JPH1175845A - トリプシンインヒビターの人工合成遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 人工合成遺伝子の提供 【解決手段】 イネをはじめとする高等植物で安定に発
現するように設計された、トリプシンインヒビター活性
を有するタンパク質をコードする人工合成遺伝子。この
遺伝子は、配列表の配列番号１の1位のGluから172位のS
erまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列、または該
アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠
失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードする
塩基配列を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、活性タンパク質を
コードする人工合成遺伝子に関する。より詳細には、ト
リプシンインヒビター活性を有するタンパク質をコード
する人工合成遺伝子に関する。本発明はさらに、トリプ
シンインヒビター活性を有するタンパク質をコードする
遺伝子を発現し、鱗翅目昆虫に対して耐性を有する植物
に関する。

【０００２】

【従来の技術】マメ科植物には、トリプシンインヒビタ
ーを含むいくつかのプロテアーゼインヒビターが存在す
る(Yamamotoら、J.Biochem. 94, 849-863 (1983))。

【０００３】マメ科植物由来のトリプシンインヒビター
は、分子量およびシスチン含量に基づいて２つの群に分
類されている。第１の群はBowmam-Birk型インヒビター
と呼ばれ、約8,000の分子量を有し、シスチン含量が高
く、７つのジスルフィド架橋を含む(Noriokaら、J. Bio
chem. 94, 589-599)。第２の群は、Kunitz型インヒビタ
ーと呼ばれ、約20,000の分子量を有し、２つのジスルフ
ィド架橋を含む(Shibataら、J.Biochem 99: 1147-1155
(1986))。Kunitz型インヒビターは、マメ科植物に限ら
ず、ダイズ、ネムノキ、オオムギ、アカシア、イネに存
在することが知られている(Yamamotoら、前掲)。トリプ
シンインヒビターは、脊椎動物の膵臓、血漿などに存在
し、消化酵素トリプシンの活性を阻害するペプチドであ
る。植物におけるトリプシンインヒビターの役割はよく
わかっていないが、昆虫体内に摂取されたトリプシンイ
ンヒビターが、昆虫の発育を妨げることが報告されてい
る（R. Johnsonら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9
871-9875（1989））。

【０００４】シカクマメ由来のトリプシンインヒビター
WTI-1bは、分子量19,200のKunitz型インヒビターであ
り、精製タンパク質のアミノ酸配列が同定されている(Y
amamotoら、前掲)。WTI-1bは、ウシトリプシンを阻害す
るが、ウシα-キモトリプシンは阻害しない。WTI-1bを
コードする遺伝子は単離されていない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、有用植物で
高効率に発現される有用遺伝子の設計法を提供する。本
発明により、有用植物に新たな形質を賦与する手段が提
供される。より詳細には、本発明は、イネなどの有用植
物におけるトリプシンイヒビターの遺伝子工学的発現を
目的とする。マメ科植物のタンパク質をコードする人工
合成遺伝子が、高等植物において高発現して、新たな形
質を付与した例は未だかつてない。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明は、イネをはじめ
とする高等植物で安定に発現するように設計された、ト
リプシンインヒビター活性を有するタンパク質をコード
する人工合成遺伝子に関する。この遺伝子は、配列表の
配列番号１の1位のGluから172位のSerまでのアミノ酸配
列をコードする塩基配列、または該アミノ酸配列におい
て１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加
されたアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む。

【０００７】この遺伝子は、 (a)トリプシンインヒビターのアミノ酸配列と植物由来
のキモトリプシンインヒビターのアミノ酸配列とを比較
し、複数のアミノ酸対を決定する工程であって、このア
ミノ酸対の各々から上記トリプシンインヒビターのアミ
ノ酸配列からの第１のアミノ酸、および上記キモトリプ
シンインヒビターのアミノ酸配列からの第２のアミノ酸
からなる、工程； (b)上記複数のアミノ酸対から対応するアミノ酸のコド
ンを選択する工程であって、上記アミノ酸対の各々の第
１のアミノ酸と第２のアミノ酸が同一であるときは、上
記第２のアミノ酸のコドンを選択し、上記アミノ酸対の
各々の第１のアミノ酸と第２のアミノ酸が異なるとき
は、上記第１のアミノ酸のコドンであって、上記第２の
アミノ酸のコドンに類似のコドンを選択する工程； (c)選択した上記複数のコドンを上記トリプシンインヒ
ビターのアミノ酸配列に沿って配置し、第１の塩基配列
を得る工程； (d)上記第１の塩基配列において、使用頻度の低いアミ
ノ酸のコドンを使用頻度の高いアミノ酸のコドンと置き
換えて、第２の塩基配列を得る工程；および (e)上記第２の塩基配列において、mRNAの不安定性の原
因となる配列を、この第２の配列によりコードされるア
ミノ酸配列が変化しないように変更して目的の塩基配列
を得る工程、により設計される。

【０００８】好ましくは、上記トリプシンインヒビター
のアミノ酸配列は、シカクマメ由来のトリプシンインヒ
ビター(例えばWTI-1b)のアミノ酸配列である。好ましく
は、上記植物由来のキモトリプシンインヒビターのアミ
ノ酸配列は、シカクマメ由来のキモトリプシンインヒビ
ター(例えばWCI-3)のアミノ酸配列である。

【０００９】本発明の人工合成遺伝子は、１つの実施態
様でプロセッシング領域をコードする塩基配列が５'側
に配置され得る。このプロセッシング領域は、好ましく
はトリプシンインヒビターまたはキモトリプシンインヒ
ビター由来であり、１つの実施態様では、配列表の配列
番号２の１位のMetから24位のAlaまでのアミノ酸配列で
ある。

【００１０】好ましくは、本発明の人工合成遺伝子は、
配列表の配列番号３で示される塩基配列を有する。

【００１１】本発明はまた、植物遺伝子プロモーターに
作動可能に連結された人工合成遺伝子を含む発現カセッ
ト、およびマーカーを含む発現ベクターが導入された植
物に関する。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本願発明を詳しく説明す
る。

【００１３】本発明の遺伝子は、DNAデータベースを利
用して設計される人工合成遺伝子である。ここで人工合
成遺伝子とは、天然に存在する遺伝子を模倣し、安定か
つ効率良く発現するように設計された塩基配列を意味す
る。上記DNAデータベースとして、当業者に公知の、Gen
Bank、EMBLE、DDBJなどが利用可能である。これらのデ
ータベースの植物遺伝子を、遺伝子解析アプリケーショ
ンを利用して解析して人工合成遺伝子の設計に供する。
遺伝子解析アプリケーションとしてGENETYX-Macなどが
当業者に公知である。

【００１４】本明細書で用いられる用語「植物遺伝子」
は、実質的に単子葉植物、双子葉植物などの有用遺伝子
を意味する。好ましい植物遺伝子の例として、本明細書
では、トリプシンインヒビター活性を有するタンパク質
をコードする植物遺伝子を対象とするがこれに限定され
ない。用語「トリプシンインヒビター活性を有するタン
パク質」は、トリプシンインヒビター、およびトリプシ
ンインヒビターと機能的に同等な活性を有するタンパク
質を意味する。トリプシンを阻害する活性を有するタン
パク質は機能的に同等であると見なされ得る。

【００１５】本発明を例示によって説明する。

【００１６】本発明の１つの実施態様では、最初、トリ
プシンインヒビターのアミノ酸配列と植物由来のキモト
リプシンインヒビターのアミノ酸配列とを比較する。２
つのアミノ酸配列を比較することにより、両アミノ酸配
列の相同領域が特定される。次いで、特定した相同領域
にある両アミノ酸配列の各々から相同アミノ酸の対(す
なわち同じアミノ酸の対)、およびこの相同領域または
非相同領域にある非相同アミノ酸の対(すなわち異なる
アミノ酸の対)が特定される。トリプシンインヒビター
のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸を第１のアミノ
酸、そしてキモトリプシンインヒビターのアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を第２のアミノ酸とする。
ここで、トリプシンインヒビターのアミノ酸配列からの
第１のアミノ酸、およびキモトリプシンインヒビターの
アミノ酸配列からの第２のアミノ酸からなる、複数のア
ミノ酸対が、トリプシンインヒビターのまたはキモトリ
プシンインヒビターのアミノ酸配列に沿って順に決定さ
れる。

【００１７】次いで、得られた複数のアミノ酸対から第
１の塩基配列を設計する。相同アミノ酸対からは、キモ
トリプシンインヒビター遺伝子の相同アミノ酸のコドン
を選択する。そして非相同アミノ酸の対からは、トリプ
シンインヒビターアミノ酸（第１のアミノ酸）のコドン
であって、かつキモトリプシンインヒビターアミノ酸
（第２のアミノ酸）のコドンに類似のコドンを選択す
る。ここで、例えば、類似のコドンとは、コドンを構成
する少なくとも第１番目の塩基が同じであるコドンを意
味する。ここで、トリプシンインヒビターのアミノ酸配
列のＮ末端からＣ末端までのアミノ酸の数に対応した数
の核酸コドンが選択され得る。選択されるコドンの数
は、コードされるタンパク質の活性を考慮して決定され
る。

【００１８】次いで、選択した複数のコドンをトリプシ
ンインヒビターのアミノ酸配列に沿って配置し、第１の
塩基配列を得る。

【００１９】次いで、この第１の塩基配列において、使
用頻度の低いアミノ酸のコドンは使用頻度の高いアミノ
酸の同義コドンと置き換えて、第２の塩基配列を得る。

【００２０】当業者に理解され得るように、同一アミノ
酸をコードする同義コドンは、通常、一様には使われて
おらず特定のコドンに偏りがみられる。特定の生物種に
おける特定のコドンの使用頻度は、この生物種で発現す
る個々の遺伝子で、このコドンの使用頻度を求め、それ
らを平均することによって算出される。ここで使用頻度
の低いアミノ酸のコドンとは、上記DNAデータベースか
らの情報をもとに計算して得られる特定生物種のコドン
使用において、使用頻度が、例えば、10%以下のコドン
をいい、使用頻度の高いアミノ酸のコドンとは、使用頻
度が、例えば、10%を超えるコドンをいう。表１に、本
発明の人工合成遺伝子の設計に用いたコドン使用頻度を
示す。このコドンの使用頻度はマメ科植物（ダイズ、イ
ンゲン、エンドウマメ）のものである。マメ科植物のコ
ドンの使用頻度に限らず、人工合成遺伝子が導入される
遺伝子を考慮して、任意の生物種のコドン使用頻度を使
用し得る。好ましくは、人工合成遺伝子がコードするタ
ンパク質を発現する生物種または人工合成遺伝子が導入
される生物種のコドン使用頻度が用いられる。

【００２１】

【表１ａ】

【００２２】

【表１ｂ】

【００２３】

【表１ｃ】

【００２４】次いで、上記第２の塩基配列において、mR
NAの不安定性の原因となる配列が存在する場合、第２の
配列によりコードされるアミノ酸配列が変化しないよう
に変更して目的の塩基配列を得る。真核生物、特に、イ
ネおよびトウモロコシ単子葉植物では、遺伝子が転写さ
れた後、配列「ATTTA」がmRNAの不安定性の原因となる
ことが知られている（Ohme-Takagiら、Proc．Natl．Aca
d．Sci．USA., Vol.90, pp.11181-11815（1993）を参
照）。

【００２５】必要に応じて、得られた目的の塩基配列に
特定の機能を有する既知の塩基配列を配置し得る。この
ような塩基配列の例として、タンパク質前駆体を液胞に
輸送するプロセッシング領域をコードする塩基配列が挙
げられる。

【００２６】得られた目的の塩基配列は、PCR法など当
業者に公知の方法を用いて合成され得る。好ましくは、
PCRを用いた長鎖DNA合成方法を用いて合成される(合成D
NAの作成は、細胞工学別冊、植物細胞工学シリーズ２
「植物のPCR実験プロトコール」島本功、佐々木卓治監
修、秀潤社、1995年４月10日刊行)。この方法では、長
い合成オリゴヌクレオチドプライマーのみを使用してDN
Aを合成する。プライマーの対は、プライマーの各々の
3'末端に約10〜12bpの相補鎖またはオーバーラップをも
つように合成され、お互いのプライマーを鋳型としてDN
A合成を行う。プライマーの全長は、好ましくは、約100
〜60merの範囲である。

【００２７】実際には、目的の塩基配列を、または目的
の塩基配列を必要に応じて約400bpの複数のセグメント
に分け、目的の塩基配列またはセグメントの各々を約６
本以内の長いプライマーでカバーして目的の塩基配列ま
たはセグメントを合成する。

【００２８】まず、目的の塩基配列またはセグメントの
中央領域の塩基配列をもとに設計したプライマーの対を
合成しPCRを行う。

【００２９】次に、このPCR産物を鋳型として、この鋳
型の外側(3'側)に10〜12merずつ重なるようなプライマ
ーを合成しPCRを行う。この操作を繰り返し塩基配列を
伸長し、目的の塩基配列またはセグメントを得る。目的
のセグメントの各々、および目的塩基配列の両端には、
必要に応じて、制限酵素部位を設け、常法に従いクロー
ニングベクターに導入する。得られたクローンの塩基配
列をDNAシークエンサーで確認し、目的の塩基配列が得
られたことを確認する。

【００３０】PCRは当業者に公知であり、PCRで用いる、
反応溶液、および反応サイクルを適切に選択し得る。例
えば、「植物のPCR実験プロトコール」、島本巧および
佐々木卓治監修、秀潤社を参照のこと。

【００３１】例示すれば、PCRは、以下のように実施さ
れ得る。

【００３２】１．試薬 (1)プライマー合成 使用する機械、例えば、Perkin-Elmer社のModel 391に
適合した調整済みの試薬を、製造業者の指示に従って使
用する。

【００３３】(2)PCR反応 使用する機械、例えば、プログラムテンプレートコント
ロールシステムPC-700（株式会社アステック）に適合し
た試薬を使用する。

【００３４】(3)DNA配列決定 使用する機械、例えば、Perkin-Elmer社のModel 373Aに
適合したキットを使用する。

【００３５】２．プライマー合成 プライマーは、例えば、β-シアノエチルホスホアミダ
イド法により、DNA合成機を用いて合成される。

【００３６】３．PCRによるセグメントの二本鎖化 耐熱性DNA合成酵素として、例えば、AmpliTaq DNA poly
merase(Pekin-Elmer社)を用い、Mg²⁺濃度を1.5mM MgCl₂
として実施し、以下の反応系で合成する。

【００３７】

【表２】

【００３８】得られた人工合成遺伝子は、植物遺伝子プ
ロモーターに作動可能に連結され、常法に従い、例え
ば、アグロバクテリウム・バイナリーベクター法（Hiei
ら(1994);Plant J. 6:271-28)を用いて、イネなどの植
物宿主に導入される。

【００３９】本願明細書で用いる用語「植物遺伝子プロ
モーター」は、植物で発現する遺伝子のプロモーターを
意味する。例えば、カリフラワーモザイクウイルス35S
プロモーター(以下、CaMV35Sプロモーターという)、ノ
パリンシンターゼのプロモーター等が挙げられるがこれ
らに限定されない。高発現のためにはエンハンサーが用
いられ得る。エンハンサーとしては、上記35Sプロモー
ター上流の配列を含むエンハンサー領域が好適である。
エンハンサーは複数個用いられ得る。

【００４０】本願明細書で用いる用語「発現カセット」
は、上記組換え遺伝子が発現するように、上記組換え遺
伝子とその発現を調節するプロモーター、エンハンサー
等の種々の調節エレメントとが宿主細胞中で作動し得る
状態で連結されている核酸配列をいう。発現カセットは
常法に従って構築され得る。適切なプロモーター、例え
ば、E7-P35S-Ω-Inプロモーターを、上記組換え遺伝子
に結合させる。 E7-P35S-Ω-Inプロモーターは、誘導性
でかつ発現量の高いプロモーターとして知られている
（Mitsuharaら、Plant Cell Physiol. 37(1):49-59 (19
96)を参照のこと）。さらに好適には、ターミネーター
を、上記組換え遺伝子に結合させ得る。

【００４１】本願明細書で用いる用語「ターミネータ
ー」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に
位置し、DNAがmRNAに転写される際の転写の終結、ポリ
Ａ配列の付加に関与する配列である。ターミネーター
は、mRNAの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及
ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、カ
リフラワーモザイクウイルス35Sターミネーター、およ
びノパリンシンターゼ遺伝子のターミネーターが挙げら
れるが、これらに限定されない。

【００４２】本願明細書で用いる用語「発現ベクター」
は、上記発現カセットを宿主細胞中に伝達する媒体をい
う。発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメ
ントの種類が宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業
者に公知の事項である。本願発明の発現ベクターはさら
にT-DNA領域と選択マーカー遺伝子とを有し得る。

【００４３】選択マーカー遺伝子は、形質転換植物の選
抜が容易であることが望ましい。選択マーカー遺伝子と
しては、ネオマイシンホスホトランスフェレースII（NP
TII）遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェレ
ース遺伝子等が好適に用いられ得る。

【００４４】選択マーカー遺伝子を発現させるプロモー
ターとしては、上記植物遺伝子プロモーター、例えば、
CaMV35Sプロモーター、ノパリンシンターゼプロモータ
ー等が挙げられるがこれらに限定されない。好適には、
構成的に高発現するCaMV35Sプロモーターの中でも特
に、E35S-P35Sの組合せによるプロモーターが使用され
得る。

【００４５】発現ベクターの構築に用いるベクターとし
ては、pBI系のベクター、pUC系のベクターあるいはpTRA
系のベクターが好適に用いられ得る。pBI系のベクター
はバイナリーベクター系あるいは中間ベクター系のよう
なアグロバクテリウムを介して植物に発現カセットを導
入し得る。例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI10
1.3等が挙げられる。pUC系のベクターは、直接植物に発
現カセットを導入し得る。例えば、pUC18、pUC19、pUC9
などが挙げられる。本願では、pBI系のバイナリーベク
ターであるGUS Fusion SystemのpBI121（clontech社）
が好適に用いられ得る。この発現ベクターは、植物に導
入され得る領域(T-領域)に融合遺伝子を含む発現カセッ
トと、マーカー遺伝子としてノパリンシンターゼプロモ
ーターの支配下で発現されるNPTII遺伝子を含んでい
る。

【００４６】植物細胞への組換え遺伝子、発現カセッ
ト、あるいは発現ベクターの植物細胞への導入には、当
業者に公知の方法が用いられ得る。

【００４７】上記得られた発現カセット、あるいは発現
ベクターを細胞に導入するには、上記のようにアグロバ
クテリウムを介する方法と直接細胞に導入する方法とが
ある。

【００４８】アグロバクテリウムを介する方法は、例え
ば、Nagelらの方法(Micribiol. Lett., 67, 325(1990))
が用いられ得る。この方法は、まず、例えば発現ベクタ
ーをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウ
ムに形質転換し、ついで、形質転換されたアグロバクテ
リウムをPlant Molecular Biology Manual (S. B. Gelv
in et al., Academic Press Publishers) に記載の方法
で植物細胞に導入する方法である。発現カセット、発現
ベクターを直接細胞に導入する方法としては、エレクト
ロポレーション法、遺伝子銃法がある。

【００４９】発現カセット、発現ベクターを導入された
細胞は、まずハイグロマイシン耐性等の薬剤耐性で選択
され、ついで、常法により、植物体に再生され得る。

【００５０】形質転換された植物における外来遺伝子の
発現の確認には、当業者に公知の方法が用いられ得る。
例えば、形質転換された植物から可溶性のタンパク質を
抽出し、Analytical Biochemistry 166, 368-379に記載
のように、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で抽出
したタンパク質を分離し、PVDF膜に転写した後、目的の
タンパク質に対する抗体と反応させ、生じるバンドを免
疫化学的に検出する事によって、発現が確認され得る。

【００５１】あるいは、外来遺伝子産物の活性を、害虫
への耐性により直接測定しても良い。例えば、形質転換
植物の葉を害虫の孵化幼虫に摂食させ、適当な時間の経
過後、幼虫の重さを測定することにより、外来遺伝子産
物の活性を確認し得る。害虫としては、例えば、鱗翅目
害虫が挙げられる。

【００５２】

【実施例】以下実施例を挙げて本願発明を具体的に説明
する。この実施例で使用した制限酵素、プラスミド等は
宝酒造株式会社および東洋紡績株式会社等から入手可能
である。

【００５３】（実施例１ シカクマメ由来トリプシンイ
ンヒビター（WTI-1b）活性を有するタンパク質をコード
する人工合成遺伝子の設計）シカクマメ由来のトリプシ
ンインヒビター（WTI-1b）活性を有するタンパク質をコ
ードする人工合成遺伝子の設計には、アミノ酸配列にお
いて相同性が高いシカクマメ由来のキモトリプシンイン
ヒビター（WCI-3）のcDNA配列を利用した（Peyachoknag
ulら、前掲）。WTI-1bのアミノ酸配列は発表されたYama
motoら（前掲）の配列を用いた。WCI-3のcDNA配列は、G
enBank、EMBLEおよびDDBJのDNAデータベースから得た。
WTI-1bのアミノ酸配列とWCI-3のアミノ酸配列をアライ
ンし、遺伝子解析アプリケーションGENETYX-Macを利用
して相同領域を特定した。ここでアラインした両配列の
相同領域を基に、WCI-1bおよびWCI-3の各アミノ酸配列
を対応づけ、WTI-1bのアミノ酸配列とWCI-3のアミノ酸
配列からなる複数のアミノ酸対を得た（図１）。次い
で、WTI-1bとWCI-3とから得た、相同のアミノ酸対から
は、WCI-3の遺伝子で使用されるコドンと同じコドンを
選択し、非相同アミノ酸対からは、WCI-3の遺伝子の塩
基配列と異なる塩基数が少なくなるようなコドンを選択
した（図２）。

【００５４】既知のマメ科植物のコドン使用頻度をDNA
データーベース（例えば、GenBank、EMBLE、DDBJ）によ
り調べ、上記で設計したWTI-1bの人工合成遺伝子のコド
ンのうち、マメ科植物での使用頻度が低いコドンについ
ては、使用頻度の高いコドンに交換した（図３）。

【００５５】図３に示す遺伝子配列には、イネにおいて
遺伝子が転写された後、mRNAの不安定性の原因となる配
列「ATTTA」が２箇所存在したので、アミノ酸が変化し
ないようにこの配列を変更した（図４）。

【００５６】さらに、WCI-3遺伝子は、５'側に親水性の
ペプチドからなるプロセッシング領域（配列表の配列番
号２の１位のMetから24位のAlaまでのアミノ酸配列）を
有する。この領域は、翻訳後、タンパク質の前駆体を液
胞に輸送するのに利用される領域である。WTI-1bの人工
合成遺伝子に、この配列と同じ塩基配列（配列表の配列
番号２の１位のＡから72位のＴまでのアミノ酸配列を
５'側に連結した。

【００５７】（実施例２ PCR法によるWTI-1bの人工合
成遺伝子の増幅）実施例１において設計したWTI-1bの人
工合成遺伝子の中央付近の150bpの配列をもとに、３'側
に10merずつ重なり合うように設計した80merのHPLCグレ
ードプライマー１および２（配列番号４および５）を、
常法を用いて合成した（「植物のPCR実験プロトコー
ル」、島本巧および佐々木卓治監修、秀潤社を参照）。
この２本のプライマーを用いて、お互いのプライマーを
鋳型として１回目のPCR（プログラムテンプコントロー
ルシステムPC-700、株式会社アステック）を行うことに
より２本鎖DNAを得た。反応液および反応条件は以下の
通りであった： 反応液 ５'プライマー１ 50pmol/μl １μl ３'プライマー２ 50pmol/μl １μl 10×Taq緩衝液 10μl 2.5mM dNTP mix. ８μl Taq DNA ポリメラーゼ（５U/μl） １μl DDW 79μl 合計 100μl 反応条件 94℃ ２分間 37℃ 10分間 以下を30サイクル 94℃ 30秒間 55℃ 30秒間 74℃ ２分間 。

【００５８】この鋳型の外側に10merずつ重なるような8
0merの常法により合成したプライマー３および４を（配
列番号６および７）用い、１回目のPCR産物１μlをテン
プレートとした以外は、上述の条件と同様にして２回目
のPCRを行った。次いで、２回目のPCR産物１μlをテン
プレートとして、プライマー５および６（配列番号８お
よび９）を用いて２回目のPCRと同様に３回目のPCRを行
った。さらに、３回目のPCR産物１μlをテンプレートと
して、プライマー７および８（配列番号10および11）を
用いて４回目のPCRを行い、WTI-1bタンパク質のアミノ
酸配列に相当する部分のDNAを合成した。ここで、さら
に、５'側にシグナルペプチドを連結するために、プラ
イマー８は、５'端に10merのWCI-3シグナルペプチドの
領域を含んだ。また、その後のクローニングのために、
プライマー７は終止コドンに続いて３'側にSacI制限酵
素部位を含んだ。４回目のPCR産物を、常法により精製
した（PCR精製産物Ａ）。

【００５９】上述の一連のPCRとは別に、PUC119のBamHI
およびSacI制限酵素部位にサブクローニングされたWCI-
3のcDNA（配列番号２）をテンプレートとして、プライ
マー９および10（配列番号12および13）を用いてPCRを
行った。反応試薬および反応条件は、上述のように行っ
た。ここで、プライマー９は、WCI-3シグナルペプチド
領域とWTI-1bタンパク質領域にそれぞれ15merづつまた
がる配列であり、プライマー10は、PUC119のマルチクロ
ーニング部位のHindIII（-240bp）から３'側の20merの
配列である。得られたPCR産物を１%アガロースゲルで電
気泳動し、目的の長さのバンドをゲルから切り出して、
常法により精製した（PCR精製産物Ｂ）。

【００６０】PCR精製産物ＡおよびＢを、それぞれ、１
μlずつテンプレートとして、プライマー７および10
（配列番号10および13）を用いて上述のようにPCRを行
い、得られた産物をBamHIおよびSacIで制限酵素処理し
た後、PUC119にサブクローニングした。このようにして
合成した遺伝子は、DNAシークエンサー（ABI PRISM 773
DNA Sequencer、Applied Biosystems）によって、配列
を確認した。誤った配列については、常法によりその部
分について合成したプライマーを用いてPCR法により修
正した。

【００６１】（実施例３ 発現ベクターの構築）実施例
２において作製した人工合成遺伝子をPUC119のBamHIお
よびSacI制限酵素部位で切り出し、そして予めBamHIお
よびSacI制限酵素部位で処理した高発現PBI系ベクター
（pMLH7133）（Mitsuharaら、前掲）とライゲース(liga
se)によって連結し、大腸菌（JM109）に形質転換するこ
とによりpMLH7113WTIを得た（図５を参照）。

【００６２】（実施例４ 発現ベクターのイネへの導
入） （１)Agrobacterium EHA101の形質転換 Agrobacterium EHA101の形質転換は、S.B. Gelven, R.
A. SchilperoortおよびD.P.S. Verma編 Plant Molecula
r Biology Manual, A3/7-8, Kluwer Academic Publishe
rsを参照し、EHA101をカナマイシン50μl/mlを含む培地
（YEP）中、28℃で３日間培養し、単一のコロニーを抗
生物質を含まないYEP液体培地中で培養して、コンピテ
ントセルを作製した。これにFreeze-thaw法（Plant Mol
ecular Biology Manual, A3/7-8、前掲）でpMLH7133WTI
を形質転換した。形質転換したAgrobacteriumは、50μg
/mlカナマイシンおよび50μg/mlハイグロマイシンを含
む培地上で培養することにより、単一のコロニーを得
た。

【００６３】（２)イネの形質転換 イネの形質転換は、細胞工学別冊、植物細胞工学シリー
ズ４「モデル植物の実験プロトコ−ル イネ・シロイヌ
ナズナ編」、93〜98頁、島本巧・岡田清孝監修秀潤社、
1996年４月１日刊行に記載の方法に準じた。

【００６４】（１）で得た形質転換Agrobacteriumを、Y
EP培地に食菌し、これをYEP培地で１昼夜28℃で振とう
培養した後、50%グリセロール液として、-80℃に保存し
た。この一部をYEP-寒天培地に塗布し、28℃、３日間培
養し、生じてきたバクテリアのコロニーの一部をかきと
り、ＡＡ培地に懸濁して、これにイネ（日本晴）の日ル
スを１分ほど浸し、寒天培地上で共存培養することによ
り感染させた。３日後、抗生物質を含む培地で上記細菌
を除去し、２週間毎にハイグロマイシン選択培地で継代
し、形質転換したイネカルスを選抜した。常法により再
分化、馴化した結果、形質転換個体を10個体得た。

【００６５】（実施例５ 遺伝子組換えイネにおけるWT
I-1b活性を有するタンパク質の発現のウェスタンブロッ
ティングによる検出）得られたpMLH7113WTIで形質転換
された、遺伝子組換えイネから可溶性のタンパク質抽出
液を調製した。遺伝子組換えイネの葉300mgを、液体窒
素で凍結して摩砕し、そして尿素・SDS緩衝液（75mM Tr
is-Cl (pH6.8）、８M 尿素、2.5% SDS、7.5% 2-Mercapt
oethanol、５μM Leupeptin hemisulfate）１ml中で抽
出した。この抽出液のタンパク質濃度をBradford法（Br
adford,M.（1976）Anal, Biochem. 72：248）で測定
し、全タンパク質量が20μgに相当する量、ならびにコ
ントロールとして、それぞれ、１ng、２ng、および４ng
の精製WTI-1bを、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動
で分離（Analytical Biochemistry 166, 368-379を参
照）し、PVDF膜にセミドライ転写装置（日本エイド−株
式会社）を用いて転写した後、抗WTI-1b抗体と反応させ
た。次いで、２次抗体抗体としてアルカリホスファター
ゼ標識抗体（Kirkegaard & Perry Laboratories, In
c.）を用いて、反応するバンドを免疫化学的に検出し
た。WTI-1bの人工合成遺伝子を発現した遺伝子組換えイ
ネのうちT10、T33の２個体について、 ウェスタンブロ
ッティングを行った結果を図６に示す。

【００６６】（実施例６ 遺伝子組換えイネの鱗翅目害
虫ニカメイガChilo suppressalis（Walker）の幼虫に対
する耐虫性の評価）実施例５に記載のように、ウエスタ
ンブロッティングにより発現量を確認した遺伝子組換え
イネのうち、発現量の多かった個体についてニカメイガ
に対する耐虫性を試験した。すなわち、全タンパク質20
μg当たり約５ngの発現量が確認されたT33、約２ngの発
現量が確認されたT60-1およびT56-2、ならびに約１ngの
発現量が確認されたT55-2を用いた。コントロールとし
て、同じ高発現ベクターでGUS遺伝子を形質転換したイ
ネの葉を用いた。これらの植物の展開葉から１つ下の葉
を３cm程切り取り、水で湿らせた濾紙を敷いたスチロー
ル製角型容器（67×37×12.7mm、GGJ社製）に入れ、ニ
カメイガの孵化幼虫を細い筆で５頭ずつ葉の上に置き、
フタをした。容器内の乾燥を防ぐため、容器はパラフィ
ルムでシールして、25℃、16時間照明定温器に入れた。
反復数はそれぞれ７とした。２日に１度、新しい葉をこ
れに追加、交換した。10日後、幼虫を容器から取り出
し、各容器ごとの幼虫の総重量を分析用上皿電子天秤
（メトラー・トレド社、AG245）で測定した。ただし、
１容器の幼虫数が２頭以下の場合には、体重が軽すぎて
測定不能となる場合があったので、この場合は、別の容
器内の幼虫と組合わせて体重を測定し、その全ての組合
せのデータから体重を計算した。例えば、ａ容器には幼
虫が２頭、ｂ容器にも幼虫が２頭、ｃ容器には幼虫が３
頭しか生存していなかった場合、ａ＋ｂ、ｂ＋ｃ、およ
びａ＋ｃの幼虫の重さを測定して、それぞれ、ｘmg、ｙ
mg、およびｚmgとなったとすれば、ａ容器内の幼虫の重
さは、(ｘ−ｙ＋ｚ)/２により求められる。他の容器も
同様にして求められる。各容器ごとに幼虫の総重量を幼
虫数で割った値を代表値とし、これらのデータを用い
て、統計処理を行った。その結果、遺伝子組換え植物を
食べたニカメイガ幼虫は、表３に示すように、コントロ
ールに比べて統計的に有意に体重が少なく、発現された
タンパク質が発育を遅延することが確認された。

【００６７】

【表３】

【００６８】

【発明の効果】有用植物で高効率に発現される有用遺伝
子の設計法が提供される。有用植物に新たな形質を賦与
する手段が提供される。イネを含む高等植物で安定して
発現する人工合成遺伝子が提供される。

【００６９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：172 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列番号１の配列 Glu Pro Leu Leu Asp Ser Glu Gly Glu Leu Val Arg Asn Gly Gly Thr 5 10 15 Tyr Tyr Leu Leu Pro Asp Arg Trp Ala Leu Gly Gly Gly Ile Glu Ala 20 25 30 Ala Ala Thr Gly Thr Glu Thr Cys Pro Leu Thr Val Val Arg Ser Pro 35 40 45 Asn Glu Val Ser Val Gly Glu Pro Leu Arg Ile Ser Ser Gln Leu Arg 50 55 60 Ser Gly Phe Ile Pro Asp Tyr Ser Leu Val Arg Ile Gly Phe Ala Asn 65 70 75 80 Pro Pro Lys Cys Ala Pro Ser Pro Trp Trp Thr Val Val Glu Asp Gln 85 90 95 Pro Gln Gln Pro Ser Val Lys Leu Ser Glu Leu Lys Ser Thr Lys Phe 100 105 110 Asp Tyr Leu Phe Lys Phe Glu Lys Val Thr Ser Lys Phe Ser Ser Tyr 115 120 125 Lys Leu Lys Tyr Cys Ala Lys Arg Asp Thr Cys Lys Asp Ile Gly Ile 130 135 140 Tyr Arg Asp Gln Lys Gly Tyr Ala Arg Leu Val Val Thr Asp Glu Asn 145 150 155 160 Pro Leu Val Val Ile Phe Lys Lys Val Glu Ser Ser *** 165 170 172

【００７０】配列番号：２ 配列の長さ：624 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA 起源 生物名：Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC. 配列番号２の配列 ATG AAG AGT ACT ACA TTT CTT GCC CTC TTT CTA CTC TCT GCC ATC ATC 48 Met Lys Ser Thr Thr Phe Leu Ala Leu Phe Leu Leu Ser Ala Ile Ile 5 10 15 TCA CAC CTA CCA TCA TCC ACT GCT GAT GAT GAT TTG GTC GAT GCT GAA 96 Ser His Leu Pro Ser Ser Thr Ala Asp Asp Asp Leu Val Asp Ala Glu 20 25 30 GGT AAC TTA GTT GAA AAT GGT GGC ACA TAC TAT CTG TTG CCA CAT ATA 144 Gly Asn Leu Val Glu Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Leu Leu Pro His Ile 35 40 45 TGG GCA CAC GGG GGA GGA ATA GAA ACA GCA AAA ACA GGA AAC GAA CCA 192 Trp Ala His Gly Gly Gly Ile Glu Thr Ala Lys Thr Gly Asn Glu Pro 50 55 60 TGC CCT CTA ACA GTG GTA CGA TCT CCC AAT GAG GTC TCT AAA GGG GAA 240 Cys Pro Leu Thr Val Val Arg Ser Pro Asn Glu Val Ser Lys Gly Glu 65 70 75 80 CCA ATA AGG ATC TCA TCC CAA TTC CTT TCA TTG TTC ATC CCC AGA GGC 288 Pro Ile Arg Ile Ser Ser Gln Phe Leu Ser Leu Phe Ile Pro Arg Gly 85 90 95 TCT CTA GTG GCT CTT GGA TTC GCT AAC CCT CCA TCT TGT GCA GCT TCT 336 Ser Leu Val Ala Leu Gly Phe Ala Asn Pro Pro Ser Cys Ala Ala Ser 100 105 110 CCG TGG TGG ACT GTT GTT GAC TCT CCA CAA GGA CCC GCT GTT AAA CTT 384 Pro Trp Trp Thr Val Val Asp Ser Pro Gln Gly Pro Ala Val Lys Leu 115 120 125 AGT CAG CAA AAA CTT CCG GAA AAG GAT ATT CTA GTG TTT AAA TTC GAG 432 Ser Gln Gln Lys Leu Pro Glu Lys Asp Ile Leu Val Phe Lys Phe Glu 130 135 140 AAA GTT TCC CAT TCT AAC ATT CAC GTG TAC AAG CTT TTG TAC TGT CAA 480 Lys Val Ser His Ser Asn Ile His Val Tyr Lys Leu Leu Tyr Cys Gln 145 150 155 160 CAT GAC GAA GAG GAT GTG AAG TGT GAT CAG TAT ATC GGG ATT CAT AGG 528 His Asp Glu Glu Asp Val Lys Cys Asp Gln Tyr Ile Gly Ile His Arg 165 170 175 GAT CGC AAT GGA AAC AGA CGT TTG GTG GTG ACT GAG GAA AAC CCA TTA 576 Asp Arg Asn Gly Asn Arg Arg Leu Val Val Thr Glu Glu Asn Pro Leu 180 185 190 GAG CTT GTG CTT CTG AAA GCT AAG TCA GAA ACT GCA TCA AGC CAT TAA 624 Glu Leu Val Leu Leu Lys Ala Lys Ser Glu Thr Ala Ser Ser His *** 195 200 205

【００７１】配列番号：３ 配列の長さ：591 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 人工合成遺伝子 配列番号３の配列 ATGAAGAGTA CTACATTTCT TGCCCTCTTT CTACTCTCTG CCATCATCTC ACACCTACCA 60 TCATCCACTG CTGAGCCATT GCTCGATTCT GAAGGTGAGT TAGTTCGAAA TGGTGGCACA 120 TACTATCTGT TGCCAGATAG ATGGGCACTC GGGGGAGGAA TAGAAGCAGC AGCAACAGGA 180 ACCGAAACAT GCCCTCTAAC AGTGGTACGA TCTCCCAATG AGGTCTCTGT AGGGGAACCA 240 TTAAGGATCT CATCCCAATT GCGTTCAGGG TTCATCCCCG ATTACTCTCT AGTGCGTATT 300 GGATTCGCTA ACCCTCCAAA GTGTGCACCT TCTCCGTGGT GGACTGTTGT TGAGGACCAA 360 CCACAACAAC CCTCTGTTAA ACTTAGTGAG CTAAAATCTA CTAAATTCGA TTATCTATTC 420 AAATTCGAGA AAGTTACCTC TAAGTTTTCC TCATACAAGC TTAAGTACTG TGCCAAGAGG 480 GACACCTGTA AGGATATCGG GATCTATAGG GATCAGAAAG GATACGCACG TTTGGTGGTG 540 ACTGACGAAA ACCCATTAGT GGTTATCTTT AAAAAGGTGG AGTCAAGCTA A 591

【００７２】配列番号：４ 配列の長さ：80 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号４の配列 GAATTTAGTA GATTTTAGCT CACTAAGTTT AACAGAGGGT TGTTGTGGTT GGTCCTCAAC 60 AACAGTCCAC CACGGAGAAG 80

【００７３】配列番号：５ 配列の長さ：80 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号５の配列 TTGCGTTCAG GGTTCATCCC CGATTACTCT CTAGTGCGTA TTGGATTCGC TAACCCTCCA 60 AAGTGTGCAC CTTCTCCGTG 80

【００７４】配列番号：６ 配列の長さ：80 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号６の配列 CTTGGCACAG TACTTAAGCT TGTATGAGGA AAACTTAGAG GTAACTTTCT CGAATTTGAA 60 TAGATAATCG AATTTAGTA 80

【００７５】配列番号：７ 配列の長さ：80 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号７の配列 ATGCCCTCTA ACAGTGGTAC GATCTCCCAA TGAGGTCTCT GTAGGGGAAC CATTAAGGAT 60 CTCATCCCAA TTGCGTTCAG 80

【００７６】配列番号：８ 配列の長さ：80 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号８の配列 GTCAGTCACC ACCAAACGTG CGTATCCTTT CTGATCCCTA TAGATCCCGA TATCCTTACA 60 GGTGTCCCTC TTGGCACAG 80

【００７７】配列番号：９ 配列の長さ：80 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号９の配列 CATACTATCT GTTGCCAGAT AGATGGGCAC TCGGGGGAGG AATAGAAGCA GCAGCAACAG 60 GAACCGAAAC ATGCCCTCTA 80

【００７８】配列番号：１０ 配列の長さ：65 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号１０の配列 AGCTGAGCTC TTAGCTTGAC TCCACCTTTT TAAAGATAAC CACTAATGGG TTTTCGTCAG 60 TCACC 65

【００７９】配列番号：１１ 配列の長さ：67 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号１１の配列 ATCCACTGCT GAGCCATTGC TCGATTCTGA AGGTGAGTTA GTTCGAAATG GTGGCACATA 60 CTATCTG 67

【００８０】配列番号：１２ 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号１２の配列 ATCGAGCAAT GGCTCAGCAG TGGATGATGG 30

【００８１】配列番号：１３ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プライマー 配列番号１３の配列 AGCGCCCAAT ACGCAAACCG 20

【図面の簡単な説明】

【図１】WTI-1bとWCI-3のアミノ酸配列の比較を示す図
である。

【図２】WCI-3の塩基配列に基づいて設計したWTI-1bの
人工合成遺伝子の配列を示す図である。

【図３】図１に示す配列を、マメ科植物遺伝子のコドン
使用頻度に基づいてさらに改変したWTI-1bの人工合成遺
伝子の配列を示す図である。変更箇所を下線で示す。ま
た、変更前の塩基を小文字で、変更後の塩基を大文字で
示す。

【図４】mRNAの不安定性の原因となる配列「ATTTA」が
存在した箇所を示す図である。変更箇所を下線で示す。
また、変更前の塩基を小文字で、変更後の塩基を大文字
で示す。

【図５】pMLH7133WTIベクターの構造を示す図である。

【図６】トリプシンインヒビター人工合成遺伝子組換え
イネにおけるトリプシンインヒビター発現量のウェスタ
ンブロッティングの結果を示す図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 イネで安定に発現するように設計され
   た、トリプシンインヒビター活性を有するタンパク質を
   コードする人工合成遺伝子であって、 該遺伝子は、配列表の配列番号１の1位のGluから172位
   のSerまでのアミノ酸配列をコードする塩基配列、また
   は該アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が
   欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列をコードす
   る塩基配列を含み、 (a)トリプシンインヒビターのアミノ酸配列と植物由来
   のキモトリプシンインヒビターのアミノ酸配列とを比較
   し、複数のアミノ酸対を決定する工程であって、該アミ
   ノ酸対の各々が該トリプシンインヒビターのアミノ酸配
   列からの第１のアミノ酸、および該キモトリプシンイン
   ヒビターのアミノ酸配列からの第２のアミノ酸からな
   る、工程； (b)該複数のアミノ酸対から対応するアミノ酸のコドン
   を選択する工程であって、該アミノ酸対の各々の第１の
   アミノ酸と第２のアミノ酸が同一であるときは、該第２
   のアミノ酸のコドンを選択し、該アミノ酸対の各々の第
   １のアミノ酸と第２のアミノ酸が異なるときは、該第１
   のアミノ酸のコドンであって、該第２のアミノ酸のコド
   ンに類似のコドンを選択する工程； (c)選択した該複数のコドンを該トリプシンインヒビタ
   ーのアミノ酸配列に沿って配置し、第１の塩基配列を得
   る工程； (d)該第１の塩基配列において、使用頻度の低いアミノ
   酸のコドンを使用頻度の高いアミノ酸のコドンと置き換
   えて、第２の塩基配列を得る工程；および (e)該第２の塩基配列において、mRNAの不安定性の原因
   となる配列を、該第２の配列によりコードされるアミノ
   酸配列が変化しないように変更して目的の塩基配列を得
   る工程、 により設計された、遺伝子。
2. 【請求項２】 前記トリプシンインヒビターのアミノ酸
   配列が、シカクマメ由来のトリプシンインヒビターのア
   ミノ酸配列である、請求項１に記載の人工合成遺伝子。
3. 【請求項３】 前記シカクマメ由来のトリプシンインヒ
   ビターのアミノ酸配列が、WTI-1bのアミノ酸配列であ
   る、請求項２に記載の人工合成遺伝子。
4. 【請求項４】 前記植物由来のキモトリプシンインヒビ
   ターのアミノ酸配列が、シカクマメ由来のキモトリプシ
   ンインヒビターのアミノ酸配列である、請求項１〜３の
   いずれかに記載の人工合成遺伝子。
5. 【請求項５】 前記シカクマメ由来のキモトリプシンイ
   ンヒビターのアミノ酸配列が、WCI-3のアミノ酸配列で
   ある、請求項４に記載の人工合成遺伝子。
6. 【請求項６】 プロセッシング領域をコードする塩基配
   列を５'側にさらに配置した、請求項１〜５のいずれか
   に記載の人工合成遺伝子。
7. 【請求項７】 前記プロセッシング領域が配列表の配列
   番号２の１位のMetから24位のAlaまでのアミノ酸配列で
   ある、請求項６に記載の人工合成遺伝子。
8. 【請求項８】 配列表の配列番号３で示される塩基配列
   からなる、請求項７に記載の人工合成遺伝子。
9. 【請求項９】 植物遺伝子プロモーターに作動可能に連
   結された、請求項１に記載の人工合成遺伝子を含む発現
   カセット、および選択マーカーを含む発現ベクターが導
   入された、請求項１に記載の人工遺伝子が導入された植
   物。