JPH1169987A

JPH1169987A - Ｈｉｖ−１および／またはｈｉｖ−２の増幅と検出

Info

Publication number: JPH1169987A
Application number: JP10177059A
Authority: JP
Inventors: John Wesley Backus; ウェスリーバッカスジョン; Susan Melissa Atwood; メリッサアトウッドスーザン; Ann Elizabeth Casey; エリザベスケイジーアン; Eric Brice Rasmussen; ブライスラズムッセンエリック; Thomas Joseph Cummins; ジョセフカミンズトマス
Original assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Current assignee: Ortho Clinical Diagnostics Inc
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 1999-03-16
Anticipated expiration: 2018-06-24
Also published as: EP0887427A3; EP0887427B1; DE69833160D1; EP0887427A2; SI0887427T1; JP4339427B2; US6001558A; ATE315667T1; ES2256920T3; DK0887427T3; DE69833160T2

Abstract

(57)【要約】【課題】ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型および
／または２型からの核酸の増幅と検出のための方法およ
び試験キットを提供する。【解決手段】該方法は、Ｍ群およびＯ群分離株を含む
ＨＩＶ−１の全亜型とＨＩＶ−２の全亜型を増幅させる
ために複数のプライマーセットを使用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト免疫不全ウイ
ルス（ＨＩＶ）の増幅と検出のための方法および試験キ
ットに関する。より詳しくは、本発明は、複数のプライ
マーセットを使用してＨＩＶ−１の全ての亜型（Ｍ群お
よびＯ群分離株を含む）とＨＩＶ−２の全ての亜型を増
幅させるＰＣＲ法に関する。

【０００２】

【従来の技術】後天性免疫不全症候群（エイズ；AIDS）
およびその原因物質であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩ
Ｖ）の理解は日々進歩している。ヒト免疫不全ウイルス
には２つの群、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２が同定されてい
る。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２は遺伝学的に関連している
が、それでも別のものである。ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２
は共に、異なる分離株間で相当な遺伝的変異性を示す。
実際、ＨＩＶ−１は10の亜型（亜型Ａ〜Ｉを含むＭ群
と、亜型Ｏを含むＯ群）が同定されている。様々なＨＩ
Ｖ−１分離株とＨＩＶ−２分離株の発表されたヌクレオ
チド配列からＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の共通配列が生成
されたけれども、ＨＩＶ−１の全分離株間にまたはＨＩ
Ｖ−２の全分離株間に実在する絶対的配列保存領域を見
つけることはできない。ＨＩＶ分離株間に見られる遺伝
的変異性に加えて、ＨＩＶの多数のヌクレオチド領域
は、それらがＨＩＶ−１ファミリーとＨＩＶ−２ファミ
リーの中にあるのと同じくらい高度にＨＩＶと無関連ウ
イルスとの間で保存される。これらの事実は、一緒にな
って、無関連ウイルスを誤って検出することなくＨＩＶ
−１の全Ｍ群およびＯ群亜型並びにＨＩＶ−２の全亜型
を効率的に検出するようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）プライマーおよびプローブをデザインすることを非
常に難しくする。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】全ての既知ＨＩＶ−１
およびＨＩＶ−２亜型を検出する増幅方法を開発しよう
とする者が直面する課題の１つは、単一設定の増幅条件
（例えば塩濃度、温度および増幅時間）下で一緒に使っ
た時に適切に機能するオリゴヌクレオチドプライマーセ
ットの開発である。プライマー−プライマー相互作用お
よびプライマー−プローブ相互作用の点から適合するプ
ライマーおよび検出プローブを同定することは、更に大
きな課題である。従って、ＨＩＶ−１および／またはＨ
ＩＶ−２の増幅と検出の場合、理想条件より低い条件下
で高度に分岐した亜型または分離株を検出する可能性を
最大にする段階が今まだ必要とされている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は上記課題を解決
し、そして高度に分岐したＨＩＶ−１および／またはＨ
ＩＶ−２分離株を増幅させて検出する必要手段を提供す
る。よって、本発明の目的はあらゆる既知のＨＩＶ−１
亜型および／またはＨＩＶ−２亜型の検出のための方法
および試験キットを提供することである。本発明の他の
目的や利点は本発明の詳細な説明から明白であろう。

【０００５】

【発明の実施の形態】一態様では、本発明はＨＩＶ−１
核酸を増幅させる方法に関する。この方法はＨＩＶ−１
核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−１核酸が増
幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三
リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４
つのオリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成
る。前記４つのオリゴヌクレオチドは (a) 配列番号１，３，７および８のセット； (b) 配列番号１，４，７および８のセット； (c) 配列番号２，３，７および８のセット；並びに (d) 配列番号２，４，７および８のセットから選ばれる。

【０００６】別の態様では、本発明はＨＩＶ−２核酸を
増幅させる方法であって、ＨＩＶ−２核酸を含む疑いの
ある試料を、前記ＨＩＶ−２核酸が増幅されるような条
件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性Ｄ
ＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４つのオリゴヌクレ
オチドと接触させることを含んで成る方法に関する。前
記４つのオリゴヌクレオチドは (a) 配列番号11，12，14および16のセット； (b) 配列番号11，12，15および16のセット； (c) 配列番号11，12，18および20のセット； (d) 配列番号11，12，19および20のセット； (e) 配列番号14，16，18および20のセット； (f) 配列番号14，16，19および20のセット； (g) 配列番号15，16，18および20のセット；並びに (h) 配列番号15，16，19および20のセットから選ばれる。

【０００７】更に別の態様では、本発明はＨＩＶ−１標
的核酸とＨＩＶ−２標的核酸を同時増幅させる方法に関
する。いずれかのＨＩＶ核酸を含む疑いのある試料を、
ＨＩＶ−１標的核酸またはＨＩＶ−２標的核酸が増幅さ
れるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン
酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、配列番号１，２，３，
４，７および８から選ばれた少なくとも１つのプライマ
ーペア、並びに配列番号11, 12, 14, 15, 16, 18, 19お
よび20から選ばれた少なくとも１つのプライマーペア、
と接触させることを含んで成る。

【０００８】ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の全亜型を高
感度に且つ特異的に検出することができるＨＩＶ−１お
よびＨＩＶ−２の同時増幅方法の開発は、幾つかの理由
により大きな課題である：(1) 個々の分離株間の核酸配
列レベルでの多様性；(2) 副生成物の生成はアッセイ感
度と多分特異性も低下させるだろうから、少なくとも８
〜10プライマー間のプライマー−プライマー相互作用を
最小にする必要があること；(3) 増幅生成物を特異的に
検出する必要があること（理論的には増幅プライマーに
内在するプローブとのオリゴヌクレオチドハイブリダイ
ゼーションにより達成させるだろう）；および(4) 調製
した患者被検物中の阻害剤の存在と試料調製からの標的
核酸の非効率的回収の両方を抑制する必要があること。
本出願人はそれらの障害を克服し、ＨＩＶ−１およびＨ
ＩＶ−２核酸の増幅および／または検出に関する本発明
に到達した。

【０００９】本発明において、互いに適合するので組み
合わせてＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の配列決定された
全分離株を検出することのできる複合同時増幅アッセイ
の構成要素となることができる、ＨＩＶ−１およびＨＩ
Ｖ−２のためのプライマーセットを開発した。本発明の
方法を使えば、当業者らは高い信頼性でＨＩＶ−１とＨ
ＩＶ−２の両標的核酸を高感度に且つ特異的に増幅およ
び検出することができる。この増幅と検出は、試料調
製、増幅および／または検出に問題があると偽陰性結果
を示す内部陽性対照（ＩＰＣ）の存在下で且つ多重化方
式で実施することができる。

【００１０】本発明は、ＨＩＶ−１および／またはＨＩ
Ｖ−２核酸を増幅させる方法に関する。様々に組み合わ
せて用いると、ＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２の
全ての既知分離株からの標的核酸を高感度に且つ特異的
に増幅せしめるオリゴヌクレオチドプライマーセットが
同定された。本発明に従ってＨＩＶ−１標的核酸を増幅
せしめるためには、次のオリゴヌクレオチドからプライ
マーセットが選ばれる：

【００１１】ＨＩＶ−１ＬＴＲ領域プライマー： GACCAGATCTGAGCCTGGGAGCT （配列番号１） CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA（配列番号２） GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT （配列番号３） TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA （配列番号４）

【００１２】ＰＯＬ領域プライマー： TCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGA （配列番号７） CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA （配列番号８）

【００１３】本発明の方法では、ＨＩＶ核酸を含む疑い
のある生物学的試料を、少なくとも４つのオリゴヌクレ
オチドを含んで成るプライマーセットと接触させること
により、ＨＩＶ−１標的核酸を増幅させる。本発明での
使用に適当であるプライマーセットとしては、 (a) 配列番号１，３，７および８のセット； (b) 配列番号１，４，７および８のセット； (c) 配列番号２，３，７および８のセット；並びに (d) 配列番号２，４，７および８のセットが挙げられるが、それらに限定されない。

【００１４】それらのプライマーセットの４つのオリゴ
ヌクレオチドは、単独でまたは別のＨＩＶ−１もしくは
ＨＩＶ−２プライマーと組み合わせて使用してもよい。
例えば、配列番号２のオリゴヌクレオチドを上記プライ
マーセット(a) または(b) と共に使用することができ
る。好ましいプライマーセットは、 (a) 配列番号１，２，３，７および８のセット； (b) 配列番号１，２，４，７および８のセット； (c) 配列番号２，３，４，７および８のセット； (d) 配列番号１，３，４，７および８のセット；並びに (e) 配列番号１，２，３，４，７および８のセットである。

【００１５】より好ましいのは、配列番号２，３，４，
７および８に相当するオリゴヌクレオチドを含むプライ
マーセットである。それらのプライマーセットのうちの
いずれも、Ｍ群およびＯ群を含む全ての既知ＨＩＶ−１
亜型からの核酸を増幅させるのに用いることができる。

【００１６】プライマーセットに加えて、生物学的試料
は、該試料中に存在する任意のＨＩＶ−１核酸が増幅さ
れるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン
酸および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのようなＰＣＲ試薬
とも接触させられる。

【００１７】本発明に従ってＨＩＶ−２標的核酸を増幅
せしめるためには、次のオリゴヌクレオチドからプライ
マーセットが選ばれる：ＨＩＶ−２ＥＮＶ領域プライマー： CCGGGATAGTGCAGCAACAGCAACA （配列番号11） CCCAGACGGTCAGTCGCAACA （配列番号12）

【００１８】ＬＴＲ領域プライマー： GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA（配列番号14） GAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCA（配列番号15） GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA（配列番号16）

【００１９】ＰＯＬ領域プライマー： TAGACACAGGGGCTGACGACTCAATAGT（配列番号18） CACAGGGGCTGACGACTCAATAGTAGCA（配列番号19） GCCAAAAATGTTGATTGGGGTATCTCCTGTCATTA （配列番号20）

【００２０】本発明の方法では、ＨＩＶ−２核酸を含む
疑いのある生物学的試料を、少なくとも４つのオリゴヌ
クレオチドを含んで成るプライマーセットと接触させる
ことにより、ＨＩＶ−２標的核酸を増幅させる。本発明
での使用に適当であるプライマーセットとしては、 (a) 配列番号11，12，14および16のセット； (b) 配列番号11，12，15および16のセット； (c) 配列番号11，12，18および20のセット； (d) 配列番号11，12，19および20のセット； (e) 配列番号14，16，18および20のセット； (f) 配列番号14，16，19および20のセット； (g) 配列番号15，16，18および20のセット；並びに (h) 配列番号15，16，19および20のセットが挙げられるが、それらに限定されない。

【００２１】好ましいのは、配列番号11, 12, 14および
16に相当するオリゴヌクレオチドを含むプライマーセッ
トである。それらのプライマーセットのいずれも、全て
の既知ＨＩＶ−２亜型からの核酸を増幅させるために用
いることができる。

【００２２】プライマーセットに加えて、生物学的試料
は、該試料中に存在する任意のＨＩＶ−２核酸が増幅さ
れるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン
酸および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのようなＰＣＲ試薬
とも接触させられる。

【００２３】ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方を増幅せし
めるためには、生物学的試料を本発明のＨＩＶ−１プラ
イマーセットと一緒に本発明のＨＩＶ−２プライマーセ
ットと接触させる。好ましくは、生物学的試料を配列番
号２，３，４，７，８，11，12，14および16に相当する
オリゴヌクレオチドと接触させる。そのようなプライマ
ーセットの使用により、試料中に存在するどんな既知Ｈ
ＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２亜型の標的核酸でも
増幅させることができる。

【００２４】本発明の方法は、ある場合には、配列番号
２，３および４を含むプライマーセットのように、共通
プローブ領域と重なる標的核酸配列を増幅させるため
に、３つ以上のプライマーを使用する。これは増幅シス
テムの系統（strain）感受性と強固さを最大にする。こ
の新規特徴は、アッセイ方法の系統感受性を増大させ、
且つ増幅システムの感受性と強固さを増大させるという
結果において各々が別々の利益、例えば大きな増幅効率
および分離株間の高い配列相同性を与えるようなプライ
マーの組合せを考慮に入れる。

【００２５】本発明の１または複数のプライマーセット
を使ってＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２標的が増
幅されれば、増幅させたＨＩＶ−１および／またはＨＩ
Ｖ−２標的核酸に特異的な１または複数のオリゴヌクレ
オチドプローブを使って、増幅させたＨＩＶ標的の存否
を検出することができる。当業者は、使用したプライマ
ーセットに応じて、増幅させたＨＩＶ−１および／また
はＨＩＶ−２標的核酸を検出するのに適するオリゴヌク
レオチドプローブを容易に同定することができよう。本
発明での使用に適当なオリゴヌクレオチドプローブとし
ては、非限定的に、次のオリゴヌクレオチドが挙げられ
る：

【００２６】ＨＩＶ−１ＬＴＲ領域プローブ： CAACAGACGGGCACACACTACT（配列番号５） GAACAGATGGGCACACACTGCT（配列番号６）

【００２７】ＰＯＬ領域プローブ： AGCTTTGCTGGTCCTTTCCAAAGTGGG （配列番号９） AGTTGTGCCGGTCCTTTCCAAATTGGG （配列番号10）

【００２８】ＨＩＶ−２ＥＮＶ領域プローブ： TGGACGTGGTCAAGAGACAACAAGAA（配列番号13）ＬＴＲ領域プローブ： CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC （配列番号17）

【００２９】ＰＯＬ領域プローブ： CCAAAAATAGTAGGGGGAATAGGGGGATTC（配列番号21） CACCCCAAAAATAGTAGGTGGGATAGGAGGG （配列番号22）

【００３０】好ましくは、増幅させたＨＩＶ−１および
ＨＩＶ−２標的は、配列番号５，６，９および10に相当
するプローブと、次の組合せ：配列番号13と17、または
13,21および22、または17, 21および22のいずれかとを
使って検出する。

【００３１】本発明は、プライマー領域に比較して低度
の配列保存を有する領域について探査する時は、全ての
既知分離株を検出するために複数の重複したプローブを
使用する。これにより、一般的には増幅生成物の配列特
異的検出に必要であるような高度に保存され且つ高度に
特異的なプローブ領域によって隔たれていない領域にお
いて増幅プライマーをデザインすることが可能である。
ある状況では、例えばＨＩＶ−１の場合、全ての既知分
離株を高感度で検出するために複数のプローブが必要で
ある。

【００３２】ＰＣＲを使った核酸の増幅と検出のための
一般原理および条件は非常に良く知られており、その詳
細は米国特許第4,683,195 号（Mullis他）、同第4,683,
202号（Mullis）および同第4,965,188 号（Mullis他）
をはじめとする多数の文献中に提供されている。よっ
て、上記技術の教示とその中に与えられる特別の教示を
参照すれば、当業者はＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２の既
知の全亜型を検出するために本発明を実施するのは何ら
難しくないはずである。

【００３３】「生物学的試料」という語は、検出するこ
とのできる核酸を含有する細胞もしくはウイルス物質、
毛髪、体液または細胞成分を限定的でなく包含する。
「オリゴヌクレオチド」という語は、１または複数のデ
オキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成
る分子、例えばプライマー、プローブ、および検出しよ
うとする核酸断片のことを言う。

【００３４】「プライマー」という語は、天然に存在す
るにせよ合成的に製造されるにせよ、核酸鎖（すなわち
鋳型）に相補的なプライマー伸長生成物の合成が誘導さ
れるような条件（そのような条件には、別のＰＣＲ試薬
の存在、並びに適当な温度およびｐＨが含まれる）下に
置いた時に合成の開始点として働くことができるオリゴ
ヌクレオチドのことである。

【００３５】プライマーは、最大の増幅効率のために好
ましくは一本鎖であるが、所望であれば二本鎖領域を含
むことができる。それはＤＮＡポリメラーゼの存在下で
伸長生成物の合成を開始させるのに十分な程長くなけれ
ばならない。各プライマーの正確なサイズは、意図する
使用目的、プライマーの濃度および配列、標的配列の複
雑さ、反応温度、並びにプライマーの起源に依存して異
なるだろう。本発明で使用するプライマーは通常12〜60
ヌクレオチドであり、好ましくは16〜40ヌクレオチドを
有するだろう。より好ましくは、各プライマーは18〜35
ヌクレオチドを有する。

【００３６】本発明に有用なプライマーは、既知の技術
と装置、例えばABI DNA 合成装置（Applied Biosystems
から入手可能）またはBiosearch 8600シリーズもしくは
8800シリーズ合成装置（Milligen-Biosearch, Inc,から
入手可能）を使って調製することができる。この装置を
使う手順は周知であり、例えば米国特許第4,965,188号
明細書（Gelfand 他）に記載されている。生物学的源か
ら単離された天然に存在するプライマーも有用であるか
もしれない（例えば制限エンドヌクレアーゼ消化物）。
一般に少なくとも２つのプライマーのセットが各々の標
的核酸に使われる。よって、複数の標的核酸を同時に増
幅させるためにプライマーの複数セットを用いることが
できる。

【００３７】本明細書中で用いる時、「プローブ」とは
標的核酸の核酸配列に実質的に相補的であり且つ増幅さ
れた標的核酸の検出または捕捉に用いられるオリゴヌク
レオチドである。

【００３８】本発明では、配列特異的プライマーおよび
プローブが提供される。例えば、５′末端か３′末端の
いずれかへのヌクレオチドの付加により（前記ヌクレオ
チドは標的配列に相補的であるかまたは非相補的であ
る）、追加の配列特異的プライマーおよびプローブを調
製できることは当業者に明白であろう。そのような組成
物は本発明の範囲内である。

【００３９】本発明において使われるプライマーおよび
／またはプローブは、所望により標識することができ
る。当該技術分野で既知の方法を使って、プライマーお
よび／またはプローブを特異的結合リガンド（例えばビ
オチン）、酵素（例えばグルコースオキシダーゼ、ペル
オキシダーゼ、ウリカーゼ、およびアルカリホスファタ
ーゼ）、放射性同位体、高電子密度試薬、色素原、蛍光
助剤、燐光成分またはフェリチンで標識することができ
る。好ましくは標識は特異的結合リガンドである。より
好ましくは標識はビオチンもしくはその誘導体、ストレ
プトアビジンもしくはその誘導体、またはハプテンであ
る。

【００４０】「ＰＣＲ試薬」とは、ＰＣＲに不可欠であ
ると考えられる試薬のいずれか、すなわち、各標的核酸
のためのプライマーセット、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮ
Ａポリメラーゼ補因子、および１または複数のデオキシ
リボヌクレオシド−５′−三リン酸（dNTP's）のことで
ある。ＰＣＲに使われる他の任意の試薬および材料につ
いては後述する。それらの試薬は個別に、試験キットの
一部分として、または試験装置の試薬室の中に、提供す
ることができる。

【００４１】ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーと鋳型
の複合体においてプライマーの３′−ヒドロキシ末端に
デオキシヌクレオシド一リン酸分子を付加する酵素であ
るが、この付加は鋳型依存方式である。一般に、伸長生
成物の合成は、新しく合成された鎖の５′から３′方向
において、合成が終結するまで進行する。有用なＤＮＡ
ポリメラーゼとしては、例えば、Ｅ．コリＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウポリメ
ラーゼ、逆転写酵素、および当業界で既知の他のものが
挙げられる。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼはそれが
熱に安定であることを意味する耐熱性であり、そして高
い温度で、特にＤＮＡ鎖のプライミングおよび伸長に使
われる高温において優先的に活性である。より詳しく
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、本明細書中に記載の
ポリメラーゼ連鎖反応に用いられる高温において実質的
に不活性でない。そのような温度は多数の反応条件、例
えばｐＨ、ヌクレオチド組成、プライマーの長さ、塩濃
度および当業界で既知の他の条件によって異なるだろ
う。

【００４２】多数の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが技術の
現状において報告されており、それらとしては、米国特
許第4,965,188 号（Gelfand 他）および同第4,889,818
号（Gelfand 他）明細書中に詳述されたものが挙げられ
る。特に有用なポリメラーゼは様々なテルムス菌種、例
えばテルムス・アクアティカス（Thermus aquaticu
s）、テルムス・テルモフィラス（Thermus thermophilu
s）、テルムス・フィリフォルミス（Thermus filiformi
s）およびテルムス・フラブス（Thermus flavus）から
得られるものである。他の有用な耐熱性ポリメラーゼ
は、テルモコッカス・リテラリス（Thermococcus liter
alis）、ピロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furi
osus）、テルモトガ種（Thermotoga sp.）およびWO-A-8
9/06691 （1989年７月27日公開）に記載のものをはじめ
とする様々な生物源から得られる。幾つかの有用な耐熱
性ポリメラーゼが市販されており、例えばPerkin Elmer
からAmpliTaq（商標）, Tth およびUlTma （商標）、St
ratageneからPfu 、並びにNew England Biolabs からVe
ntおよびDeep-Vent が市販されている。生物体から天然
ポリメラーゼを単離する技術、および組換え技術を用い
て遺伝子操作された酵素を生産する技術も多数知られて
いる。

【００４３】ＤＮＡポリメラーゼ補因子とは、酵素の活
性がそれに依存する非タンパク質化合物のことである。
よって、補因子が存在しなければ酵素は触媒的に不活性
である。多数の物質が既知の補因子であり、例えばその
非限定例として、マンガンおよびマグネシウムの塩、例
えば塩化物、硫酸塩、酢酸塩および脂肪酸塩が挙げられ
る。塩化マグネシウムおよび硫酸マグネシウムが好まし
い。

【００４４】ＰＣＲに更に必要であるのは、２以上のデ
オキシリボヌクレオシド−５′−三リン酸、例えばdAT
P, dCTP, dGTP, dTTPおよびdUTPのうちの２以上であ
る。好ましくは４種の一般的三リン酸（dATP, dCTP, dG
TPおよびdTTP）が一緒に使用される。

【００４５】本明細書中に記載のＰＣＲ試薬は、標的核
酸の増幅を提供するのに適当な濃度で供給されそしてＰ
ＣＲに使われる。増幅に必要であるプライマー、ＤＮＡ
ポリメラーゼ、補因子およびデオキシリボヌクレオシド
−５′−三リン酸の最小量並びに各々の最適範囲は当業
界で周知である。ＤＮＡポリメラーゼの最小量は通常少
なくとも約0.5 単位／100 μL 溶液であり、約２〜約25
単位／100 μL 溶液が好ましく、約７〜約20単位／100
μL 溶液がより好ましい。与えられた増幅システムには
他の量が有用なことがある。「１単位」は、本明細書中
では74℃で30分間の間に伸長核酸鎖の中に10ナノモルの
全ヌクレオチド（dNTPs ）を取り込むのに必要とされる
酵素活性の量として定義される。増幅に用いる各プライ
マーの最小量は少なくとも約0.075 マイクロモル濃度で
あり、約0.1 〜約２マイクロモル濃度が好ましいが、他
の量も当業界で公知である。補因子は通常約２〜約15ミ
リモル濃度の量で存在する。各dNTPの量は通常約0.25〜
約3.5 ミリモル濃度である。

【００４６】ＰＣＲ試薬は、任意の適当な緩衝剤（多数
が当業界で既知である）を使って、約７〜約９の範囲内
のｐＨを有する緩衝溶液中に、個別にもしくは種々に組
み合わせてまたは全部一緒に供給することができる。

【００４７】ＰＣＲにおいて使用できる他の試薬として
は、例えば、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的な抗体
が挙げられる。抗体は増幅前に前記ポリメラーゼを抑制
するために使用することができる。本発明に有用な抗体
は、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼに特異的であり、約50℃
より低い温度でＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を抑制
し、そして高い温度で失活する抗体である。有用な抗体
としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体お
よび抗体断片が挙げられる。好ましくは抗体はモノクロ
ーナルである。本発明において有用な抗体は、既知の方
法、例えばHarlow他、Antibodies: A Laboratory Manua
l, Cold Spring Harbor, NY (1988)に記載された方法を
使って調製することができる。

【００４８】代表的なモノクローナル抗体は米国特許第
5,338,671 号明細書（Scalice 他）に記載されている。
常用の手順と、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ATCC）（Rockville, MD ）に寄託されたハイ
ブリドーマ細胞系HB 11126または11127 のいずれかを含
む出発材料を使って、当業者は２つのモノクローナル抗
体を容易に得ることができる。モノクローナル抗体は、
ＤＮＡポリメラーゼに対してモル比約５：１〜約500 ：
１の量で存在する。

【００４９】増幅された核酸は多数の既知の方法、例え
ば米国特許第4,965,188 号明細書（Gelfand 他）に記載
の方法で検出することができる。例えば、増幅された核
酸はサザンブロット法、ドットブロット技術、または標
識プローブを用いる非同位体オリゴヌクレオチド捕捉検
出技術を使って検出することができる。あるいは、適当
に標識されたプライマーを使って増幅を行い、その標識
の検出手順および検出装置を使って、増幅されたプライ
マー伸長生成物を検出することができる。

【００５０】好ましい態様では、増幅された標的核酸
は、検出用に標識されており且つ増幅された標的と直接
的または間接的にハイブリダイズすることができるオリ
ゴヌクレオチドプローブを使って検出される。該プロー
ブは可溶性であっても固体支持体に取り付けられてもよ
い。別の好ましい態様では、標的核酸を増幅させるのに
使われるプライマーのうちの１つまたは複数が、例えば
特異的結合成分によって標識される。標識プライマーが
中に取り込まれている生じたプライマー伸長生成物を、
プローブを使って捕捉することができる。該プローブに
ハイブリダイズした増幅標的の検出は、当業界で周知で
ある適当な検出装置および手順を使って標識付プローブ
の存在または増幅された標識付標的の存在を検出するこ
とにより行うことができる。標識によっては、検出装置
を使わずに目で見ることができるものもある。

【００５１】より好ましい態様では、標的核酸を増幅さ
せるのに用いるプライマーの１つまたは複数がビオチン
により標識され、増幅されたビオチン化標的核酸が固体
支持体に取り付けられたプローブにハイブリダイズせし
められる。次いで、それらを酸化剤（例えば過酸化水
素）および適当な色素形成性組成物の存在下でストレプ
トアビジン−ペルオキシダーゼ接合体と接触させること
により、結合した標識が検出される。例えば、有用な色
素形成試薬として、テトラメチルベンジジンおよびその
誘導体、並びにロイコ色素、例えば米国特許第4,089,74
7 号明細書（Bruschi ）に記載のトリアリールイミダゾ
ールロイコ色素が挙げられる。

【００５２】本明細書中で時間に関して用いる時、
「約」という語は時間限界の±10％を表し、そして温度
に関して用いる時、「約」という語は±５℃を表す。下
記の実施例は本発明の幾つかの態様を例示するために与
えられるのであって、本発明を限定するものであると解
釈してはならない。

【００５３】

【実施例】材料と方法：テルムス・アクアティカス（Thermus aqu
aticus）からの組換えＤＮＡポリメラーゼは既知の手
順、例えば欧州特許公開EP-A-0 482 714に記載されたも
のを使って調製し、これは約250,000 単位／mgタンパク
質の活性を有した。

【００５４】下記の実施例で使用するプライマーおよび
プローブは、既知の出発材料と手順を用いて、Applied
Biosystems Model 380B 、標準ホスホロアミダイト化学
を用いる３カラムＤＮＡ合成装置、およびＡＢＩ１μモ
ルスケール・ファーストサイクルプロトコールを使って
調製した。ヌクレオシド−３′−ホスホロアミダイトお
よびヌクレオシド誘導化細孔制御ガラス支持体はApplie
d Biosystemsから入手した。プライマーは上記に示した
配列を有した。米国特許第4,962,029 号明細書に記載の
２つのテトラエチレングリコールスペーサーに続いて１
つの市販のデュポン社製ビオチンホスホロアミダイトに
より、それらの５′末端を機能性にした。米国特許第4,
914,210 号明細書に記載の２つのテトラエチレングルコ
ールスペーサーに続いて１つのアミノジオール連結基に
よりプローブの３′末端を機能性にした。全ての精製は
核酸精製カラムに続いて逆相HPLC技術を使って実施し
た。デオキシリボヌクレオチド（dNTPs ）はSigma Chem
ical Co.から入手した。

【００５５】幾つかの実験では、ホスホロチオエート含
有プライマーを使用した。３′−ヒドロキシル基に関し
て末位と末位から二番目にホスホロチオエート結合を有
するホスホロチオエート含有プライマーは、米国特許第
5,003,087 号明細書および技術公報添付カタログNo. 40
-4036-xx, Glen Research, Sterling, Virginia 中にも
記載された方法に従ってＨ−ホスフェート化学により調
製した。

【００５６】ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ接
合体溶液は、リン酸塩緩衝化食塩溶液（24 mM リン酸ナ
トリウムおよび75 mM 塩化ナトリウム）中に市販の（Si
gmaChemical Co.）ストレプトアビジンと西洋ワサビペ
ルオキシダーゼの接合体、カゼイン（0.5 ％）およびメ
ルチオレート（0.5 ％）を含んで成る溶液を使用した。
接合体安定剤として10 mM の４′−ヒドロキシアセトア
ニリドを使用した。

【００５７】内部陽性対照（ＩＰＣ）標的は次のように
して調製した。ホスホロアミダイトオリゴヌクレオチド
合成により一本鎖合成標的としてＩＰＣ配列を調製し
た。次いでそれを５′制限部位を含むオリゴヌクレオチ
ドプライマーを使って増幅させ、pBluescript II KS(-)
プラスミドベクター中に指向性クローニングした。プラ
スミドを含むＥ．コリの大規模培養物を以前に記載され
た通りにアンピシリン選択条件下で増殖させた（Sambro
ok他, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Press 1989 ）。続いて販売業者からの
適当な試薬を使ってそして販売業者の手順に従って、プ
ラスミドＤＮＡをQiagenカラム上で精製した。得られた
精製プラスミドをＴＥ緩衝液（10 mM Tris pH 8.0, 1 m
M EDTA pH8.0 ）中に再懸濁し、濃度を分光光度測定し
た（Sambrook他, 1989）。続いてプラスミドを制限酵素
ScaIで消化して、完全な標的配列を維持したままでプラ
スミドを直鎖状にした。全ての標的の系列希釈は、10mg
／mlの音波処理済の子牛胸腺ＤＮＡ（Sigma ）を含むＴ
Ｅ緩衝液において行った。

【００５８】ロイコ色素分散液は、アガロース（0.5
％）、４，５−ビス（４−ジメチルアミノフェニル）−
２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）イミダ
ゾールロイコ色素（250 μモル濃度）、ジエチレントリ
アミン五酢酸（100 μモル濃度）、３′−クロロ−４′
−ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）、ポリ
ビニルピロリドン（112 ミリモル濃度）、一塩基性リン
酸ナトリウム一水和物（10ミリモル濃度）および過酸化
水素（H₂O₂）（8.82ミリモル濃度）を含んだ。

【００５９】洗浄溶液（pH 7.4）は、一塩基性リン酸ナ
トリウム一水和物緩衝剤（25ミリモル濃度）中に塩化ナ
トリウム（373 ミリモル濃度）、（エチレンジニトリ
ロ）四酢酸二ナトリウム塩（2.5 ミリモル濃度）、デシ
ル硫酸ナトリウム（38ミリモル濃度）およびエチルセリ
チオサリチル酸ナトリウム塩（25マイクロモル濃度）を
含んだ。

【００６０】ポリメラーゼ連鎖反応混合物（75μL ）
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤
（10〜18ミリモル濃度、pH 8）、EDTA（０〜0.75ミリモ
ル濃度）、塩化カリウム（50ミリモル濃度）、塩化マグ
ネシウム（４ミリモル濃度）、dATP, dCTP, dGTPおよび
dTTP（各0.3 mM）、記載のプライマー（別記しないかぎ
り各0.4 マイクロモル濃度）、IV型ゼラチン（100 mg／
ml）、Taq ポリメラーゼ（16単位／100 μL ）およびグ
リセロール（9.5 ％）を含有した。50倍モル過剰（ポリ
メラーゼに対して）のTP1-12.2と５倍過剰のTP4-9.2 を
使用した。

【００６１】捕捉試薬を作製するために、常用の乳化重
合技術を使って、ポリ〔スチレン−コ−３−（ｐ−ビニ
ルベンジルチオ）プロピオン酸〕（重量比95：５〜98：
２、平均直径１μｍ）から調製したポリマー粒子（平均
直径１μｍ）にプローブを共有結合で取り付けた。前記
粒子の水中懸濁液を２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸緩衝剤（0.1 モル濃度、pH 6）で洗浄し、次いで
固形分約10％になるように懸濁した。緩衝剤（0.1 モル
濃度）中に固形分3.33％に希釈された洗浄済粒子の試料
（3.3 ml）を、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−
３−エチルカルボジイミド塩酸塩（84mg／ml水、2.1 m
l）およびプローブ（44.44 OD／mlナノ純水、983 μL
）と混合した。生じた懸濁液を断続的に混合しながら
湯浴中50℃で約２時間加熱した後、遠心分離した。（エ
チレンジニトリロ）四酢酸二ナトリウム塩（0.0001モル
濃度）を含むトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝剤（0.01モル濃度、pH 8）で粒子を３回洗浄し、そ
して固形分４％になるようにその中に再懸濁した。

【００６２】緩衝剤で固形分0.25％に希釈したらすぐ
に、捕捉試薬（１〜２μL ）を、SURECELL（商標）使い
捨て試験装置〔Johnson & Johnson Clinical Diagnosti
cs, Inc.から入手可能；これは米国特許第4,948,561 号
明細書（HincKley他）に詳細に記載されている〕中の試
験ウエルの微孔質膜（LOPRODYNE （商標）ポリアミド
膜、平均ポアサイズ 1.2μｍ、Pall Corp.から）の限定
領域に適用し乾燥させた。他の試薬と材料は、商業源か
ら入手したか、または容易に入手可能な出発材料と常用
手順を使って調製した。

【００６３】実験：プライマーの選択：本出願人らは、ＨＩＶ−１の高度保
存配列領域を同定することによりＨＩＶ−１およびＨＩ
Ｖ−２のためのＰＣＲ増幅システムの開発に着手した。
次の基準を使って保存領域に対するプライマーをデザイ
ンした：(1) 小さい生成物ほど高い効率で増幅し、有効
ポリメラーゼ濃度、アニール／伸長時間または調製され
る試料の平均サイズの減少に対する感受性が低いので、
生成物の長さは200 ヌクレオチドを越えてはならない；
(2) プライマーセットは増幅生成物の特異的検出のため
にそれらの間に機能的なプローブ領域を持たなければな
らない；(3) プライマーの３′末端付近の不正対合（ミ
スマッチ）は、５′末端付近の不正対合よりもはるかに
好ましくない；(4) それらのプライマーは３′末端安定
性、長さ、ＧＣ含量および別の可能なプライマーやプロ
ーブとの相互作用に関する確立されたプライマー開発基
準を満たさなければならない。

【００６４】初めに、次の11のプライマーを試験用に選
択した： GACCAGATCTGAGCCTGGGAGCT 、23マー（配列番号１） GACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTC、24マー（配列番号23） CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAG 、31マー（配列番号
24） CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA、30マー（配列番号
２） GGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT、28マー（配列番号25） GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT 、29マー（配列番号
３） GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAG、26マー（配列番号26） TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA 、23マー（配列番号４） TCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGA 、27マー（配列番号７） GTATTACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA、28マー（配列番号27） CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA 、31マー（配列番号
８）

【００６５】これらのプライマーの多くは、プライマー
の５′末端、３′末端または両末端のところの配列を除
いて別のプライマー１つまたは２つと同じである。配列
番号１と23は、ＨＩＶ−１ゲノムのＬＴＲ領域の１つの
正プライマー領域であり、一方配列番号24と２は別のＬ
ＴＲ正プライマー領域である。配列番号25, ３および26
は１つのＬＴＲ逆プライマー領域を表し、一方配列番号
４は第二の領域を表す。配列番号７はＨＩＶ−１ゲノム
のＰＯＬ領域に対してデザインした唯一の正プライマー
であり、一方配列番号27と８は配列番号７と相補するこ
とができる逆プライマーである。

【００６６】これらのプライマーを、PE9600サーモサイ
クラー上で40サイクルに渡るＰＣＲによって反応液75 m
l あたりＨＩＶ−１標的０コピーまたは15コピーを増幅
させ、次いでゲル電気泳動を使って検出することにより
試験した。ＨＩＶ−１標的ＤＮＡは次のようにして調製
した。宿主染色体中に組み込まれたポリメラーゼ欠損Ｈ
ＩＶゲノムの単一コピーを含む８Ｅ５細胞（Folks T.M.
他, J. Exp. Med. 164:280, 1986）を、10％ウシ胎児血
清を含む90％RPMI培地中で増殖させた。典型的なＳＤ
Ｓ、プロテイナーゼＫ消化に続くフェノール／クロロホ
ルム抽出およびエタノール沈澱によって、2.5 ×10⁹細
胞／１Ｌ培養物からＤＮＡを調製した。得られた抽出物
を塩化セシウム上でバンド沈降せしめ、透析し、抽出
し、エタノール沈澱し、そして分析用に10 mM Tris／1
mM EDTA (pH 8.0)中に再懸濁した。Ａ ₂₆₀での光学濃度
測定によりＤＮＡ含量を計算した。全ての反応は反応液
75μLあたり３mgの子牛胸腺ＤＮＡを添加すること以外
は上述した通りに実施した。16通りの可能なＬＴＲ組合
せと２通りの可能なＰＯＬ組合せの各々について複製反
応を実施した。ゲル結果を第１表に示す。68℃のアニー
ル／伸長温度でのＨＩＶ−１標的を含まない対照反応
は、配列番号23／４の組合せについて検出可能な副生成
物バンドを示した。このため、この組合せはあまり好ま
しくないプライマーセットである。この副生成物の他に
は、いずれのアニール／伸長温度でも検出可能な副生成
物は本質的に全く観察されなかった。

【００６７】選ばれたプライマーを、２つのアニール／
伸長温度においてゲルバンド強度の点から更に比較し
た。配列番号１または23を含む組合せ間にはゲルバンド
強度にほとんど差がなかった。配列番号24と２は、異な
る逆プライマーと組み合わせた時に互いに同等に機能し
た。３つの重複する逆プライマーのうち、配列番号３と
26は、特に70℃のアニール／伸長温度を使った時に、配
列番号25よりも良好に機能した。配列番号４を含む全て
の組合せが両アニール／伸長温度で良好に増幅させた。
配列番号27は配列番号８に比べて非常に貧弱にしか機能
しなかった（共に配列番号１と組み合わせた時）。従っ
て、配列番号27に関してはこれ以上試験を行わなかっ
た。

【００６８】

【表１】

【００６９】次の実験は、配列番号７／８プライマーセ
ットと個々の全ての可能なＬＴＲプライマーセットとの
同時増幅反応であった。この同時増幅は内部陽性対照
（ＩＰＣ）の存在下で実施した。増幅は、米国特許第5,
089,233 号明細書に記載された自動ＰＣＲプロセッサー
である、Johnson & Johnson Clinical DiagnosticsのＰ
ＣＲアナライザーを使って実施した。次の３種類の温度
プロフィールを使って、40サイクルに渡りＨＩＶ標的を
増幅させた。

【００７０】(1) 95 ℃で15秒間の変性および68℃で30
秒間のアニール／伸長； (2) 95 ℃で15秒間の変性および66℃で30秒間のアニー
ル／伸長；並びに (3) 96 ℃で５秒間の変性および68℃で40秒間のアニー
ル／伸長。増幅生成物は上述した通りに検出した。

【００７１】プロフィール１は従来技術の条件と見な
し、第二のプロフィールはどのプライマー組合せが副生
成物を形成する傾向があるかを決定するために使用し、
そして第三のプロフィールは合計循環時間を増大させる
ことなく（アニール／伸長時間を増加することによっ
て）増幅をより強固にする試みであった。全ての反応
は、反応液75μL あたりＨＩＶ標的とＩＰＣ標的各々10
コピーを使って実施した。第三の増幅プロフィールを使
った時、特により長い（＞150 ヌクレオチド）生成物を
生じるプライマーセットの場合、増幅はより強固であっ
た。この結果は、配列番号23, 24および４がいずれも副
生成物を形成する傾向があることも証明した。従って配
列番号23と24を外した。その後の実験は配列番号１，２
および３を使って実施した。

【００７２】次に、２つのＨＩＶ−１同時増幅システム
（配列番号１／３または２／３と配列番号７／８との同
時増幅）の絶対感度を試験した。反応は40または45サイ
クル実施した（96℃で５秒；ＩＰＣ標的およびプライマ
ーの存在下または非存在下のいずれかで68℃で40秒）。
10, 5, 2.5, 1, 0.5および０のＨＩＶ標的レベルを全て
の試験条件に対して二重反復で実験した。

【００７３】配列番号２／３を含むシステムは増幅中に
生成する副生成物が少なく（特に45サイクルの場合）、
両システムとも2.5 コピーほどの少量のＨＩＶ−１標的
を一貫して検出できるようであった。ＩＰＣの存在下で
は、配列番号１／３同時増幅システムは、１コピーでは
４複製物のうちの２つ、そして0.5 コピーでは４複製物
のうちの１つにおいてＨＩＶ生成物（一方または両方）
を増幅させた。同じ条件下で、配列番号２／３同時増幅
システムは、１コピーでは４複製物のうちの３つ、そし
て0.5 コピーでは４複製物のうちの４つでＨＩＶ生成物
（ＨＩＶ−１もしくは２またはその両方）を増幅させ
た。この実験で行った標的配列を１つも含まない対照反
応は全て外観上陰性であった。

【００７４】ＨＩＶ−１について要約したのと同じ基準
に従って、ＨＩＶ−２プライマーを試験用に選んだ。Ｈ
ＩＶ−２プライマーをデザインする時に考慮した１つの
追加の基準は、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２の両方のプライ
マー候補との起こり得る相互作用を最小にすることであ
った。試験したＨＩＶ−２プライマーの最初のセットを
下記に列挙する：

【００７５】 CCGGGATAGTGCAGCAACAGCAACA （配列番号11） CGGGATAGTGCAGCAACAGCAACAG （配列番号28） CCCCAGACGGTCAGTCGCAACA （配列番号29） CCCAGACGGTCAGTCGCAACA （配列番号12） GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA（配列番号14） CCCTGGGAGGTTCTCTCCAGCA（配列番号30） GAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCA（配列番号15） GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA（配列番号16） CTGTTCGGGCGCCAACCTGCTA（配列番号31） CTGCACCTCAATTCTCTCTTTGGAAAAGACCAGTA （配列番号32） GCACCTCAATTCTCTCTTTGGAAAAGACCAGTA （配列番号33） TAGACACAGGGGCTGACGACTCAATAGT（配列番号18） CACAGGGGCTGACGACTCAATAGTAGCA（配列番号19） GCCAAAAATGTTGATTGGGGTATCTCCTGTCATTA （配列番号20） GCCAAAAATGTTGATTGGGGTATCTCCTGTCA（配列番号34）

【００７６】ＨＩＶ−２ＤＮＡを調製するために、Ｈ
ＩＶ−２のHut78 NIH-Z 株に感染した10E8細胞を、ＳＤ
ＳおよびプロテイナーゼＫで処理し、次いでフェノール
／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈澱し、得ら
れた抽出物を分析用に10 mMTris／1 mM EDTA pH 8.0中
に再懸濁した。

【００７７】個々のＨＩＶ−２プライマーを、次の２つ
の異なる増幅プロフィール： (1) 68℃のアニール／伸長温度で40サイクル；および
(2) 62℃のアニール／伸長温度で５サイクルに続いて68
℃のアニール／伸長温度で35サイクルを用いて、配列番
号１，２，３，26，４，７および８のＨＩＶ−１プライ
マーと共に使った場合の副生成物を形成する能力につい
てスクリーニングした。二番目のプロフィールは、標的
の不正対合の影響を最小にする条件下でどのプライマー
セットが副生成物形成を最小にできるかを決定する試験
のために選んだ。条件１を使った時に配列番号７および
８と共に強い副生成物を形成したどのプライマーも即座
に捨てた。何故なら、それらのプライマーは同時増幅ア
ッセイに最小にしか必要でないからである。この基準の
ために捨てたのは配列番号30および31のただ２つのプラ
イマーであった。プライマーの残りを、様々な基準に基
づいて狭めていった。ＨＩＶ−１プライマーと配列番号
20により形成される副生成物が非常に低レベルであった
ために配列番号34よりも配列番号20を選んだ。配列番号
11と12は副生成物をあまり生じず、更に確立された基準
にも良く適合するために、配列番号28と29よりも配列番
号11と12を選んだ。配列番号32と33は、増幅条件２の下
で配列番号20または34のいずれかと併用した時に比較的
貧弱な増幅であったために捨てた。残ったＨＩＶ−２プ
ライマーセット（配列番号11／12、14／16、15／16、18
／20および19／20）は全て、次のプライマー：配列番号
２，３，７および８（各々0.4 μＭ）、IPC-F1（0.2 μ
Ｍ）およびIPC-R1（0.2 μＭ）を含む系において、反応
あたり10コピーのＨＩＶ−２標的レベルで非常に良好に
増幅させ且つ良く見えるゲルバンドを与える。上記の増
幅条件１を使用した時のそれらの増幅システムによる副
生成物形成はいずれも非常に少ない。増幅条件２を使用
した時には有意な副生成物形成があるが、しかし特定の
生成物がゲル上にまだ非常に良く検出可能である。

【００７８】プローブ選択：ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−
２のような多分岐のゲノムを扱う時には、２つのプライ
マーを使った各領域の増幅および１つのオリゴヌクレオ
チドプローブを使った各領域の検出を可能にするのに十
分なほどに保存されている３つの領域を同定することは
しばしば困難である。生成物の長さを最小にする必要が
あるシステムでは、プローブ特異性が損なわれ得る程度
にまでプロービングの緊縮性を減らさない限り、この問
題は作業を不可能にする程度にまで悪化する。この問題
を避けるために、本出願人は、アッセイ特異性を傷つけ
ることなく、全ての既知配列変異体の検出を可能にする
ために多重プローブを使用するシステムを開発した。

【００７９】配列番号２と３により形成される生成物を
探査するために、プローブは長さがわずか34ヌクレオイ
ドの領域にはまらなければならない。この領域中の最も
保存された配列は配列番号５のプローブの配列である。プローブ： CAACAGACGGGCACACACTACT（配列番号５）この配列はＨＩＶ−１分離株の大部分に高度に保存され
ており、該プローブと分離株配列のこの領域との間には
１個以下のヌクレオチドの相違しかない。しかしなが
ら、この領域には２〜５個の変異を有する幾つかの分岐
配列がある。将来それらの配列から更に分岐した配列を
検出する能力を最大にするために、配列番号６の追加の
プローブをデザインした。プローブ： GAACAGATGGGCACACACTGCT（配列番号６）

【００８０】ＨＩＶ−１ＰＯＬの場合、遭遇する変異
の最大数および苛酷性を最小にするように使用する両プ
ローブを変更した。これを達成するために、デザインし
た両プローブはいずれの既知分離株配列とも等しくな
い。２つのプローブを使うことにより、任意の既知分離
株に対して遭遇する変異の最大数を５から３に減らし
た。加えて、残りの変異の大部分はプローブの片側末端
の付近に置かれ、かくしてハイブリダイゼーションした
時のそれらの影響が小さくなる。ＨＩＶ−１ＰＯＬプ
ローブの配列を下記に示す： AGCTTTGCTGGTCCTTTCCAAAGTGGG （配列番号９） AGTTGTGCCGGTCCTTTCCAAATTGGG （配列番号10）

【００８１】記載した上記状況は、２つのプローブを使
用するＨＩＶ−２ＰＯＬシステム用に選ばれた配列に
ついても同様である。しかしながら、この状況は、２つ
のプローブに相補的な領域は重複しているけれども位置
が同一でないという点で幾らか異なっている。これは、
ＨＩＶ−２の２つの亜型間で配列が非常に異なるので必
要な熱安定性を獲得するためにプローブの位置を変更し
なればならないという事実のためである。この２つのプ
ローブを使うと、全ての既知ＨＩＶ−２配列は亜型特異
的ＨＩＶ−２プローブに比較して多くて２個のヌクレオ
チド相違を有する。２つのＨＩＶ−２ＰＯＬプローブ
配列を下記に示す： CCAAAAATAGTAGGGGGAATAGGGGGATTC（配列番号21） CACCCCAAAAATAGTAGGTGGGATAGGAGGG （配列番号22）

【００８２】上述した同時増幅システムを、ＨＩＶ−１
およびＨＩＶ−２試料に対して試験した。比色検出に用
いる検出プローブは下記のものであった：ＨＩＶ−１ＬＴＲ生成物： CAACAGACGGGCACACACTACT（配列番号５） GAACAGATGGGCACACACTGCT（配列番号６）ＨＩＶ−１ＰＯＬ生成物： 5'-AGCTTTGCTGGTCCTTTCCAAAGTGGG（配列番号９） 5'-AGTTGTGCCGGTCCTTTCCAAATTGGG（配列番号10）

【００８３】ＨＩＶ−２ＰＯＬ生成物： CCAAAAATAGTAGGGGGAATAGGGGGATTC（配列番号21） CACCCCAAAAATAGTAGGTGGGATAGGAGGG （配列番号22）ＨＩＶ−２ＬＴＲ生成物： CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC （配列番号17）ＨＩＶ−２ＥＮＶ生成物： TGGACGTGGTCAAGAGACAACAAGAA（配列番号13）

【００８４】始原型Ｍ群およびＯ群分離株を含む５種類
の培養増幅したＨＩＶ−１分離株を試験した。試験した
同時増幅システムは全て、配列番号７／８プライマーセ
ット、内部陽性対照プライマーセット、並びに次の４つ
のＨＩＶ−１ＬＴＲプライマーセットのうちの１つ：
配列番号１／３、１／４、２／３および２／４を含ん
だ。ＨＩＶ−１特異的プライマーセットはいずれも試験
した全ての分離株を検出した。標的ＤＮＡの系列希釈
は、配列番号２／３および２／４プライマーセットが最
も感受性のＬＴＲプライマーセットであることを証明し
た。配列番号２／４プライマーセットは多分岐のＯ群分
離株に対して最も感受性であるように見えた。

【００８５】２種類の培養増幅したＨＩＶ−２分離株も
試験して様々なＨＩＶ−２プライマーセットの性能を評
価した。どの反応も配列番号11／12プライマーセット、
並びに次の４つのＬＴＲ−またはＰＯＬ−特異的ＨＩＶ
−２プライマーセットのうちの１つ：配列番号18／20、
19／20、14／16および15／16を含んだ。全てのプライマ
ーセットが、試験した高い方の標的レベルで両標的の増
幅をもたらした。ＨＩＶ−２標的の系列希釈はＬＴＲプ
ライマーセットが最も感受性であることを示唆した。

【００８６】15の培養増幅したＨＩＶ−１Ｏ群分離株、
ＨＩＶ−１に感染したアフリカ人患者からの17の凍結し
た患者細胞ペレット（高レベルの配列非相同性を含むで
あろう）、および12の培養増幅したＨＩＶ−２分離株を
試験することにより、様々な同時増幅システムの系統感
受性を更に評価した。15のＯ群分離株は全て配列番号７
／８プライマーセットと配列番号１／４，２／３および
２／４のＬＴＲプライマーセットにより検出された。し
かしながら、３つの分離株が配列番号１／３プライマー
セットにより見落とされた。ＬＴＲシステムの場合、数
個のＯ群分離株は２つのＬＴＲプローブのうちの１つ
（Ｏ群とＵ分離株に最も相同であり且つチンパンジーウ
イルスHIV1-CPZgab に最も相同であるプローブ）だけに
陽性であった。これらの結果は、単一の標的に対して２
つの検出プローブを使用することにより観察される改善
を証明した。上述のアフリカ人患者細胞ペレットの場合
には、３つのＨＩＶ−１システム（配列番号２／３、２
／４および７／８）全てが陽性であたが、しかし配列番
号２／３システムがこの実験で最高の感受性のシステム
であるらしく、試験した標的ＤＮＡの最高レベルでも２
つの複製物のうち１つしか検出しなかったので配列番号
７／８セットは最低の感受性であるように見えた。

【００８７】12の培養増幅したＨＩＶ−２分離株のうち
の１つは、試験した全てのプライマーセットに対して陰
性であった。この試料はラボで用いる対照プライマーセ
ットでも陰性であり、このことは、試料中にＨＩＶ−２
ＤＮＡが全く存在していなかった可能性があることを
示す（幾つかのＨＩＶ−２分離株は十分に培養しないこ
とは周知である）。他の11分離株はＥＮＶプライマーセ
ットおよび両ＬＴＲプライマーセットを用いた時に陽性
であった。対照的に、配列番号18／20および19／20セッ
トはそれぞれ11の分離株のうち２つおよび11の分離株の
うち１つを見落とした。

【００８８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GACCAGATCT GAGCCTGGGA GCT 23

【００８９】配列番号：２配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CTGCTTAAGC CTCAATAAAG CTTGCCTTGA 30

【００９０】配列番号：３配列の長さ：29 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GGGTCTGAGG GATCTCTAGT TACCAGAGT 29

【００９１】配列番号：４配列の長さ：23 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： TGTTCGGGCG CCACTGCTAG AGA 23

【００９２】配列番号：５配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CAACAGACGG GCACACACTA CT 22

【００９３】配列番号：６配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GAACAGATGG GCACACACTG CT 22

【００９４】配列番号：７配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： TCGGGTTTAT TACAGGGACA GCAGAGA 27

【００９５】配列番号：８配列の長さ：31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CTTGTATTAC TACTGCCCCT TCACCTTTCC A 31

【００９６】配列番号：９配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： AGCTTTGCTG GTCCTTTCCA AAGTGGG 27

【００９７】配列番号：10 配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： AGTTGTGCCG GTCCTTTCCA AATTGGG 27

【００９８】配列番号：11 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CCGGGATAGT GCAGCAACAG CAACA 25

【００９９】配列番号：12 配列の長さ：21 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CCCAGACGGT CAGTCGCAAC A 21

【０１００】配列番号：13 配列の長さ：26 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： TGGACGTGGT CAAGAGACAA CAAGAA 26

【０１０１】配列番号：14 配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GGGAGGTTCT CTCCAGCACT AGCA 24

【０１０２】配列番号：15 配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GAGCCCTGGG AGGTTCTCTC CA 22

【０１０３】配列番号：16 配列の長さ：26 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GCGACTAGGA GAGATGGGAA CACACA 26

【０１０４】配列番号：17 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CCACGCTTGC TTGCTTAAAG ACCTC 25

【０１０５】配列番号：18 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： TAGACACAGG GGCTGACGAC TCAATAGT 28

【０１０６】配列番号：19 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CACAGGGGCT GACGACTCAA TAGTAGCA 28

【０１０７】配列番号：20 配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GCCAAAAATG TTGATTGGGG TATCTCCTGT CATTA 35

【０１０８】配列番号：21 配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CCAAAAATAG TAGGGGGAAT AGGGGGATTC 30

【０１０９】配列番号：22 配列の長さ：31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CACCCCAAAA ATAGTAGGTG GGATAGGAGG G 31

【０１１０】配列番号：23 配列の長さ：24 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GACCAGATCT GAGCCTGGGA GCTC 24

【０１１１】配列番号：24 配列の長さ：31 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CTGCTTAAGC CTCAATAAAG CTTGCCTTGA G 31

【０１１２】配列番号：25 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GGTCTGAGGG ATCTCTAGTT ACCAGAGT 28

【０１１３】配列番号：26 配列の長さ：26 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GGGTCTGAGG GATCTCTAGT TACCAG 26

【０１１４】配列番号：27 配列の長さ：28 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GTATTACTAC TGCCCCTTCA CCTTTCCA 28

【０１１５】配列番号：28 配列の長さ：25 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CGGGATAGTG CAGCAACAGC AACAG 25

【０１１６】配列番号：29 配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CCCCAGACGG TCAGTCGCAA CA 22

【０１１７】配列番号：30 配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CCCTGGGAGG TTCTCTCCAG CA 22

【０１１８】配列番号：31 配列の長さ：22 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CTGTTCGGGC GCCAACCTGC TA 22

【０１１９】配列番号：32 配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： CTGCACCTCA ATTCTCTCTT TGGAAAAGAC CAGTA 35

【０１２０】配列番号：33 配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GCACCTCAAT TCTCTCTTTG GAAAAGACCA GTA 33

【０１２１】配列番号：34 配列の長さ：32 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Genomic DNA 配列： GCCAAAAATG TTGATTGGGG TATCTCCTGT CA 32

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者スーザンメリッサアトウッドアメリカ合衆国，ニューヨーク 14620, ロチェスター，ランスデイルストリート 47 (72)発明者アンエリザベスケイジーアメリカ合衆国，ニューヨーク 14617, ロチェスター，ウィノナブールバード 399 (72)発明者エリックブライスラズムッセンアメリカ合衆国，ウィスコンシン 53719, マディソン，アパートメント 309，ティンバーレイクトレイル 7329 (72)発明者トマスジョセフカミンズアメリカ合衆国，ニューヨーク 14526, ペンフィールド，ヘンダーソンドライブ 83

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−
１）からの核酸を増幅させる方法であって、ＨＩＶ−１
核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−１核酸が増
幅されるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三
リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４
つのオリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成
り、前記少なくとも４つのオリゴヌクレオチドの４つの
オリゴヌクレオチドが (a) 配列番号１，３，７および８のセット； (b) 配列番号１，４，７および８のセット； (c) 配列番号２，３，７および８のセット；並びに (d) 配列番号２，４，７および８のセットから選ばれる方法。
【請求項２】前記少なくとも４つのオリゴヌクレオチ
ドの５つのオリゴヌクレオチドが (a) 配列番号１，２，３，７および８のセット； (b) 配列番号１，２，４，７および８のセット； (c) 配列番号２，３，４，７および８のセット； (d) 配列番号１，３，４，７および８のセット；並びに (e) 配列番号１，２，３，４，７および８のセットから選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記５つのオリゴヌクレオチドが配列番
号２，３，４，７および８である、請求項２に記載の方
法。
【請求項４】前記少なくとも４つのオリゴヌクレオチ
ドの６つのオリゴヌクレオチドが配列番号１，２，３，
４，７および８である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが、テル
ムス・アクアティカスのポリメラーゼ、テルムス・テル
モフィラスのポリメラーゼおよびテルモコッカス・リト
ラリスのポリメラーゼから選ばれる、請求項１に記載の
方法。
【請求項６】ＨＩＶ−１核酸を増幅させて検出する方
法であって、 (i) ＨＩＶ−１核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩ
Ｖ−１核酸が増幅されるような条件下で、４つの異なる
ヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよ
び少なくとも４つのオリゴヌクレオチドと接触させるこ
とを含んで成り、前記少なくとも４つのオリゴヌクレオ
チドの４つのオリゴヌクレオチドが (a) 配列番号１，３，７および８のセット； (b) 配列番号１，４，７および８のセット； (c) 配列番号２，３，７および８のセット；並びに (d) 配列番号２，４，７および８のセットから選ばれ； (ii) 前記増幅したＨＩＶ−１核酸を変性させて一本鎖
核酸にし；そして (iii) 前記増幅したＨＩＶ−１核酸の存否を検出することを含んで成る方法。
【請求項７】前記検出が、 (a) 配列番号５および９のセット； (b) 配列番号５および10のセット； (c) 配列番号６および９のセット；並びに (d) 配列番号６および10のセットから選ばれた少なくとも２つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブを使って行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】前記検出が配列番号５，６，９および10
に相当する４つのオリゴヌクレオチドプローブを使って
行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】前記検出が酵素標識されているかまたは
酵素標識することができるプローブを使って行われる、
請求項６に記載の方法。
【請求項１０】ＨＩＶ−１核酸の増幅に有用な診断キ
ットであって、 (i) 配列番号１，２，３，４，７および８に相当する
オリゴヌクレオチド；並びに(ii) 耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼを含んで成る診断キット。
【請求項１１】配列番号５，６，９および10に相当す
るオリゴヌクレオチドを更に含んで成る、請求項１０に
記載の診断キット。
【請求項１２】ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−
２）の核酸を増幅させる方法であって、ＨＩＶ−２核酸
を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−２核酸が増幅さ
れるような条件下で、４つの異なるヌクレオシド三リン
酸、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも４つの
オリゴヌクレオチドと接触させることを含んで成り、前
記少なくとも４つのオリゴヌクレオチドの４つのオリゴ
ヌクレオチドが (a) 配列番号11，12，14および16のセット； (b) 配列番号11，12，15および16のセット； (c) 配列番号11，12，18および20のセット； (d) 配列番号11，12，19および20のセット； (e) 配列番号14，16，18および20のセット； (f) 配列番号14，16，19および20のセット； (g) 配列番号15，16，18および20のセット；並びに (h) 配列番号15，16，19および20のセットから選ばれる方法。
【請求項１３】次のオリゴヌクレオチド： GACCAGATCTGAGCCTGGGAGCT （配列番号１） CTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA（配列番号２） GGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAGT （配列番号３） TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA （配列番号４） CAACAGACGGGCACACACTACT（配列番号５） GAACAGATGGGCACACACTGCT（配列番号６） TCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGA （配列番号７） CTTGTATTACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA （配列番号８） AGCTTTGCTGGTCCTTTCCAAAGTGGG （配列番号９） AGTTGTGCCGGTCCTTTCCAAATTGGG （配列番号10） CCGGGATAGTGCAGCAACAGCAACA （配列番号11） CCCAGACGGTCAGTCGCAACA （配列番号12） TGGACGTGGTCAAGAGACAACAAGAA（配列番号13） GGGAGGTTCTCTCCAGCACTAGCA（配列番号14） GAGCCCTGGGAGGTTCTCTCCA（配列番号15） GCGACTAGGAGAGATGGGAACACACA（配列番号16） CCACGCTTGCTTGCTTAAAGACCTC （配列番号17） TAGACACAGGGGCTGACGACTCAATAGT（配列番号18） CACAGGGGCTGACGACTCAATAGTAGCA（配列番号19） GCCAAAAATGTTGATTGGGGTATCTCCTGTCATTA （配列番号20） CCAAAAATAGTAGGGGGAATAGGGGGATTC（配列番号21） CACCCCAAAAATAGTAGGTGGGATAGGAGGG （配列番号22）のうちの１つまたは複数を含んで成る組成物。
【請求項１４】ＨＩＶ−１核酸とＨＩＶ−２核酸を同
時増幅させる方法であって、ＨＩＶ−１核酸またはＨＩ
Ｖ−２核酸を含む疑いのある試料を、前記ＨＩＶ−１核
酸またはＨＩＶ−２核酸が増幅されるような条件下で、
４つの異なるヌクレオシド三リン酸、耐熱性ＤＮＡポリ
メラーゼ、配列番号７および８に相当するオリゴヌクレ
オチド、配列番号１，２，３および４から選ばれた少な
くとも１つのプライマーペア、並びに配列番号11, 12,
14, 15, 16, 18, 19および20から選ばれた少なくとも１
つのプライマーペア、と接触させることを含んで成る方
法。