JPH1175897A - 遺伝子工学用色素含有剤 - Google Patents
遺伝子工学用色素含有剤Info
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Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 遺伝子増幅法や該方法で得られた核酸断片の
解析に有用な遺伝子工学用試薬を提供する。 【解決手段】 後記（１）、（２）より選択される遺伝
子工学用色素含有剤：（１）遺伝子増幅反応においてそ
の反応の効率を向上させる遺伝子増幅効率向上剤、
（２）遺伝子増幅反応を阻害せず、反応前の遺伝子増幅
反応液に添加されることによって反応液を直接電気泳動
に供することを可能にする色素剤。前記の遺伝子工学用
色素含有剤を含有する遺伝子増幅反応液。前記の遺伝子
工学用色素含有剤、又は遺伝子増幅反応液を含有する遺
伝子増幅用キット。 【効果】 反応後に得られる増幅産物の量の増加、並び
に遺伝子の検出感度の向上、また、一連の遺伝子増幅操
作を簡便、かつ効率よく行うことができる。
解析に有用な遺伝子工学用試薬を提供する。 【解決手段】 後記（１）、（２）より選択される遺伝
子工学用色素含有剤：（１）遺伝子増幅反応においてそ
の反応の効率を向上させる遺伝子増幅効率向上剤、
（２）遺伝子増幅反応を阻害せず、反応前の遺伝子増幅
反応液に添加されることによって反応液を直接電気泳動
に供することを可能にする色素剤。前記の遺伝子工学用
色素含有剤を含有する遺伝子増幅反応液。前記の遺伝子
工学用色素含有剤、又は遺伝子増幅反応液を含有する遺
伝子増幅用キット。 【効果】 反応後に得られる増幅産物の量の増加、並び
に遺伝子の検出感度の向上、また、一連の遺伝子増幅操
作を簡便、かつ効率よく行うことができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、遺伝子増幅法や該
方法で得られた核酸断片の解析に有用な遺伝子工学用色
素含有剤に関する。
方法で得られた核酸断片の解析に有用な遺伝子工学用色
素含有剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】遺伝子増幅法、特にポリメラーゼ・チェ
ーン・リアクション（ＰＣＲ）法は試験管内において簡
便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、現在では遺
伝子に関する研究のみならず生物学、医学、農業等幅広
い分野において不可欠の手法となっている。遺伝子増幅
法によって試料中に存在する特定の遺伝子、又はその断
片を増幅することは、該遺伝子のみならず該遺伝子を有
する生物そのものの存在を検出することにつながる。ま
た増幅対象をｍＲＮＡとすることにより、該遺伝子の発
現状態を知ることも可能である。遺伝子増幅法のこのよ
うな特徴は、該方法を広範な分野において利用可能な遺
伝子のスクリーニング方法とした。その例としては、例
えば微生物遺伝子の検出による食品や飲料水の微生物汚
染の検査や、組織適合性抗原遺伝子を調べる移植適合検
査等が挙げられる。このような分野での遺伝子増幅法の
利用は、非常に多数の試料を対象として該方法を実施す
ることを必要とし、その操作全体を効率よく行うことが
望まれるようになってきた。遺伝子増幅反応において、
その増幅効率は該反応の全体の質を左右する重要な因子
である。遺伝子増幅反応効率が低い反応系では、必要な
増幅産物を得るために反応のスケールを大きくする、す
なわち使用する鋳型量や酵素量を増やすか、あるいは反
応時間を延長するなどの配慮が必要となることがある。
また、遺伝子の検出手段として行われる遺伝子増幅反応
においては増幅反応効率が検出感度を左右する。例え
ば、ＰＣＲ法による遺伝子増幅反応は、ＤＮＡポリメラ
ーゼの活性を利用してある鋳型核酸に相補的な核酸を合
成する工程の繰返しからなる。理想的には１工程の反応
によって１分子の鋳型核酸から１分子の相補鎖核酸が合
成されるはずであるが、実際には反応の中断等のために
これよりも低い効率で相補鎖が合成される。したがっ
て、その条件を改善することによって現行の反応よりも
高い効率で遺伝子増幅を行うことが期待される。
ーン・リアクション（ＰＣＲ）法は試験管内において簡
便に所望の核酸断片を増幅する技術であり、現在では遺
伝子に関する研究のみならず生物学、医学、農業等幅広
い分野において不可欠の手法となっている。遺伝子増幅
法によって試料中に存在する特定の遺伝子、又はその断
片を増幅することは、該遺伝子のみならず該遺伝子を有
する生物そのものの存在を検出することにつながる。ま
た増幅対象をｍＲＮＡとすることにより、該遺伝子の発
現状態を知ることも可能である。遺伝子増幅法のこのよ
うな特徴は、該方法を広範な分野において利用可能な遺
伝子のスクリーニング方法とした。その例としては、例
えば微生物遺伝子の検出による食品や飲料水の微生物汚
染の検査や、組織適合性抗原遺伝子を調べる移植適合検
査等が挙げられる。このような分野での遺伝子増幅法の
利用は、非常に多数の試料を対象として該方法を実施す
ることを必要とし、その操作全体を効率よく行うことが
望まれるようになってきた。遺伝子増幅反応において、
その増幅効率は該反応の全体の質を左右する重要な因子
である。遺伝子増幅反応効率が低い反応系では、必要な
増幅産物を得るために反応のスケールを大きくする、す
なわち使用する鋳型量や酵素量を増やすか、あるいは反
応時間を延長するなどの配慮が必要となることがある。
また、遺伝子の検出手段として行われる遺伝子増幅反応
においては増幅反応効率が検出感度を左右する。例え
ば、ＰＣＲ法による遺伝子増幅反応は、ＤＮＡポリメラ
ーゼの活性を利用してある鋳型核酸に相補的な核酸を合
成する工程の繰返しからなる。理想的には１工程の反応
によって１分子の鋳型核酸から１分子の相補鎖核酸が合
成されるはずであるが、実際には反応の中断等のために
これよりも低い効率で相補鎖が合成される。したがっ
て、その条件を改善することによって現行の反応よりも
高い効率で遺伝子増幅を行うことが期待される。
【０００３】一方、遺伝子増幅反応によって生成された
増幅産物の解析法としては、増幅産物の鎖長とその量を
同時に知ることができる電気泳動法がよく使用されてい
る。電気泳動による増幅産物の解析は、反応後の溶液の
一部をとってこれに試料用色素緩衝液（ローディング・
バッファー）を添加し、電気泳動に供するのが一般的で
ある。このような試料用色素緩衝液は、泳動距離の指標
となる成分として色素（色素マーカー）、反応液をゲル
のウエル内に容易にアプライできるように反応液の比重
を増加させる成分としてグリセロール等を含んでいる。
多数の試料について遺伝子増幅法を実施し、その結果の
解析を電気泳動によって行う場合、個々の反応液を試料
用色素緩衝液と混合して電気泳動に供するのは非常に煩
雑な作業である。この作業は増幅反応が終った容器から
の反応液の採取、試料用色素緩衝液の添加、混合といっ
た一連の操作を要し、また、混合のための新たな容器も
必要である。更に操作中に試料を取り違えてしまう危険
もある。遺伝子増幅反応液に予め試料用色素緩衝液を加
えておき、遺伝子増幅反応後の反応液を直接電気泳動に
供することができれば、上記の煩雑さを解消し、能率よ
く作業を行うことができる。しかしながら、反応に悪影
響を与えることなく、反応開始前の遺伝子増幅反応液に
添加して使用可能な試料用色素緩衝液は存在しなかっ
た。
増幅産物の解析法としては、増幅産物の鎖長とその量を
同時に知ることができる電気泳動法がよく使用されてい
る。電気泳動による増幅産物の解析は、反応後の溶液の
一部をとってこれに試料用色素緩衝液（ローディング・
バッファー）を添加し、電気泳動に供するのが一般的で
ある。このような試料用色素緩衝液は、泳動距離の指標
となる成分として色素（色素マーカー）、反応液をゲル
のウエル内に容易にアプライできるように反応液の比重
を増加させる成分としてグリセロール等を含んでいる。
多数の試料について遺伝子増幅法を実施し、その結果の
解析を電気泳動によって行う場合、個々の反応液を試料
用色素緩衝液と混合して電気泳動に供するのは非常に煩
雑な作業である。この作業は増幅反応が終った容器から
の反応液の採取、試料用色素緩衝液の添加、混合といっ
た一連の操作を要し、また、混合のための新たな容器も
必要である。更に操作中に試料を取り違えてしまう危険
もある。遺伝子増幅反応液に予め試料用色素緩衝液を加
えておき、遺伝子増幅反応後の反応液を直接電気泳動に
供することができれば、上記の煩雑さを解消し、能率よ
く作業を行うことができる。しかしながら、反応に悪影
響を与えることなく、反応開始前の遺伝子増幅反応液に
添加して使用可能な試料用色素緩衝液は存在しなかっ
た。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上記
の問題を解決することが可能な遺伝子工学用試薬を提供
することにある。
の問題を解決することが可能な遺伝子工学用試薬を提供
することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明の第１の発明はその成分として色素を含有する遺伝
子工学用色素含有剤に関し、下記（１）、（２）から選
択されることを特徴とする； （１）遺伝子増幅反応においてその反応の効率を向上さ
せる遺伝子増幅効率向上剤、（２）遺伝子増幅反応を阻
害せず、反応前の遺伝子増幅反応液に添加されることに
よって反応液を直接電気泳動に供することを可能にする
色素剤。次に、本発明の第２の発明は遺伝子増幅反応に
使用するための反応液に関し、第１の発明の遺伝子工学
用色素含有剤を含有することを特徴とする。更に、本発
明の第３の発明は遺伝子増幅反応を行うためのキットに
関し、第１の発明の遺伝子工学用色素含有剤、又は第２
の発明の遺伝子増幅反応液を含有することを特徴とす
る。
発明の第１の発明はその成分として色素を含有する遺伝
子工学用色素含有剤に関し、下記（１）、（２）から選
択されることを特徴とする； （１）遺伝子増幅反応においてその反応の効率を向上さ
せる遺伝子増幅効率向上剤、（２）遺伝子増幅反応を阻
害せず、反応前の遺伝子増幅反応液に添加されることに
よって反応液を直接電気泳動に供することを可能にする
色素剤。次に、本発明の第２の発明は遺伝子増幅反応に
使用するための反応液に関し、第１の発明の遺伝子工学
用色素含有剤を含有することを特徴とする。更に、本発
明の第３の発明は遺伝子増幅反応を行うためのキットに
関し、第１の発明の遺伝子工学用色素含有剤、又は第２
の発明の遺伝子増幅反応液を含有することを特徴とす
る。
【０００６】本発明者らは鋭意研究の結果、遺伝子増幅
反応液中に色素を添加して反応を行った場合に反応が促
進され、より多くの増幅産物が得られることを明らかに
した。また、色素を予め反応液に添加することにより、
反応液中の核酸の電気泳動による解析が簡便に行えるよ
うになることを見出し、本発明を完成した。
反応液中に色素を添加して反応を行った場合に反応が促
進され、より多くの増幅産物が得られることを明らかに
した。また、色素を予め反応液に添加することにより、
反応液中の核酸の電気泳動による解析が簡便に行えるよ
うになることを見出し、本発明を完成した。
【０００７】
【発明の実施の形態】以下、本発明を具体的に説明す
る。本発明の遺伝子工学用色素含有剤は、その有効成分
として色素を含有することを特徴とする。本発明に使用
することのできる色素には特に限定はないが、生化学分
野で汎用されている色素、例えばｐＨ指示薬やタンパク
染色用試薬として使用されている色素等を使用すること
ができる。本発明に好適な色素としては、例えばオレン
ジＧ、ブロモフェノールブルー、ポンソーＳ、キシレン
シアノール、ファーストグリーンＦＣＦ、アミドブラッ
ク、メチルレッド等があり、これらは単独あるいは混合
された形で使用することができる。
る。本発明の遺伝子工学用色素含有剤は、その有効成分
として色素を含有することを特徴とする。本発明に使用
することのできる色素には特に限定はないが、生化学分
野で汎用されている色素、例えばｐＨ指示薬やタンパク
染色用試薬として使用されている色素等を使用すること
ができる。本発明に好適な色素としては、例えばオレン
ジＧ、ブロモフェノールブルー、ポンソーＳ、キシレン
シアノール、ファーストグリーンＦＣＦ、アミドブラッ
ク、メチルレッド等があり、これらは単独あるいは混合
された形で使用することができる。
【０００８】本発明の遺伝子工学用色素含有剤として
は、遺伝子増幅反応においてその反応効率を向上させる
もの、すなわち遺伝子増幅効率向上剤として使用される
ものがある。該遺伝子増幅効率向上剤には遺伝子増幅反
応の効率を向上させる成分として上記の色素を使用する
ことができる。これらの色素のうちには高濃度で使用し
た場合に遺伝子増幅反応を阻害するものがあるが、本発
明の遺伝子増幅効率向上剤には、該色素が遺伝子増幅反
応の効率を向上させるのに効果のある濃度で反応液に添
加されるような濃度で含有されていればよい。また、本
発明の遺伝子増幅効率向上剤はｐＨを調整するための緩
衝成分、例えばトリス−塩酸等を含んでいてもよい。そ
のｐＨは、該遺伝子増幅効率向上剤が添加された反応液
のｐＨが通常遺伝子増幅反応が実施される範囲、例えば
ｐＨ８．３〜ｐＨ９．２の範囲となるように調整されて
いることが好ましい。
は、遺伝子増幅反応においてその反応効率を向上させる
もの、すなわち遺伝子増幅効率向上剤として使用される
ものがある。該遺伝子増幅効率向上剤には遺伝子増幅反
応の効率を向上させる成分として上記の色素を使用する
ことができる。これらの色素のうちには高濃度で使用し
た場合に遺伝子増幅反応を阻害するものがあるが、本発
明の遺伝子増幅効率向上剤には、該色素が遺伝子増幅反
応の効率を向上させるのに効果のある濃度で反応液に添
加されるような濃度で含有されていればよい。また、本
発明の遺伝子増幅効率向上剤はｐＨを調整するための緩
衝成分、例えばトリス−塩酸等を含んでいてもよい。そ
のｐＨは、該遺伝子増幅効率向上剤が添加された反応液
のｐＨが通常遺伝子増幅反応が実施される範囲、例えば
ｐＨ８．３〜ｐＨ９．２の範囲となるように調整されて
いることが好ましい。
【０００９】本明細書記載の「遺伝子増幅反応の効率」
は、一定の条件、すなわち一定の鋳型核酸やプライマー
の量、反応温度、反応時間において得られる増幅産物の
量を示す。本発明の遺伝子増幅効率向上剤を添加した反
応液を用いて遺伝子増幅反応を行うことにより、添加し
ない場合に比べて得られる増幅産物の量が増加する。ま
た、本発明の遺伝子増幅効率向上剤によって増幅可能な
核酸の鎖長が延長されることもあるが、この場合にもこ
れまでわずかな量しか、あるいは全く得られなかった長
鎖の増幅産物が豊富に得られるようになり、「遺伝子増
幅反応の効率」の向上が認められる。
は、一定の条件、すなわち一定の鋳型核酸やプライマー
の量、反応温度、反応時間において得られる増幅産物の
量を示す。本発明の遺伝子増幅効率向上剤を添加した反
応液を用いて遺伝子増幅反応を行うことにより、添加し
ない場合に比べて得られる増幅産物の量が増加する。ま
た、本発明の遺伝子増幅効率向上剤によって増幅可能な
核酸の鎖長が延長されることもあるが、この場合にもこ
れまでわずかな量しか、あるいは全く得られなかった長
鎖の増幅産物が豊富に得られるようになり、「遺伝子増
幅反応の効率」の向上が認められる。
【００１０】本発明の遺伝子増幅効率向上剤は、上記の
ように予め反応液に添加して遺伝子増幅反応に使用され
る。該向上剤が添加可能な遺伝子増幅反応としては、特
に限定されるものではないが、例えばＰＣＲ法等が挙げ
られる。該向上剤はそこに含有される色素の終濃度が遺
伝子増幅反応に適した範囲となるような量を反応開始前
の反応液に添加して使用すればよい。該向上剤の使用に
より、これまでよりも少量の鋳型核酸からも十分な量の
増幅産物が得られるようになり、また、遺伝子の検出を
行う場合においてもその感度を向上させることができ
る。
ように予め反応液に添加して遺伝子増幅反応に使用され
る。該向上剤が添加可能な遺伝子増幅反応としては、特
に限定されるものではないが、例えばＰＣＲ法等が挙げ
られる。該向上剤はそこに含有される色素の終濃度が遺
伝子増幅反応に適した範囲となるような量を反応開始前
の反応液に添加して使用すればよい。該向上剤の使用に
より、これまでよりも少量の鋳型核酸からも十分な量の
増幅産物が得られるようになり、また、遺伝子の検出を
行う場合においてもその感度を向上させることができ
る。
【００１１】遺伝子増幅効率に優れ、かつ長鎖のＤＮＡ
断片の増幅が可能なＰＣＲ技術としてＬＡ ＰＣＲ法が
知られている〔プロシーディングズ オブ ザ ナショ
ナルアカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ Ｕ
ＳＡ（Proc. Natl. Acad.Sci. USA）、第９１巻、第２
２１６〜２２２０頁（１９９４）〕。該方法は性質の異
なる２種のＤＮＡポリメラーゼを混合して使用するＰＣ
Ｒ法であり、その特徴の一つとして、１種のＤＮＡポリ
メラーゼの使用では増幅が困難な長鎖のＤＮＡを増幅可
能なことが挙げられる。本発明の遺伝子増幅効率向上剤
は該方法における増幅効率の向上に特に有用である。
断片の増幅が可能なＰＣＲ技術としてＬＡ ＰＣＲ法が
知られている〔プロシーディングズ オブ ザ ナショ
ナルアカデミー オブ サイエンシーズ オブ ザ Ｕ
ＳＡ（Proc. Natl. Acad.Sci. USA）、第９１巻、第２
２１６〜２２２０頁（１９９４）〕。該方法は性質の異
なる２種のＤＮＡポリメラーゼを混合して使用するＰＣ
Ｒ法であり、その特徴の一つとして、１種のＤＮＡポリ
メラーゼの使用では増幅が困難な長鎖のＤＮＡを増幅可
能なことが挙げられる。本発明の遺伝子増幅効率向上剤
は該方法における増幅効率の向上に特に有用である。
【００１２】また、本発明の遺伝子工学用色素含有剤と
しては、反応前の遺伝子増幅反応液に添加されることに
よって反応液を直接電気泳動に供することを可能にする
色素剤がある。該色素剤は遺伝子増幅反応を阻害しない
ことを特徴とする。該色素剤を反応開始前の遺伝子増幅
反応液に添加することにより、反応終了後、反応液をそ
のまま電気泳動のゲルにアプライすることができる。す
なわち、この場合には反応終了後、電気泳動に先立って
反応液に試料用色素緩衝液を添加する必要がないため、
増幅産物を電気泳動によって解析する際に有用である。
該色素剤に含有される色素としては、電気泳動時にその
泳動状態を知るための目安となるよう陽極側に移動する
ものであれば特に限定はなく、１種、又は複数の色素を
組合せて使用すればよい。
しては、反応前の遺伝子増幅反応液に添加されることに
よって反応液を直接電気泳動に供することを可能にする
色素剤がある。該色素剤は遺伝子増幅反応を阻害しない
ことを特徴とする。該色素剤を反応開始前の遺伝子増幅
反応液に添加することにより、反応終了後、反応液をそ
のまま電気泳動のゲルにアプライすることができる。す
なわち、この場合には反応終了後、電気泳動に先立って
反応液に試料用色素緩衝液を添加する必要がないため、
増幅産物を電気泳動によって解析する際に有用である。
該色素剤に含有される色素としては、電気泳動時にその
泳動状態を知るための目安となるよう陽極側に移動する
ものであれば特に限定はなく、１種、又は複数の色素を
組合せて使用すればよい。
【００１３】電気泳動後の増幅産物の解析は、通常、ゲ
ルを適当な核酸染色用試薬で染色することによって実施
される。例えば、エチジウムブロマイドを使用する場合
には、染色したゲルを紫外線照射下に肉眼で観察、ある
いは写真撮影するか、適当な装置を使用した画像解析を
行う。色素のあるものは染色後のゲル中の増幅産物の確
認を困難にすることがあるが、本発明の色素剤において
はこのような性質を示さない濃度で使用することが望ま
しい。また、該色素剤に含有される色素の濃度は、反応
液中では遺伝子増幅反応を阻害せず、かつ電気泳動時に
は泳動距離の指標として目視可能な濃度であればよい。
反応液中での終濃度が、例えばオレンジＧであれば０．
０５〜０．５mg／ml、ブロモフェノールブルーでは０．
０２〜０．２mg／ml、アミドブラックでは０．０１〜
０．０５mg／mlとなるように設定されるのが適当であ
る。更に、含有される色素が遺伝子増幅反応の効率を向
上させる作用を有するものは特に有用である。
ルを適当な核酸染色用試薬で染色することによって実施
される。例えば、エチジウムブロマイドを使用する場合
には、染色したゲルを紫外線照射下に肉眼で観察、ある
いは写真撮影するか、適当な装置を使用した画像解析を
行う。色素のあるものは染色後のゲル中の増幅産物の確
認を困難にすることがあるが、本発明の色素剤において
はこのような性質を示さない濃度で使用することが望ま
しい。また、該色素剤に含有される色素の濃度は、反応
液中では遺伝子増幅反応を阻害せず、かつ電気泳動時に
は泳動距離の指標として目視可能な濃度であればよい。
反応液中での終濃度が、例えばオレンジＧであれば０．
０５〜０．５mg／ml、ブロモフェノールブルーでは０．
０２〜０．２mg／ml、アミドブラックでは０．０１〜
０．０５mg／mlとなるように設定されるのが適当であ
る。更に、含有される色素が遺伝子増幅反応の効率を向
上させる作用を有するものは特に有用である。
【００１４】本発明の色素剤はｐＨを調整するための緩
衝成分、例えばトリス−塩酸等を含んでいてもよい。そ
のｐＨは、該色素剤が添加された反応液のｐＨが通常遺
伝子増幅反応が実施される範囲、例えばｐＨ８．３〜
９．２の範囲となるように調整されていることが好まし
い。
衝成分、例えばトリス−塩酸等を含んでいてもよい。そ
のｐＨは、該色素剤が添加された反応液のｐＨが通常遺
伝子増幅反応が実施される範囲、例えばｐＨ８．３〜
９．２の範囲となるように調整されていることが好まし
い。
【００１５】また、本発明の色素剤は反応液のゲルのウ
エルへの添加が容易となるよう、反応液の比重を高める
ような成分を含有するものであってもよい。このような
成分としては、例えばグリセロールやショ糖等を使用す
ることができる。その反応液中での濃度は遺伝子増幅反
応に悪影響を与えず、かつ反応液に適度な比重を与える
範囲であれば特に限定はない。なお、下記に例示した本
発明の遺伝子工学用色素含有剤はこのような成分を含有
していないが、これを添加した反応液は十分な比重を有
しており、電気泳動に供する上で不都合はない。更に、
該色素剤を含有する反応液はアガロース、アクリルアミ
ド等各種の電気泳動用ゲルに使用することが可能であ
る。
エルへの添加が容易となるよう、反応液の比重を高める
ような成分を含有するものであってもよい。このような
成分としては、例えばグリセロールやショ糖等を使用す
ることができる。その反応液中での濃度は遺伝子増幅反
応に悪影響を与えず、かつ反応液に適度な比重を与える
範囲であれば特に限定はない。なお、下記に例示した本
発明の遺伝子工学用色素含有剤はこのような成分を含有
していないが、これを添加した反応液は十分な比重を有
しており、電気泳動に供する上で不都合はない。更に、
該色素剤を含有する反応液はアガロース、アクリルアミ
ド等各種の電気泳動用ゲルに使用することが可能であ
る。
【００１６】本発明の色素剤が添加可能な遺伝子増幅反
応としては、特に限定されるものではないが、例えばＰ
ＣＲ法が挙げられる。なお、本発明の色素剤は目的とす
る反応を阻害しない範囲で、遺伝子増幅以外の酵素反
応、例えばＤＮＡの制限酵素消化反応等にも使用するこ
とが可能である。
応としては、特に限定されるものではないが、例えばＰ
ＣＲ法が挙げられる。なお、本発明の色素剤は目的とす
る反応を阻害しない範囲で、遺伝子増幅以外の酵素反
応、例えばＤＮＡの制限酵素消化反応等にも使用するこ
とが可能である。
【００１７】本発明の遺伝子工学用色素含有剤の例とし
ては、例えば、１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１
mg／mlオレンジＧ、０．２mg／mlブロモフェノールブル
ーという組成のものが挙げられる。該色素含有剤は遺伝
子増幅反応液に、その全量に対して５〜１０％程度の量
を添加して使用される。例えば、反応開始前のＰＣＲ反
応液に該色素含有剤を添加して遺伝子増幅反応を行った
場合には、該色素含有剤が添加されない場合に比べて増
幅される産物の量が増加する。また、この反応液は反応
終了後に直接電気泳動に供することが可能である。
ては、例えば、１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１
mg／mlオレンジＧ、０．２mg／mlブロモフェノールブル
ーという組成のものが挙げられる。該色素含有剤は遺伝
子増幅反応液に、その全量に対して５〜１０％程度の量
を添加して使用される。例えば、反応開始前のＰＣＲ反
応液に該色素含有剤を添加して遺伝子増幅反応を行った
場合には、該色素含有剤が添加されない場合に比べて増
幅される産物の量が増加する。また、この反応液は反応
終了後に直接電気泳動に供することが可能である。
【００１８】上記のように、本発明の遺伝子工学用色素
剤は、例えばその適量を遺伝子増幅反応液に添加して使
用されるが、遺伝子増幅反応に必要な各種の成分と、本
発明の遺伝子工学用色素剤とを混合した反応液を調製し
ておくことにより、簡便に遺伝子増幅反応を実施するこ
とができる。このような遺伝子増幅反応液としては、例
えばＰＣＲ法に使用するものの場合は、反応に適したｐ
Ｈを維持するための緩衝成分（トリス−塩酸等）、Ｍｇ
Ｃｌ2 、基質となるデオキシリボヌクレオチド三リン酸
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、及び本
発明の遺伝子工学用色素剤を含むものが例示される。更
にＤＮＡポリメラーゼを含有するものでもよい。また増
幅の対象となる遺伝子が特定のものであれば、該遺伝子
を増幅するためのプライマーを含んでいてもよい。これ
らの各成分の濃度は、最終的に反応液が調製された際
に、それぞれ遺伝子増幅反応に適した濃度となるように
設定されていればよい。
剤は、例えばその適量を遺伝子増幅反応液に添加して使
用されるが、遺伝子増幅反応に必要な各種の成分と、本
発明の遺伝子工学用色素剤とを混合した反応液を調製し
ておくことにより、簡便に遺伝子増幅反応を実施するこ
とができる。このような遺伝子増幅反応液としては、例
えばＰＣＲ法に使用するものの場合は、反応に適したｐ
Ｈを維持するための緩衝成分（トリス−塩酸等）、Ｍｇ
Ｃｌ2 、基質となるデオキシリボヌクレオチド三リン酸
（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、及び本
発明の遺伝子工学用色素剤を含むものが例示される。更
にＤＮＡポリメラーゼを含有するものでもよい。また増
幅の対象となる遺伝子が特定のものであれば、該遺伝子
を増幅するためのプライマーを含んでいてもよい。これ
らの各成分の濃度は、最終的に反応液が調製された際
に、それぞれ遺伝子増幅反応に適した濃度となるように
設定されていればよい。
【００１９】本発明の遺伝子工学用色素剤、並びに本発
明の遺伝子工学用色素剤を含有する遺伝子増幅反応液
は、種々の遺伝子増幅反応に利用することができる。し
たがって試験管内での遺伝子増幅を行うためのキット、
例えば、ＰＣＲキット等に本発明の遺伝子工学用色素剤
又は本発明の遺伝子増幅反応液を添付することにより、
これらキットの性能を改善することができる。このよう
なキットとしては、例えばＤＮＡポリメラーゼや核酸合
成の基質であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸、Ｍ
ｇＣｌ2 と言った遺伝子増幅反応に必要な試薬と本発明
の遺伝子工学用色素剤とを含むもの等が挙げられる。
明の遺伝子工学用色素剤を含有する遺伝子増幅反応液
は、種々の遺伝子増幅反応に利用することができる。し
たがって試験管内での遺伝子増幅を行うためのキット、
例えば、ＰＣＲキット等に本発明の遺伝子工学用色素剤
又は本発明の遺伝子増幅反応液を添付することにより、
これらキットの性能を改善することができる。このよう
なキットとしては、例えばＤＮＡポリメラーゼや核酸合
成の基質であるデオキシリボヌクレオチド三リン酸、Ｍ
ｇＣｌ2 と言った遺伝子増幅反応に必要な試薬と本発明
の遺伝子工学用色素剤とを含むもの等が挙げられる。
【００２０】以上に説明したとおり、本発明により、遺
伝子増幅反応を始め種々の遺伝子工学的実験操作におい
て有用な遺伝子工学用色素剤が提供される。本発明の遺
伝子工学用色素剤は、種々の遺伝子増幅反応に利用可能
であり、例えばＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅等に利用で
きる。この遺伝子工学用色素剤を利用して遺伝子増幅を
実施することにより、反応後に得られる増幅産物の量の
増加、並びに遺伝子の検出感度の向上を達成することが
できる。また、増幅産物の検出、確認を含む一連の遺伝
子増幅操作を簡便、かつ効率よく行うことができる。
伝子増幅反応を始め種々の遺伝子工学的実験操作におい
て有用な遺伝子工学用色素剤が提供される。本発明の遺
伝子工学用色素剤は、種々の遺伝子増幅反応に利用可能
であり、例えばＰＣＲ法によるＤＮＡの増幅等に利用で
きる。この遺伝子工学用色素剤を利用して遺伝子増幅を
実施することにより、反応後に得られる増幅産物の量の
増加、並びに遺伝子の検出感度の向上を達成することが
できる。また、増幅産物の検出、確認を含む一連の遺伝
子増幅操作を簡便、かつ効率よく行うことができる。
【００２１】
【実施例】以下に実施例をもって更に具体的に本発明を
説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるもので
はない。
説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるもので
はない。
【００２２】実施例１ ＰＣＲ反応液中に添加可能な色
素濃度の確認 オレンジＧ、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、アミ
ドブラックの３種の色素に関して、その濃度がＰＣＲの
効率、及び電気泳動に与える影響を調べた。以下の組成
の反応液にオレンジＧとブロモフェノールブルーはそれ
ぞれ終濃度０．０１〜１mg／ml、またアミドブラックは
終濃度０．００１〜１mg／mlの範囲で反応液に添加し
た。反応液組成（最終容量５０μl 中）：１ngのλ Ｄ
ＮＡ（宝酒造社製）、各１０pmolのプライマーλ１及び
プライマーλ２（配列表の配列番号１及び２にそれぞれ
プライマーλ１とλ２の塩基配列を示す）、５μl のＥ
ｘ Ｔａｑ添付１０倍濃度反応緩衝液（宝酒造社製）、
終濃度各０．２５mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ、１．２５単位のＥｘ Ｔａｑ（宝酒造社
製）。こうして調製した反応液を９４℃、３０秒〜５５
℃、３０秒〜７２℃、３０秒を１サイクルとした３０サ
イクルの反応に付した。反応終了後、反応液のうちの８
μl を直接１％アガロースゲル（アガロースＬ０３、宝
酒造社製）にアプライし、泳動時の色素が目視できるか
どうかを観察し、また、泳動後のゲルをエチジウムブロ
マイドで染色してＤＮＡの増幅の状態を調べた。この結
果を表１に示す。
素濃度の確認 オレンジＧ、ブロモフェノールブルー（ＢＰＢ）、アミ
ドブラックの３種の色素に関して、その濃度がＰＣＲの
効率、及び電気泳動に与える影響を調べた。以下の組成
の反応液にオレンジＧとブロモフェノールブルーはそれ
ぞれ終濃度０．０１〜１mg／ml、またアミドブラックは
終濃度０．００１〜１mg／mlの範囲で反応液に添加し
た。反応液組成（最終容量５０μl 中）：１ngのλ Ｄ
ＮＡ（宝酒造社製）、各１０pmolのプライマーλ１及び
プライマーλ２（配列表の配列番号１及び２にそれぞれ
プライマーλ１とλ２の塩基配列を示す）、５μl のＥ
ｘ Ｔａｑ添付１０倍濃度反応緩衝液（宝酒造社製）、
終濃度各０．２５mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及
びｄＴＴＰ、１．２５単位のＥｘ Ｔａｑ（宝酒造社
製）。こうして調製した反応液を９４℃、３０秒〜５５
℃、３０秒〜７２℃、３０秒を１サイクルとした３０サ
イクルの反応に付した。反応終了後、反応液のうちの８
μl を直接１％アガロースゲル（アガロースＬ０３、宝
酒造社製）にアプライし、泳動時の色素が目視できるか
どうかを観察し、また、泳動後のゲルをエチジウムブロ
マイドで染色してＤＮＡの増幅の状態を調べた。この結
果を表１に示す。
【００２３】
【表１】 表 １ ───────────────────────────────── 終濃度 オレンジＧ ＢＰＢ アミドブラック ──────────────────────── （mg／ml） 増幅 目視 増幅 目視 増幅 目視 ───────────────────────────────── １．０ − × − × − × ０．５ △ ○ − × − × ０．２ ○ ○ △ ○ − × ０．１ ○ ○ ○ ○ − ○ ０．０５ ○ △ ○ △ △ ○ ０．０２ ○ − ○ △ ○ ○ ０．０１ ○ − ○ − ○ △ ０．００５ ○ − ０．００２ ○ − ０．００１ ○ − ─────────────────────────────────
【００２４】 増幅 ○：多量の増幅産物が見られる △：増幅産物が見られる −：増幅産物は見られない 目視 ○：色素の濃さは泳動状態の確認に適している △：色素は薄いが泳動状態の確認は可能 −：色素を視認できない ×：色素が濃すぎて泳動状態がわかりづらい
【００２５】表１に示されるようにオレンジＧ、ブロモ
フェノールブルー、アミドブラックはそれぞれ反応液中
の終濃度として０．０５〜０．５mg／ml、０．０２〜
０．２mg／ml、０．０１〜０．０５mg／mlの範囲でＰＣ
Ｒを阻害せず、また、泳動中はこれらの色素を泳動状態
の指標として利用可能であった。このように、これらの
色素を使用することによって増幅反応の効率を低下させ
ることなく、反応後の遺伝子増幅反応液を直接電気泳動
に供すること可能であることが示された。
フェノールブルー、アミドブラックはそれぞれ反応液中
の終濃度として０．０５〜０．５mg／ml、０．０２〜
０．２mg／ml、０．０１〜０．０５mg／mlの範囲でＰＣ
Ｒを阻害せず、また、泳動中はこれらの色素を泳動状態
の指標として利用可能であった。このように、これらの
色素を使用することによって増幅反応の効率を低下させ
ることなく、反応後の遺伝子増幅反応液を直接電気泳動
に供すること可能であることが示された。
【００２６】実施例２ 反応液を直接電気泳動に供する
ことを可能にする遺伝子工学用色素含有剤 ヒトβ−グロビン遺伝子の一部の１１０bpの領域を増幅
するためのプライマー対であるプライマーＰＣ０３とＰ
Ｃ０４（配列表の配列番号３及び４にそれぞれプライマ
ーＰＣ０３とＰＣ０４の塩基配列を示す）、同じくヒト
β−グロビン遺伝子の一部の２６２bpの領域を増幅する
ためのプライマー対であるプライマーＫＭ２９とＫＭ３
８（配列表の配列番号５及び６にそれぞれプライマーＫ
Ｍ２９とＫＭ３８の塩基配列を示す）、同じくヒトβ−
グロビン遺伝子の一部の４０８bpの領域を増幅するため
のプライマー対であるプライマーＧＨ２０とＧＨ２１
（配列表の配列番号７及び８にそれぞれプライマーＧＨ
２０とＧＨ２１の塩基配列を示す）、ヒトＮ−ｒａｓ／
６１遺伝子の一部の１０３bpの領域を増幅するためのプ
ライマー対であるプライマー N-ras/61 F と N-ras/61
Ｒ（配列表の配列番号９及び１０にそれぞれプライマー
N-ras/61 F と N-ras/61 R の塩基配列を示す）、ヒト
β−アクチン遺伝子の一部の２６１bpの領域を増幅する
ためのプライマー対であるプライマーβ-actin F1 とβ
-actin R２（配列表の配列番号１１及び１２にそれぞれ
プライマーβ-actin F1 とβ-actin R２の塩基配列を示
す）をそれぞれ合成した。１０倍濃度の遺伝子工学用色
素含有剤〔１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１mg／
mlオレンジＧ、０．２mg／mlブロモフェノールブルー〕
を調製し、これを上記の標的遺伝子を増幅するためのＰ
ＣＲ反応液に添加し、その反応への影響を調べた。ＰＣ
Ｒ反応液の組成（最終容量は５０μl 、濃度による表示
は終濃度を示す）を以下に示す。：それぞれ１０pmolの
上記の各プライマー対、１００ngの精製ヒトゲノムＤＮ
Ａ、１０mMのトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０mMのＫ
Ｃｌ、１．５mMのＭｇＣｌ2 、各０．２mMのｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μl の１０倍濃度
遺伝子工学用色素含有剤、及び１．２５単位のＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）。各反応液について９
４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、３０秒を１サ
イクルとして３０サイクルの反応を行った。また、コン
トロールとして、各標的遺伝子について上記の遺伝子工
学用色素含有剤を添加しない反応も並行して行った。反
応後、増幅産物の解析をヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）
３：１アガロース（ＦＭＣ社製）を使用した３％アガロ
ースゲル電気泳動により行った。本発明の遺伝子工学用
色素含有剤が添加された反応液はその８μl を直接、ま
たコントロールの反応液はその８μl をサンプリングし
て１．６μl の試料用色素緩衝液（２．５mg／mlブロモ
フェノールブルー、２．５mg／mlキシレンシアノール、
３０％グリセロール）と混合した後ゲルにアプライし
た。この際、遺伝子工学用色素含有剤を含むＰＣＲ反応
液は直接ゲルにアプライしても不都合なくウェル内に沈
降し、また、電気泳動中は反応液に含まれる２種類の色
素も目視可能であり泳動距離の指標とすることができ
た。電気泳動終了後のゲルをエチジウムブロマイド染色
して増幅されたＤＮＡを検出した。遺伝子工学用色素含
有剤を添加した反応液と添加しなかった反応液について
増幅されたＤＮＡ断片の量を比較したところ、５種類の
プライマー対すべてで遺伝子工学用色素含有剤の添加の
有無による増幅ＤＮＡ量の差は見られなかった。このよ
うに、上記の遺伝子工学用色素含有剤はＰＣＲを全く阻
害しないことが確認された。
ことを可能にする遺伝子工学用色素含有剤 ヒトβ−グロビン遺伝子の一部の１１０bpの領域を増幅
するためのプライマー対であるプライマーＰＣ０３とＰ
Ｃ０４（配列表の配列番号３及び４にそれぞれプライマ
ーＰＣ０３とＰＣ０４の塩基配列を示す）、同じくヒト
β−グロビン遺伝子の一部の２６２bpの領域を増幅する
ためのプライマー対であるプライマーＫＭ２９とＫＭ３
８（配列表の配列番号５及び６にそれぞれプライマーＫ
Ｍ２９とＫＭ３８の塩基配列を示す）、同じくヒトβ−
グロビン遺伝子の一部の４０８bpの領域を増幅するため
のプライマー対であるプライマーＧＨ２０とＧＨ２１
（配列表の配列番号７及び８にそれぞれプライマーＧＨ
２０とＧＨ２１の塩基配列を示す）、ヒトＮ−ｒａｓ／
６１遺伝子の一部の１０３bpの領域を増幅するためのプ
ライマー対であるプライマー N-ras/61 F と N-ras/61
Ｒ（配列表の配列番号９及び１０にそれぞれプライマー
N-ras/61 F と N-ras/61 R の塩基配列を示す）、ヒト
β−アクチン遺伝子の一部の２６１bpの領域を増幅する
ためのプライマー対であるプライマーβ-actin F1 とβ
-actin R２（配列表の配列番号１１及び１２にそれぞれ
プライマーβ-actin F1 とβ-actin R２の塩基配列を示
す）をそれぞれ合成した。１０倍濃度の遺伝子工学用色
素含有剤〔１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、１mg／
mlオレンジＧ、０．２mg／mlブロモフェノールブルー〕
を調製し、これを上記の標的遺伝子を増幅するためのＰ
ＣＲ反応液に添加し、その反応への影響を調べた。ＰＣ
Ｒ反応液の組成（最終容量は５０μl 、濃度による表示
は終濃度を示す）を以下に示す。：それぞれ１０pmolの
上記の各プライマー対、１００ngの精製ヒトゲノムＤＮ
Ａ、１０mMのトリス−塩酸（ｐＨ８．３）、５０mMのＫ
Ｃｌ、１．５mMのＭｇＣｌ2 、各０．２mMのｄＡＴＰ、
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μl の１０倍濃度
遺伝子工学用色素含有剤、及び１．２５単位のＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）。各反応液について９
４℃、３０秒〜５５℃、３０秒〜７２℃、３０秒を１サ
イクルとして３０サイクルの反応を行った。また、コン
トロールとして、各標的遺伝子について上記の遺伝子工
学用色素含有剤を添加しない反応も並行して行った。反
応後、増幅産物の解析をヌシーブ（ＮｕＳｉｅｖｅ）
３：１アガロース（ＦＭＣ社製）を使用した３％アガロ
ースゲル電気泳動により行った。本発明の遺伝子工学用
色素含有剤が添加された反応液はその８μl を直接、ま
たコントロールの反応液はその８μl をサンプリングし
て１．６μl の試料用色素緩衝液（２．５mg／mlブロモ
フェノールブルー、２．５mg／mlキシレンシアノール、
３０％グリセロール）と混合した後ゲルにアプライし
た。この際、遺伝子工学用色素含有剤を含むＰＣＲ反応
液は直接ゲルにアプライしても不都合なくウェル内に沈
降し、また、電気泳動中は反応液に含まれる２種類の色
素も目視可能であり泳動距離の指標とすることができ
た。電気泳動終了後のゲルをエチジウムブロマイド染色
して増幅されたＤＮＡを検出した。遺伝子工学用色素含
有剤を添加した反応液と添加しなかった反応液について
増幅されたＤＮＡ断片の量を比較したところ、５種類の
プライマー対すべてで遺伝子工学用色素含有剤の添加の
有無による増幅ＤＮＡ量の差は見られなかった。このよ
うに、上記の遺伝子工学用色素含有剤はＰＣＲを全く阻
害しないことが確認された。
【００２７】実施例３ 色素の添加による遺伝子増幅の
反応効率の向上 各種の色素がＰＣＲ反応液に添加された場合の遺伝子増
幅反応の効率への影響を、反応液中に添加する鋳型ＤＮ
Ａ量を減らした反応系を用いて確認した。色素としてオ
レンジＧ、ブロモフェノールブルー、アミドブラック
を、またＰＣＲに使用する酵素としてはＴａＫａＲａ
Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）を使用した。鋳型として
２．５ng、２５０pg、あるいは２５pgのλ ＤＮＡ（宝
酒造社製）を含む以下の組成の反応液（最終容量は５０
μl ）を調製した。：各１０pmolのプライマーλＬ３６
及びプライマーＭＢＲ２０２（配列表の配列番号１３、
１４にそれぞれプライマーλＬ３６、ＭＢＲ２０２の塩
基配列を示す）、５μl のＥｘ Ｔａｑ添付１０倍濃度
反応緩衝液、終濃度各０．２５mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μl の色素水溶液、１．
２５単位のＥｘ Ｔａｑ。なお各色素水溶液の濃度は、
その反応液中の終濃度がオレンジＧについては０．１mg
／ml、０．０５mg／ml、０．０２mg／mlの３通り、ブロ
モフェノールブルーについては０．０２mg／ml、０．０
１mg／ml、０．００５mg／mlの３通り、アミドブラック
については０．０２mg／ml、０．０１mg／mlの２通りと
なるよう調製した。また、コントロールとして色素水溶
液を添加しない反応液も調製した。こうして調製した反
応液を９４℃、１分の加熱処理の後、９８℃、１０秒〜
６８℃、１５分を１サイクルとした３０サイクルの反応
を行い、更に７２℃、１０分の処理に付した。反応終了
後、実施例１同様に反応液を１％アガロースゲル（アガ
ロースＬ０３）電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエ
チジウムブロマイドで染色することにより増幅されたＤ
ＮＡを検出した。その結果を表２に示す。
反応効率の向上 各種の色素がＰＣＲ反応液に添加された場合の遺伝子増
幅反応の効率への影響を、反応液中に添加する鋳型ＤＮ
Ａ量を減らした反応系を用いて確認した。色素としてオ
レンジＧ、ブロモフェノールブルー、アミドブラック
を、またＰＣＲに使用する酵素としてはＴａＫａＲａ
Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）を使用した。鋳型として
２．５ng、２５０pg、あるいは２５pgのλ ＤＮＡ（宝
酒造社製）を含む以下の組成の反応液（最終容量は５０
μl ）を調製した。：各１０pmolのプライマーλＬ３６
及びプライマーＭＢＲ２０２（配列表の配列番号１３、
１４にそれぞれプライマーλＬ３６、ＭＢＲ２０２の塩
基配列を示す）、５μl のＥｘ Ｔａｑ添付１０倍濃度
反応緩衝液、終濃度各０．２５mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μl の色素水溶液、１．
２５単位のＥｘ Ｔａｑ。なお各色素水溶液の濃度は、
その反応液中の終濃度がオレンジＧについては０．１mg
／ml、０．０５mg／ml、０．０２mg／mlの３通り、ブロ
モフェノールブルーについては０．０２mg／ml、０．０
１mg／ml、０．００５mg／mlの３通り、アミドブラック
については０．０２mg／ml、０．０１mg／mlの２通りと
なるよう調製した。また、コントロールとして色素水溶
液を添加しない反応液も調製した。こうして調製した反
応液を９４℃、１分の加熱処理の後、９８℃、１０秒〜
６８℃、１５分を１サイクルとした３０サイクルの反応
を行い、更に７２℃、１０分の処理に付した。反応終了
後、実施例１同様に反応液を１％アガロースゲル（アガ
ロースＬ０３）電気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエ
チジウムブロマイドで染色することにより増幅されたＤ
ＮＡを検出した。その結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】 表 ２ ────────────────────────────────── λ ＤＮＡ添加量 ２．５ng ２５０pg ２５pg ────────────────────────────────── コントロール ＋＋ ＋ − オレンジＧ ０．１mg／ml ＋＋ ＋ − ０．０５mg／ml ＋＋ ＋＋ ± ０．０２mg／ml ＋＋ ＋＋ ＋ ブロモフェノールブルー ０．０２mg／ml ＋＋ ＋＋ ＋ ０．０１mg／ml ＋＋ ＋＋ ＋ ０．００５mg／ml ＋＋ ＋＋ ＋ アミドブラック ０．０２mg／ml ＋＋ ＋＋ ± ０．０１mg／ml ＋＋ ＋ ± ──────────────────────────────────
【００２９】 ＋＋：多量の増幅産物が見られる ＋ ：増幅産物が見られる ± ：わずかな増幅産物が見られる − ：増幅産物は見られない
【００３０】表２に示されるように、色素の種類やその
濃度によって強弱はあるが、いずれの色素においてもコ
ントロールの反応液に比べて遺伝子増幅反応の効率の向
上が見られた。すなわち、これらの色素が遺伝子増幅反
応の効率を向上させる作用を有していることが明らかと
なった。
濃度によって強弱はあるが、いずれの色素においてもコ
ントロールの反応液に比べて遺伝子増幅反応の効率の向
上が見られた。すなわち、これらの色素が遺伝子増幅反
応の効率を向上させる作用を有していることが明らかと
なった。
【００３１】実施例４ ２種の色素を含有する遺伝子工
学用色素含有剤による遺伝子増幅の反応効率の向上 実施例２で調製された２種類の色素を含有する遺伝子工
学用色素含有剤について、その遺伝子増幅反応効率への
影響を以下の実験により確認した。ＰＣＲに使用する酵
素としてはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを使用した。鋳
型として２．５ng、２５０pg、あるいは２５pgのλ Ｄ
ＮＡを含む以下の組成の反応液（最終容量は５０μl ）
を調製した。：各１０pmolのプライマーλＬ３６及びプ
ライマーＭＢＲ２０２、５μl のＥｘ Ｔａｑ添付１０
倍濃度反応緩衝液、各０．２５mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μl の１０倍濃度遺伝子
工学用色素含有剤〔１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．
３）、１mg／mlオレンジＧ、０．２mg／mlブロモフェノ
ールブルー〕、２．５単位のＥｘ Ｔａｑ。また、コン
トロールとして遺伝子工学用色素含有剤を添加しない反
応液も調製した。こうして調製した反応液を９４℃、１
分の加熱処理の後、９８℃、１０秒〜６８℃、１５分を
１サイクルとした３０サイクルの反応を行い、更に７２
℃、１０分の処理に付した。反応終了後、実施例１同様
に反応液を１％アガロースゲル（アガロースＬ０３）電
気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイ
ドで染色することにより増幅されたＤＮＡを検出した。
コントロールの反応液では２．５ngのλ ＤＮＡを含む
反応液のみで約３５kbの増幅産物が見られるのに対し、
本発明の遺伝子工学用色素含有剤を添加されたものでは
２５pgのλ ＤＮＡでも増幅産物が確認された。この結
果より、上記の遺伝子工学用色素含有剤において、優れ
た遺伝子増幅効率向上効果が見られることが明らかとな
った。
学用色素含有剤による遺伝子増幅の反応効率の向上 実施例２で調製された２種類の色素を含有する遺伝子工
学用色素含有剤について、その遺伝子増幅反応効率への
影響を以下の実験により確認した。ＰＣＲに使用する酵
素としてはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを使用した。鋳
型として２．５ng、２５０pg、あるいは２５pgのλ Ｄ
ＮＡを含む以下の組成の反応液（最終容量は５０μl ）
を調製した。：各１０pmolのプライマーλＬ３６及びプ
ライマーＭＢＲ２０２、５μl のＥｘ Ｔａｑ添付１０
倍濃度反応緩衝液、各０．２５mMのｄＡＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ、５μl の１０倍濃度遺伝子
工学用色素含有剤〔１０mMトリス−塩酸（ｐＨ８．
３）、１mg／mlオレンジＧ、０．２mg／mlブロモフェノ
ールブルー〕、２．５単位のＥｘ Ｔａｑ。また、コン
トロールとして遺伝子工学用色素含有剤を添加しない反
応液も調製した。こうして調製した反応液を９４℃、１
分の加熱処理の後、９８℃、１０秒〜６８℃、１５分を
１サイクルとした３０サイクルの反応を行い、更に７２
℃、１０分の処理に付した。反応終了後、実施例１同様
に反応液を１％アガロースゲル（アガロースＬ０３）電
気泳動に供し、電気泳動後のゲルをエチジウムブロマイ
ドで染色することにより増幅されたＤＮＡを検出した。
コントロールの反応液では２．５ngのλ ＤＮＡを含む
反応液のみで約３５kbの増幅産物が見られるのに対し、
本発明の遺伝子工学用色素含有剤を添加されたものでは
２５pgのλ ＤＮＡでも増幅産物が確認された。この結
果より、上記の遺伝子工学用色素含有剤において、優れ
た遺伝子増幅効率向上効果が見られることが明らかとな
った。
【００３２】実施例５ 遺伝子増幅用キットの作製 ＰＣＲ法により高い効率で標的遺伝子の増幅を行うこと
が可能であり、また、反応後の反応液を直接電気泳動に
供することが可能な、本発明の遺伝子工学用色素含有剤
を含む遺伝子増幅用キットを作製した。１０mMトリス−
塩酸（ｐＨ８．３）、１mg／mlオレンジＧ、０．２mg／
mlブロモフェノールブルーの組成の試薬を調製し、これ
をＡ剤（遺伝子工学用色素含有剤）とした。次にＴａＫ
ａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）より１０μl をと
り、これをＢ剤（酵素剤）とした。また、該製品添付の
１０倍濃度反応緩衝液、及びｄＮＴＰ混合液よりそれぞ
れ１００μl をとり、これらをそれぞれＣ剤、Ｄ剤とし
た。これらＡ剤〜Ｄ剤を組合せて、５０μl の反応液に
して２０反応分の遺伝子増幅用キットを作製した。５０
μl のＰＣＲ反応液当りのＡ剤〜Ｄ剤の使用量はそれぞ
れ５μl 、０．５μl 、５μl 、５μl である。
が可能であり、また、反応後の反応液を直接電気泳動に
供することが可能な、本発明の遺伝子工学用色素含有剤
を含む遺伝子増幅用キットを作製した。１０mMトリス−
塩酸（ｐＨ８．３）、１mg／mlオレンジＧ、０．２mg／
mlブロモフェノールブルーの組成の試薬を調製し、これ
をＡ剤（遺伝子工学用色素含有剤）とした。次にＴａＫ
ａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）より１０μl をと
り、これをＢ剤（酵素剤）とした。また、該製品添付の
１０倍濃度反応緩衝液、及びｄＮＴＰ混合液よりそれぞ
れ１００μl をとり、これらをそれぞれＣ剤、Ｄ剤とし
た。これらＡ剤〜Ｄ剤を組合せて、５０μl の反応液に
して２０反応分の遺伝子増幅用キットを作製した。５０
μl のＰＣＲ反応液当りのＡ剤〜Ｄ剤の使用量はそれぞ
れ５μl 、０．５μl 、５μl 、５μl である。
【００３３】
【発明の効果】本発明により、遺伝子増幅反応等の遺伝
子工学的実験操作において有用な遺伝子工学用色素剤が
提供される。この遺伝子工学用色素剤を利用して遺伝子
増幅を実施することにより、反応後に得られる増幅産物
の量の増加、並びに遺伝子の検出感度の向上を達成する
ことができる。また、増幅産物の検出、確認を含む一連
の遺伝子増幅操作を簡便、かつ効率よく行うことができ
る。
子工学的実験操作において有用な遺伝子工学用色素剤が
提供される。この遺伝子工学用色素剤を利用して遺伝子
増幅を実施することにより、反応後に得られる増幅産物
の量の増加、並びに遺伝子の検出感度の向上を達成する
ことができる。また、増幅産物の検出、確認を含む一連
の遺伝子増幅操作を簡便、かつ効率よく行うことができ
る。
【００３４】
【００３５】配列番号１ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GATGAGTTCG TGTCCGTACA ACT 23
【００３６】配列番号２ 配列の長さ： 配列の型：核酸２５ 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTTATCGAA ATCAGCCACA GCGCC 25
【００３７】配列番号３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ACACAACTGT GTTCACTAGC 20
【００３８】配列番号４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： CAACTTCATC CACGTTCACC 20
【００３９】配列番号５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTTGGCCAA TCTACTCCCA GG 22
【００４０】配列番号６ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： TGGTCTCCTT AAACCTGTCT TG 22
【００４１】配列番号７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GAAGAGCCAA GGACAGGTAC 20
【００４２】配列番号８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGAAAATAGA CCAATAGGCA G 21
【００４３】配列番号９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTGAAACCT GTTTGTTGGA 20
【００４４】配列番号１０ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： ATACACAGAG GAAGCCTTCG 20
【００４５】配列番号１１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： AGGCACCAGG GCGTGATGGT 20
【００４６】配列番号１２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGTCTCAAAC ATGATCTGGG 20
【００４７】配列番号１３ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GGGCGGCGAC CTCGCGGGTT TTCGCTATTT ATGAAA 36
【００４８】配列番号１４ 配列の長さ：３３ 配列の型：核酸 鎖の数：１ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GCGCACAAAA CCATAGATTG CTCTTCTGTA AGG 33
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 加藤 郁之進 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒造 株式会社中央研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 下記（１）、（２）より選択される遺伝
子工学用色素含有剤； （１）遺伝子増幅反応においてその反応の効率を向上さ
せる遺伝子増幅効率向上剤、（２）遺伝子増幅反応を阻
害せず、反応前の遺伝子増幅反応液に添加されることに
よって反応液を直接電気泳動に供することを可能にする
色素剤。 - 【請求項２】 ポリメラーゼ・チェーン・リアクション
法によって行われる遺伝子増幅反応に使用されることを
特徴とする請求項１記載の遺伝子工学用色素含有剤。 - 【請求項３】 オレンジＧ、ブロモフェノールブルー、
ポンソーＳ、キシレンシアノール、ファーストグリーン
ＦＣＦ、アミドブラック、メチルレッドから選択される
色素を含有することを特徴とする請求項１又は２記載の
遺伝子工学用色素含有剤。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺
伝子工学用色素含有剤を含有する遺伝子増幅反応液。 - 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺
伝子工学用色素含有剤、又は請求項４記載の遺伝子増幅
反応液を含有する遺伝子増幅用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25793997A JP3587284B2 (ja) | 1997-09-08 | 1997-09-08 | 遺伝子工学用色素含有剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP25793997A JP3587284B2 (ja) | 1997-09-08 | 1997-09-08 | 遺伝子工学用色素含有剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1175897A true JPH1175897A (ja) | 1999-03-23 |
| JP3587284B2 JP3587284B2 (ja) | 2004-11-10 |
Family
ID=17313312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP25793997A Expired - Fee Related JP3587284B2 (ja) | 1997-09-08 | 1997-09-08 | 遺伝子工学用色素含有剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3587284B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011027722A1 (ja) * | 2009-09-01 | 2011-03-10 | タカラバイオ株式会社 | 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の組成物 |
| JP2013506413A (ja) * | 2009-10-02 | 2013-02-28 | フィンザイムズ・オサケユキテュア | 反応混合液および関連製品の調製方法 |
-
1997
- 1997-09-08 JP JP25793997A patent/JP3587284B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011027722A1 (ja) * | 2009-09-01 | 2011-03-10 | タカラバイオ株式会社 | 逆転写ポリメラーゼ連鎖反応用の組成物 |
| JP2013506413A (ja) * | 2009-10-02 | 2013-02-28 | フィンザイムズ・オサケユキテュア | 反応混合液および関連製品の調製方法 |
| JP2021168673A (ja) * | 2009-10-02 | 2021-10-28 | サーモ・フィッシャー・サイエンティフィック・バルティクス・ユーエイビーThermo Fisher Scientific Baltics Uab | 反応混合液および関連製品の調製方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3587284B2 (ja) | 2004-11-10 |
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