割を調べた。トラ
ンスフェクションによって、３種類のγδＴＣＲ型（１
型、２ａｂｃ型及び２ｂｃ型）に対応するγＴＣＲ鎖と
一本鎖の固有δＴＣＲ鎖との会合によって形成されたγ
δＴＣＲ複合体を調べた。γＴＣＲポリペプチドの１型
又は２ａｂｃ型のいずれかをコードするγＴＣＲのＤＮ
ＡをＭＯＬＴ−１３細胞系中にトランスフェクトした。
このＤＮＡは、δＴＣＲポリペプチドと非共有結合的に
会合した２ｂｃ型γＴＣＲから成るγδヘテロダイマー
を構造的に発現した。トランスフェクトした細胞は、Ｍ
ＯＬＴ−１３細胞系のγδＴＣＲの特徴とともに、δＴ
ＣＲと非共有結合的に会合した２ａｂｃ型γＴＣＲ又は
δＴＣＲと共有結合的に結合した１型γＴＣＲからなる
γδヘテロダイマーを発現することが可能であった。そ
の上、トランスフェクトしたγＴＣＲ遺伝子産物のグリ
コシル化は、それらの天然の細胞系におけるこれらの遺
伝子のグリコシル化と同じであった。このように、グリ
コシル化の程度及びジスルフィド結合能は、γＴＣＲ遺
伝子によって決定される。γＴＣＲの定常領域のＣＩＩ
エキソンを使用すると、ＴＣＲγ及びＴＣＲδポリペプ
チド間のジスルフィド結合の有無ばかりでなく、γＴＣ
Ｒ鎖に付着した炭水化物量をも決定し、細胞表面γＴＣ
Ｒタンパク質の大きさの差に強く影響を与える。

【０１２９】９．１．材料と方法 ９．１．１．細胞系 ＭＯＬＴ−１３、ＴＣＲγδ^＋Ｔ白血病細胞系（Ｈａｔ
ａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３８：６７８−６８２：Ｌｏｈ，Ｅ．Ｙ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９−５７
２）、及び末梢血由来のＴＣＲ γδ^＋細胞系ＰＢＬ
Ｃ１（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９４）及びＩＤ
Ｐ２（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２２：１４５−１４９）を前記のように培
養した。

【０１３０】９．１．２．抗体 使用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は以下のものを使用
した。抗Ｌｅｕ−４（抗ヒトＣＤ３：ＩｇＧ１）（Ｌｅ
ｄｂｅｔｔｅｒ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９８１，
Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５３：３１０−３２３）、抗Ｔ
ＣＲ δ１（抗ヒトＴＣＲ δ鎖定常領域：ＩｇＧ１）
（第６節を参照のこと（Ｂａｎｄ，Ｈ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６８２−６
８４））、抗ＴｉγＡ（抗Ｖγ２：ＩｇＧ２ａ）（Ｊｉ
ｔｓｕｋａｗａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．
Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１１９２−１１９７）、抗Ｃ
γｍ１（抗ヒトγＴＣＲ定常領域：第８．１．７節を参
照のこと）、Ｐ３（Ｐ３×６３ＡＧ８ミエローマによっ
て分泌されたＩｇＧ１）（Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ｇ．，ａｎ
ｄＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ
２５６：４９５−４９７）、及び１８７．１（ラット抗
マウスκ軽鎖特異性）（Ｙｅｌｔｏｎ，Ｄ．Ｅ．，ｅｔ
ａｌ．，１９８１，ハイブリドーマ１：５−１１）。

【０１３１】９．１．３．ＭＯＬＴ−１３のδＴＣＲの
ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 ベクターλｇｔ１０中にＭＯＬＴ−１３のポリＡ^＋ＲＮ
Ａから調製した相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）ライブラリー
（Ｈｕｙｎｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８５，ｉｎＤＡＮ
ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｄ．Ｍ．（ＩＲ
Ｌ Ｐｒｅｓｓ．Ｏｘｆｏｒｄ），ｖｏｌｕｍｅ ｌ，
ｐｐ４９−７８）を、^３２Ｐ標識ヒトδＴＣＲのｃＤＮ
ＡクローンＩＤＰ２ ０−２４０／３８とのハイブリダ
イゼーションによってスクリーニングした（Ｈａｔａ
ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６
７８−６８２）。クローンを、大きさ及び限定制限酵素
地図に基づいて詳細な分析のために選択した。核酸配列
は、修飾Ｔ７ポリメラーゼを用いるジデオキシチェイン
ターミネーター法（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９
７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．Ａ．７４：５４６３−５４６７）を使用してＭ１３
ベクター中で決定した（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ，Ｕｎｉｔ
ｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒ
ｐ．）（Ｐｏｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８
１：７１６１−７１６５）。

【０１３２】９．１．４．発現プラスミドの構築及びト
ランスフェクンョン γＴＣＲのｃＤＮＡ（ＰＢＬ Ｃ１．１５とＩＤＰ２．
１１ｒ）（Ｋｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）は、
図１０Ｂに模式的に示したように、Ｆｒｉｅｎｄ ｓｐ
ｌｅｅｎ ｆｏｒｍｉｎｇ ｖｉｒｕｓ（ＳＦＦＶ）の
長い末端反復配列（ＬＴＲ）の下流で、ｐＦｎｅｏ哺乳
動物発現ベクター（Ｓａｉｔｏ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，
１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：１２５−１３０；
Ｏｈａｓｈｉ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｎａｔ
ｕｒｅ ３１６：６０６−６０９）中にクローニングし
た。プラスミド構築物をエレクトロポレーションによっ
てＭＯＬＴ−１３細胞ヘトランスフェクトした（Ｐｏｔ
ｔｅｒ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，８１：７１７６−７１６
５）。形質転換体を選択し、２ｍｇ／ｍＬのＧ４１８含
有培地（バイオアッセイによれば４８０μｇ／ｍＬの固
形分。ＧＩＢＣＯ）中で維持し、限界希釈によりクロー
ニングした。

【０１３３】９．１．５．ヨード化及び免疫沈降 ラクトパーオキシダーゼを使用する^１２５Ｉによる細胞
表面標識、３−［（３−コラミドプロピル（ｃｈｏｌａ
ｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ））ジメチルアンモニオ）］１−
プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ： Ｓｉｇｍａ Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌＣｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で
の可溶化、各種抗体を使用する免疫沈降、非平衡ｐＨグ
ラジェントゲル電気泳動法（ＮＥＰＨＧＥ）及びＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ）を記載の通りに行なった（第８．１．３．節参照の
こと。（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１
９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２２：１４５−１４９：Ｂｒ
ｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９４）。特異的な免疫沈
降は、１μｇの抗Ｌｅｕ−４、０．１μＬの抗ＴＣＲ
δ１腹水、又は１μＬのＰ３腹水を用いて、１８７．１
の培養上清１５０μＬとともに行なった。抗Ｔ９−γＡ
に対しては、１μＬの腹水を用い、１８７．１なしで行
なった。

【０１３４】９．１．６．生合成標識化 対数増殖期にある細胞をメオチニン及びシステインを含
まない培地で３０分間インキュベートし、続いて３７℃
で^３５Ｓ−メチオニン及び^３５Ｓ−ンステインを用いて
１５分間パルス標識を行ない、そして前記第８．１．３
節に記載したように免疫沈降を行なった。免疫沈降物を
エンドグリコシダーゼＨ（ｅｎｄｏ Ｈ）処理するか又
はｍｏｃｋインキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによっ
て分離し、フルオログラフィーによって可視化した（Ｂ
ｏｎｎｅｒ Ｗ．Ｍ．ａｎｄ Ｌａｓｋｅｙ，Ｒ．Ａ．
１９７４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４６：８３−
８８）。

【０１３５】９．２．結果 我々は、各種γＴＣＲイソタイプ間の構造上の相違を決
定する際に、γＴＣＲ遺伝子、特にＴＣＲ ＣＩＩエキ
ソンの役割を証明するために、構造上異なるγＴＣＲ遺
伝子産物と一本鎖δＴＣＲタンパク質との会合から生ず
る生成物を調べた。この目的のために、ＭＯＬＴ−１
３、すなわち４０ｋＤ非ジスルフィド結合γＴＣＲポリ
ペプチド（２ｂｃ型）を発現するＴ白血病細胞系を、レ
セプターの他の２つの型に対応するγＴＣＲ鎖のｃＤＮ
Ａクローンのためのレンピエントとして使用した（１型
と２ａｂｃ）。これらのγＴＣＲ鎖を表すｃＤＮＡクロ
ーンの完全な配列は、図１４（２ｂｃ型）及びクランゲ
ル等（Ｋｒａｎｇｅｌ ｅｔａｌ．，１９８７，Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３７：６４−６７）（１型と２ａｂｃ）の
文献に記載されており、図１８Ａに図示した。

【０１３６】９．２．１．一本鎖機能的δＴＣＲ鎖はＭ
ＯＬＴ−１３細胞系に存在する ＭＯＬＴ−１３細胞系のδＴＣＲ遺伝子の再編成の研究
より（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）、一本鎖の機能
的δＴＣＲ遺伝子産物だけがこの細胞系において発現さ
れることが示唆された。しかしながら、δＴＣＲのため
の一本鎖の機能的転写物がＭＯＬＴ−１３細胞内で作ら
れたことを直接的に証明するために、δＴＣＲのｃＤＮ
Ａプローブとの交差ハイブリダイゼーンョンさせたｃＤ
ＮＡクローン（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）をλｇ
ｔ１０中で作製したＭＯＬＴ−１３ライブラリーから単
離し、選択したｃＤＮＡクローンの配列を決定した。こ
の分析から、ＭＯＬＴ−１３細胞が機能的に再編成され
たもの及びδＴＣＲ遺伝子を突然変異的に再編成された
ものに対応する転写物を発現することが示された。機能
的に再編成されたδＴＣＲ遺伝子に対応するｃＤＮＡク
ローンは、ＩＤＰ２細胞系について先に記載したのと同
じＶ（Ｖδ１）、Ｊ（Ｊδ１）、及びＣ遺伝子セグメン
トを有する（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔａｌ．，１９８７．
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８−６８２）。しかしな
がら、ＭＯＬＴ−１３のδＴＣＲのｃＤＮＡクローン
は、Ｄセグメントの利用（ＭＯＬＴ−１３はおそらくＤ
δ２のみを使用する）、不正確な連結、Ｖ−Ｄ結合部及
びＤ−Ｊ結合部におけるＮ領域の多様性より生ずるＶ遺
伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントの間に異なる核
酸配列を有する（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９
８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１５４１−１５４
４）。また、ＭＯＬＴ−１３のδＴＣＲのｃＤＮＡよ
り、定常領域の膜近位結合領域におけるンステイン残基
を予測させる。この結合領域は、Ｃγ１遺伝子セグメン
トを利用するγＴＣＲ遺伝子産物へのジスルフィド結合
を有用なものとするはずである。ＭＯＬＴ−１３細胞系
はジスルフィド結合していないγ，δＴＣＲレセプター
を発現するが、そのδＴＣＲ鎖の膜近位結合領域におけ
るンステイン残基の存在は、δＴＣＲサブユニットがジ
スルフィド結合していない複合体又はジスルフィド結合
した複合体のいずれかに関係し得る可能性を明らかに残
している。

【０１３７】９．２．２．γＴＣＲ遺伝子産物はレセプ
ターの型を決定する γＴＣＲのｃＤＮＡ構築物でトランスフェクトしたＭＯ
ＬＴ−１３細胞を、Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γ（ＰＢＬ
Ｃ１由来のγＴＣＲのｃＤＮＡでトランスフェクトした
ＭＯＬＴ−１３細胞について）と、そしてＭ１３．ＩＤ
Ｐ２γ（ＩＤＰ２由来のγＴＣＲのｃＤＮＡでトランス
フェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞について）と略称す
る。バルクの形質転換細胞系及びこれらの系に由来する
代表的なサブクローンは、γＴＣＲ（ＶＪＣ）又はＶγ
２−特異的ｃＤＮＡプローブを用いるノーザンブロット
分析によって分析した。固有の１．６ｋｂのＭＯＬＴ−
１３γＴＣＲ転写物に加えて、約１．８ｋｂの第２のγ
ＴＣＲ転写物（発現プラスミドのＳＦＦＶ ＬＴＲで開
始されるγＴＣＲ転写物に対して期待される大きさ）
が、形質転換体及びそれらのクローンにおいて観察され
た。Ｖγ１．３と交差ハイブリダイズしないＶγ２プロ
ーブと特異的にハイブリダイズするこの１．８ｋｂの転
写物が、固有のＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲ転写物中に存
在し、こうして、この１．８ｋｂ転写物はトランスフェ
クトされたγＴＣＲのｃＤＮＡの転写物を表わす（この
転写物はＶγ２セグメントを利用する）。

【０１３８】形質転換体の表面上に発現されたγＴＣＲ
タンパク質を生化学的に特徴づけるために、各細胞系に
由来する代表的なクローンを、Ｐ３（対照）、抗Ｌｅｕ
−４（抗ＣＤ３）、抗ＴＣＲ δ１（抗δＴＣＲ）又は
抗Ｔｉ−γＡのｍＡｂを用いる表面ヨード化細胞免疫沈
降によって分析した。抗Ｔｉ−γＡ（Ｊｉｔｓｕｋａｗ
ａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅ
ｄ．１６６：１１９２−１１９７）は、それらのγＴＣ
Ｒ鎖可変領域としてＶγ２遺伝子セグメントを利用す
る、γ，δＴＣＲ細胞を特異的に認識するらしい。トラ
ンスフェクトしていないＭＯＬＴ−１３（図１９Ａ）な
らびにトランスフェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞（図１
９Ｂ及び図１９Ｃ）とは、期待された親γＴＣＲ（４０
ｋＤ；白い矢印を参照せよ）とδＴＣＲサブユニット
（星印を参照せよ）とを発現する。抗Ｖγ２−特異的ｍ
Ａｂ（抗Ｔｉ−γＡ）は固有のＭＯＬＴ−１３γＴＣＲ
鎖と反応しないことに注意すべきである（図１９Ａ、レ
ーン７及び８）。Ｍ１３．ＰＢＬ Ｃ１γ形質転換細胞
の抗ＣＤ３免疫沈降は、非還元条件下で試験した場合に
別のＣＤ３会合種（６８ｋＤ）を示した（図１９Ｂ、レ
ーン３、黒い矢印を参照せよ）。ＰＢＬ Ｃ１細胞（図
１９Ｄ）レーン３及び４）及びＭ１３．ＰＢＬＣ１γ形
質転換細胞系（図１９Ｂ、レーン３及び４）の両方につ
いて、６８ｋＤ複合体は、還元により４０ｋＤ種及び３
６ｋＤ種を産生した（Ｍ１３．ＰＢＬＣ１γ形質転換体
の場合に、これらのバンドは抗Ｖγ２の免疫沈降におい
て、明瞭に可視化された。図１９Ｂ、レーン７及び８、
黒い矢印を参照せよ）。これらの４０ｋＤ種おび３６ｋ
Ｄ種は、異なってグリコシル化されたγＴＣＲポリペプ
チドを示す（Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３２５：６８９−６９
４）。これらの免疫沈降において、δＴＣＲ鎖（４０ｋ
Ｄ還元）は４０ＫＤのγＴＣＲポリペプチドとともに移
動し、それゆえに可視化されない（しかしながら、下記
参照のこと）。

【０１３９】重要なことは、これらの実験より、ＭＯＬ
Ｔ−１３細胞系の固有のδＴＣＲ鎖が、通常、ジスルフ
ィド結合していない複合体の一部であり、ＰＢＬ Ｃ１
のγＴＣＲタンパク質と会合して形質転換細胞系中でジ
スルフィド結合した、γ，δＴＣＲヘテロダイマーを形
成することが示された。対照的に、Ｍ１３．ＩＤＰ２形
質転換細胞系におけるＩＤＰ２由来γＴＣＲタンパク質
（５５ｋＤ）は、固有のＭＯＬＴ−１３ δＴＣＲ鎖と
ともにジスルフィド結合していない複合体を形成した
（図１９Ｃ、レーン３及び４）。抗ＴＣＲ δ１のｍＡ
ｂ（δＴＣＲペプチドに特異的）を用いて行なった免疫
沈降により、これらの細胞系の全てからの内因性のγＴ
ＣＲ（図１９Ａ、Ｄ図及びＥ図、レーン５及び６）なら
びにトランスフェクトしたγＴＣＲ鎖（図１９Ｂ及び図
１９Ｃ、レーン５及び６）が直接的にδＴＣＲ鎖と会合
することが確認された。抗Ｔｉ−γＡは、Ｍ１３．ＰＢ
ＬＣ１形質転換細胞からの６８ｋＤジスルフィド結合
γ，δＴＣＲヘテロダイマー（図１９Ｂ、レーン７及び
８）、Ｍ１３．ＥＤＰ２γ形質転換細胞からの５５ｋＤ
のγＴＣＲ鎖を４０ｋＤのδＴＣＲ鎖（図１９Ｃ、レー
ン７と８）とともに特異的に免疫沈降させ、これらの複
合体の一部であるγＴＣＲがそれぞれトランスフェクト
されたＰＢＬ Ｃ１及びＩＤＰ２由来γＴＣＲのｃＤＮ
Ａに対応することが確認された。

【０１４０】各種γＴＣＲタンパク質をさらに特徴づけ
るために、表面^１２５Ｉ標識細胞の生化学的二次元（２
Ｄ）ゲル分析（ＮＥＰＨＧＥに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
を行なった。ＣＤ３成分の位置に関する固有の（ＭＯＬ
Ｔ−１３ ）γＴＣＲ鎖及びトランスフェクトした（Ｐ
ＢＬ Ｃ１又はＩＤＰ２）γＴＣＲ鎖の２Ｄパターンの
重ね合せにより、適切なγＴＣＲ種の比較を行なった。
ＭＯＬＴ−１３細胞からの免疫沈降物において、γＴＣ
Ｒ鎖は、２つの分離したヨード化種の平行なシリーズと
して分離した（図２０Ａ、白い矢印を参照せよ）。ＰＢ
Ｌ Ｃ１又はＩＤＰ２のＴＣＲのｃＤＮＡでトランスフ
ェクトしたＭＯＬＴ−１３細胞は、固有のＭＯＬＴ−１
３のγＴＣＲポリペプチドシリーズを示したが、加え
て、２Ｄゲルパターンで、それぞれ、ＰＢＬ Ｃ１のγ
ＴＣＲポリペプチド（図２０Ｂ及び図Ｄを比較せよ、図
２０Ｂの星印を参照せよ）、又はＩＤＰ２（図２０Ｃ及
び図Ｄを比較せよ、図２０Ｃの黒い矢印を参照せよ）と
同一である放射性標識種を示した。このように、２Ｄゲ
ルの生化学分析では、トランスフェクトしたγＴＣＲ鎖
が発現され、ＭＯＬＴ−１３の形質転換細胞及び親細胞
系である、ＰＢＬ Ｃ１とＩＤＰ２で同様にプロセシン
グされることが確認された。

【０１４１】９．２．３．トランスフェクトしたγＴＣ
Ｒ鎖タンパク質のポリペプチド骨格の大きさ トランスフェクトされたγＴＣＲ鎖のペプチド骨格の大
きさは、代謝的にパルス標識された細胞から免疫沈降さ
れた物質のエンドグリコシダーゼＨ処理によって決定し
た。抗ＣγＭ１（γＴＣＲ鎖に特異的）を用いた免疫沈
降では、内因性のＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲポリペプチ
ドを表わすトランスフェクトされていないＭＯＬＴ−１
３細胞（図２１、レーン４）において３５．５ｋＤ種及
び３４ｋＤ種が同定された。これらの２種類のポリペプ
チドの小さい方（白い矢印を参照のこと）は期待された
ポリペプチドコアサイズのＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲポ
リペプチドに対応し、一方、大きい方は、ポリペプチド
は部分的にプロセシングされた中間体を表わすらしい。
これらの固有のＭＯＬＴ−１３ γＴＣＲポリペプチ
ド、すなわち、脱グリコシル化された４１ｋＤの大きさ
を有するポリペプチドは、Ｍ１３．ＩＤＰ２γ形質転換
体からの抗ＣγＭ１によって免疫沈降された（図２１、
レーン８、黒い矢印を参照のこと）。この形質転換体特
異的γＴＣＲポリペプチドの大きさは、ＩＤＰ２細胞で
先に決定した脱グリコシル化ＩＤＰ２γＴＣＲポリペプ
チドのコアサイズとよく一致する（Ｂｒｅｎｎｅｒ，
Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａｔｕｒｅ ３
２５：６８９−６９４）。期待されたように、Ｍ１３．
ＰＢＬ Ｃ１γ形質転換細胞は、３２ｋＤの脱グリコシ
ル化されたサイズ（図２１、レーン１２、黒い矢印参照
のこと）を有する別のγＴＣＲタンパク質を示し（Ｂｒ
ｅｎｎｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａ
ｔｕｒｅ３２５：６８９−６９４）、これは以前にＰＢ
Ｌ Ｃ１細胞系について報告されたγＴＣＲポリペプチ
ド骨格の大きさに十分に匹敵する。この３２ｋＤ種は、
Ｖγ２特異的ｍＡｂ、抗Ｔｉ−γＡ（図２１、レーン１
３、黒い矢印を参照のこと）によって特異的に免疫沈降
し、それによってこの細胞系における固有のγＴＣＲ種
及びトランスフェトクされたγＴＣＲ種の割り当て量を
明確にする。このようにして、ＩＤＰ２細胞系及びＰＢ
Ｌ Ｃ１細胞系に由来するトランスフェクトされたγＴ
ＣＲ鎖の決定された骨格の大きさが、それらの親細胞系
におけるこられのポリペプチド骨格の大きさと合致す
る。γＴＣＲポリペプチドコアの大きさと細胞表面タン
パク質の大きさとを比較することによって、ＭＯＬＴ−
１３由来γＴＣＲ鎖、ＩＤＰ２由来γＴＣＲ鎖及びＰＢ
Ｌ Ｃ１由来γＴＣＲ鎖が、それぞれ、６ｋＤ、１４ｋ
Ｄ、及び８ｋＤのＮ−結合炭水化物を有していることが
結論される。

【０１４２】９．３．検討 ヒトγδＴＣＲサブユニット構造には３種類の生化学的
に区別される型が存在する。今日の研究において、我々
は、一本鎖δＴＣＲポリペプチドが、これら３種類のレ
セプター型の各々を表わすγＴＣＲ鎖と会合して適切な
γ，δＴＣＲヘテロダイマーを再構成することを示す。
ＭＯＬＴ−１３の固有のγＴＣＲポリペプチド（２ｂｃ
型）は４０ｋＤであり、δＴＣＲサブユニットと非共有
結合的に会合している。ＰＢＬ Ｃ１のジスルフィド結
合レセプター（１型）又はＩＤＰ２細胞系の５５ｋＤの
ジスルフィド結合していないレセプター（２ａｂｃ型）
に対応するγＴＣＲのｃＤＮＡクローンをＭＯＬＴ−１
３細胞系へトランスフェクトさせた場合、ｃＤＮＡドナ
ー細胞系中で見いだされるそれらに対応するγδＴＣＲ
型が再構成された。現在のトランスフェクションに関す
る研究から、ジスルフィド結合はγＴＣＲの定常セグメ
ントの使用によって指図されるという直接的な証拠が示
された。その理由は、固有のＭＯＬＴ−１３のδＴＣＲ
鎖はＰＢＬＣ１由来のγＴＣＲ鎖を有するジスルフィド
結合レセプター複合体（１型）に関係し、ＩＤＰ２由来
γＴＣＲ鎖を有するジスルフィド結合していないレセプ
ター複合体（２ａｂｃ型）に関係することが認められる
からである。

【０１４３】我々は、５５ｋＤ（２ａｂｃ型）及び４０
ｋＤ（２ｂｃ型）のジスルフィド結合していないγＴＣ
Ｒポリペプチド間の大きさの顕著な相違が、主にγＴＣ
Ｒポリペプチド骨格に付着したＮ−結合炭水化物の量の
相違によることを示した（前記第８．２．２．節参照の
こと）。このように、同じ数のＮ−結合グリカンアクセ
プター部位（各々５箇所）がこれらの型のいずれにおい
ても使用された定常領域遺伝子セグメントによってコー
ドされたとしても、１５ｋＤ（ＩＤＰ２又はＰＥＥＲ上
の２ａｂｃ型）又はわずか５ｋＤ（ＭＯＬＴ−１３上の
２ｂｃ型）のＮ−結合炭水化物がこれらのγＴＣＲポリ
ペプチドに付着する。これらのＮ−結合グリコシル化部
位の４箇所が、ＣＩＩエキソンコードコネクター領域及
びその周辺に存在する。ここにおける実施例において、
我々は、トランスフェクトしたγＴＣＲのｃＤＮＡクロ
ーンのタンパク質産物のペプチドコアサイズ及び成熟細
胞表面サイズの比較に基づいて、トランスフェクトした
γＴＣＲタンパク質に付着したＮ−結合炭水化物の量
が、それらの親細胞系に見られるのと同一であることを
示す。このように、２種類のＣγ２コードタンパク質セ
グメントのコンホメーションは十分に相違するに違いな
く、グリコシル化において劇的な相違を生じさせる。こ
れら２種類の型のＣγセグメント間の主要な相違は、Ｃ
ＩＩエキソンのコピー“ａ”が２ａｂｃ型の５５ｋＤの
γＴＣＲ鎖に存在し、２ｂｃ型の４０ｋＤのγＴＣＲ鎖
に存在しないということにある。このように、ＣＩＩエ
キソンのコピーが存在するか否かは、γＴＣＲポリペプ
チドの大きさを説明するグリコシル化の相違に大きく関
与する。このような相似はαβＴＣＲにおいて観察され
ないので、Ｔ細胞レセプターの間ではヒトγδＴＣＲイ
ソタイプ型の構造の変化は新規なものである。

【０１４４】１０．ＣＤ３と会合しないＴ細胞レセプタ
ーγδ複合体はヒト子宮内膜腺上皮において同定される 胎盤形成初期においては、単核細胞の浸潤は、母体の子
宮組織におけるらせん状の動脈及び子宮内膜腺の付近で
多い。これらは、通常にはない未知の機能のＴ系統の細
胞の集団を含む。多くの絨毛外の栄養膜は新規なタイプ
のクラスＩ ＭＨＣ抗原を発現し、これらは大部分の体
細胞上で発現されたものとは相違している。我々は、妊
娠子宮又は非妊娠子宮におけるＴＣＲγδヘテロダイマ
ー（γδＴＣＲ）に対する１パネルのモノクローナル抗
体を試験した。驚くべきことに、γδＴＣＲ複合体は白
血球では検出されなかったが、妊娠子宮からの子宮内膜
腺上皮の細胞質に局在していた。また、これらの抗体は
非妊娠子宮からの腺上皮とも反応し、その反応性は月経
周期の増殖相においてよりも分泌相においてさらに強
い。しかしながら、ＣＤ３（ＯＫＴ３、抗Ｌｅｕ−４、
ＵＣＨＴ−１）に対する３種類の異なるモノクローナル
抗体を用いた免疫沈降物を調べることで示されるよう
に、γδＴＣＲはＣＤ３複合体と会合しなかった。γδ
ＴＣＲ陽性腺上皮細胞はαβＴＣＲに対するモノクロー
ナル抗体と反応しなかった。この細胞もまたＣＤ４及び
ＣＤ８陰性であった。さらに、腺上皮細胞は妊娠初期に
おいてクラスＩ ＭＨＣ抗原を失なう。これらのデータ
から、γδＴＣＲを有する子宮内膜腺細胞は、少なくと
も、遺伝子発現の局所的調節のもとで表現型修飾を受け
ることを示唆する。

【０１４５】１１．実施例：ヒトδＴ細胞レセプター遺
伝子及びＶδ特異モノクローナル抗体の特徴付け 我々は、ヒトγδＴ細胞クローン、ＡＫ１１９からδＴ
ＣＲのｃＤＮＡ及び再編成されたδＴＣＲ遺伝子を単離
した。これらのＤＮＡクローンから、κδプローブが得
られ、これを使用して、１パネルの１３個のヒトγ，δ
Ｔ細胞クローンと３個のγ，δヒトＴ細胞腫瘍系におけ
るδＴＣＲ遺伝子再編成の多様性を決定した。全体で５
つの異なる再編成が検出され、これらは２〜５個の異な
るｘδ遺伝子を用いる再編成に対応していた。ある特別
な再編成が、ｍＡｂ ＴＣＳ δ１（δＴＣＡＲ−３）
と反応するヒトγ，δＴ細胞で常に見られた。加えて、
ＴＣＳ δ１はγ，δ腫瘍細胞系、ＭＯＬＴ−１３から
のδＴＣＲポリペプチドを免疫沈降させた。我々は、モ
ノクローナル抗体ＴＣＳδ１が、ＡＫ１１９のＶδ遺伝
子でコードされたエピトープ、又は再編成されたＡＫ１
１９遺伝子のＶδ−Ｊδ遺伝子の組み合わせでコードさ
れたエピトープを認識する証拠を提供する。

【０１４６】１１．１．原料及び方法 １１．１．１．ＡＫ１１９のδＴＣＲのｃＤＮＡクロー
ンの単離と配列決定 ｃＤＮＡライブラリーを、ＧｕｂｌｅｒとＨｏｆｆｍａ
ｎの方法（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ，１
９８３，Ｇｅｎｅ ２５：２６３）によって、ＰＢＬの
Ｔ細胞クローンであるＡＫ１１９から作製した。約１０
０，０００プラークの増幅ライブラリーを^３２Ｐ標識し
たニックトランスレートＣδプローブを使用してスクリ
ーニングし、Ｏ−０２４というδＴＣＲクローンから単
離した（Ｈａｔａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ２３８：６７８）。最も長いハイブリダ
イズｃＤＮＡクローン（１．３ｋｂクローンＣ１１９δ
３）をジデオキシチェーンターミネーンョン法（ｄｉｄ
ｅｏｘｙ ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｍｅｔ
ｈｏｄ）によって配列分析のために選択した。

【０１４７】１１．１．２．再編成されたδＴＣＲ遺伝
子のクローニング 再編成されたＶδ遺伝子含有３．５ｋｂのゲノムＤＮＡ
クローンを、下記のようにしてＡＫ１１９細胞から得
た。すなわち、ＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡを分取用アガロー
スゲル上でサイズ分画し、λｇｔ１０へライゲートし、
そしてパッケージングしてＥ．ｃｏｌｉへトランスフェ
クトした。組換えファージを、ｃＤＮＡクローンである
Ｃ１１９δ ３由来の^３２Ｐ標識したニックトランスレ
ート５５０ｂｐのＥｃｏＲＩフラグメントを用いてスク
リーニングした。ｒ１１９δ１と呼ぶ再編成クローンが
単離され、このクローンには０．８ｋｂのＨｉｎｃＩＩ
フラグメント（Ｖ領域特異的）と１ｋｂのＨｉｎｃＩＩ
−ＥｃｏＲＩフラグメント（Ｖ−Ｊ領域）とが含有され
ていた。

【０１４８】１１．１．３．ＤＮＡの調製 胎児及び新生児の胸腺組織を、患者の権利及び認可に関
する許容されたガイドラインに従って集めた。限界希釈
により末梢血、胸膜滲出物又は脳脊髄液からＴ細胞クロ
ーンを得て、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した（Ｈａｆｌｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．
８：４５１，Ｖａｎ ｄｅ Ｇｒｉｅｎｄ ｅｔ ａ
ｌ．，１９８７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３８：１６２
７）。すべての場合において、プロテイナーゼＫを含む
１％ドデシル硫酸ナトリウムを用いて消化し、続いてフ
ェノール／クロロホルム抽出及びエタノール沈降を行な
ってＤＮＡを調製した。

【０１４９】１１．１．４．サザンブロット分析 ゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、０．９％アガロー
スゲル上でサイズ分画し、ニトロセルロースに移した。
前記のように^３２Ｐニックトランスレートプローブを用
いてハイブリダイゼーションを行なつた（Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏ
ｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ； Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ； Ｎ
ｅｗ Ｙｏｒｋ）。

【０１５０】１１．１．５．サイトフルオロメーター分
析 提供者から得られた正常な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
は、フィコールグラジエント上で分画することによって
単離した。ＰＢＭＣ及びＰＢＬのＴ細胞を、ＴＣＳ δ
１ｍＡｂ（すでにδＴＣＡＲ−３と命名した、第７節参
照のこと）及びフルオレセイン結合ヤギ抗マウスＩｇＧ
（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて間接蛍
光染色し、そして蛍光活性化フローサイトメーターで分
析した。

【０１５１】１１．２結果 １１．２．１．δＴＣＲ遺伝子再編成の多様性 Ｃδプローブを用いて、Ｔ細胞クローンＡＫ１１９のλ
ｇｔ１０のｃＤＮＡライブラリーからｃ１１９δ３と称
する１．３ｋｂのδＴＣＲのｃＤＮＡクローンを単離し
た。ｃ１１９δ３の５’端を配列決定し、すでに同定し
たＶδとＪδ遺伝子とが使用されることを見い出された
（Ｈａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３８：６７８； Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８
７，Ｎａｔｕｒｅ ３３０：５６９）。Ｖ−Ｊ結合部の
配列は、Ｃ１１９δ３がフレーム内のＶ−Ｊ結合を有す
ることを示した。

【０１５２】すべての可変領域と結合領域、及び一部の
定常領域をコードする５５０塩基対（ｂｐ）のＥｃｏＲ
Ｉフラグメント（Ｖ−Ｊ−Ｃプローブ）をＣ１１９δ３
から単離し、ＡＫ１１９からのＥｃｏＲＩ消化ゲノムＤ
ＮＡサザンブロット分析に使用した。このプローブは、
胚細胞系（ｇｅｒｍｌｉｎｅ）の３．２ｋｂのＶδ及び
胚細胞系の１．０ｋｂのＣδバンドを検出した。ＡＫ１
１９は、特別な再編成がされた３．５ｋｂのバンドを示
し、これは共通のδＴＣＲの再編成と同一であった（Ｈ
ａｔａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
３８：６７８；Ｌｏｈ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎａ
ｔｕｒｅ ３３０：５６９）（図２２における再編成Ｉ
Ｉ）。この３．５ｋｂのバンドは、Ｖ−Ｊ−Ｃ ｃＤＮ
Ａプローブを用いてＥｃｏＲＩサイズ分画したλｇｔ１
０ゲノムライブラリーからクローニングした。ｒ１１９
δ１と称するクローニングされた再編成δＴＣＲ遺伝子
の部分地図を、図１７に示す。可変領域及び結合領域の
局在化を、Ｊオリゴヌクレオチドプローブ及び可変領域
特異的プローブとを用いて決定した。ｒ１１９δ１か
ら、１ｋｂのＶ−ＪプローブをＨｉｎｃＩＩ酵素及びＥ
ｃｏＲＩ酵素とを用いて消化して単離した（図１７）。

【０１５３】このＶ−Ｊプローブを用いて、１パネルの
１３個のヒトγδＴＣＲ陽性Ｔ細胞クローンと３個のヒ
トγ−δＴＣＲ陽性腫瘍細胞系におけるδＴＣＲ遺伝子
の再編成の多様性を決定した。図２２に示すように、Ｉ
−Ｖと番号付けした５つの共通の再編成がポリクローナ
ル新生児胸腺細胞サンプル中に見られた（レーン１
１）。これらの再編成はヒトγδＴ細胞クローンによっ
て使用された再編成の代表的なものである。再編成ＩＩ
だけがＨｉｎｃＩＩ−ＨｉｎｃＩＩＶδ特異的プローブ
にハイブリダイズする。これらの再編成の全てがＤ−Ｊ
再編成よりもＶ−Ｄ−Ｊ再編成を表わすということは知
られていないが、これらうちの幾つかは、以前に特徴づ
けられたＪδ遺伝子セグメントに対する新しい可変領域
の再編成を示すに違いない。その理由は、これらの細胞
が細胞表面上に機能的なδＴＣＲポリペプチド鎖を発現
するためである。我々は、新たな再編成が、他のＪδ遺
伝子に対する単一の新たなＶδ遺伝子の再編成を表すと
いう可能性を除外していないが、まだ同定していない。
我々のデータは、δＴＣＲの遺伝子の再編成に使用し得
る２〜５個の可変領域遺伝子が存在するにちがいないと
いう事実と一致する。

【０１５４】１１．２．２．ｍＡｂ ＴＣＳ δ１の特
異性の決定 以前にδＴＣＡＲ−３と命名したＴＣＳδ１を、ヒト腫
瘍γδＴＣＲ細胞系ＭＯＬＴ−１３で免疫したマウスの
牌細胞とマウスのミエローマ系とを融合させて作製し
た。ケイ光活性細胞ソーター分析で使用する場合は、Ｔ
ＣＳ δ１はヒトγδＴ細胞のいくつかとのみ反応し、
全てのものとは反応しない。この結果を表１に示す。Ｔ
ＣＳ δ１によって陽性染色とＡＫ１１９のＶδ遺伝子
（再編成ＩＩ）の使用とは完全に相関性を有する。この
データから、δＴＣＳ １によって認識されたエピトー
プが、ＡＫ１１９のＶδ遺伝子中又は再編成されたＡＫ
１１９のＶδ−Ｊδ遺伝子の組み合せエピトープ中でコ
ードされているという強力な証拠を提供する。

【０１５５】

【表１】 １．図２２に示すように１−Ｖと番号付けしたＶ−Ｊプ
ローブによって検出したδＴＣＲの再編成。 ２．胚細胞系Ｊδは検出されないとしても、各場合にお
いて１つだけ再編成が同定された。 ３．新生児又は胎児胸腺細胞では見られない新たな再編
成が観察された。この再編成を再編成ＶＩとした。 ４．＋は陽性の染色を、−は陰性の染色を示し、ｎｄは
決定していないことを示す。

【０１５６】１２．ハイブリドーマの寄託 示唆されたモノクローナル抗体を産生する次のハイブリ
ドーマ細胞系を、記載の日にメリーランドロックビルの
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒ
ｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に寄託し、ここに示す受託
番号を得た。 本発明は、寄託された実施態様が本発明の１つの特徴を
例証することを意図するものであり、機能的に均等ない
かなる細胞系も本発明の範囲内にあるので、寄託した細
胞系によって範囲が限定されることはない。事実、当業
者には、本明細書に示されかつ記載された種々の変形に
加えて各種の変更が、上述した記載及び添付図面から明
らかであろう。このような変更は、添付した請求の範囲
内に入るであろう。

【図面の簡単な説明】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、抗ＴＣＲ δ１を使用したＴ細胞系
のサイトフルオログラフ分析（細胞蛍光間接撮影分析）
の結果を示す図である。

【図２】 図２は、ｍＡｂ抗ＴＣＲ δ１特異性の免疫
化学分析ず示す図である。

【図３】 図３は、δＴＣＲのＮ−グリカナーゼ消化の
結果を示す図である。

【図４】 図４は、ｐＧＥＭ３−０−２４０／３８の地
図である。

【図５】 図５は、ｍＡｂ抗ＴＣＲ δ１によるｃＤＮ
ＡクローンＩＤＰ２ ０−２４０／３８のｉｎ ｖｉｔ
ｒｏ翻訳生成物の免疫沈降の結果を示す図である。

【図６】 図６は、Ｔ細胞抗原レセプターの免疫沈降及
びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す図である。

【図７】 図７は、δＴＣＡＲ−３抗体によるδ鎖の免
疫沈降の結果を示す図である。

【図８】 図８は、フロサイトメトリーによる細胞表面
染色分析の結果を示す図である。

【図９】 図９は、δＴＣＡＲ−３^＋及びＯＫＴ３^＋末
梢血リンパ球の二色サイトフルオログラフ分析（細胞間
接撮影分析）の結果を示す図である。

【図１０】 図１０は、細胞質内Ｃａ^２＋濃度（［Ｃａ
^２＋］_ｉ）を経時的に測定した結果を表す図である。

【図１１】 図１１は、３型のγ，δＴＣＲの免疫沈降
の結果を示す図である。

【図１２】 図１２は、抗Ｃγｍ１抗体及び抗ＴＣＲδ
１抗体のそれぞれによるγＴＣＲ鎖及びδＴＣＲ鎖の免
疫沈降の結果を示す図である。

【図１３】 図１３は、ＰＥＥＲ及びＭＯＬＴ−１３細
胞からのγＴＣＲ及びδＴＣＲのペプチド骨格の大きさ
及びグリコシル化の測定の結果を示す図である。

【図１４】 図１４は、ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲの核
酸配列（２ｂｃ型）を示す図である。

【図１５】 図１５は、γ，δＴＣＲ １型の優先的使
用を示す図である。

【図１６】 図１６は、ヒトにおける三種のγ、δＴＣ
Ｒ型の模式図である。

【図１７】 図１７は、再配列されたδＴＣＲ遺伝子地
図である。

【図１８】 図１８Ａは、ＭＯＬＴ−１３細胞系へのト
ランスフェクンョンに使用したγＴＣＲ鎖を示す模式図
である。図１８Ｂは、発現プラスミド構築物ｐＦｎｅ
ｏ．ＰＢＬ及びｐＦｎｅｏ．Ｉ ＤＰ２γを示す。ＩＤ
Ｐ２γをγＴＣＲクローンをＭＯＬＴ−１３細胞系に導
入するために使用した。

【図１９】 図１９は、ＭＯＬＴ−１３のγＴＣＲトラ
ンスフェクタント上のγ，δＴＣＲの免疫沈降分析の結
果を示す図である。

【図２０】 図２０は、トランスフェクタントのγＴＣ
Ｒポリペプチドの二次元ゲル分析である。

【図２１】 図２１は、トランスフェクタントのγＴＣ
Ｒ鎖の骨格ポリペプチドの大きさの分析の結果を示す図
である。

【図２２】 図２２は、γδＴ細胞クローン及びポリク
ローナルヒトＴ細胞集団のサザンブロット分析の結果を
示す図である。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図７】

【図６】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１２】

【図１５】

【図１１の１】

【図１１の２】

【図１６】

【図１７】

【図１３】

【図２０】

【図２２】

【図１４】

【図１８】

【図１９】

【図２１】

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (71)出願人 592257310 プレジデント・アンド・フェロウズ・オ ブ・ハーバード・カレッジ アメリカ合衆国02138マサチューセッツ州 ケンブリッジ、クウィンシー・ストリート 17 (72)発明者 ブレンナー，マイケル，ビー アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01721 アッシュランド，♯73，オーク ストリート，99 (72)発明者 イブ，ステファン，エイチ. アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 01710， フラミンハム ジョディー ロ ード 45 (72)発明者 サイドマン，ジョナサン アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02186， ミルトン，キャントン アベニ ュー1350 (72)発明者 バンド、ハミド アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02215， ボストン，ブルックライン ア ベニュー ♯５−シー 400

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトＴ細胞抗原レセプターデルタ鎖の可変領域また
   は再編成された可変−結合領域の１エピトープと反応性
   を有するモノクローナル抗体。 ２．ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ９５７８が与え
   られたハイブリドーマによって産生されたモノクローナ
   ル抗体ＴＣＳδ１（δＴＣＡＲ−３）からなる請求の範
   囲第１項に記載のモノクローナル抗体。 ３．ヒトＴ細胞抗原レセプターデルタ鎖の定常領域の１
   エピトープと反応性を有するモノクローナル抗体。 ４．ＡＴＣＣに寄託され、受託番号ＨＢ９７７２が与え
   られたハイブリドーマによって産生されるモノクローナ
   ル抗体抗ＴＣＲδ１からなる請求の範囲第３項に記載の
   モノクローナル抗体。 ５．請求の範囲第１〜第４項のいずれか１項に記載のモ
   ノクローナル抗体のＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ
   （ａｂ’）_２フラグメント。 ６．請求の範囲第１〜第４項のいずれか１項に記載のモ
   ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ。 ７．細胞におけるヒトデルタＴ細胞抗原レセプター可変
   遺伝子の機能的再編成の存在を検出する方法であって、
   細胞または細胞のポリペプチド含有サンプルを、再編成
   された遺伝子によってコードされたポリペプチドの１エ
   ピトープに特異的な反応性を有するモノクローナル抗体
   と接触させることからなる方法。 ８．モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣに寄託され、受託
   番号ＨＢ９５７８が与えられたハイブリドーマによって
   産生されたＴＣＳδ１（δＴＣＡＲ−３）を含有する請
   求の範囲第９項に記載の方法。 ９．（ａ）生細胞表面上でγ，δＴ細胞抗原レセプター
   およびＣＤ３抗原を発現する細胞と抗体とを、ＣＤ３抗
   原がコモジュレーションを生じるのに十分な時間接触さ
   せ、そして、（ｂ）ＣＤ３抗原のコモジュレーションを
   検出する工程を含んでなる、γ，δＴ細胞抗原レセプタ
   ーと反応性を有するモノクローナル抗体の同定方法。 １０．コモジュレーションの検出が、（ａ）細胞とＣＤ
   ３抗原に対する標識抗体とを、標識抗体がＣＤ３抗原に
   結合するのに十分な時間接触させ、そして（ｂ）結合し
   た標識抗体の量を測定することからなる、請求の範囲第
   １１項に記載の方法。 １１．ＣＤ３抗原をコモジュレーションさせる能力を有
   することを特徴とする請求の範囲第１項〜第４項に記載
   のモノクローナル抗体。