JPH1176399A - 組織工学を応用した人工臓器 - Google Patents
組織工学を応用した人工臓器Info
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- JPH1176399A JPH1176399A JP9237145A JP23714597A JPH1176399A JP H1176399 A JPH1176399 A JP H1176399A JP 9237145 A JP9237145 A JP 9237145A JP 23714597 A JP23714597 A JP 23714597A JP H1176399 A JPH1176399 A JP H1176399A
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Landscapes
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- External Artificial Organs (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 細胞が付着したホローファイバーを備え
てなる体外循環型人工臓器であって、前記細胞が薬物輸
送に係る遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転
換細胞である人工臓器。 【効果】 本発明の人工臓器によれば、特定の薬物、毒
物をを選択的に排出することができる。
てなる体外循環型人工臓器であって、前記細胞が薬物輸
送に係る遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転
換細胞である人工臓器。 【効果】 本発明の人工臓器によれば、特定の薬物、毒
物をを選択的に排出することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ホローファイバー
を備えた体外循環型の人工臓器に関する。
を備えた体外循環型の人工臓器に関する。
【０００２】
【従来の技術】肝臓は、物質代謝とその調節の大部分を
担っており、糖質、タンパク質、脂質、核酸、ビタミ
ン、ホルモンなどの代謝や、内因性・外因性物質の解
毒、排泄等の生体に必要な複雑かつ膨大な機能を行う臓
器である。劇症肝炎や術後肝不全などの急性肝不全は、
肝再生までの一定期間の肝機能補助を行えば救命が可能
と考えられる。しかしながら、肝臓は、上記のように複
雑かつ膨大な機能を担う臓器であることから、純粋な人
工的手法による人工肝臓で肝機能補助を行うのは困難で
ある。これに対し、表面に肝機能の主体である肝細胞を
付着させたホローファイバーを備えたハイブリッド型の
人工肝臓が提案されており、これは、体外循環への適用
に有利である（葛西真一、澤雅之ら, 腹救診11, 827, 1
991 、戸部成四郎、武井由香ら，人工臓器21, 1045, 19
92、竹下和良、石橋治昭ら, 人工臓器22(1), 153, 199
3、特開平9-56814 号公報等参照）。
担っており、糖質、タンパク質、脂質、核酸、ビタミ
ン、ホルモンなどの代謝や、内因性・外因性物質の解
毒、排泄等の生体に必要な複雑かつ膨大な機能を行う臓
器である。劇症肝炎や術後肝不全などの急性肝不全は、
肝再生までの一定期間の肝機能補助を行えば救命が可能
と考えられる。しかしながら、肝臓は、上記のように複
雑かつ膨大な機能を担う臓器であることから、純粋な人
工的手法による人工肝臓で肝機能補助を行うのは困難で
ある。これに対し、表面に肝機能の主体である肝細胞を
付着させたホローファイバーを備えたハイブリッド型の
人工肝臓が提案されており、これは、体外循環への適用
に有利である（葛西真一、澤雅之ら, 腹救診11, 827, 1
991 、戸部成四郎、武井由香ら，人工臓器21, 1045, 19
92、竹下和良、石橋治昭ら, 人工臓器22(1), 153, 199
3、特開平9-56814 号公報等参照）。
【０００３】また同様に、腎不全などで生体機能が低下
した場合に、腎臓が排出すべき老廃物を血液中から除去
するのに用いるホローファイバー型の人工腎臓も提案さ
れている。
した場合に、腎臓が排出すべき老廃物を血液中から除去
するのに用いるホローファイバー型の人工腎臓も提案さ
れている。
【０００４】ところで、癌患者に対して抗がん性抗生物
質を投与するなど、薬物を投与することによる化学療法
は盛んに実施されているが、薬物は副作用を発現しやす
いので選択的に体外に排出させたほうがよい場合があ
る。また、治療目的以外に何らかの毒物を誤って摂取し
てしまった場合などに、その毒物を選択的に体外に排出
させたい場合もある。したがって、そのような薬物、毒
物を選択的に排出することができるシステムの開発が望
まれている。
質を投与するなど、薬物を投与することによる化学療法
は盛んに実施されているが、薬物は副作用を発現しやす
いので選択的に体外に排出させたほうがよい場合があ
る。また、治療目的以外に何らかの毒物を誤って摂取し
てしまった場合などに、その毒物を選択的に体外に排出
させたい場合もある。したがって、そのような薬物、毒
物を選択的に排出することができるシステムの開発が望
まれている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、薬
物、毒物を選択的に排出することができるホローファイ
バー型の人工臓器を提供することである。
物、毒物を選択的に排出することができるホローファイ
バー型の人工臓器を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の薬物の輸送
に係る遺伝子を導入した形質転換細胞をホローファイバ
ーの外表面に付着させてホローファイバー内部にその薬
物を含む液を灌流させると、その薬物が選択的に前記細
胞により輸送されることを見い出して本発明を完成し
た。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、特定の薬物の輸送
に係る遺伝子を導入した形質転換細胞をホローファイバ
ーの外表面に付着させてホローファイバー内部にその薬
物を含む液を灌流させると、その薬物が選択的に前記細
胞により輸送されることを見い出して本発明を完成し
た。
【０００７】本発明は、細胞が付着したホローファイバ
ーを備えてなる体外循環型人工臓器であって、前記細胞
が薬物輸送に係る遺伝子を含有する組換えベクターを含
む形質転換細胞である人工臓器である。
ーを備えてなる体外循環型人工臓器であって、前記細胞
が薬物輸送に係る遺伝子を含有する組換えベクターを含
む形質転換細胞である人工臓器である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明において、薬物輸送に係る遺伝子としては、例え
ば、有機アニオン輸送体に係る遺伝子（この遺伝子のク
ローニングについてはKanai N., Lu R., Satriano J.
A., Bao Y., Wolkoff, A.W.and Schuster V.L., "Ident
ification and characterizaion of a prostaglandin t
ransporter", Science(Wash)268:866-9(1995) 参照）、
有機カチオン輸送体に係る遺伝子（この遺伝子のクロー
ニングについてはLopez-Nieto-CE, You-G, Bush-KT, Ba
rros-EJ, Beier-DR and Nigma-SK,"Molecular cloning
and characterization of NKT, a gene product relate
d to the organic cation transporter family that is
almost exclusively expressed in the kidney", J. B
iol. Chem. 272(10), 6471-8(1997) 参照) 、ペプチド
輸送体に係る遺伝子（この遺伝子についてはBoll-M, He
rget-M, Wagener-M, Weber-WM, Markovich-D, Biber-J,
Clauss-W, Murer-H and Daniel-H, "Expression cloni
ng and functional characterization of the kidney c
ortex high-affinity proton-coupled peptide transpo
rter", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996 Jan 9,
93(1), 284-9参照) 等が挙げられる。その他、水チャン
ネルに係る遺伝子（この遺伝子のクローニングについて
はFushimi-K, Uchida-S, Hara-Y,Hirata-Y, Marumo-F a
nd Sasaki-S, "Cloning and expression of apical mem
brane water channel of rat kidney collecting tubul
e", Nature, 361(6412),549-52(1993)参照) 、チトクロ
ムP450に係る遺伝子（この遺伝子についてはEmi-Y, Chi
jiiwa-C and Omura-TA, "different cytochrome P450 f
orm is induced in primary cultures of rat hepatocy
tes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990Dec, 87(24),
9746-50 参照）等も使用可能である。具体的には、ジ
ゴキシン及び／又はドキソルビシンの輸送に係るヒト多
剤耐性遺伝子MDR-1 （この遺伝子のクローニングについ
てはKioka N., Tsubota J., Kakehi Y., Komano T., Go
ttesman MM., Pastan I. and Ueda K., "P-glycoprotei
n carries Gly185 with an altered patteren of multi
dtug resistance", Biochem. Biophys. Res. Commun.,
162, 224-231(1989)参照) が好適に使用される。
本発明において、薬物輸送に係る遺伝子としては、例え
ば、有機アニオン輸送体に係る遺伝子（この遺伝子のク
ローニングについてはKanai N., Lu R., Satriano J.
A., Bao Y., Wolkoff, A.W.and Schuster V.L., "Ident
ification and characterizaion of a prostaglandin t
ransporter", Science(Wash)268:866-9(1995) 参照）、
有機カチオン輸送体に係る遺伝子（この遺伝子のクロー
ニングについてはLopez-Nieto-CE, You-G, Bush-KT, Ba
rros-EJ, Beier-DR and Nigma-SK,"Molecular cloning
and characterization of NKT, a gene product relate
d to the organic cation transporter family that is
almost exclusively expressed in the kidney", J. B
iol. Chem. 272(10), 6471-8(1997) 参照) 、ペプチド
輸送体に係る遺伝子（この遺伝子についてはBoll-M, He
rget-M, Wagener-M, Weber-WM, Markovich-D, Biber-J,
Clauss-W, Murer-H and Daniel-H, "Expression cloni
ng and functional characterization of the kidney c
ortex high-affinity proton-coupled peptide transpo
rter", Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996 Jan 9,
93(1), 284-9参照) 等が挙げられる。その他、水チャン
ネルに係る遺伝子（この遺伝子のクローニングについて
はFushimi-K, Uchida-S, Hara-Y,Hirata-Y, Marumo-F a
nd Sasaki-S, "Cloning and expression of apical mem
brane water channel of rat kidney collecting tubul
e", Nature, 361(6412),549-52(1993)参照) 、チトクロ
ムP450に係る遺伝子（この遺伝子についてはEmi-Y, Chi
jiiwa-C and Omura-TA, "different cytochrome P450 f
orm is induced in primary cultures of rat hepatocy
tes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990Dec, 87(24),
9746-50 参照）等も使用可能である。具体的には、ジ
ゴキシン及び／又はドキソルビシンの輸送に係るヒト多
剤耐性遺伝子MDR-1 （この遺伝子のクローニングについ
てはKioka N., Tsubota J., Kakehi Y., Komano T., Go
ttesman MM., Pastan I. and Ueda K., "P-glycoprotei
n carries Gly185 with an altered patteren of multi
dtug resistance", Biochem. Biophys. Res. Commun.,
162, 224-231(1989)参照) が好適に使用される。
【０００９】上記遺伝子を含む組換えベクターの作成及
びその組換えベクターによる形質転換細胞の作成は、例
えば以下のようにして行うことができる。上記遺伝子を
組み込むベクターとしては、例えば、発現プラスミドp-
HIR 社製) 、pbluescript （Strategene社製）等が挙げ
られる。組換えベクターはpHaMAIRESneo(Mets etal Vir
ology(1996)217:230〜241)をもとに植田らがMDR-1 を組
み入れたものである(Taguchi etal, Biochemistry 36:8
883 〜8889(1997)参照 )。
びその組換えベクターによる形質転換細胞の作成は、例
えば以下のようにして行うことができる。上記遺伝子を
組み込むベクターとしては、例えば、発現プラスミドp-
HIR 社製) 、pbluescript （Strategene社製）等が挙げ
られる。組換えベクターはpHaMAIRESneo(Mets etal Vir
ology(1996)217:230〜241)をもとに植田らがMDR-1 を組
み入れたものである(Taguchi etal, Biochemistry 36:8
883 〜8889(1997)参照 )。
【００１０】本発明において、宿主細胞としては、肝細
胞、腎細胞等が挙げられ、その他、線維芽細胞、心筋細
胞等も使用可能である。初代培養のこれらの細胞に SV4
0large Tantigen を導入し不死化して作成する。導入の
方法はエレクトロポレーション又はリポフェクショウに
よる。
胞、腎細胞等が挙げられ、その他、線維芽細胞、心筋細
胞等も使用可能である。初代培養のこれらの細胞に SV4
0large Tantigen を導入し不死化して作成する。導入の
方法はエレクトロポレーション又はリポフェクショウに
よる。
【００１１】本発明において、形質転換細胞を付着させ
るホローファイバーとしては、従来から人工腎臓、人工
肝臓等として用いられている多孔性のものを用いること
ができる。ホローファイバーの材質としては、例えば、
親水性ポリオレフィン、キュプラアンモニュームレーヨ
ン等が挙げられる。また、ホローファイバーの膜厚は、
通常、５〜70μm であり、好ましくは10〜50μm であ
る。また、膜の内径は、通常、100 〜400 μm であり、
好ましくは180 〜330 μm である。さらに、孔径は、通
常、0.01〜３μm であり、好ましくは0.1 〜0.3 μm で
ある。本発明の人工臓器におけるホローファイバーの膜
面積は、通常、150 〜300 cm2であり、好ましくは160
〜200 cm2である。
るホローファイバーとしては、従来から人工腎臓、人工
肝臓等として用いられている多孔性のものを用いること
ができる。ホローファイバーの材質としては、例えば、
親水性ポリオレフィン、キュプラアンモニュームレーヨ
ン等が挙げられる。また、ホローファイバーの膜厚は、
通常、５〜70μm であり、好ましくは10〜50μm であ
る。また、膜の内径は、通常、100 〜400 μm であり、
好ましくは180 〜330 μm である。さらに、孔径は、通
常、0.01〜３μm であり、好ましくは0.1 〜0.3 μm で
ある。本発明の人工臓器におけるホローファイバーの膜
面積は、通常、150 〜300 cm2であり、好ましくは160
〜200 cm2である。
【００１２】図１は、本発明による人工臓器の一実施例
を示すものである。図１において、円筒状のハウジング
１の両開口端には、上流側蓋体２及び下流側蓋体３が設
置されている。上流側蓋体２には血液流入口４が、下流
側蓋体３には血液流出口５がそれぞれ設けられている。
また、ハウジング１には、液体流入口６と液体流出口７
が設けられている。さらに、ハウジング１の内部には、
ホローファイバーが多数配設されている。これらのホロ
ーファイバーの両端は、それぞれ一つに纏められて血液
流入口４、血液流入口５に連通されている。ハウジング
１の内部で、かつホローファイバーの外側の空隙（ファ
イバー外空隙）は、ハウジング１に設けられた液体流入
口６と液体流出口７に連通している。
を示すものである。図１において、円筒状のハウジング
１の両開口端には、上流側蓋体２及び下流側蓋体３が設
置されている。上流側蓋体２には血液流入口４が、下流
側蓋体３には血液流出口５がそれぞれ設けられている。
また、ハウジング１には、液体流入口６と液体流出口７
が設けられている。さらに、ハウジング１の内部には、
ホローファイバーが多数配設されている。これらのホロ
ーファイバーの両端は、それぞれ一つに纏められて血液
流入口４、血液流入口５に連通されている。ハウジング
１の内部で、かつホローファイバーの外側の空隙（ファ
イバー外空隙）は、ハウジング１に設けられた液体流入
口６と液体流出口７に連通している。
【００１３】図２は、ハウジング１内に多数配設され
た、外表面に形質転換細胞８が付着したホローファイバ
ーのうちの１本のホローファイバーの拡大部分の断面図
である。ホローファイバー９の外表面には、多数の形質
転換細胞８が付着している。図１に例示した本発明の人
工臓器によれば、ファイバー内に流入した血液中の特定
の薬物は、ファイバーの孔を通過し、形質転換細胞８に
よって選択的に輸送されてファイバー外空隙に移動す
る。また、その際、ファイバー外空隙にリン酸バッファ
ー等を流しておくことにより、移動された薬物をハウジ
ング外に排出させることができる。
た、外表面に形質転換細胞８が付着したホローファイバ
ーのうちの１本のホローファイバーの拡大部分の断面図
である。ホローファイバー９の外表面には、多数の形質
転換細胞８が付着している。図１に例示した本発明の人
工臓器によれば、ファイバー内に流入した血液中の特定
の薬物は、ファイバーの孔を通過し、形質転換細胞８に
よって選択的に輸送されてファイバー外空隙に移動す
る。また、その際、ファイバー外空隙にリン酸バッファ
ー等を流しておくことにより、移動された薬物をハウジ
ング外に排出させることができる。
【００１４】図３は、図１及び２に示した本発明の人工
臓器を製造する装置の全体の概略を示す図である。この
装置には、形質転換細胞が付着されていないこと以外は
図１と同様のホローファイバーを内包するホローファイ
バー型モジュール10と、培地等を入れておくボトル11
と、ペリスタルティックポンプ12と、細胞懸濁液等を注
入するためのシリンジ13と、空のシリンジ14とを備えて
いる。前記のホローファイバー型モジュールとしては、
例えば高密度細胞培養システムCultureflo G（旭メディ
カル株式会社製）等を用いることができる。また、この
装置を作成するにあたっては、ホローファイバー型モジ
ュールとチューブ等が一体化された高密度細胞培養ユニ
ットCultureflo TC-50（旭メディカル株式会社製）等を
利用することもできる。
臓器を製造する装置の全体の概略を示す図である。この
装置には、形質転換細胞が付着されていないこと以外は
図１と同様のホローファイバーを内包するホローファイ
バー型モジュール10と、培地等を入れておくボトル11
と、ペリスタルティックポンプ12と、細胞懸濁液等を注
入するためのシリンジ13と、空のシリンジ14とを備えて
いる。前記のホローファイバー型モジュールとしては、
例えば高密度細胞培養システムCultureflo G（旭メディ
カル株式会社製）等を用いることができる。また、この
装置を作成するにあたっては、ホローファイバー型モジ
ュールとチューブ等が一体化された高密度細胞培養ユニ
ットCultureflo TC-50（旭メディカル株式会社製）等を
利用することもできる。
【００１５】本発明の人工臓器の製造は、例えば、図３
に示したような装置をインキュベーター内に入れて行
う。まず、ボトル11に培養液を入れ、この培養液をペリ
スタルティックポンプ12を用いて循環させる。次いで、
細胞懸濁液の入ったシリンジ13をセットして細胞懸濁液
をファイバー外空隙に注入し、シリンジ12とシリンジ13
を交互に押して細胞を空隙内に分散させる。培養液を、
通常、0.5 〜10ml／分、好ましくは 0.5〜２ml／分で循
環させながら培養を行う。培養は、通常、36〜38℃の温
度で行う。また、培養時間は、通常、24〜240時間であ
る。
に示したような装置をインキュベーター内に入れて行
う。まず、ボトル11に培養液を入れ、この培養液をペリ
スタルティックポンプ12を用いて循環させる。次いで、
細胞懸濁液の入ったシリンジ13をセットして細胞懸濁液
をファイバー外空隙に注入し、シリンジ12とシリンジ13
を交互に押して細胞を空隙内に分散させる。培養液を、
通常、0.5 〜10ml／分、好ましくは 0.5〜２ml／分で循
環させながら培養を行う。培養は、通常、36〜38℃の温
度で行う。また、培養時間は、通常、24〜240時間であ
る。
【００１６】上記のようにして、外表面に形質転換細胞
が付着したホローファイバーを備えてなる本発明の人工
臓器を製造することができる。ファイバー外空隙におけ
る該細胞の密度は、肝細胞の場合、通常、１×107 〜１
×1011個／mlであり、好ましくは１×109 〜１×1010個
／mlである。腎細胞の場合、通常、１×108 〜１×1010
個／mlであり、好ましくは１×109 〜５×109 個／mlで
ある。一般の透析膜による透析、血液吸着では生体に必
要なの（例えばアルブミン）の排泄が起こるという大き
な問題があった。しかし、このシステムでは除去したい
ものだけを自由に選べるという大きな利点がある。ま
た、アンチセンスを導入すればこの細胞の輸送するもの
（例えばPAH)を輸送しないようにすることも可能であ
る。
が付着したホローファイバーを備えてなる本発明の人工
臓器を製造することができる。ファイバー外空隙におけ
る該細胞の密度は、肝細胞の場合、通常、１×107 〜１
×1011個／mlであり、好ましくは１×109 〜１×1010個
／mlである。腎細胞の場合、通常、１×108 〜１×1010
個／mlであり、好ましくは１×109 〜５×109 個／mlで
ある。一般の透析膜による透析、血液吸着では生体に必
要なの（例えばアルブミン）の排泄が起こるという大き
な問題があった。しかし、このシステムでは除去したい
ものだけを自由に選べるという大きな利点がある。ま
た、アンチセンスを導入すればこの細胞の輸送するもの
（例えばPAH)を輸送しないようにすることも可能であ
る。
【００１７】また、本発明は、外表面に形質転換細胞を
付着させたホローファイバーを備えた人工臓器に限られ
ず、内表面に形質転換細胞を付着させたホローファイバ
ーを備えた人工臓器をも含むものであり、その場合、ホ
ローファイバー外空隙に血液を灌流させ、排出させたい
薬物をファイバー内に移動させてリン酸バッファー等と
ともに排出することもできる。
付着させたホローファイバーを備えた人工臓器に限られ
ず、内表面に形質転換細胞を付着させたホローファイバ
ーを備えた人工臓器をも含むものであり、その場合、ホ
ローファイバー外空隙に血液を灌流させ、排出させたい
薬物をファイバー内に移動させてリン酸バッファー等と
ともに排出することもできる。
【００１８】
ヒト多剤耐性遺伝子を含有する組換えベクターを含む形
質転換細胞が付着したホローファイバーを備えた人工臓
器の作成 (1) ウサギ近位尿細管培養細胞PTCLの作成 体重１〜２ kｇの雄性または雌性Japanese White rabbi
t(日本白兎）を、ペントバルビトール又はエーテルによ
り麻酔した後、その腎臓を取り出した。次いで、実体顕
微鏡下でその腎臓からピンセットを用いて近位尿細管
（約１mm）を数本単離し、培地（１：１(v/v) のDulbec
o's modified Eagle培地とHAM F-12、及び10％ウシ胎児
血清を含む）中に入れた。これを、37℃、５％CO2 のイ
ンキュベーター中で細胞数が約１×106 になるまで培養
して、初代培養細胞を得た。次に、得られた初代培養細
胞に、上記培地の代わりにウシ胎児血清フリーの培地を
添加し、SV40ラージＴ抗原及びネオマイシン耐性遺伝子
を含むプラスミドp-SVneo3（１μg /ml 、Bethesda lob
oratory 製）５μl をリポフェクチン（GIBC製）５μl
とともに添加し、24〜48時間培養した。次いで10％ウシ
胎児血清、及びネオマイシン40μg/mlを含む培地に変
え、そのまま培養を続けた。このようにしてネオマイシ
ン耐性の細胞株PTCLを作成した。
質転換細胞が付着したホローファイバーを備えた人工臓
器の作成 (1) ウサギ近位尿細管培養細胞PTCLの作成 体重１〜２ kｇの雄性または雌性Japanese White rabbi
t(日本白兎）を、ペントバルビトール又はエーテルによ
り麻酔した後、その腎臓を取り出した。次いで、実体顕
微鏡下でその腎臓からピンセットを用いて近位尿細管
（約１mm）を数本単離し、培地（１：１(v/v) のDulbec
o's modified Eagle培地とHAM F-12、及び10％ウシ胎児
血清を含む）中に入れた。これを、37℃、５％CO2 のイ
ンキュベーター中で細胞数が約１×106 になるまで培養
して、初代培養細胞を得た。次に、得られた初代培養細
胞に、上記培地の代わりにウシ胎児血清フリーの培地を
添加し、SV40ラージＴ抗原及びネオマイシン耐性遺伝子
を含むプラスミドp-SVneo3（１μg /ml 、Bethesda lob
oratory 製）５μl をリポフェクチン（GIBC製）５μl
とともに添加し、24〜48時間培養した。次いで10％ウシ
胎児血清、及びネオマイシン40μg/mlを含む培地に変
え、そのまま培養を続けた。このようにしてネオマイシ
ン耐性の細胞株PTCLを作成した。
【００１９】(2) ヒト多剤耐性遺伝子(MDR-1）のPTCLへ
の導入 発現プラスミドp-HIR のマルチクローニングサイトにヒ
トMDR-1 を入れ、ネオマイシンを加えることで選択し、
てMDR-1 を含有するプラスミドベクターp-HIRMDR1 を調
製した。即ち、このプラスミドベクターp-HIRMDR1 はpH
aMAIRESneo(Mets etal Virology(1996)217:230〜241)を
もとに植田らがMDR-1 を組み入れたものである(Taguchi
etal, Biochemistry 36:8883 〜8889(1997)参照 )。
の導入 発現プラスミドp-HIR のマルチクローニングサイトにヒ
トMDR-1 を入れ、ネオマイシンを加えることで選択し、
てMDR-1 を含有するプラスミドベクターp-HIRMDR1 を調
製した。即ち、このプラスミドベクターp-HIRMDR1 はpH
aMAIRESneo(Mets etal Virology(1996)217:230〜241)を
もとに植田らがMDR-1 を組み入れたものである(Taguchi
etal, Biochemistry 36:8883 〜8889(1997)参照 )。
【００２０】得られたプラスミドベクターp-HIRMDR1 と
上記で得られたPTCLをエレクトロポレーション用容器に
入れて下記のようにしてp-HIRMDR1 をPTCLに導入した。
PCTL 2×106 個/30μl 培地にpHIRHORI 10μg/10μl を
混ぜBioRad社ジーンパルサーを使用500V30μsec の電圧
をかける。これを再度DMEM/HAMF'-1210%FBSに混ぜ300μ
g/mlコルヒチンと共に培養を行う。これによりコルヒチ
ン耐性、つまりMDR-1 をつよく発現した細胞のみが培養
できる。このようにして得られた形質転換細胞PTCL(p-H
IRMDR1) を、培地（DMEM/HAMF'-12 10% FBS）と混合し
て、37℃で１×105 細胞になるまで培養した。これを細
胞懸濁液とした。
上記で得られたPTCLをエレクトロポレーション用容器に
入れて下記のようにしてp-HIRMDR1 をPTCLに導入した。
PCTL 2×106 個/30μl 培地にpHIRHORI 10μg/10μl を
混ぜBioRad社ジーンパルサーを使用500V30μsec の電圧
をかける。これを再度DMEM/HAMF'-1210%FBSに混ぜ300μ
g/mlコルヒチンと共に培養を行う。これによりコルヒチ
ン耐性、つまりMDR-1 をつよく発現した細胞のみが培養
できる。このようにして得られた形質転換細胞PTCL(p-H
IRMDR1) を、培地（DMEM/HAMF'-12 10% FBS）と混合し
て、37℃で１×105 細胞になるまで培養した。これを細
胞懸濁液とした。
【００２１】(3) PTCL(p-HIRMDR1) のホローファイバー
での培養 図３に示した装置を用いてPTCL(p-HIRMDR1) の培養を行
った。なお、この装置は、旭メディカル株式会社製の高
密度細胞培養ユニットCultureflo T/C-50 （ホローファ
イバーの材質 新水性ポリオレフィン、ホローファイバ
ーの膜厚：50μm 、ホローファイバーの膜の内径：330
μm 、孔径：0.3 μm 、ホローファイバーの有効長：80
mm、ホローファイバーの数：150 本、ホローファイバー
の膜面積：160cm2、ホローファイバー外容積：２ml、ホ
ローファイバー内容積：0.1 ml）を利用して作成した。
での培養 図３に示した装置を用いてPTCL(p-HIRMDR1) の培養を行
った。なお、この装置は、旭メディカル株式会社製の高
密度細胞培養ユニットCultureflo T/C-50 （ホローファ
イバーの材質 新水性ポリオレフィン、ホローファイバ
ーの膜厚：50μm 、ホローファイバーの膜の内径：330
μm 、孔径：0.3 μm 、ホローファイバーの有効長：80
mm、ホローファイバーの数：150 本、ホローファイバー
の膜面積：160cm2、ホローファイバー外容積：２ml、ホ
ローファイバー内容積：0.1 ml）を利用して作成した。
【００２２】まず、ボトル11として、リン酸バッファー
入りのボトルを接続し、リン酸バッファーをペリスタル
ティックポンプ12を用いて流量10ml／分で１時間循環さ
せた。また、シリンジ13としてリン酸バッファーの入っ
たシリンジを接続してファイバー外空隙にもリン酸バッ
ファーを10ml注入した。次に、装置をインキュベーター
に入れ、リン酸バッファーボトルを培地（DMEM/HAMF'-1
2 10% FBS）入りのボトルに変えて、培地を流量 10 ml
／分で48時間循環させた後、汚染のないことを確認し
た。また、ファイバー外空隙もリン酸バッファーに変え
て培地を入れ、数回培地の交換を行った。
入りのボトルを接続し、リン酸バッファーをペリスタル
ティックポンプ12を用いて流量10ml／分で１時間循環さ
せた。また、シリンジ13としてリン酸バッファーの入っ
たシリンジを接続してファイバー外空隙にもリン酸バッ
ファーを10ml注入した。次に、装置をインキュベーター
に入れ、リン酸バッファーボトルを培地（DMEM/HAMF'-1
2 10% FBS）入りのボトルに変えて、培地を流量 10 ml
／分で48時間循環させた後、汚染のないことを確認し
た。また、ファイバー外空隙もリン酸バッファーに変え
て培地を入れ、数回培地の交換を行った。
【００２３】次いで、培地の循環を止め、シリンジ13と
して上記(2) で得られた形質転換細胞懸濁液の入ったシ
リンジを接続して、該細胞懸濁液をファイバー外空隙に
注入し、シリンジ12とシリンジ13を交互に押して細胞を
空隙内に分散させた。このまま、培地を循環させずに37
℃で30分間放置した。その後、ポンプ12を超低速から作
動させ、６時間かけて流量２ml／分まで高めて、48〜72
時間培養を行った。このようにして、ホローファイバー
の外表面に形質転換細胞が多数付着したホローファイバ
ーを備えた、図１に示したような人工臓器を作成した。
して上記(2) で得られた形質転換細胞懸濁液の入ったシ
リンジを接続して、該細胞懸濁液をファイバー外空隙に
注入し、シリンジ12とシリンジ13を交互に押して細胞を
空隙内に分散させた。このまま、培地を循環させずに37
℃で30分間放置した。その後、ポンプ12を超低速から作
動させ、６時間かけて流量２ml／分まで高めて、48〜72
時間培養を行った。このようにして、ホローファイバー
の外表面に形質転換細胞が多数付着したホローファイバ
ーを備えた、図１に示したような人工臓器を作成した。
【００２４】〔実施例２〕 インビトロでの本発明の人工臓器の薬物輸送能の評価 上記(3) で作成した、図１に示した本発明の人工臓器を
用いてジゴキシンの輸送能を評価した。図４に、本実施
例で用いた試験装置を示す。１：１(v/v) のDulbeco's
modified Eagle培地とHAM F-12及び10％ウシ胎児血清を
含む培地と、所定の濃度のジゴキシン（7.25ng/ml 、5.
85ng/ml 、及び4.05ng/ml の３種類の濃度で試験を行っ
た）と、パラアミノ馬尿酸２μg/mlと、イヌリンの１μ
g/mlとの混合溶液50mlの入った容器15を、シリンジポン
プを介して人工臓器10の血液流入口４に接続した。シリ
ンジポンプ16を用いて流量１ml／時間で混合溶液を人工
臓器に灌流させた。そして、回収容器17に灌流液を採取
し、各薬物の30分間の排出量を測定した。また、50時間
後に、MDR-1 の遮断薬であるベラパミルを容器15に添加
して灌流させ、回収容器17に採取した灌流液中の各薬物
の濃度を測定した。
用いてジゴキシンの輸送能を評価した。図４に、本実施
例で用いた試験装置を示す。１：１(v/v) のDulbeco's
modified Eagle培地とHAM F-12及び10％ウシ胎児血清を
含む培地と、所定の濃度のジゴキシン（7.25ng/ml 、5.
85ng/ml 、及び4.05ng/ml の３種類の濃度で試験を行っ
た）と、パラアミノ馬尿酸２μg/mlと、イヌリンの１μ
g/mlとの混合溶液50mlの入った容器15を、シリンジポン
プを介して人工臓器10の血液流入口４に接続した。シリ
ンジポンプ16を用いて流量１ml／時間で混合溶液を人工
臓器に灌流させた。そして、回収容器17に灌流液を採取
し、各薬物の30分間の排出量を測定した。また、50時間
後に、MDR-1 の遮断薬であるベラパミルを容器15に添加
して灌流させ、回収容器17に採取した灌流液中の各薬物
の濃度を測定した。
【００２５】また、比較例として、遺伝子MDR-1 を導入
していない腎細胞を付着させたホローファイバーを備え
てなる人工臓器を用いて上記と同様の試験を行った（MD
R(-)) 。
していない腎細胞を付着させたホローファイバーを備え
てなる人工臓器を用いて上記と同様の試験を行った（MD
R(-)) 。
【００２６】各試験における灌流液中のジゴキシンの中
空糸内から外への輸送量Ｊdigoxin(ng/30min)の変化を
図５の(A) に示す。また、混合溶液中のジゴキシンの濃
度が4.05ng/ml の場合の、灌流液中のパラアミノ馬尿酸
の中空糸内から外への輸送量ＪPHA （μg/30min)と、イ
ヌリンの濃度Ｊinulin（μg/30min)の変化を、それぞれ
図５の(B) 、(C) に示す。これらの結果から、PTCL(p-H
IRMDR1) は、ジゴキシンを選択的に輸送するということ
がわかる。
空糸内から外への輸送量Ｊdigoxin(ng/30min)の変化を
図５の(A) に示す。また、混合溶液中のジゴキシンの濃
度が4.05ng/ml の場合の、灌流液中のパラアミノ馬尿酸
の中空糸内から外への輸送量ＪPHA （μg/30min)と、イ
ヌリンの濃度Ｊinulin（μg/30min)の変化を、それぞれ
図５の(B) 、(C) に示す。これらの結果から、PTCL(p-H
IRMDR1) は、ジゴキシンを選択的に輸送するということ
がわかる。
【００２７】〔実施例３〕本実施例において、ジゴキシ
ンの代わりにドキソルビシン（ＡＤＭ）を６μg/ml用い
た以外は実施例２と同様にして試験を行った。各試験に
おける灌流液中のＡＤＭの輸送量ＪADM (ng/30min)の変
化を図６の(A) に示す。また、灌流液中のパラアミノ馬
尿酸の輸送量ＪPHA （μg/30min)と、イヌリンの濃度Ｊ
inulin（μg/30min)の濃度の変化を、それぞれ図６の
(B) 、(C) に示す。これらの結果から、PTCL(p-HIRMDR
1) は、ＡＤＭを選択的に輸送するということがわか
る。
ンの代わりにドキソルビシン（ＡＤＭ）を６μg/ml用い
た以外は実施例２と同様にして試験を行った。各試験に
おける灌流液中のＡＤＭの輸送量ＪADM (ng/30min)の変
化を図６の(A) に示す。また、灌流液中のパラアミノ馬
尿酸の輸送量ＪPHA （μg/30min)と、イヌリンの濃度Ｊ
inulin（μg/30min)の濃度の変化を、それぞれ図６の
(B) 、(C) に示す。これらの結果から、PTCL(p-HIRMDR
1) は、ＡＤＭを選択的に輸送するということがわか
る。
【００２８】
【発明の効果】本発明の人工臓器によれば、特定の薬
物、毒物をを選択的に排出することができる。
物、毒物をを選択的に排出することができる。
【図１】本発明による人工臓器の一実施例を示す図であ
る。
る。
【図２】外表面に形質転換細胞が付着したホローファイ
バーの拡大部分の断面図である。
バーの拡大部分の断面図である。
【図３】本発明による人工臓器を製造する装置の全体の
概略を示す図である。
概略を示す図である。
【図４】実施例で用いた、本発明による人工臓器の試験
装置を示す図である。
装置を示す図である。
【図５】実施例２におけるジゴキシンの輸送量Ｊ
digoxin 、パラアミノ馬尿酸の輸送量ＪPHA 及びイヌリ
ンの輸送量Ｊinulinの変化を示す図である。
digoxin 、パラアミノ馬尿酸の輸送量ＪPHA 及びイヌリ
ンの輸送量Ｊinulinの変化を示す図である。
【図６】実施例３におけるＡＤＭの輸送量ＪADM 、パラ
アミノ馬尿酸の輸送量ＪPHA 及びイヌリンの輸送量Ｊ
inulinの変化を示す図である。
アミノ馬尿酸の輸送量ＪPHA 及びイヌリンの輸送量Ｊ
inulinの変化を示す図である。
１…ハウジング、２…上流側蓋体、３…下流側蓋体、４
…血液流入口、５…血液流出口、６…液体流入口、７…
液体流入口、８…形質転換細胞、９…ホローファイバ
ー、10…人工臓器、11…ボトル、12…ポンプ、13…シリ
ンジ、14…シリンジ、15…容器、16…ポンプ、17…回収
容器
…血液流入口、５…血液流出口、６…液体流入口、７…
液体流入口、８…形質転換細胞、９…ホローファイバ
ー、10…人工臓器、11…ボトル、12…ポンプ、13…シリ
ンジ、14…シリンジ、15…容器、16…ポンプ、17…回収
容器
Claims (5)
- 【請求項１】 細胞が付着したホローファイバーを備え
てなる体外循環型人工臓器であって、前記細胞が薬物輸
送に係る遺伝子を含有する組換えベクターを含む形質転
換細胞である人工臓器。 - 【請求項２】 宿主細胞が肝細胞である、請求項１に記
載の人工臓器。 - 【請求項３】 宿主細胞が腎細胞である、請求項１に記
載の人工臓器。 - 【請求項４】 遺伝子がジゴキシン及び／又はドキソル
ビシンの輸送に係るものである、請求項１〜３のいずれ
か１項に記載の人工臓器。 - 【請求項５】 遺伝子が多剤耐性遺伝子である、請求項
１〜３のいずれか１項に記載の人工臓器。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9237145A JP3059127B2 (ja) | 1997-09-02 | 1997-09-02 | 組織工学を応用した人工臓器 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9237145A JP3059127B2 (ja) | 1997-09-02 | 1997-09-02 | 組織工学を応用した人工臓器 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1176399A true JPH1176399A (ja) | 1999-03-23 |
| JP3059127B2 JP3059127B2 (ja) | 2000-07-04 |
Family
ID=17011082
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9237145A Expired - Fee Related JP3059127B2 (ja) | 1997-09-02 | 1997-09-02 | 組織工学を応用した人工臓器 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3059127B2 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2004085606A1 (ja) * | 2003-03-24 | 2006-06-29 | 独立行政法人国立環境研究所 | 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 |
| US8088568B2 (en) | 2001-11-05 | 2012-01-03 | Medgentics, Inc. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8142990B2 (en) | 2001-11-05 | 2012-03-27 | Medgenics Inc. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8501396B2 (en) | 2001-11-05 | 2013-08-06 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8586024B2 (en) | 2006-09-14 | 2013-11-19 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Long lasting drug formulations |
| US8685635B2 (en) | 2002-11-05 | 2014-04-01 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8877175B2 (en) | 2006-09-14 | 2014-11-04 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Long lasting drug formulations |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP5277520B2 (ja) | 2006-06-01 | 2013-08-28 | タカタ株式会社 | エアバッグジャケット |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3908278B2 (ja) | 1996-01-25 | 2007-04-25 | 株式会社カネカ | 免疫グロブリンおよびその複合体の吸着材、吸着方法、および吸着装置 |
-
1997
- 1997-09-02 JP JP9237145A patent/JP3059127B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9107896B2 (en) | 2001-11-05 | 2015-08-18 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8530149B2 (en) | 2001-11-05 | 2013-09-10 | Medgenics Medical Israel Ltd | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8088568B2 (en) | 2001-11-05 | 2012-01-03 | Medgentics, Inc. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8142990B2 (en) | 2001-11-05 | 2012-03-27 | Medgenics Inc. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8293463B2 (en) | 2001-11-05 | 2012-10-23 | Medgenics Inc. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8501396B2 (en) | 2001-11-05 | 2013-08-06 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US9468667B2 (en) | 2001-11-05 | 2016-10-18 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8771291B2 (en) | 2002-11-05 | 2014-07-08 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8685635B2 (en) | 2002-11-05 | 2014-04-01 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US9101595B2 (en) | 2002-11-05 | 2015-08-11 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| JPWO2004085606A1 (ja) * | 2003-03-24 | 2006-06-29 | 独立行政法人国立環境研究所 | 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 |
| JP4555773B2 (ja) * | 2003-03-24 | 2010-10-06 | 独立行政法人国立環境研究所 | 細胞培養基質および細胞接着蛋白質またはペプチドの固相化標品 |
| US9572593B2 (en) | 2003-05-01 | 2017-02-21 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Dermal micro-organs, methods and apparatuses for producing and using the same |
| US8586024B2 (en) | 2006-09-14 | 2013-11-19 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Long lasting drug formulations |
| US8877175B2 (en) | 2006-09-14 | 2014-11-04 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Long lasting drug formulations |
| US9687564B2 (en) | 2006-09-14 | 2017-06-27 | Medgenics Medical Israel Ltd. | Long lasting drug formulations |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3059127B2 (ja) | 2000-07-04 |
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