JPH1180025A - 悪液質治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 悪液質治療剤の提供。 【解決手段】 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受
容体との結合を阻害する物質を有効成分として含む悪液
質治療剤。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は副甲状腺ホルモン関
連ペプチド（Parathyroid hormone related protein（P
THrP））とその受容体との結合を阻害する物質を有効成
分として含有する悪液質治療剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】末期癌患者にみられる悪液質は、悪性腫
瘍の随伴性症候群の一つであり、食欲不振、体重減少、
貧血、水電解質の異常、免疫異常などを主症状とする全
身状態の不良をきたす。癌患者にとって、悪液質の発症
は、生命を脅かす終末期症状をもたらすのみならず、患
者のQOL（Quality of life）を著しく損ない、患者自身
はもちろん、家族や周囲の人に強い精神的、身体的、社
会的影響を及ぼす。

【０００３】近年、癌悪液質の原因物質であると考えら
れていたカケクチンが、腫瘍壊死因子（TNF）と同一因
子であることが明らかになった。その後、インターロイ
キン１（IL-1）やIL-6、LIF、IFNなどのサイトカインに
も同様の作用が明らかになり、癌悪液質は、複数の因子
による複合的に作用する病態であることが明らかになっ
てきた。

【０００４】ヒト口腔底癌由来OCC-1細胞株は、このよ
うな癌悪液質に関連する種々の液性因子を産生すること
が知られており、OCC-1細胞をヌードマウスに移植する
と、悪液質などの諸症状を発症させる（Kajimura N. e
t al., Cancer Chemother. Pharmacol., 1996, 38 Supp
l. pS48-52、Tanaka R. et al., Jpn. J. Clin. Oncolo
gy Apr.1996, 26（2）p88-94）。これは、ヌードマウス
に移植されたOCC-1細胞株が、増殖と共に種々のサイト
カイン（G-CSF、IL-6、LIF、IL-11、PTHrP など）を産
生し、これらの因子が複合的に作用して、上記諸症状を
発症させると考えられる。

【０００５】このように、OCC-1細胞株を移植したヌー
ドマウスの症状は、ヒト末期癌患者の症状ときわめて共
通性が高いと考えられる。しかしながら、現在に至るま
でこのような悪液質に対する薬剤についての報告は知ら
れていない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、PTHrPとそ
の受容体との結合を阻害する物質を有効成分として含
む、悪液質に対する治療剤を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる治
療剤を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、副甲状腺ホル
モン関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質
により、目的が達成されることを見出し、本発明を完成
するに至った。すなわち、本発明は、副甲状腺ホルモン
関連ペプチドとその受容体との結合を阻害する物質を有
効成分として含む悪液質治療剤である。上記悪液質とし
ては癌由来のものが挙げられる。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明は、副甲状腺ホルモン関連
ペプチド（Parathyroid hormone related protein：PTH
rP）とその受容体（PTHrP受容体）との結合を阻害する
物質を有効成分として含む悪液質治療剤である。本明細
書中で「PTHrP受容体」とは、例えば特表平6-506598号
公報に記載されているPTHrPと結合する受容体を指し、
標的器官上（例えば骨や腎臓）に存在するPTHrP受容体
か否かを問わない。

【０００９】また、「PTHrPとPTHrP受容体との結合を阻
害する物質」とは、PTHrPに結合することにより、PTHrP
がPTHrP受容体と結合することを阻害する物質（例えば
抗PTHrP抗体）、およびPTHrP受容体に結合することによ
り、PTHrPがPTHrP受容体と結合することを阻害する物質
（例えばPTHrP受容体に対するアンタゴニスト（PTHrPア
ンタゴニストともいう）、具体的にはPTHrPペプチドの
少なくとも一つのアミノ酸を置換、欠失したものやPTHr
Pペプチドの部分配列などを指す）のいずれか一方又は
両方を指す。

【００１０】抗PTHrP抗体としては、例えばヒト型化抗
体、ヒト抗体（WO96/33735号公報）又はキメラ抗体（特
開平4-228089号公報）などの公知の抗体のほか、本発明
における抗体（#23-57-137-1抗体）などが挙げられる。
なお、抗体はポリクローナル抗体でもよいがモノクロー
ナル抗体であることが好ましい。また、PTHrPアンタゴ
ニストとしては、ポリペプチドや低分子を含むが、例え
ばPTHrPに対して拮抗的にPTHrP受容体に結合する物質、
例えば特開平7-165790号公報、Peptides（UNITED STATE
S）1995, 16（6）1031-1037、Biochemistry（UNITED ST
ATES）Apr.281992, 31（16）4026-4033、特表平5-50909
8号公報に記載のPTHrPアンタゴニスト活性を有するポリ
ペプチドが挙げられる。また、上記例示のポリペプチド
のうち、少なくとも１個のアミノ酸が欠失、置換、付
加、挿入されたポリペプチドで、同等のPTHrPアンタゴ
ニスト活性を有するものも本発明のPTHrPアンタゴニス
トに含まれる。本発明では、「PTHrPとPTHrP受容体との
結合を阻害する物質」として抗PTHrP抗体を例に説明す
る。

【００１１】１．抗PTHrP抗体 本発明で使用される抗PTHrP抗体は、悪液質の治療効果
を有するものであれば、その由来、種類（モノクローナ
ル、ポリクローナル）および形状を問うものではない。

【００１２】本発明で使用される抗PTHrP抗体は、公知
の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗
体として得ることができる。本発明で使用される抗PTHr
P抗体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体
が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハ
イブリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手
法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した
宿主に産生されるものを含む。この抗体はPTHrPと結合
することにより、PTHrPがPTH／PTHrP受容体に結合する
のを阻害してPTHrPのシグナル伝達を遮断し、PTHrPの生
物学的活性を阻害する抗体である。

【００１３】このような抗体としては、ハイブリドーマ
クローン#23-57-137-1により産生される#23-57-137-1抗
体が挙げられる。なお、ハイブリドーマクローン＃23-5
7-137-1 は、mouse-mouse hybridoma ＃23-57-137-1 と
して、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つく
ば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、FE
RM BP-5631としてブダペスト条約に基づき国際寄託され
ている。

【００１４】２．抗体産生ハイブリドーマ モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には
公知技術を使用し、以下のようにして作製できる。すな
わち、PTHrPを感作抗原として使用して、これを通常の
免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常
の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常の
スクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細
胞をスクリーニングすることによって作製できる。

【００１５】具体的には、モノクローナル抗体を作製す
るには次のようにすればよい。まず、抗体取得の感作抗
原として使用されるヒトPTHrPを、Suva, L. J. et al.,
Science（1987）237, 893に開示されたPTHrP遺伝子／
アミノ酸配列を発現することによって得る。すなわち、
PTHrPをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系
に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿
主細胞中または培養上清中から目的のPTHrPタンパク質
を公知の方法で精製する。

【００１６】次に、この精製PTHrPタンパク質を感作抗
原として用いる。あるいは、PTHrPのN末端の34個のペプ
チドについて、化学合成により作製することもでき、こ
れを感作抗原として使用することもできる。

【００１７】感作抗原で免疫される哺乳動物としては、
特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親
細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般
的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハム
スター、あるいはウサギ、サル等が使用される。

【００１８】感作抗原を動物に免疫するには、公知の方
法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、
感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射すること
により行われる。具体的には、感作抗原をPBS（Phospha
te-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当量に希釈、
懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば
フロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺
乳動物に4-21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫
時に適当な担体を使用することもできる。このように免
疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認し
た後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付
されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙
げられる。

【００１９】前記免疫細胞と融合される他方の親細胞と
して、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエロ
ーマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3（P3x63A
g8.653）（J. Immnol.（1979）123, 1548-1550）、P3x6
3Ag8U.1（Current Topics inMicrobiology and Immunol
ogy（1978）81, 1-7）、NS-1（Kohler. G. and Milstei
n, C. Eur. J. Immunol.（1976）6, 511-519）、MPC-11
（Margulies. D. H.et al., Cell（1976）8, 405-41
5）、SP2/0（Shulman, M. et al., Nature（1978） 27
6, 269-270）、FO（de St. Groth, S. F. et al., J. I
mmunol. Methods（1980）35, 1-21）、S194（Trowbridg
e, I. S. J. Exp. Med.（1978）148, 313-323）、R210
（Galfre, G. et al., Nature（1979）277, 131-133）
等が好適に使用される。

【００２０】前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融
合は、基本的には公知の方法、たとえば、ミルステイン
らの方法（Kohler. G. and Milstein, C.、Methods Enz
ymol.（1981）73, 3-46）等に準じて行うことができ
る。より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合
促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融
合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PE
G）、センダイウィルス（HVJ）等が使用され、更に所望
により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等
の補助剤を添加使用することもできる。

【００２１】免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は
任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞
に対して免疫細胞を1-10倍とするのが好ましい。前記細
胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエロー
マ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、
その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が
使用可能であり、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清
補液を併用することもできる。

【００２２】細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細
胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程
度に加温したPEG溶液（例えば平均分子量1000-6000程
度）を通常30-60％（w/v）の濃度で添加し、混合するこ
とによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）を形
成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して
上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドー
マの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。

【００２３】このようにして得られたハイブリドーマ
は、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサン
チン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で
培養することにより選択される。上記HAT培養液での培
養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細
胞）が死滅するのに十分な時間（通常、数日〜数週間）
継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的と
する抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングお
よび単一クローニングを行う。

【００２４】また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上
記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitro
でPTHrPに感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂
能を有するミエローマ細胞と融合させ、PTHrPへの結合
活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公
平1-59878号公報参照）。さらに、ヒト抗体遺伝子の全
てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗
原となるPTHrPを投与して抗PTHrP抗体産生細胞を取得
し、これを不死化させた細胞からPTHrPに対するヒト抗
体を取得してもよい（国際特許出願公開番号WO 94/2558
5 号公報、WO 93/12227 号公報、WO 92/03918 号公報、
WO 94/02602 号公報参照）。

【００２５】このようにして作製されるモノクローナル
抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継
代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期
保存することが可能である。当該ハイブリドーマからモ
ノクローナル抗体を取得するには、当該ハイブリドーマ
を通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得
る方法、あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある
哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法
などが採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得る
のに適しており、一方、後者の方法は、抗体の大量生産
に適している。

【００２６】３．組換え型抗体 本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子を
ハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに
組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を
用いて産生させた組換え型のものを用いることができる
（例えば、Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.
（1990）192, 767-775, 1990参照）。

【００２７】具体的には、抗PTHrP抗体を産生するハイ
ブリドーマから、抗PTHrP抗体の可変（V）領域をコード
するmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例え
ば、グアニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Bi
ochemistry（1979）18, 5294-5299）、AGPC法（Chomczy
nski, P.et al., Anal. Biochem.（1987）162, 156-15
9）等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification
Kit（Pharmacia製）等を使用して目的のmRNAを調製す
る。また、QuickPrep mRNA Purification Kit（Pharma
cia製）を用いることによりmRNAを直接調製することが
できる。

【００２８】得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体
V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse T
ranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化
学工業社製）等を用いて行う。また、cDNAの合成および
増幅を行うには、5'-AmpliFINDER RACE Kit（Clontech
製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Frohman, M. A.et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. USA（1988）85, 8998-900
2、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.（1989）
17, 2919-2932）等を使用することができる。

【００２９】得られたPCR産物から目的とするDNA断片を
精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組
換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを
選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目
的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオ
キシヌクレオチドチェインターミネーション法により確
認する。

【００３０】目的とする抗PTHrP抗体のV領域をコードす
るDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域（C領
域）をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込
む。本発明で使用される抗PTHrP抗体を製造するには、
抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プ
ロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに
組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を
形質転換し、抗体を発現させる。

【００３１】抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖（H鎖）ま
たは軽鎖（L鎖）をコードするDNAを別々に発現ベクター
に組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、
あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベ
クターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい
（WO 94/11523 号公報参照）。

【００３２】また、組換え型抗体の産生には上記宿主細
胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用するこ
とができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産
生される蛋白質（ヤギβカゼインなど）をコードする遺
伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体
遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの
胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容し
たヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその
子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トラ
ンスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳
汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェ
ニックヤギに使用してもよい（Ebert, K.M. et al., Bi
o/Technology（1994）12, 699-702）。

【００３３】４．改変抗体 本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原
性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺
伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化（Hu
manized）抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既
知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体
は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAを
ヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベ
クターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより
得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキ
メラ抗体を得ることができる。

【００３４】ヒト型化抗体は、再構成（reshaped）ヒト
抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えば
マウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity d
etermining region）をヒト抗体の相補性決定領域へ移
植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知
られている（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、W
O 96/02576 号公報参照）。

【００３５】具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体
のフレームワーク領域（framework region；FR）とを連
結するように設計したDNA配列を、CDR及びFR両方の末端
領域にオーバーラップする部分を有するように作製した
数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPC
R法により合成する。得られたDNAをヒト抗体C領域をコ
ードするDNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込ん
で、これを宿主に導入し産生させることによりヒト型化
抗体が得られる（EP 239400号公報、WO 96/02576 号公
報参照）。

【００３６】CDRを介して連結されるヒト抗体のフレー
ムワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位
を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト
抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成する
ように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域の
アミノ酸を置換してもよい（Sato, K.et al., CancerRe
s.（1993）53, 851-856）。

【００３７】キメラ抗体及びヒト型化抗体のＣ領域に
は、ヒト抗体のものが使用され、例えばＨ鎖では、Ｃγ
１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｃγ４を、Ｌ鎖ではＣκ、Ｃλを
使用することができる。また、抗体またはその産生の安
定性を改善するために、ヒト抗体Ｃ領域を修飾してもよ
い。

【００３８】キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗
体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一
方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相
補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域お
よびＣ領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内におけ
る抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効
成分として有用である。

【００３９】本発明に使用できるヒト型化抗体としては
ヒト型化#23-57-137-1抗体が挙げられる。ヒト型化#23-
57-137-1抗体は、マウス由来の#23-57-137-1抗体の相補
性決定領域を、Ｌ鎖についてはヒト抗体HSU03868（GEN-
BANK, Deftos Mら, Scand. J. Immunol., 39, 95-103,
1994）由来の３つのFR断片（FR1、FR2およびFR3）並び
にヒト抗体S25755（NBRF-PDB）由来のFR断片（FR4）に
連結したものであり、Ｈ鎖についてはヒト抗体S31679
（NBRF-PDB、Cuisinier AMら, Eur. J. Immunol., 23,
110-118, 1993）のフレームワーク領域と連結し、抗原
結合活性を有するようにフレームワーク領域のアミノ酸
残基を一部置換したものである。

【００４０】なお、ヒト型化#23-57-137-1抗体のＬ鎖ま
たはＨ鎖をコードするDNAを含むプラスミドを有する大
腸菌は、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つ
くば市東１丁目１番３号）に、平成８年８月15日に、Ｈ
鎖をコードするDNAを含むプラスミドを有する大腸菌で
あるEscherichia coli JM109（ hMBC1HcDNA/pUC19 ）に
ついてはFERM BP-5629として、Ｌ鎖をコードするDNAを
含むプラスミドを有する大腸菌であるEscherichia coli
JM109（ hMBC1Lqλ/pUC19）についてはFERM BP-5630と
して、ブダペスト条約に基づきそれぞれ国際寄託されて
いる。

【００４１】５．抗体修飾物 本発明で使用される抗体は、PTHrPに結合し、PTHrPの活
性を阻害するかぎり、抗体の断片又はその修飾物であっ
てよい。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(a
b')₂ 、Fv、またはＨ鎖若しくはＬ鎖のFvを適当なリン
カーで連結させたシングルチェインFv（scFv）が挙げら
れる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプ
シンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら
抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベク
ターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例え
ば、Co, M.S. et al., J. Immunol.（1994）152, 2968-
2976、Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzym
ology（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、P
lueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology
（1989）178, 476-496, Academic Press, Inc.、Lamoy
i, E., Methods in Enzymology（1989）121, 652-663、
Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology（198
9）121, 663-669、Bird, R. E. et al., TIBTECH（199
1）9, 132-137参照）。

【００４２】scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連
結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領
域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカ
ーを介して連結される（Huston, J. S. et al.、Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1988）85, 5879-5883）。sc
FvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体
として記載されたもののいずれの由来であってもよい。
V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばア
ミノ酸12-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用い
られる。

【００４３】scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖ま
たはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領
域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部
又は所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型と
し、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法に
より増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコ
ードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結さ
れるように規定するライマー対を組み合せて増幅するこ
とにより得られる。

【００４４】また、一旦scFvをコードするDNAが作製さ
れると、それらを含有する発現ベクター、および該発現
ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得る
ことができ、また、その宿主を用いることにより、常法
に従ってscFvを得ることができる。これら抗体の断片
は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿
主により産生させることができる。本発明における「抗
体」にはこれらの抗体の断片も包含される。

【００４５】抗体の修飾物として、ポリエチレングリコ
ール（PEG）等の各種分子と結合した抗PTHrP抗体を使用
することもできる。本発明における「抗体」にはこれら
の抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、
得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得るこ
とができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野において
すでに確立されている。

【００４６】６．組換え型抗体または改変抗体の発現お
よび産生 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により
発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、
常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝
子、その3'側下流にポリAシグナルを機能的に結合させ
て発現させることができる。例えばプロモーター／エン
ハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロ
モーター／エンハンサー（ human cytomegalovirus imm
ediate early promoter/enhancer）を挙げることができ
る。

【００４７】また、その他に本発明で使用される抗体発
現に使用できるプロモーター／エンハンサーとして、レ
トロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、
シミアンウィルス40（SV 40）等のウィルスプロモータ
ー／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファ
クター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモー
ター／エンハンサー等が挙げられる。

【００４８】SV 40プロモーター／エンハンサーを使用
する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277, 10
8）により、また、HEF1αプロモーター／エンハンサー
を使用する場合はMizushimaらの方法（Nucleic Acids R
es.（1990）18, 5322）により、容易に遺伝子発現を行
うことができる。

【００４９】大腸菌の場合、常用される有用なプロモー
ター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗
体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させる
ことができる。プロモーターとしては、例えばlaczプロ
モーター、araBプロモーターを挙げることができる。la
czプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature
（1098）341, 544-546；FASEB J.（1992）6, 2422-242
7）により、あるいはaraBプロモーターを使用する場合
はBetterらの方法（Science（1988）240, 1041-1043）
により発現することができる。

【００５０】抗体分泌のためのシグナル配列としては、
大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル
配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol.（1987）169, 4
379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生
された抗体を分離した後、抗体の構造を適切に組み直し
て（refold）使用する。

【００５１】複製起源としては、SV 40、ポリオーマウ
ィルス、アデノウィルス、ウシパピローマウィルス（BP
V）等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主
細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクターは、
選択マーカーとしてアミノグリコシドトランスフェラー
ゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大
腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラ
ーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）
遺伝子等を含むことができる。

【００５２】本発明で使用される抗体の製造のために、
任意の発現系、例えば真核細胞又は原核細胞系を使用す
ることができる。真核細胞としては、例えば樹立された
哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細
胞などの動物細胞等が挙げられ、原核細胞としては、例
えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。好ましく
は、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばCH
O、COS、ミエローマ、BHK、Vero、HeLa細胞中で発現さ
れる。

【００５３】次に、形質転換された宿主細胞をin vitro
またはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させ
る。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、
培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用する
ことができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用す
ることもできる。

【００５４】７．抗体の分離、精製 前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物
から分離し均一にまで精製することができる。本発明で
使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを
用いて行うことができる。例えば、プロテインAカラム
を用いたカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.
F.（Pharmacia製）等が挙げられる。その他、通常のタ
ンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すれば
よく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフ
ィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フ
ィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合
わせることにより、抗体を分離、精製することができる
（Antibodies A LaboratoryManual. Ed Harlow, David
Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988）。

【００５５】８．抗体の活性の確認 本発明で使用される抗体の抗原結合活性（Antibodies A
Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, 1988）、リガンドレセプター
結合阻害活性（Harada, A. et al., International Imm
unology（1993）5, 681-690）の測定には公知の手段を
使用することができる。

【００５６】本発明で使用される抗PTHrP抗体の抗原結
合活性を測定する方法として、ELISA（酵素結合免疫吸
着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測
定法）あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例え
ば、酵素免疫測定法を用いる場合、PTHrP（1-34）をコ
ーティングしたプレートに、抗PTHrP抗体を含む試料、
例えば、抗PTHrP抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を
加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した
二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄
した後、p-ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて
吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することが
できる。本発明で使用される抗体の活性を確認するに
は、抗PTHrP抗体の中和活性を測定する。

【００５７】９．投与方法および製剤 本発明の治療剤は、悪液質に対する治療又は改善を目的
として使用される。また、悪液質の種類は癌由来のもの
であるか否かを問わない。例えば、癌由来のものとし
て、J. Urol.（UNITED STATES）Mar 1995, 153（3 Pt
1）p854-857、Langenbecks Arch. Chir. Suppl II Verh
Dtsch Ges Chir（GERMANY）1990, p261-265、Oncology
（SWITZERLAND）1990, 47（1）p87-91、Int. J. Pancre
atol.（UNITED STATES）Aug-Nov 1990, 7（1-3）p141-1
50、J. Natl. Cancer Inst.（UNITEDSTATES）Dec 19, 1
990,82（24）p1922-1926などに記載の悪液質が挙げられ
る。

【００５８】また、癌由来でないものとして、JPEN J.
Parenter. Enteral Nutr.（UNITEDSTATES）Nov-Dec 199
0, 14（6）p605-609、Chest（UNITED STATES）Nov 199
0, 98（5）p1091-1094、Bone Marrow Transplant.（ENG
LAND）Jul 1990, 6（1）p53-57などに記載の悪液質が挙
げられる。

【００５９】本発明の抗PTHrP抗体を有効成分として含
有する治療剤は、経口、非経口投与のいずれでも可能で
あるが、好ましくは非経口投与であり、具体的には経肺
剤型（例えばネフライザーなどの器具を用いた経肺投与
剤）、経鼻投与剤型、経皮投与剤型（例えば軟膏、クリ
ーム剤）、注射剤型等が挙げられる。注射剤型の例とし
ては、例えば点滴等の静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内
注射、皮下注射等により全身又は局部的に投与すること
ができる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法
を選択することができる。有効投与量は、一回につき体
重1kgあたり0.001mg から1000mgの範囲で選ばれる。あ
るいは、患者あたり0.01〜100000mg/bodyの投与量を選
ぶことができる。しかしながら、本発明の抗PTHrP抗体
を含有する治療剤はこれらの投与量に制限されるもので
はない。

【００６０】また、投与時期としては、悪液質が生ずる
前後を問わず投与してもよく、あるいは体重減少が予測
される時に投与してもよい。本発明の抗PTHrP抗体を有
効成分として含有する治療剤は、常法にしたがって製剤
化することができ（Remington's Pharmaceutical Scien
ce, latest edition, Mark Publishing Company, Easto
n,米国）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含む
ものであってもよい。

【００６１】このような担体および医薬添加物の例とし
て、水、医薬的に許容される有機溶剤、コラーゲン、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ
シビニルポリマー、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ポリアクリル酸ナトリウム、アルギン酸ナトリウ
ム、水溶性デキストラン、カルボキシメチルスターチナ
トリウム、ペクチン、メチルセルロース、エチルセルロ
ース、キサンタンガム、アラビアゴム、カゼイン、寒
天、ポリエチレングリコール、ジグリセリン、グリセリ
ン、プロピレングリコール、ワセリン、パラフィン、ス
テアリルアルコール、ステアリン酸、ヒト血清アルブミ
ン（HSA）、マンニトール、ソルビトール、ラクトー
ス、医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げら
れる。

【００６２】実際の添加物は、本発明治療剤の剤型に応
じて上記の中から単独で又は適宜組み合わせて選ばれる
が、もちろんこれらに限定するものではない。例えば、
注射用製剤として使用する場合、精製された抗PTHrP抗
体を溶剤、例えば生理食塩水、緩衝液、ブドウ糖溶液等
に溶解し、これに吸着防止剤、例えばTween80、Tween2
0、ゼラチン、ヒト血清アルブミン等を加えたものを使
用することができる。あるいは、使用前に溶解再構成す
る剤形とするために凍結乾燥したものであってもよく、
凍結乾燥のための賦形剤としては、例えば、マンニトー
ル、ブドウ糖等の糖アルコールや糖類を使用することが
できる。

【００６３】

【実施例】以下、参考例および実施例により本発明をさ
らに具体的に説明する。但し、本発明は、これら実施例
等にその技術的範囲を限定するものではない。 〔実施例１〕悪液質モデル動物での薬効試験 ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の悪液質モデル動物を用
いて、PTHrPに対するマウスモノクローナル抗体の悪液
質に対する治療効果を検討した。モデル動物としてヒト
口腔底癌OCC-1（（財）実験動物中央研究所より購入）
を移植したヌードマウスを用いた。ヒト口腔底癌OCC-1
を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カ
ルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの
悪液質症状を発症する。ヒト口腔底癌OCC-1によって引
き起こされる悪液質症状を、マウスモノクローナル抗体
が改善することを、血中カルシウム濃度、体重および延
命効果を指標にして評価した。

【００６４】ヒト口腔底癌OCC-1の継代は、BALB/c-nu/n
uヌードマウス（日本クレア）を用いてin vivoで行っ
た。薬効評価には、6週齢雄性BALB/c-nu/nuヌードマウ
ス（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、7週齢
の動物を使用した。悪液質モデル動物の作製および群分
けは、以下のようにして行った。すなわち、継代してい
るヒト口腔底癌OCC-1を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細
かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個
ずつ移植した。腫瘍塊移植後、10日目に腫瘍体積が十分
に大きくなったのを確認した後、血中カルシウム濃度、
体重および腫瘍体積を指標として各指標が平均化するよ
うに群分けし、悪液質モデル動物とした。悪液質に対す
る治療効果の検討は、以下のようにして行った。

【００６５】（1）生存期間の観察 延命効果の検討では、マウスモノクローナル抗体を週２
回投与して、生存期間の観察を行った。また、既に高カ
ルシウム血症治療薬として処方されているパミドロネー
ト（アレディア）を、15mg/Kgの用量で尾静脈内に単回
投与した。対照として、リン酸バッファー生理食塩水
（PBS）を0.2ml/mouseで尾静脈内に週２回投与した。そ
の結果を図１に示す。

【００６６】（2）血中カルシウム濃度の観察 上記で作製、群分けした悪液質モデル動物に、マウス１
匹あたり10μgまたは100μgのPTHrPに対するマウスモノ
クローナル抗体を尾静脈内に２日おきに２回投与した。
また、既に高カルシウム血症治療薬として処方されてい
るパミドロネート（アレディア）を、15mg/Kgの用量で
尾静脈内に単回投与した。対照として、リン酸バッファ
ー生理食塩水（PBS）を0.2ml/mouseで尾静脈内に２日お
きに２回投与した。

【００６７】（3）血中カルシウムの測定 マウスモノクローナル抗体投与後、１日および４日目に
血中カルシウム濃度を測定し、各抗体の薬効評価を行っ
た。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット管
で採血し、643自動Ca/pHアナライザー（CIBA-CORNING）
を用いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。
体重は、抗体投与後４日目まで毎日測定した。その結果
を、図２および図３に示す。

【００６８】（4）腫瘍重量の測定 腫瘍体積は、抗体投与後４日目に、腫瘍の長径（a mm）
および短径（b mm）を測定し、ギャランの計算式ab²/2
により腫瘍体積として算出した。その結果を、図４に示
す。

【００６９】以上の結果より、血中カルシウム濃度につ
いては、抗体濃度10μgでは、パミドロネート投与群と
差がないにも関わらず、悪性腫瘍に伴う体重減少をパミ
ドロネート投与群又は対照群に比べて抑制した。抗体濃
度100μgを投与した群では、血中カルシウム濃度の上昇
をパミドロネート投与群又は対照群に比べて抑制し、体
重減少もパミドロネート投与群又は対照群に比べて抑制
した。また、抗PTHrP中和抗体100μgを週２回投与した
群では、パミドロネート投与群又は対照群に比べて有意
な生存期間の延長（p=0.0003：Log Rank test）が認め
られた。このことから、PTHrPに対する中和マウスモノ
クローナル抗体は体重減少抑制、生存期間の延長など既
存の高カルシウム血症治療薬にはない効果を有する。し
たがって本抗体の悪性腫瘍に伴う悪液質の治療薬として
の有用性が示された。

【００７０】〔実施例２〕高カルシウム血症・悪液質モ
デル動物での薬効試験 ヒト腫瘍−ヌードマウス移植系の悪液質モデル動物を用
いて、PTHrPに対するヒト型化抗体バージョンｑの悪液
質に対する治療効果を検討した。モデル動物としてヒト
口腔底癌OCC-1（（財）実験動物中央研究所より購入）
を移植したヌードマウスを用いた。ヒト口腔底癌OCC-1
を移植されたヌードマウスは、腫瘍の増加に伴い血中カ
ルシウム濃度が上昇し、体重減少や運動量の低下などの
悪液質症状を発症する。ヒト口腔底癌OCC-1によって引
き起こされる悪液質症状を、ヒト型化抗体バージョンq
が改善することを、血中カルシウム濃度、体重および延
命効果を指標にして評価した。

【００７１】ヒト口腔底癌OCC-1の継代は、BALB/c-nu/n
uヌードマウス（日本クレア）を用いてin vivoで行っ
た。薬効評価には、6週齢雄性BALB/c-nu/nuヌードマウ
ス（日本クレア）を購入し、１週間の馴化の後、7週齢
の動物を使用した。悪液質モデル動物の作製および群分
けは、以下のようにして行った。すなわち、継代してい
るヒト口腔底癌OCC-1を摘出し、３ｍｍ角ブロックに細
かく刻んだ腫瘍塊をマウスの脇腹皮下に１匹あたり１個
ずつ移植した。腫瘍塊移植後、10日目に腫瘍体積が十分
に大きくなったのを確認した後、腫瘍体積、血中カルシ
ウム濃度および体重を指標として各指標が平均化するよ
うに群分けし、悪液質モデル動物とした。悪液質に対す
る治療効果の検討は、以下のようにして行った。

【００７２】（1）生存期間の観察 延命効果の検討では、ヒト型化抗体バージョンｑを週２
回尾静脈内に投与して、生存期間の観察を行った。対照
として、リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.1ml/m
ouseで尾静脈内に週２回投与した。その結果を図16に示
す。

【００７３】（2）血中カルシウム濃度の観察 上記で作製、群分けした悪液質モデル動物に、マウス１
匹あたり10μgまたは100μgのヒト型化抗体バージョン
ｑを尾静脈内に２日あけて２回投与した。対照として、
リン酸バッファー生理食塩水（PBS）を0.1ml/mouseで同
様に投与した。

【００７４】（3）血中カルシウムの測定 ヒト型化抗体バージョンｑ初回投与後、１日および４日
目に血中カルシウム濃度を測定し、抗体の薬効評価を行
った。血中カルシウム濃度は、眼窩よりヘマトクリット
管で採血し、643自動Ca/pHアナライザー（CHIRON）を用
いて全血イオン化カルシウム濃度として測定した。体重
は、４日目まで毎日測定した。その結果を、図17および
図18に示す。 （4）腫瘍重量の測定 腫瘍体積は、初回投与時および４日目に、腫瘍の長径
（ａmm）および短径（ｂmm）を測定し、ギャランの計算
式ab²/2により算出した。その結果を図19に示す。

【００７５】以上の結果のように、ヒト型化抗体バージ
ョンｑを10μgあるいは100μgを投与することで、悪性
腫瘍に伴う血中カルシウム濃度の上昇及び体重の減少は
対照群に比べて抑制された。また、ヒト型化抗体バージ
ョンｑを100μg、週2回投与し続けた場合、対照群に比
べて有意な生存期間の延長（p=0.0108：Log Rank tes
t）が認められた。今回のヒト型化抗体バージョンｑの
悪性腫瘍に伴う悪液質モデル動物に対する効果は、すで
に報告したマウスモノクローナル抗体の効果と同様のも
のであった。このことから、本抗体の悪性腫瘍に伴う高
カルシウム血症・悪液質の治療薬としての有用性が示さ
れた。

【００７６】〔参考例１〕 抗ＰＴＨｒＰ（１−３４）マウスモノクローナル抗体産
生ハイブリドーマの作製 ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）（配列番号75) に対するモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマ＃23-57-154 およ
び#23-57-137-1を、佐藤幹二らにより作製された（Sat
o, K. et al., J. Bone Miner. Res. 8, 849-860, 199
3)。免疫原として使用するために、ＰＴＨｒＰ（１−３
４）（Peninsula 製）とキャリアータンパクであるサイ
ログロブリンをカルボジイミド（Dojinn）を用いて結合
した。サイログロブリンと結合したＰＴＨｒＰ（１−３
４）を透析し、タンパク濃度として２μg/mlとなるよう
に調製した後、フロイントアジュバント（Difco)と１:
１で混合し、エマルジョン作製後、16匹の雌性BALB/Cマ
ウスの背部皮下又は腹腔内に動物あたり100 μｇを11回
免疫した。初回免疫は、フロイント完全アジュバントを
用い、二回目以降の追加免疫にはフロイント不完全アジ
ュバントを使用した。

【００７７】免疫したマウスの血清中の抗体価の測定
は、以下の方法で行った。すなわち、マウス尾静脈より
採血し、血清分離後ＲＩＡバッファーで希釈した抗血清
と125I標識ＰＴＨｒＰ（１−３４）を混合し、結合活性
を測定した。抗体価の上昇したマウスの腹腔に、キャリ
アータンパクを結合していないＰＴＨｒＰ（１−３４）
を動物あたり50μｇを最終免疫した。

【００７８】最終免疫３日目にマウスを屠殺し、脾臓を
摘出後、脾臓細胞とマウスミエローマ細胞株P3x63Ag8U.
1 を50％ポリエチレングリコール4000を用いる常法にし
たがって細胞融合した。細胞融合した細胞を２×10⁴／
ウェルの細胞数で85枚の96穴プレートに蒔き込んだ。ハ
イブリドーマの選別はＨＡＴ培地を用いて行った。

【００７９】ハイブリドーマのスクリーニングは、ＨＡ
Ｔ培地中で生育の認められた穴の培養上清を固相化ＲＩ
Ａ法にてＰＴＨｒＰ認識抗体の有無を測定し選択するこ
とにより行った。抗体との結合能の認められた穴からハ
イブリドーマを回収し、15％ＦＣＳを含むRPMI-1640 培
地にＯＰＩ-supplement(Sigma)を添加した培地に懸濁
し、限界希釈法にてハイブリドーマの単一化を実施し
た。ＰＴＨｒＰ（１−３４）との結合能の強いクローン
＃23-57-154 および#23-57-137-1を得た。なお、ハイブ
リドーマクローン#23-57-137-1は、mouse-mouse hybrid
oma #23-57-137-1として、工業技術院生命工学工業技術
研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）に、平成８
年８月１５日に、FERM BP-5631としてブダペスト条約に
基づき国際寄託されている。

【００８０】〔参考例２〕ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）
に対するマウスモノクローナル抗体のＶ領域をコードす
るDNAのクローニング ヒトＰＴＨｒＰ（１−３４）に対するマウスモノクロー
ナル抗体#23-57-137-1の可変領域をコードするDNAを次
の様にしてクローニングした。 (1) ｍＲＮＡの調製 ハイブリドーマ#23-57-137-1からのｍＲＮＡをQuick Pr
ep mRNA PurificationKit(Pharmacia Biotech社) を用
いて調製した。ハイブリドーマ#23-57-137-1の細胞をEx
traction Buffer で完全にホモジナイズし、キット添付
の処方に従い、oligo(dT)-Cellulose Spun Column にて
ｍＲＮＡを精製し、エタノール沈殿をおこなった。ｍＲ
ＮＡ沈殿物をElution Bufferに溶解した。

【００８１】(2) マウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子
のｃDNAの作製および増幅 (i) #23-57-137-1抗体Ｈ鎖Ｖ領域ｃDNAのクローニング ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＨ
鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５'−
ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA, 85, 8998-9002, 1988; Belyavsky, A. et
al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) によ
り行った。５'−ＲＡＣＥ法には５'-Ampli FINDER RACE
kit (CLONETECH社) を用い、操作はキット添付の処方
にしたがって行った。ｃDNA合成に使用するプライマー
は、マウスＨ鎖定常領域（Ｃ領域）とハイブリダイズす
るＭＨＣ２プライマー（配列番号１）を用いた。前記の
ようにして調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型としてＭＨ
Ｃ２プライマー10pmole を加え、逆転写酵素と52℃、30
分間反応させることによりｃDNAへの逆転写を行った。

【００８２】６Ｎ NaOH でＲＮＡを加水分解（65℃、30
分間）した後、エタノール沈殿によりｃDNAを精製し
た。Ｔ４ＲＮＡリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間
反応することにより、合成したｃDNAの５'末端にAmpli
FINDER Anchor(配列番号42)を連結した。これを鋳型と
してPCRにより増幅するためのプライマーとしてAnchor
プライマー（配列番号２）およびＭＨＣ−Ｇ１プライマ
ー（配列番号３）（S.T.Jones,et al.,Biotechnology,
9,88,1991) を使用した。PCR溶液は、その50μｌ中に10
mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.25mM dNTPs(dATP, d
GTP, dCTP, dTTP)、1.5 mM MgCl₂、2.5 ユニットのTaKa
Ra Taq（宝酒造）、10pmole のアンカー(Anchor)プライ
マー、並びにＭＨＣ−Ｇ１プライマー及びAmpli FINDER
Anchor を連結したｃDNAの反応混合物１μｌを含有す
る。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。PCRはThermal
Cycler Mode 1480J(Perkin Elmer) を用い、94℃にて4
5秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイク
ルで30回行った。

【００８３】(ii) #23-57-137-1 抗体Ｌ鎖Ｖ領域のｃDN
Aのクローニング ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノクローナル抗体のＬ
鎖Ｖ領域をコードする遺伝子のクローニングは、５'−
ＲＡＣＥ法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988 ; Belyavsky, A. et
al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989)によ
り行った。５'-ＲＡＣＥ法には５'-AmpliFinder RACE K
it(Clonetech)を用い、操作は添付の処方に従った。ｃD
NA合成に使用するプライマーは、oligo-dTプライマーを
用いた。前記のように調製したｍＲＮＡ約２μｇを鋳型
としてoligo-dTプライマーを加え、逆転写酵素と52℃、
30分間反応させることによりｃDNAへの逆転写を行っ
た。６N NaOHでＲＮＡを加水分解（65℃、30分間）した
後、エタノール沈殿によりｃDNAを精製した。合成した
ｃDNAの５'末端に前記Ampli FINDER Anchor をＴ４ＲＮ
Ａリガーゼで37℃で６時間、室温で16時間反応させるこ
とにより連結した。

【００８４】マウスＬ鎖λ鎖定常領域の保存配列からPC
RプライマーＭＬＣ（配列番号４）を設計し、394 DNA/R
NA シンセサイザー (ABI 社）を用いて合成した。PCR溶
液は、その100 μｌ中に10 mM Tris-HCl（pH８．３）、
50mM KCl、0.25mM ｄＮＴＰｓ（dATP, dGTP，dCTP，dT
TP）、1.5mM MgCl₂ 、2.5 ユニットの AmpliTaq （PERK
IN ELMER）、50pmole のAnchorプライマー（配列番号
２）、並びにＭＬＣ（配列番号４）およびAmpli FINDER
Anchor を連結したｃDNAの反応混合物１μｌを含有す
る。この溶液に50μｌの鉱油を上層した。PCRはThermal
Cycler Model480J（Perkin Elmer）を用い、94℃にて4
5秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サイク
ルで３５回行った。

【００８５】(3) PCR生成物の精製および断片化 前記のようにしてPCR法により増幅したDNA断片を３％Nu
Sieve GTGアガロース（FMC Bio. Products)を用いたア
ガロースゲル電気泳動により分離した。Ｈ鎖Ｖ領域とし
て約550bp 長、Ｌ鎖Ｖ領域として約550bp 長のDNA断片
を含有するアガロース片を切取り、GENECLEAN II Kit(B
IO101)を用い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製
した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた後、10mM
Tris-HCl(pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。
得られたDNA溶液１μｌを制限酵素XmaI（New England B
iolabs)により37℃で１時間消化し、次いで制限酵素Eco
RI （宝酒造）により37℃で１時間消化した。この消化
混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、エタノ
ール沈殿によりDNAを回収した。こうして、５'−末端に
EcoRI 認識配列を有し、３'−末端にＸｍａＩ認識配列
を有するマウスＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコードす
る遺伝子を含むDNA断片を得た。

【００８６】上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領
域およびＬ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含むEcoRI-Xm
aI DNA断片とEcoRI 及びXmaIで消化することにより調製
したpUC19 ベクターをDNAライゲーションキットver.2
（宝酒造）を用い、添付の処方に従い16℃で１時間反応
させ連結した。次に10μｌの上記連結混合物を大腸菌Ｊ
Ｍ１０９コンピテント細胞（ニッポンジーン）100 μｌ
に加え、この細胞を氷上で15分間、42℃にて１分間、さ
らに氷上で１分間静置した。次いで300 μｌのＳＯＣ培
地（Molecular Cloning: A Labgoratory Manual, Sambr
ook,et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1
989)を加え37℃にて30分間インキュベートした後、100
μｇ／ｍｌ又は50μｇ／ｍｌのアンピシリン、0.1mM の
IPTG、20μｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌを含むＬＢ寒天培地ま
たは２ｘＹＴ寒天培地（Molecular Cloning: A Labgora
tory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor L
aboratory Press, 1989)上にこの大腸菌をまき、37℃に
て一夜インキュベートして大腸菌形質転換体を得た。

【００８７】この形質転換体を100 μｇ／ｍｌ又は50μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢ培地または２×
ＹＴ培地２ｍｌで37℃にて一夜培養し、菌体画分からプ
ラスミド抽出機PI-100Σ（クラボウ）又はQIAprep Spin
Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドDNAを調製
し、塩基配列の決定を行った。

【００８８】(4) マウス抗体Ｖ領域をコードする遺伝子
の塩基配列決定 前記のプラスミド中のｃDNAコード領域の塩基配列をDye
Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を
用い、DNA Sequencer 373A (ABI社Perkin-Elmer）によ
り決定した。配列決定用プライマーとしてM13 Primer M
4 （宝酒造）（配列番号５）及びM13 Primer RV （宝酒
造）（配列番号６）を用い、両方向の塩基配列を確認す
ることにより配列を決定した。

【００８９】こうして得られたハイブリドーマ#23-57-1
37-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を
含有するプラスミドをMBC1H04 、Ｌ鎖Ｖ領域をコードす
る遺伝子を含有するプラスミドをMBC1L24 と命名した。
プラスミドMBC1H04 およびMBC1L24 に含まれるマウス#2
3-57-137-1抗体のＨ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域をコード
する遺伝子の塩基配列（対応するアミノ酸配列を含む）
をそれぞれ配列番号57、65に示す。Ｈ鎖Ｖ領域及びＬ鎖
Ｖ領域断片のポリペプチドは、ともに配列番号57、65で
表される塩基配列の第58番目（グルタミンをコードす
る）から開始されている。これらのアミノ酸配列を、Ｈ
鎖Ｖ領域の断片については配列番号46、Ｌ鎖Ｖ領域の断
片については配列番号45に示す。

【００９０】なお、前記プラスミドMBC1H04 およびMBC1
L24 を有する大腸菌はEscherichiacoli JM109（MBC1H04
）およびEscherichia coli JM109（MBC1L24 ）とし
て、工業技術院生命工学工業技術研究所（茨城県つくば
市東１丁目１番３号）に、平成８年８月１５日に、Esch
erichia coli JM109 (MBC1H04)についてはFERM BP-562
8、Escherichia coli JM109 (MBC1L24)についてはFERM
BP-5627としてブダペスト条約に基づき国際寄託されて
いる。

【００９１】(5) ヒトＰＴＨｒＰに対するマウスモノク
ローナル抗体#23-57-137-1のＣＤＲの決定 Ｈ鎖Ｖ領域およびＬ鎖Ｖ領域の全般の構造は、互いに類
似性を有しており、それぞれ４つのフレームワーク部分
が３つの超可変領域、すなわち相補性決定領域（ＣＤ
Ｒ）により連結されている。フレームワークのアミノ酸
配列は、比較的よく保存されているが、一方、ＣＤＲ領
域のアミノ酸配列の変異性は極めて高い（Kabat,E.A.et
al., 「Sequence of Proteins of Immunological Inte
rest」US Dept. Health and Human Services, 1983) 。
このような事実に基づき、ヒトＰＴＨｒＰに対するマ
ウスモノクローナル抗体の可変領域のアミノ酸配列をKa
batらにより作成された抗体のアミノ酸配列のデータベ
ースにあてはめて、相同性を調べることによりＣＤＲ領
域を表１に示すごとく決定した。なお、Ｌ鎖Ｖ領域のＣ
ＤＲ１〜３のアミノ酸配列についてはそれぞれ配列番号
59〜61に示し、Ｈ鎖Ｖ領域のＣＤＲ１〜３のアミノ酸配
列についてはそれぞれ配列番号62〜64に示した。

【００９２】

【表１】

【００９３】〔参考例３〕キメラ抗体の構築 (1) キメラ抗体Ｈ鎖の構築 (i) Ｈ鎖Ｖ領域の構築 ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のゲノムDNAを含む発現ベクター
に連結するために、クローニングしたマウスＨ鎖Ｖ領域
をPCR法により修飾した。後方プライマーＭＢＣ１−Ｓ
１（配列番号７）はＶ領域のリーダー配列の５'−側を
コードするDNAにハイブリダイズし且つKozak コンセン
サス配列（Kozak, M. et al., J. Mol.Biol., 196, 947
-950, 1987)及び制限酵素Hind IIIの認識配列を有する
ように設計した。前方プライマーＭＢＣ１−ａ（配列番
号８）はＪ領域の３'−側をコードするDNA配列にハイブ
リダイズし、且つ、スプライスドナー配列及び制限酵素
BamHIの認識配列を有するように設計した。PCRは、TaKa
Ra Ex Taq （宝酒造）を用い、50μｌの反応混合液に鋳
型DNAとして0.07μｇのプラスミドMBC1H04 、プライマ
ーとしてMBC1-aおよびMBC1-S1 をそれぞれ50pmole 、2.
5UのTaKaRa Ex Taq 、0.25mMのｄＮＴＰ含む条件で添付
緩衝液を使用して50μｌの鉱油を上層し、94℃にて１分
間、55℃にて１分間、72℃にて２分間の温度サイクルで
30回行った。PCR法により増幅したDNA断片を３％Nu Sie
ve GTGアガロース（FMC Bio. Products)を用いたアガロ
ースゲル電気泳動により分離した。

【００９４】437bp 長のDNA断片を含有するアガロース
片を切取り、GENECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット
添付の処方に従いDNA断片を精製した。精製したDNAをエ
タノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4) 、
１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。得られたDNA溶液１
μｌを制限酵素BamHI、Hind III（宝酒造）により37℃
１時間消化した。この消化混合物をフェノール及びクロ
ロホルムで抽出し、エタノール沈殿によりDNAを回収し
た。

【００９５】上記のようにして調製したマウスＨ鎖Ｖ領
域をコードする遺伝子を含むHind III-BamHI DNA断片を
Hind IIIおよびBamHIで消化することにより調製したpUC
19ベクターにサブクローニングした。このプラスミドの
塩基配列を確認するためプライマーM13 Primer M4 およ
びM13 Primer RV をプライマーとして、Dye Terminator
Cycle Sequencing kit(Perkin-Elmer) を用い、DNA Se
quencer 373A (Perkin-Elmer)により塩基配列を決定し
た。正しい塩基配列を有するハイブリドーマ#23-57-137
-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含
有し、５'−側にHind III認識配列及びKozak 配列、３'
−側にBamHI認識配列を持つプラスミドをMBC1H/pUC19
と命名した。

【００９６】(ii)ｃDNAタイプのマウス−ヒトキメラＨ
鎖の作製のためのＨ鎖Ｖ領域の構築 ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃDNAと連結するために、上記
のようにして構築したマウスＨ鎖Ｖ領域をPCR法により
修飾した。Ｈ鎖Ｖ領域のための後方プライマーMBC1HVS2
（配列番号９）はＶ領域のリーダー配列の最初をコード
する配列の２番のアスパラギンをグリシンに変換し、且
つKozak コンセンサス配列（Kozak, M.et al., J. Mol.
Biol., 196, 947-950, 1987)並びにHind IIIおよびEco
RI 認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のた
めの前方プライマーMBC1HVR2（配列番号10）はＪ領域の
３'−側をコードするDNA配列にハイブリダイズし、且
つ、Ｃ領域の５'−側の配列をコードしＡpaＩおよびSma
I認識配列を有するように設計した。

【００９７】PCRはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を用い、5
0μｌの反応混合液に鋳型DNAとして0.6 μｇのプラスミ
ドMBC1H/pUC19 、プライマーとしてMBC1HVS2およびMBC1
HVR2をそれぞれ50pmole 、TaKaRa Ex Taq を2.5U、0.25
mMのｄＮＴＰ含む条件で添付の緩衝液を使用して50μｌ
の鉱油を上層して94℃１分間、55℃１分間、72℃１分間
の温度サイクルで30回行った。PCR法により増幅したDNA
断片を１％Sea Kem GTG アガロース（FMC Bio.Product
s) を用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。4
56bp 長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、GE
NECLEAN II Kit(BIO101)を用い、キット添付の処方に従
いDNA断片を精製した。精製したDNAをエタノール沈殿さ
せた後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液20μｌ
に溶解した。

【００９８】得られたDNA溶液１μｌを制限酵素EcoRI
およびSmaI（宝酒造）により37℃で１時間消化した。こ
の消化混合物をフェノール及びクロロホルムで抽出し、
エタノール沈殿によりDNAを回収した。上記のようにし
て調製したマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含む
EcoRI-SmaI DNA断片をEcoRI およびSmaIで消化すること
により調製したpUC19 ベクターにサブクローニングし
た。このプラスミドの塩基配列を確認するため、プライ
マーM13 Primer M4 及びM13 Primer RV をプライマーと
して、Dye Terminator Cycle Sequencing kit(Perkin-E
lmer) を用い、DNA Sequencer 373A(Perkin-Elmer)によ
り塩基配列を決定した。正しい塩基配列を有するハイブ
リドーマ#23-57-137-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコ
ードする遺伝子を含有し、５'−側にEcoRI およびHind
III認識配列及びKozak 配列、３'−側にＡpaＩおよびSm
aI認識配列を持つプラスミドをMBC1Hv/pUC19と命名し
た。

【００９９】(iii) キメラ抗体Ｈ鎖の発現ベクターの構
築 ヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含むｃDNAは、以下のよう
にして調製した。すなわち、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ
領域およびヒト抗体Ｈ鎖Ｃ領域ＩｇＧ１のゲノムDNA
（N. Takahashi, et al., Cell 29, 671-679 1982）を
コードする発現ベクターDHFR-△E-RVh-PM-1-f（WO92/19
759参照）と、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｌ鎖Ｖ領域およびヒ
ト抗体Ｌ鎖κ鎖Ｃ領域のゲノムDNAをコードする発現ベ
クターRV1-PM1a（WO92/19759参照）とを導入したＣＨＯ
細胞よりｍＲＮＡを調製し、ＲＴ−PCR法でヒト型化Ｐ
Ｍ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１を含む
ｃDNAをクローニングし、pUC19 のHind IIIとBamHI部位
にサブクローニングした。塩基配列を確認した後、正し
い配列を持つプラスミドをpRVh-PM1f-ｃDNAと命名し
た。

【０１００】DHFR-△E-RVh-PM-1-f上のＳＶ４０プロモ
ーターとＤＨＦＲ遺伝子との間にあるHind III部位、お
よびＥＦ−１αプロモーターとヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖
Ｖ領域との間にあるEcoRI 部位を欠失した発現ベクター
を作製し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗
体Ｃ領域Ｃγ１を含むｃDNAの発現ベクターの構築のた
めに使用した。pRVh-PM1f-ｃDNAをBamHIで消化した後、
Klenowフラグメントで平滑化し、さらにHind IIIで消化
し、Hind III-BamHI平滑化断片を調製した。このHind I
II-BamHI平滑化断片を、上記のHind III部位およびEcoR
I 部位が欠失したDHFR-△E-RVh-PM1-f をHind IIIおよ
びSmaIで消化することにより調製した発現ベクターに連
結し、ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト抗体Ｃ
領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含む発現ベクターRVh-P
M1f−ｃDNAを構築した。

【０１０１】ヒト型化ＰＭ１抗体Ｈ鎖Ｖ領域およびヒト
抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含む発現ベクタ
ーRVh-PM1f−ｃDNAをApaIおよびBamHIで消化した後、Ｈ
鎖Ｃ領域を含むDNA断片を回収し、ApaIおよびBamHIで消
化することにより調製したMBC1Hv/pUC19に導入した。こ
うして作製したプラスミドをMBC1HcDNA ／pUC19 と命名
した。このプラスミドはマウス抗体のＨ鎖Ｖ領域および
ヒト抗体Ｃ領域Ｃγ１をコードするｃDNAを含み、５'-
末端にEcoRI およびHind III認識配列、３'-末端にBamH
I認識配列を持つ。

【０１０２】プラスミドMBC1HcDNA/pUC19 をEcoRI およ
びBamHIで消化し、得られたキメラ抗体のＨ鎖をコード
する塩基配列を含むDNA断片を、EcoRI およびBamHIで消
化することにより調製した発現ベクターpCOS1に導入し
た。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをMB
C1HcDNA/pCOS1と命名した。なお、発現ベクターpCOS1
は、HEF-PMh-gγ1（WO92/19759参照）から、EcoRI およ
びSmaI消化により抗体遺伝子を削除し、EcoRI-NotI-Bam
HI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構築した。

【０１０３】さらにＣＨＯ細胞での発現に用いるための
プラスミドを作製するため、プラスミドMBC1HcDNA/pUC1
9 をEcoRI およびBamHIで消化し、得られたキメラ抗体
Ｈ鎖配列を含むDNA断片を、EcoRI およびBamHIで消化す
ることにより調製した発現プラスミドpCHO1に導入し
た。こうして得られたキメラ抗体の発現プラスミドをMB
C1HcDNA/pCHO1 と命名した。なお、発現ベクターpCHO1
は、DHFR- △E-rvH-PM1-f（WO92/19759参照）から、Eco
RI およびSmaI消化により抗体遺伝子を削除し、EcoRI-N
otI-BamHI Adaptor（宝酒造）を連結することにより構
築した。

【０１０４】(2) ヒトＬ鎖定常領域の構築 (i) クローニングベクターの作製 ヒトＬ鎖定常領域を含むpUC19 ベクターを構築するため
に、Hind III部位欠失pUC19 ベクターを作製した。pUC1
9 ベクター２μｇを20mM Tris-HCl（pH8.5 ）、10mM M
gCl₂、１mM DTT、100 mM KCl、８Ｕの Hind III （宝酒
造）を含有する反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消
化した。消化混合液をフェノールおよびクロロホルムで
抽出し、DNAをエタノール沈殿により回収した。回収し
たDNAを50mM Tris-HCl （pH7.5)、10mM MgCl₂、１mM DT
T、100mM NaCl、0.5mM dNTP、６Ｕのクレノウ(Klenow)
フラグメント（GIBCO BRL)を含有する50μｌの反応混合
液中で室温にて20分間反応させ、末端を平滑化させた。
反応混合液をフェノールおよびクロロホルムで抽出し、
ベクターDNAをエタノール沈殿により回収した。

【０１０５】回収したベクターDNAを50mM Tris-HCl （p
H7.6)、 10mM MgCl₂ 、１mM ATP、１mM DTT、５％(v/v)
ポリエチレングリコール-8000 、0.5 ＵのT4 DNAリガ
ーゼ（GIBCO BRL)を含有する反応混合液10μｌ中で16℃
で２時間反応させ、自己連結させた。反応混合液５μｌ
を大腸菌JM109 コンピテント細胞（ニッポンジーン）10
0 μｌに加え、氷上で30分間静置した後、42℃にて１分
間、さらに氷上で１分間静置した。ＳＯＣ培地500 μｌ
を加えて、37℃で１時間インキュベーションした後、X-
gal とIPTGを表面に塗布した２×ＹＴ寒天培地（50μg/
mlアンピシリン含有）（Molecular Cloning: A Labgora
tory Manual, Sambrook,et al., Cold Spring Harbor L
aboratory Press, 1989)にまき、37℃で一夜培養して形
質転換体を得た。形質転換体を、50μg/mlアンピシリン
を含有する２×ＹＴ培地20mlで37℃一夜培養し、菌体画
分からPlasmid Mini Kit(QIAGEN)を用いて、添付の処方
に従ってプラスミドDNAを精製した。精製したプラスミ
ドをHind IIIで消化し、Hind III部位が欠失しているこ
とを確認したプラスミドをpUC19 ΔHind IIIと命名し
た。

【０１０６】(ii)ヒトＬ鎖λ鎖定常領域をコードする遺
伝子の構築 ヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域は、Ｍｃｇ+ Ｋｅ+ Ｏｚ- 、Ｍ
ｃｇ- Ｋｅ- Ｏｚ- 、Ｍｃｇ- Ｋｅ- Ｏｚ+ 、Ｍｃｇ-
Ｋｅ+ Ｏｚ- の少なくとも４種類のアイソタイプが知ら
れている（P.Dariavach,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA,84,9074-9078,1987) 。#23-57-137-1マウスＬ鎖λ鎖
Ｃ領域と相同性を有するヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をＥＭ
ＢＬデータベースで検索した結果、アイソタイプがＭｃ
ｇ+ Ｋｅ+ Ｏｚ- （accession No.X57819)（P. Dariava
ch, et al., Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 84, 9074-90
78, 1987)のヒト抗体Ｌ鎖λ鎖が最も高い相同性を示
し、#23-57-137-1マウスＬ鎖λ鎖Ｃ領域との相同性はア
ミノ酸配列で64.4％、塩基配列で73.4％であった。

【０１０７】そこで、このヒト抗体Ｌ鎖λ鎖Ｃ領域をコ
ードする遺伝子の構築をPCR法を用いて行った。各プラ
イマーの合成は、394 DNA/RNA 合成機(ABI社) を用いて
行った。HLAMB1（配列番号11）およびHLAMB3（配列番号
13）はセンスDNA配列を有し、HLAMB2（配列番号12）お
よびHLAMB4（配列番号14）はアンチセンスDNA配列を有
し、それぞれのプライマーの両端に20から23bpの相補的
配列を有する。

【０１０８】外部プライマーHLAMBS（配列番号15）、HL
AMBR（配列番号16）はHLAMB1、HLAMB4とそれぞれ相同な
配列を有しており、またHLAMBSはEcoRI 、Hind III、Bl
nI認識配列を、HLAMBRはEcoRI 認識配列をそれぞれ含ん
でいる。第一PCRでHLAMB1-HLAMB2 とHLAMB3-HLAMB4 の
反応を行った。反応後、それらを等量混合し、第二PCR
でアセンブリを行った。さらに外部プライマーHLAMBSお
よびHLAMBRを添加し、第三PCRにより全長DNAを増幅させ
た。

【０１０９】PCRはTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を使い、
添付の処方に従って行った。第一PCRでは、５pmole のH
LAMB1および 0.5pmole のHLAMB2と５ＵのTaKaRa Ex Taq
（宝酒造）とを含有する100 μｌの反応混合液、ある
いは0.5pmoleのHLAMB3および５pmole のHLAMB4と５Ｕの
TaKaRa Ex Taq （宝酒造）とを含有する100 μｌの反応
混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分
間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで
５回行った。

【０１１０】第二PCR は、反応液を50μｌずつ混合し、
50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃にて１分
間、72℃にて１分間の温度サイクルで３回行った。第三
PCRは、反応液に外部プライマーHLAMBSおよびHLAMBRを
各50pmole ずつ添加し、94℃にて１分間、60℃にて１分
間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行った。第三
PCR産物のDNA断片を３％低融点アガロースゲル（NuSiev
e GTG Agarose, FMC) で電気泳動した後、GENECLEANII
Kit(BIO101) を用い、添付の処方に従ってゲルから回
収、精製した。

【０１１１】得られたDNA断片を50mM Tris-HCl(pH7.
5)、10mM MgCl₂、１mM DTT、 100mM NaCl 、８ＵのEcoR
I （宝酒造）を含有する20μｌの反応混合液中で37℃に
て１時間消化した。消化混合液をフェノールおよびクロ
ロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した後、1
0mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液８μｌに溶解し
た。

【０１１２】プラスミドpUC19 ΔHind III 0.8μｇを同
様にEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロホルムで
抽出、エタノール沈殿により回収した。消化したプラス
ミドpUC19 ΔHind IIIを50 mM Tris-HCl（pH9.0)、１mM
MgCl₂、アルカリホスファターゼ(E.coli C75, 宝酒
造）を含有する反応混合液50μｌ中で37℃、30分間反応
させ脱リン酸処理（ＢＡＰ処理）した。反応液をフェノ
ールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿
により回収した後、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mMEDTA溶
液10μｌに溶解した。

【０１１３】上記のＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 Δ
Hind III１μｌと先のPCR産物４μｌをDNA Ligation Ki
t Ver.2（宝酒造）を用いて連結し、大腸菌JM109 コン
ピテント細胞に形質転換した。得られた形質転換体を50
μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで一夜
培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAG
EN) を用いてプラスミドを精製した。

【０１１４】上記プラスミドについて、クローニングさ
れたDNAの塩基配列の確認を行った。塩基配列の決定に
は373A DNA シークエンサー (ABI 社) を用い、プライ
マーにはM13 Primer M4 およびM13 Pricer RV （宝酒
造）を用いた。その結果、クローニングされたDNAの内
部に12bpの欠失があることが判明した。このDNAを含む
プラスミドをＣλΔ／pUC19 と命名した。そこで、その
部分を補うためのプライマーHCLMS （配列番号17）、 H
CLMR（配列番号18）を新たに合成し、PCRで再度正しいD
NAの構築を行った。

【０１１５】第一PCRで欠失DNAを含むプラスミドＣλΔ
／pUC19 を鋳型とし、プライマーHLAMBSとHCLMR 、HCLM
S とHLAMB4で反応を行った。PCR産物をそれぞれ精製
し、第二PCRでアセンブリを行った。さらに外部プライ
マーHLAMBSおよびHLAMB4を添加し、第三PCRにより全長D
NAを増幅させた。

【０１１６】第一PCRでは、鋳型としてＣλΔ／pUC19
0.1μｇ、プライマーHLAMBSおよびHCLMR 各50pmole 、
あるいはHCLMS およびHLAMB4各50pmole 、５ＵのTaKaRa
Ex Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を
用い、50μｌの鉱油を上層して94℃にて１分間、60℃に
て１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで30回行っ
た。

【０１１７】PCR産物HLAMBS-HCLMR(236bp) 、HCLMS-HLA
MB4(147bp) をそれぞれ３％低融点アガロースゲルで電
気泳動した後、GENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲル
から回収、精製した。第二PCRでは精製DNA断片各40ng、
１ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒造）を含有する20μｌの反
応混合液を用い、25μｌの鉱油を上層して94℃にて１分
間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルを
５回行った。

【０１１８】第三PCRでは、第二PCR反応液２μｌ、外部
プライマーHLAMBS、HLAMB4各50pmole 、５ＵのTaKaRa E
x Taq （宝酒造）を含有する100 μｌの反応混合液を用
い、50μｌの鉱油を上層した。PCRは、94℃にて１分
間、60℃にて１分間、72℃にて１分間の温度サイクルで
30回行った。第三PCR産物である357bp のDNA断片を３％
低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII
Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製した。

【０１１９】得られたDNA断片0.1μｇをEcoRI で消化し
た後、ＢＡＰ処理したプラスミド pUC19ΔHind IIIにサ
ブクローニングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細
胞に形質転換し、50μg/mlアンピシリンを含有する２×
ＹＴ培地２mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin
Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。
精製したプラスミドについて塩基配列をM13 Primer M4
、M13 Primer RV （宝酒造）を用い、373A DNAシーク
エンサー(ABI社）にて決定した。欠失のない正しい塩基
配列を有していることが確認されたプラスミドをＣλ／
pUC19 とした。

【０１２０】(iii) ヒトＬ鎖κ鎖定常領域をコードする
遺伝子の構築 プラスミドHEF-PM1k-gk （WO92/19759）からＬ鎖κ鎖Ｃ
領域をコードするDNA断片をPCR法を用いてクローニング
した。394 DNA/RNA 合成機(ABI社）を用いて合成した前
方プライマーHKAPS （配列番号19）はEcoRI 、Hind II
I、BlnI認識配列を、後方プライマーHKAPA （配列番号2
0）はEcoRI 認識配列を有するように設計した。鋳型と
なるプラスミドHEF-PM1k-gk 0.1 μｇ、プライマーHKAP
S 、HKAPA 各50pmole 、５ＵのTaKaRa Ex Taq （宝酒
造）を含有する100 μｌの反応混合液を用い、50μｌの
鉱油を上層した。94℃にて１分間、60℃にて１分間、72
℃にて１分間の反応を30サイクル行った。360bp のPCR
産物を３％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、GE
NECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し
た。

【０１２１】得られたDNA断片をEcoRI で消化した後、
ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 ΔHind IIIにクローニ
ングした。大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転
換し、50μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２
mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid K
it(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製した。精製したプ
ラスミドの塩基配列をM13 Primer M4 、M13 Primer RV
（宝酒造）を用い、373A DNAシークエンサー(ABI社）に
て決定した。正しい塩基配列を有していることが確認さ
れたプラスミドをＣκ／pUC19 とした。

【０１２２】(3) キメラ抗体Ｌ鎖発現ベクターの構築 キメラ#23-57-137-1抗体Ｌ鎖発現ベクターを構築した。
プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 のヒト抗体定常
領域の直前にあるHind III、BlnI部位に、#23-57-137-1
Ｌ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を連結することによっ
て、それぞれキメラ#23-57-137-1抗体Ｌ鎖Ｖ領域および
Ｌ鎖λ鎖またはＬ鎖κ鎖定常領域をコードするpUC19 ベ
クターを作製した。EcoRI 消化によってキメラ抗体Ｌ鎖
遺伝子を切り出し、ＨＥＦ発現ベクターへサブクローニ
ングを行った。

【０１２３】すなわち、プラスミドMBC1L24 から#23-57
-137-1抗体Ｌ鎖Ｖ領域をPCR法を用いてクローニングし
た。各プライマーの合成は、394 DNA/RNA 合成機(ABI
社）を用いて行った。後方プライマーMBCCHL1 （配列番
号２１）はHind III認識配列とKozak 配列（Kozak,M.et
al.,J.Mol.Biol.196,947-950,1987) を、前方プライマ
ーMBCCHL3 （配列番号２２）はBglII 、EcoRI 認識配列
を有するように設計した。

【０１２４】PCRは、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KC
l、1.5mM MgCl₂ 、0.2mM ｄＮＴＰ、0.1 μｇのMBC1L24
、プライマーとしてMBCCHL1 およびMBCCHL3 を各50pmo
le 、１μｌの AmpliTaq(PERKIN ELMER) を含有する100
μｌの反応混合液を用い、50μｌの鉱油を上層して94℃
にて45秒間、60℃にて45秒間、72℃にて２分間の温度サ
イクルで30回行った。４４４ｂｐのPCR産物を３％低融
点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEAN II kit
(BIO101)を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris-HC
l (pH7.4) 、１mM EDTA 溶液20μｌに溶解した。PCR産
物１μｌをそれぞれ10mM Tris-HCl （pH7.5)、10mM MgC
l₂、１mM DTT、50mM NaCl 、８ＵのHind III（宝酒造）
および８ＵのEcoRI （宝酒造）を含有する反応混合液20
μｌ中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノ
ールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿
で回収し、10mM Tris-HCl （pH7.4)、１mM EDTA 溶液８
μｌに溶解した。

【０１２５】プラスミドpUC19１μｇを同様にHind III
およびEcoRIで消化し、フェノールおよびクロロホルム
で抽出、エタノール沈殿により回収し、アルカリホスフ
ァターゼ(E.coli C75 ，宝酒造）でＢＡＰ処理した。反
応液をフェノールおよびクロロホルムで抽出、DNAをエ
タノール沈殿で回収した後、10mM Tris-HCl (pH7.4)、
１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。

【０１２６】ＢＡＰ処理したプラスミドpUC19 １μｌと
先のPCR産物４μｌをDNA LigationKit Ver.2 （宝酒
造）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細
胞（ニッポンジーン）に前述と同様に形質転換した。こ
れを50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ寒天
培地にまき、３７℃で一夜培養した。得られた形質転換
体を、50μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×ＹＴ培
地２mlで37℃で一夜培養した。菌体画分からQIAprep Sp
in Plasmid Kit(QIAGEN)を用いてプラスミドを精製し
た。塩基配列を決定後、正しい塩基配列を有するプラス
ミドをCHL/pUC19 とした。

【０１２７】プラスミドＣλ／pUC19 、Ｃκ／pUC19 各
１μｇをそれぞれ20mM Tris-HCl(pH8.5)、10mM MgCl₂、
１mM DTT、100mM KCl、８Ｕの Hind III（宝酒造）お
よび２ＵのBlnI（宝酒造）を含有する反応混合液20μｌ
中で37℃にて１時間消化した。消化混合液をフェノール
およびクロロホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回
収した後、37℃で30分間ＢＡＰ処理を行った。反応液を
フェノールおよびクロロホルムで抽出し、DNAをエタノ
ール沈殿で回収し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mM EDTA
溶液10μｌに溶解した。#23-57-137-1Ｌ鎖Ｖ領域を含む
プラスミドCHL/pUC19 から８μｇを同様にHindIIIおよ
びBlnIで消化した。得られた409bp のDNA断片を３％低
融点アガロースゲルで電気泳動した後、GENECLEANII Ki
t(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris
-HCl（pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。

【０１２８】このＬ鎖Ｖ領域DNA ４μｌをＢＡＰ処理し
たプラスミドＣλ／pUC19 またはＣκ／pUC19 各１μｌ
にサブクローニングし、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント
細胞に形質転換した。50μg/mlアンピシリンを含有する
２×ＹＴ培地３mlで一夜培養し、菌体画分からQIAprep
Spin Plasmid Kit (QIAGEN) を用いてプラスミドを精製
した。これらをそれぞれプラスミドMBC1L(λ)/pUC19 、
MBC1L(κ)/pUC19 とした。プラスミドMBC1L(λ)/pUC19
およびMBC1L(κ)/pUC19 をそれぞれEcoRI で消化し、３
％低融点アガロースゲルで電気泳動した後、743bp のDN
A断片をGENECLEANII Kit(BIO101) を用いてゲルから回
収、精製し、10mM Tris-HCl(pH7.4)、１mMEDTA溶液10μ
ｌに溶解した。

【０１２９】発現ベクターとしてプラスミドHEF-PM1k-g
k 2.7 μｇをEcoRI で消化し、フェノールおよびクロロ
ホルムで抽出、DNAをエタノール沈殿で回収した。回収
したDNA断片をＢＡＰ処理した後、１％低融点アガロー
スゲルで電気泳動し、6561bpのDNA断片をGENECLEANII K
it(BIO101) を用いてゲルから回収、精製し、10mM Tris
-HCl(pH7.4)、１mM EDTA 溶液10μｌに溶解した。ＢＡ
Ｐ処理したＨＥＦベクター２μｌを上記プラスミドMBC1
L(λ) またはMBC1L(κ) EcoRI 断片各３μｌと連結し、
大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。50
μg/mlアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地２mlで培養
し、菌体画分からQIAprep Spin Plasmid Kit (QIAGEN)
を用いてプラスミドを精製した。

【０１３０】精製したプラスミドを、20mM Tris-HCl (p
H8.5) 、10mM MgCl₂、１mM DTT、100mM KCl 、８ＵのHi
nd III（宝酒造）および２ＵのPvuI（宝酒造）を含有す
る反応混合液20μｌ中で37℃にて１時間消化した。断片
が正しい方向に挿入されていれば5104/2195bp 、逆方向
に挿入されていれば4378/2926bp の消化断片が生じるこ
とより、正しい方向に挿入されていたプラスミドをそれ
ぞれMBC1L(λ)/neo 、MBC1L(κ)/neo とした。

【０１３１】(4) ＣＯＳ−７細胞のトランスフェクショ
ン キメラ抗体の抗原結合活性および中和活性を評価するた
め、前記発現プラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発
現させた。すなわちキメラ抗体の一過性発現は、プラス
ミドMBC1HcDNA/pCOS1とＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏまた
はMBC1HcDNA/pCOS1とＭＢＣ１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み
合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）
を用いてエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞
に同時形質導入した。ＰＢＳ（−）中に１ｘ１０⁷細胞
／ｍｌの細胞濃度で懸濁されているＣＯＳ−７細胞０．
８ｍｌに、各プラスミドDNA１０μｇを加え、１，５０
０Ｖ，２５μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温に
て１０分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処
理された細胞を２％のUltra Low IgGウシ胎児血清（Ｇ
ＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ）に懸
濁し、１０ｃｍ培養皿を用いてＣＯ₂ インキュベーター
にて培養した。７２時間の培養の後、培養上清を集め、
遠心分離により細胞破片を除去し、ＥＬＩＳＡの試料に
供した。 また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清からのキメ
ラ抗体の精製は、ＡｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ
ＭＡＰＳＩＩキット（ＢｉｏＲａｄ）を用いてキット
添付の処方に従って行った。

【０１３２】(5) ＥＬＩＳＡ (i) 抗体濃度の測定 抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のように
して調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉ
ｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（0.1M
NaHCO₃ 、0.02％ NaN₃ ）で１μｇ／ｍｌの濃度に調製
したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌで固
相化し、２００μｌの希釈バッファー（50mM Tris-HC
l、１mM MgCl₂ 、0.1M NaCl 、0.05％ Tween20、0.02
％ NaN₃ 、１％ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、pH7.2
）でブロッキングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯ
Ｓ細胞の培養上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈し
て各穴に加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢ
Ｓ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリフォスファター
ゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを
加えた。１時間室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗ
ｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉ
ｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、ＳＩＧＭ
Ａ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイクロプレ
ートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。濃度測定の
スタンダードとして、Ｈｕ ＩｇＧ１λ Ｐｕｒｉｆｉ
ｅｄ（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ）を用いた。

【０１３３】(ii)抗原結合能の測定 抗原結合測定のためのＥｌＩＳＡプレートでは、次のよ
うにして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴
を固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒ
トＰＴＨｒＰ（１−３４）（ペプチド研究所）１００μ
ｌで固相化した。２００μｌの希釈バッファーでブロッ
キングの後、キメラ抗体を発現させたＣＯＳ細胞の培養
上清あるいは精製キメラ抗体を段階希釈して各穴に加え
た。室温にてインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０
で洗浄後、アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。室温にてイ
ンキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１
ｍｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロ
フェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍ
での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａ
ｄ）で測定した。その結果、キメラ抗体は、ヒトＰＴＨ
ｒＰ（１−３４）に対する結合能を有しており、クロー
ニングしたマウス抗体Ｖ領域の正しい構造を有すること
が示された（図５）。また、キメラ抗体においてＬ鎖Ｃ
領域がλ鎖あるいはκ鎖のいずれであっても抗体のＰＴ
ＨｒＰ（１−３４）に対する結合能は変化しないことか
ら、ヒト型化抗体のＬ鎖Ｃ領域は、ヒト型化抗体Ｌ鎖λ
鎖を用いて構築した。

【０１３４】(6) ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立 キメラ抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発現
プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。す
なわちキメラ抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ細胞
用発現プラスミドＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とＭＢＣ１Ｌ
（λ）／ｎｅｏまたはＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とＭＢＣ
１Ｌ（κ）／ｎｅｏの組み合わせで、ＧｅｎｅＰｕｌｓ
ｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーシ
ョンによりＣＨＯ細胞に同時形質導入した。それぞれの
発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断して直鎖DNAに
し、フェノールおよびクロロホルム抽出後、エタノール
沈殿でDNAを回収してエレクトロポレーションに用い
た。ＰＢＳ（−）中に１×10⁷細胞／ｍｌの細胞濃度で
懸濁されているＣＨＯ細胞0.8ml に、各プラスミドDNA
10μｇを加え、1,500 Ｖ，25μＦの静電容量にてパルス
を与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エレクト
ロポレーション処理された細胞を１０％ウシ胎児血清
（ＧＩＢＣＯ）を添加したＭＥＭ−α培地（ＧＩＢＣ
Ｏ）に懸濁し、３枚の９６穴プレート（Ｆａｌｃｏｎ）
を用いてCO₂インキュベーターにて培養した。培養開始
翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）および５０
０ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ４１８Ｓｕｌｆ
ａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレオシドおよびデ
オキリボヌクレオシド不含ＭＥＭーα培地（ＧＩＢＣ
Ｏ）の選択培地を交換し、抗体遺伝子の導入された細胞
を選択した。選択培地交換後、２週間前後に顕微鏡下で
細胞を観察し、順調な細胞増殖が認められた後に、上記
抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量を測定し、抗体
産生量の多い細胞を選別した。

【０１３５】樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡
大し、ローラーボトルにて２％のUltra Low IgGウシ胎
児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキリボヌクレ
オシド不含ＭＥＭ培地を用いて、大量培養を行った。培
養３ないし４日目に培養上清を回収し、0.2μmのフィル
ター（Millipore）により細胞破片を除去した。ＣＨＯ
細胞の培養上清からのキメラ抗体の精製は、POROSプロ
テインAカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓ
ｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐ ＬＣ１００（Mill
ipore）にて添付の処方に従って行い、中和活性の測定
および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験に供し
た。得られた精製キメラ抗体の濃度および抗原結合活性
は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。

【０１３６】〔参考例４〕ヒト型化抗体の構築 (1) ヒト型化抗体Ｈ鎖の構築 (i) ヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域の構築 ヒト型化#23-57-137-1抗体Ｈ鎖を、PCR法によるＣＤＲ
−グラフティングにより作製した。ヒト抗体S31679（Ｎ
ＢＲＦ−ＰＤＢ、Ｃｕｉｓｉｎｉｅｒ Ａ．Ｍ．ら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１１０−１１８，
１９９３）由来のＦＲを有するヒト型化#23-57-137-1抗
体Ｈ鎖（バージョン"ａ"）の作製のために６個のPCRプ
ライマーを使用した。ＣＤＲ−グラフティングプライマ
ーＭＢＣ１ＨＧＰ１（配列番号２３）及びＭＢＣ１ＨＧ
Ｐ３（配列番号２４）はセンスDNA配列を有し、そして
ＣＤＲグラフティングプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ２（配
列番号２５）及びＭＢＣ１ＨＧＰ４（配列番号２６）は
アンチセンスDNA配列を有し、そしてそれぞれプライマ
ーの両端に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外
部プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ１（配列番号２７）及びＭ
ＢＣ１ＨＶＲ１（配列番号２８）はＣＤＲグラフティン
グプライマーＭＢＣ１ＨＧＰ１及びＭＢＣ１ＨＧＰ４と
ホモロジーを有する。

【０１３７】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ
１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３およ
びＭＢＣ１ＨＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲル
を用いて分離し（Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, 1989)、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ ａｎｄｓｏ
ａｋ法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sa
mbrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
9)にて行った。

【０１３８】すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤＲ
−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリルア
ミドゲルで分離し、目的の大きさのDNA断片の同定をシ
リカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓｈ
ａｎｄ ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥＤ
ＴＡ溶液に溶解した。PCRは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔ
ａｑ（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記
の様に調製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢ
Ｃ１ＨＧＰ１、ＭＢＣ１ＨＧＰ２、ＭＢＣ１ＨＧＰ３お
よびＭＢＣ１ＨＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭ
のｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａＫａＲａＥｘ Ｔａｑを含
む条件で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５
℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回
行い、さらに５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢＣ１
ＨＶＳ１及びＭＢＣ１ＨＶＲ１を加え、同じ温度サイク
ルを３０回行った。PCR法により増幅したDNA断片を４％
Ｎｕ ＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動に
より分離した。

【０１３９】４２１ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロ
ース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（Ｂ
ＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片
を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた
後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたPCR反
応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する
ことにより調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、
塩基配列を決定した。正しい配列を有するプラスミドを
ｈＭＢＣＨｖ／ｐＵＣ１９と命名した。

【０１４０】（ii) ヒト型化Ｈ鎖ｃDNAのためのＨ鎖Ｖ
領域の構築 ヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１のｃDNAと連結するために、上記
のようにして構築したヒト型化Ｈ鎖Ｖ領域をPCR法によ
り修飾した。後方プライマーＭＢＣ１ＨＶＳ２はＶ領域
のリーダー配列の５'−側をコードする配列とハイブリ
ダイズし、且つＫｏｚａｋコンセンサス配列（Ｋｏｚａ
ｋ，Ｍ，ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７−
９５０，１９８７）、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ
認識配列を有するように設計した。Ｈ鎖Ｖ領域のための
前方プライマーＭＢＣ１ＨＶＲ２はＪ領域の３'−側を
コードするDNA配列にハイブリダイズし且つＣ領域の５'
−側の配列をコードしＡｐａＩおよびＳｍａＩ認識配列
を有するように設計した。

【０１４１】PCRはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒
造）を用い、鋳型DNAとして０．４μｇのｈＭＢＣＨｖ
／ｐＵＣ１９を用い、プライマーとしてＭＢＣ１ＨＶＳ
２およびＭＢＣ１ＨＶＲ２をそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、
２．５ＵのＴａＫａＲａ ＥｘＴａｑ、０．２５ｍＭの
ｄＮＴＰを含む条件で添付緩衝液を使用し、９４℃にて
１分間、５５℃にて１分間、７２℃にて１分間の温度サ
イクルで３０回行った。PCR法により増幅したDNA断片を
３％ＮｕＳｉｅｖｅＧＴＧアガロース（ＦＭＣＢｉｏ．
Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロースゲル電気泳動に
より分離した。

【０１４２】４５６ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロ
ース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（Ｂ
ＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片
を精製した。精製したDNAをエタノールで沈殿させた
後、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに溶解した。得られたPCR反
応混合物をＥｃｏＲＩおよびＳｍａＩで消化することで
調製したｐＵＣ１９にサブクローニングし、塩基配列を
決定した。こうして得られたハイブリドーマ#23-57-137
-1に由来するマウスＨ鎖Ｖ領域をコードする遺伝子を含
有し、５'−側にＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識
配列及びＫｏｚａｋ配列、３'−側にＡｐａＩおよびＳ
ｍａＩ認識配列を持つプラスミドをｈＭＢＣ１Ｈｖ／ｐ
ＵＣ１９と命名した。

【０１４３】（２）ヒト型化抗体Ｈ鎖の発現ベクターの
構築 ｈＰＭ１抗体Ｈ鎖ｃDNAの配列を含むプラスミドＲＶｈ
−ＰＭ１ｆ−ｃDNAをＡｐａＩおよびＢａｍＨＩにて消
化し、Ｈ鎖Ｃ領域を含むDNA断片を回収し、ＡｐａＩお
よびＢａｍＨＩで消化することにより調製したｈＭＢＣ
１Ｈｖ／ｐＵＣ１９に導入した。こうして作製したプラ
スミドをｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９と命名した。
このプラスミドはヒト型化#23-57-137-1抗体のＨ鎖Ｖ領
域及びヒトＨ鎖Ｃ領域Ｃγ１を含み、５'-末端にＥｃｏ
ＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識配列、３'-末端にＢａｍ
ＨＩ認識配列を持つ。プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDNA／
ｐＵＣ１９に含まれるヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"の塩
基配列および対応するアミノ酸配列を配列番号５８に示
す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号５６
に示す。

【０１４４】ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９をＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、得られたＨ鎖配列を含
むDNA断片をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化するこ
とにより調製した発現プラスミドpCOS1に導入した。こ
うして得られたヒト型化抗体の発現プラスミドをｈMBC1
HcDNA/pCOS1と命名した。さらにＣＨＯ細胞での発現に
用いるためのプラスミドを作製するためｈＭＢＣ１Ｈｃ
DNA／ｐＵＣ１９をＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化
し、得られたＨ鎖配列を含むDNA断片をＥｃｏＲＩおよ
びＢａｍＨＩで消化することにより調製した発現プラス
ミドpCHO1に導入した。こうして得られたヒト型化抗体
の発現プラスミドをｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1と命名し
た。

【０１４５】（３）Ｌ鎖ハイブリッド可変領域の構築 (i) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体の作製 ヒト型化抗体とマウス（キメラ）抗体のＦＲ領域を組み
換えたＬ鎖遺伝子を構築し、ヒト型化のための各領域の
評価を行った。ＣＤＲ２内にある制限酵素ＡｆｌＩＩ切
断部位を利用することによって、ＦＲ１及び２はヒト抗
体由来、ＦＲ３及び４はマウス抗体由来とするハイブリ
ッド抗体を作製した。プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎ
ｅｏ及びｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ各１０μｇを１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭ MgC
l₂，１ｍＭＤＴＴ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ
／ｖ）ＢＳＡ，ＡｆｌＩＩ（宝酒造）１０Ｕを含有する
反応混合液１００μｌ中で３７℃にて１時間消化した。
反応液を２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラ
スミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２８２ｂｐの断
片（ｃ１とする）および１０２２ｂｐの断片（ｃ２とす
る）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから６２
８２ｂｐの断片（ｈ１とする）および１０２２ｂｐの断
片（ｈ２とする）を、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ
（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回収、精製した。

【０１４６】回収したｃ１、ｈ１断片各１μｇについて
ＢＡＰ処理を行った。DNAをフェノールおよびクロロホ
ルムで抽出、エタノール沈殿で回収した後、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶
液１０μｌに溶解した。ＢＡＰ処理したｃ１及びｈ１断
片１μｌをそれぞれｈ２、ｃ２断片４μｌに連結し（４
℃、一夜）、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質
転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×
ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ
ＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い
てプラスミドを精製した。

【０１４７】精製したプラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭMgCl₂ ，１ｍＭＤＴ
Ｔ，ＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕ、またはＢａｍＨＩ（宝
酒造）８Ｕ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕを含有する
反応混合液２０μｌ中で３７℃、１時間消化した。ｃ１
-ｈ２が正しく連結されていれば、ＡｐａＬＩで５５６
０／１２４６／４９８ｂｐ、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ
Ｉで７１３４／２６９ｂｐの消化断片が生じることによ
り、プラスミドの確認を行った。

【０１４８】これをヒトＦＲ１，２／マウスＦＲ３，４
ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｈ／
ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。一方、ｈ１-ｃ２
のクローンが得られなかったので、ｐＵＣベクター上で
組換えてからＨＥＦベクターにクローニングした。その
際、アミノ酸置換のないヒト型化抗体Ｌ鎖Ｖ領域を含む
プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、及びＦＲ３
内の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７
位）のチロシンをイソロイシンに置換したヒト型化抗体
Ｌ鎖Ｖ領域を含むプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ
１９を鋳型として用いた。

【０１４９】プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１
９、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９及びｈＭＢＣ１Ｌｄ
λ／ｐＵＣ１９の各１０μｇを１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５），１０ｍＭＭｇＣｌ₂，１ｍＭＤＴ
Ｔ，５０ｍＭＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，
ＨｉｎｄＩＩＩ１６Ｕ，ＡｆｌＩＩ４Ｕを含有する反応
混合液３０μｌ中で３７℃、１時間消化した。反応液を
２％低融点アガロースゲルで電気泳動し、プラスミドＭ
ＢＣ１Ｌ（λ）／ｐＵＣ１９から２１５ｂｐ（ｃ
２'）、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およ
びｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９からそれぞれ３２１８
ｂｐ（ｈａ１'，ｈｄ１'）のDNA断片をＧＥＮＥＣＬＥ
ＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用いてゲルから回
収、精製した。

【０１５０】ｈａ１'、ｈｄ１'断片をそれぞれｃ２'断
片に連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質
転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する２×
ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分からＱＩＡｐｒｅｐ
ＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い
てプラスミドを精製した。これらをそれぞれプラスミド
ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌ
ｄλ／ｐＵＣ１９とした。得られたプラスミドｍ／ｈＭ
ＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９，ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｐ
ＵＣ１９をＥｃｏＲＩで消化した。それぞれ７４３ｂｐ
のDNA断片を２％低融点アガロースゲルで電気泳動した
後、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩＫｉｔ（ＢＩＯ１０１）を
用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶液２０μｌに
溶解した。

【０１５１】各DNA断片４μｌを前述のＢＡＰ処理した
ＨＥＦベクター１μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コン
ピテント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシ
リンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分
からＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（Ｑ
ＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。精製した
各プラスミドを、２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．
５），１０ｍＭ MgCl₂，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭＫＣ
ｌ，ＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造）８Ｕ，ＰｖｕＩ（宝酒
造）２Ｕを含有する反応混合液２０μｌ中で３７℃にて
１時間消化した。断片が正しい方向に挿入されていれば
５１０４／２１９５ｂｐ、逆方向に挿入されていれば４
３７８／２９２６ｂｐの消化断片が生じることより、プ
ラスミドの確認を行った。これらをそれぞれマウスＦＲ
１，２／ヒトＦＲ３，４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコード
する発現ベクターをｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅｏ、ｍ
／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅｏとした。

【０１５２】(ii)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体の作
製 ＣＤＲ１内にあるＳｎａＢＩ切断部位を利用することに
よって、同様にＦＲ１とＦＲ２のハイブリッド抗体を作
製した。プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ及びｈ／
ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏの各１０μｇを１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９），１０ｍＭ MgCl₂，１
ｍＭ ＤＴＴ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．０１％（ｗ／
ｖ）ＢＳＡ，ＳｎａＢＩ（宝酒造）６Ｕを含有する反応
混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。次に２
０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５），１０ｍＭ MgC
l₂，１ｍＭＤＴＴ，１００ｍＭ ＫＣｌ，０．０１％
（ｗ／ｖ）ＢＳＡ，ＰｖｕＩ６Ｕを含有する反応混合液
５０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。

【０１５３】反応液を１．５％低融点アガロースゲルで
電気泳動した後、プラスミドＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏ
から４９５５ｂｐ（ｍ１）および２３４９ｂｐ（ｍ
２）、プラスミドｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏから
４９５５ｂｐ（ｈｍ１）および２３４９ｂｐ（ｈｍ２）
の各DNA断片をＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩ
Ｏ１０１）を用いてゲルから回収、精製し、１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭ ＥＤＴＡ溶
液４０μｌに溶解した。

【０１５４】ｍ１、ｈｍ１断片１μｌをそれぞれｈｍ
２、ｍ２断片４μｌに連結し、大腸菌ＪＭ１０９コンピ
テント細胞に形質転換した。５０μｇ／ｍｌアンピシリ
ンを含有する２×ＹＴ培地２ｍｌで培養し、菌体画分か
らＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＰｌａｓｍｉｄＫｉｔ（ＱＩ
ＡＧＥＮ）を用いてプラスミドを精製した。精製した各
プラスミドを、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５），１０ｍＭ MgCl₂，１ｍＭＤＴＴ，ＡｐａＩ（宝酒
造）８Ｕ、またはＡｐａＬＩ（宝酒造）２Ｕを含有する
反応混合液２０μｌ中で３７℃にて１時間消化した。

【０１５５】各断片が正しく連結されていれば、Ａｐａ
Ｉで７３０４ｂｐ、ＡｐａＬＩで５５６０／１２４６／
４９８ｂｐ（ｍ１-ｈｍ２）、ＡｐａＩで６５３８／７
６６ｂｐ、ＡｐａＬＩで３５３５／２０２５／１２４６
／４９８ｂｐ（ｈｍ１-ｍ２）の消化断片が生じること
により、プラスミドの確認を行った。これらをそれぞれ
ヒトＦＲ１／マウスＦＲ２，３，４ハイブリッド抗体Ｌ
鎖をコードする発現ベクターをｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）
／ｎｅｏ、マウスＦＲ１／ヒトＦＲ２／マウスＦＲ３，
４ハイブリッド抗体Ｌ鎖をコードする発現ベクターをｍ
ｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅｏとした。

【０１５６】（４）ヒト型化抗体Ｌ鎖の構築 ヒト型化#23-57-137-1抗体Ｌ鎖を、PCR法によるＣＤＲ
−グラフティングにより作製した。ヒト抗体ＨＳＵ０３
８６８（ＧＥＮ-ＢＡＮＫ、Ｄｅｆｔｏｓ Ｍら，Ｓｃ
ａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３９，９５−１０３，
１９９４）由来のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、並びに
ヒト抗体Ｓ２５７５５（ＮＢＲＦ-ＰＤＢ）由来のＦＲ
４を有するヒト型化#23-57-137-1抗体Ｌ鎖（バージョ
ン"ａ"）の作製のために６個のPCRプライマーを使用し
た。

【０１５７】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ
１ＬＧＰ１（配列番号２９）及びＭＢＣ１ＬＧＰ３（配
列番号３０）はセンスDNA配列を有し、そしてＣＤＲグ
ラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧＰ２（配列番号３
１）及びＭＢＣ１ＬＧＰ４（配列番号３２）はアンチセ
ンスDNA配列を有し、そしてそれぞれプライマーの両端
に１５から２１ｂｐの相補的配列を有する。外部プライ
マーＭＢＣ１ＬＶＳ１（配列番号３３）及びＭＢＣ１Ｌ
ＶＲ１（配列番号３４）はＣＤＲグラフティングプライ
マーＭＢＣ１ＬＧＰ１及びＭＢＣ１ＬＧＰ４とホモロジ
ーを有する。

【０１５８】ＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ
１ＬＧＰ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およ
びＭＢＣ１ＬＧＰ４は尿素変性ポリアクリルアミドゲル
を用いて分離し（Molecular Cloning: A Laboratory Ma
nual, Sambrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Pr
ess, 1989)、ゲルからの抽出はｃｒｕｓｈ ａｎｄｓｏ
ａｋ法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sa
mbrookら, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 198
9)にて行った。すなわち、それぞれ１ｎｍｏｌｅのＣＤ
Ｒ−グラフティングプライマーを６％変性ポリアクリル
アミドゲルで分離し、目的の大きさのDNA断片の同定を
シリカゲル薄層板上で紫外線を照射して行い、ｃｒｕｓ
ｈ ａｎｄ ｓｏａｋ法にてゲルから回収し２０μｌの
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１ｍＭＥ
ＤＴＡ溶液に溶解した。

【０１５９】PCRは、ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝
酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に上記の様に調
製したＣＤＲ−グラフティングプライマーＭＢＣ１ＬＧ
Ｐ１、ＭＢＣ１ＬＧＰ２、ＭＢＣ１ＬＧＰ３およびＭＢ
Ｃ１ＬＧＰ４をそれぞれ１μｌ、０．２５ｍＭのｄＮＴ
Ｐ、２．５ＵのＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを含む条件
で添付緩衝液を使用して９４℃にて１分間、５５℃にて
１分間、７２℃にて１分間の温度サイクルで５回行い、
この反応混合液に５０ｐｍｏｌｅの外部プライマーＭＢ
Ｃ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１ＬＶＲ１を加え、さらに同じ
温度サイクルで３０回反応させた。PCR法により増幅し
たDNA断片を３％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴＧアガロース
（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を用いたアガロ
ースゲル電気泳動により分離した。

【０１６０】４２１ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロ
ース片を切取り、ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（Ｂ
ＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA断片
を精製した。得られたPCR反応混合物をＢａｍＨＩおよ
びＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐＵＣ
１９にサブクローニングし、塩基配列を決定した。こう
して得られたプラスミドをｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１９と命
名した。しかしながらＣＤＲ４の１０４位（Ｋａｂａｔ
の規定によるアミノ酸番号９６位）のアミノ酸がアルギ
ニンになっていたため、これをチロシンに修正するため
の修正プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１０Ｒ（配列番号３
５）を設計し、合成した。PCRはＴａＫａＲａ Ｔａｑ
（宝酒造）を用い、１００μｌの反応混合液に鋳型DNA
として０．６μｇのプラスミドｈＭＢＣＬ／ｐＵＣ１
９、プライマーとしてＭＢＣ１ＬＶＳ１及びＭＢＣ１Ｌ
ＧＰ１０Ｒをそれぞれ５０ｐｍｏｌｅ、２．５ＵのＴａ
ＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（宝酒造）０．２５ｍＭのｄＮ
ＴＰを含む条件で添付の緩衝液を使用して５０μｌの鉱
油を上層して９４℃にて１分間、５５℃にて１分間、７
２℃にて１分間の温度サイクルで３０回行った。PCR法
により増幅したDNA断片を３％Ｎｕ Ｓｉｅｖｅ ＧＴ
Ｇアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏ．Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を
用いたアガロースゲル電気泳動により分離した。４２１
ｂｐ長のDNA断片を含有するアガロース片を切取り、Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ（ＢＩＯ１０１）を用
い、キット添付の処方に従いDNA断片を精製した。得ら
れたPCR反応混合物をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ
で消化することにより調製したｐＵＣ１９にサブクロー
ニングした。

【０１６１】Ｍ１３ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４プライマー及
びＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶプライマーを用いて塩基
配列を決定した結果、正しい配列を得ることができたの
で、このプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで
消化し、４１６ｂｐの断片を１％アガロースゲル電気泳
動により分離した。ＧＥＮＥＣＬＥＡＮＩＩ Ｋｉｔ
（ＢＩＯ１０１）を用い、キット添付の処方に従いDNA
断片を精製した。得られたPCR反応混合物をＨｉｎｄＩ
ＩＩおよびＢｌｎＩで消化することにより調製したプラ
スミドＣλ／ｐＵＣ１９に導入し、プラスミドｈＭＢＣ
１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と命名した。このプラスミドをＥ
ｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む
配列をプラスミドpCOS1に導入し、ＥＦ１αプロモータ
ーの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するように
した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌａλ
／pCOS1と命名した。ヒト型化Ｌ鎖バージョン"ａ"の塩
基配列（対応するアミノ酸を含む）を配列番号66に示
す。また、バージョンａのアミノ酸配列を配列番号47に
示す。

【０１６２】バージョン"ｂ"をPCR法による変異導入を
用いて作製した。バージョン"ｂ"では４３位（Ｋａｂａ
ｔの規定によるアミノ酸番号４３位）のグリシンをプロ
リンに、４９位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号
４９位）のリジンをアスパラギン酸に変更するように設
計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ５Ｒ（配列番
号３６）とプライマーＭＢＣ１ＬＶＳ１によりプラスミ
ドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行
い、得られたDNA断片をＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉで消化し、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ
部位にサブクローニングした。塩基配列決定後、制限酵
素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化し、Ｈｉｎｄ
ＩＩＩおよびＡｆｌＩＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／
ｐＵＣ１９と連結した。こうして得られたプラスミドを
ｈＭＢＣ１Ｌｂλ／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドを
ＥｃｏＲＩで消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードするDNAを
含む断片をプラスミドpCOS1に導入し、ＥＦ１αプロモ
ーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するよ
うにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌ
ｂλ／pCOS1と命名した。

【０１６３】バージョン"ｃ"をPCR法による変異導入を
用いて作製した。バージョン"ｃ"では８４位（Ｋａｂａ
ｔの規定によるアミノ酸番号８０位）のセリンをプロリ
ンに変更するように設計した。変異原プライマーＭＢＣ
１ＬＧＰ６Ｓ（配列番号３７）とプライマーＭ１３ Ｐ
ｒｉｍｅｒ ＲＶによりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／
ｐＵＣ１９を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片を
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐ
ＵＣ１９にサブクローニングした。

【０１６４】塩基配列決定後、制限酵素ＢｓｔＰＩおよ
びＡｏｒ５１ＨＩで消化し、ＢｓｔＰＩおよびＡｏｒ５
１ＨＩで消化したｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９と連結
した。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１Ｌｃλ
／ｐＵＣ１９とし、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲ
Ｉ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列を
プラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１α
プロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置
するようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢ
Ｃ１Ｌｃλ／pCOS1と命名した。

【０１６５】バージョン"ｄ" 、"ｅ" 及び"ｆ" をPCR法
による変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順
に"ａ" 、"ｂ" 、"ｃ" バージョンの９１位（Ｋａｂａ
ｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチロシンをイソ
ロイシンに変更するように設計した。変異原プライマー
ＭＢＣ１ＬＧＰ１１Ｒ（配列番号３８）とプライマーＭ
-Ｓ１（配列番号４４）によりそれぞれｈＭＢＣ１Ｌａ
λ／pCOS1，ｈＭＢＣ１Ｌｂλ／pCOS1，ｈＭＢＣ１Ｌｃ
λ／pCOS1を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片を
ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＢａｍＨＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩで消化することにより調製したｐ
ＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定後、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ
およびＢｌｎＩで消化することより調製したＣλ／ｐＵ
Ｃ１９と連結した。

【０１６６】こうして得られたプラスミドを順にｈＭＢ
Ｃ１Ｌｄλ／ｐＵＣ１９、ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／ｐＵＣ１
９、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／ｐＵＣ１９とした。これらのプ
ラスミドをＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードす
る配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位
に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流にヒト型化Ｌ鎖
の開始コドンが位置するようにした。こうして得られた
プラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｄλ／pCOS1、
ｈＭＢＣ１Ｌｅλ／pCOS1、ｈＭＢＣ１Ｌｆλ／pCOS1と
命名した。

【０１６７】バージョン"ｇ" 及び"ｈ" をPCR法による
変異導入を用いて作製した。各バージョンとも順に"ａ"
、"ｄ" バージョンの３６位（Ｋａｂａｔの規定による
アミノ酸番号３６位）のヒスチジンをチロシンに変更す
るように設計した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ９
Ｒ（配列番号３９）およびＭ１３ Ｐｒｉｍｅｒ ＲＶ
をプライマーとして用いて、ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ
１９を鋳型としてPCRを行い、得られたPCR産物とＭ１３
Ｐｒｉｍｅｒ Ｍ４をプライマーとして用いて、プラ
スミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９を鋳型としてさら
にPCRを行った。得られたDNA断片をＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＢｌｎＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｌｎＩで
消化することで調製したプラスミドＣλ／ｐＵＣ１９に
サブクローニングした。このプラスミドを鋳型として、
プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１３Ｒ（配列番号４０）とＭ
ＢＣ１ＬＶＳ１をプライマーとしたPCRを行った。得ら
れたPCR断片をＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩでＩ消化
し、ＡｐａＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したプラスミ
ドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｄ
λ／ｐＵＣ１９に導入した。塩基配列を決定し、正しい
配列を含むプラスミドを順にｈＭＢＣ１Ｌｇλ／ｐＵＣ
１９およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／ｐＵＣ１９とし、これら
のプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩ消化し、ヒト型化Ｌ
鎖をコードする配列を含む配列をプラスミドpCOS1のＥ
ｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロモーターの下流に
ヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置するようにした。こう
して得られたプラスミドをそれぞれ順にｈＭＢＣ１Ｌｇ
λ／pCOS1およびｈＭＢＣ１Ｌｈλ／pCOS1と命名した。

【０１６８】バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｋ" 、"ｌ"
、"ｍ" 、"ｎ" および"ｏ" をPCR法による変異導入を
用いて作製した。変異原プライマーＭＢＣ１ＬＧＰ１４
Ｓ（配列番号４１）とプライマーＶｌＲＶ（λ）（配列
番号４３）によりプラスミドｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｐＵＣ
１９を鋳型としてPCRを行い、得られたDNA断片をＡｐａ
ＩおよびＢｌｎＩで消化し、ＡｐａＩおよびＢｌｎＩで
消化することにより調製したプラスミドｈＭＢＣ１Ｌｇ
λ／ｐＵＣ１９にサブクローニングした。塩基配列決定
を行い、それぞれのバージョンに対応した変異が導入さ
れたクローンを選択した。こうして得られたプラスミド
をｈＭＢＣ１Ｌｘλ／ｐＵＣ１９（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，
ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）とし、このプラスミドをＥｃｏＲＩ消
化し、ヒト型化Ｌ鎖をコードする配列を含む配列をプラ
スミドpCOS1のＥｃｏＲＩ部位に導入し、ＥＦ１αプロ
モーターの下流にヒト型化Ｌ鎖の開始コドンが位置する
ようにした。こうして得られたプラスミドをｈＭＢＣ１
Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ｉ，ｊ，ｋ，ｌ，ｍ，ｎ，ｏ）と
命名した。バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、"ｍ" および"ｏ"
の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそれぞれ配列
番号67、68、69、70に示す。また、これらの各バージョ
ンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号48、49、50、51に
示す。

【０１６９】バージョン"ｐ" 、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" お
よび"ｔ" は、バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ"
または"ｏ" のアミノ酸配列の８７位のチロシンをイソ
ロイシンに置換したバージョンであり、ＦＲ３内にある
制限酵素Ａｏｒ５１ＭＩ切断部位を利用して、バージョ
ン"ｈ" を、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ"ま
たは"ｏ" とつなぎ換えることにより作製したものであ
る。すなわち、発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS
1（ｘ＝ｉ，ｊ，ｍ，ｌ，ｏ）中、ＣＤＲ３並びにＦＲ
３の一部及びＦＲ４を含むＡｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂ
ｐを除き、ここに発現プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｈλ／pC
OS1中、ＣＤＲ３並びにＦＲ３の一部及びＦＲ４を含む
Ａｏｒ５１ＨＩ断片５１４ｂｐをつなぐことにより９１
位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番号８７位）のチ
ロシンがイソロイシンとなるようにした。塩基配列決定
を行い、各バージョン"ｉ" 、"ｊ" 、"ｍ" 、"ｌ" およ
び"ｏ" の９１位（Ｋａｂａｔの規定によるアミノ酸番
号８７位）のチロシンがイソロイシンに置換されたクロ
ーンを選択し、対応するバージョンをそれぞれ"ｐ"、"
ｑ" 、"ｓ" 、"ｒ" および"ｔ" とし、得られたプラス
ミドをｈＭＢＣ１Ｌｘλ／pCOS1（ｘ＝ｐ，ｑ，ｓ，
ｒ，ｔ）と命名した。バージョン"ｑ" 、"ｒ"、"ｓ" お
よび"ｔ" の塩基配列（対応するアミノ酸を含む）をそ
れぞれ配列番号71、72、73、74に示す。また、これらの
各バージョンのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号52、5
3、54、55に示す。

【０１７０】プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／pCOS1をＨ
ｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩ
ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＵＣ１９に
サブクローニングし、プラスミドｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐ
ＵＣ１９と命名した。ヒト型化Ｌ鎖の各バージョンにお
ける置換アミノ酸の位置を表２に示す。

【０１７１】

【表２】

【０１７２】表中、Ｙはチロシン、Ｐはプロリン、Ｋは
リジン、Ｖはバリン、Ｄはアスパラギン酸、Ｉはイソロ
イシンを示す。なお、前記プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDN
A／ｐＵＣ１９およびｈＭＢＣ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９を
有する大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｊ
Ｍ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１９）および
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢ
Ｃ１Ｌｑλ／ｐＵＣ１９）として、工業技術院生命工学
工業技術研究所（茨城県つくば市東１丁目１番３号）
に、平成８年８月１５日に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１ＨｃDNA／ｐＵＣ１
９）についてはＦＥＲＭ ＢＰ−５６２９、Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９（ｈＭＢＣ１Ｌｑ
λ／ｐＵＣ１９）についてはＦＥＲＭ ＢＰ−５６３０
としてブダペスト条約に基づき国際寄託されている。

【０１７３】（５）ＣＯＳ−７細胞へのトランスフェク
ション ハイブリッド抗体およびヒト型化#23-57-137-1抗体の抗
原結合活性および中和活性を評価するため、前記発現プ
ラスミドをＣＯＳ−７細胞で一過性に発現させた。すな
わちＬ鎖ハイブリッド抗体の一過性発現では、プラスミ
ドｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎｅ
ｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλ／ｎｅ
ｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍ／ｈＭＢＣ１Ｌｄλ／ｎｅ
ｏ、ｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）／ｎ
ｅｏ、またはｈMBC1HcDNA/pCOS1とｍｈｍＭＢＣ１Ｌ
（λ）／ｎｅｏとの組み合わせを、ＧｅｎｅＰｕｌｓｅ
ｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレクトロポレーショ
ンによりＣＯＳ−７細胞に同時形質導入した。ＰＢＳ
（−）中に１×10⁷細胞／ｍｌの細胞濃度で懸濁されて
いるＣＯＳ−７細胞０．８ｍｌに、各プラスミドDNA１
０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５μＦの静電容量にて
パルスを与えた。室温にて１０分間の回復期間の後、エ
レクトロポレーション処理された細胞を２％のUltra Lo
w IgGウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含有するＤＭＥＭ
培養液（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、１０ｃｍ培養皿を用い
てＣＯ₂ インキュベーターにて培養した。７２時間の培
養の後、培養上清を集め、遠心分離により細胞破片を除
去し、ＥＬＩＳＡの試料に供した。

【０１７４】ヒト型化#23-57-137-1抗体の一過性発現で
は、プラスミドｈMBC1HcDNA/pCOS1とｈＭＢＣ１Ｌｘλ
／pCOS1（ｘ＝ａ〜ｔ）のいずれかの組み合わせをＧｅ
ｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、前記
ハイブリッド抗体の場合と同様の方法によりＣＯＳ−７
細胞にトランスフェクションし、得られた培養上清をＥ
ＬＩＳＡに供した。また、ＣＯＳ−７細胞の培養上清か
らのハイブリッド抗体またはヒト型化抗体の精製は、Ａ
ｆｆｉＧｅｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ＭＡＰＳＩＩキッ
ト（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、キット添付の処方に従っ
て行った。

【０１７５】（６）ＥＬＩＳＡ (i) 抗体濃度の測定 抗体濃度測定のためのＥＬＩＳＡプレートを次のように
して調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレート（Ｍａｘｉ
ｓｏｒｐ，ＮＵＮＣ）の各穴を固相化バッファー（０．
１Ｍ ＮａＨＣＯ₃ 、０．０２％ ＮａＮ₃ ）で１μｇ
／ｍｌの濃度に調製したヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧ
Ｏ）１００μｌで固相化し、２００μｌの希釈バッファ
ー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、０．１Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２
０、０．０２％ ＮａＮ₃ 、１％ 牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）、ｐＨ７．２）でブロッキングの後、ハイブ
リッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳ−７
細胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒ
ト型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。１時間室温に
てインキュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、
アルカリフォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体
（ＴＡＧＯ）１００μｌを加えた。１時間室温にてイン
キュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍ
ｇ／ｍｌの基質溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフ
ェニルリン酸、ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍで
の吸光度をマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）
で測定した。濃度測定のスタンダードとして、Ｈｕ Ｉ
ｇＧ１λ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ（ＴｈｅＢｉｎｄｉｎｇ
Ｓｉｔｅ）を用いた。

【０１７６】(ii)抗原結合能の測定 抗原結合測定のためのＥＬＩＳＡプレートを、次のよう
にして調製した。ＥＬＩＳＡ用９６穴プレートの各穴を
固相化バッファーで１μｇ／ｍｌの濃度に調製したヒト
ＰＴＨｒＰ（１−３４）１００μｌで固相化した。２０
０μｌの希釈バッファーでブロッキングの後、ハイブリ
ッド抗体またはヒト型化抗体を発現させたＣＯＳー７細
胞の培養上清あるいは精製ハイブリッド抗体またはヒト
型化抗体を段階希釈して各穴に加えた。室温にてインキ
ュベートしＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄後、アルカリ
フォスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴＡＧ
Ｏ）１００μｌを加えた。室温にてインキュベートしＰ
ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄の後、１ｍｇ／ｍｌの基質
溶液（Ｓｉｇｍａ１０４、ｐ−ニトロフェニルリン酸、
ＳＩＧＭＡ）を加え、次に４０５ｎｍでの吸光度をマイ
クロプレートリーダー（ＢｉｏＲａｄ）で測定した。

【０１７７】（７） 活性確認 (i) ヒト型化Ｈ鎖の評価 ヒト型化Ｈ鎖バージョン"ａ"とキメラＬ鎖を組み合わせ
た抗体は、キメラ抗体とＰＴＨｒＰ結合能が同等であっ
た（図６）。この結果は、Ｈ鎖Ｖ領域のヒト型化はバー
ジョン"ａ"で十分なことを示す。以下、ヒト型化Ｈ鎖バ
ージョン"ａ"をヒト型化抗体のＨ鎖として供した。

【０１７８】(ii)ハイブリッド抗体の活性 (ii-a) ＦＲ１，２／ＦＲ３，４ハイブリッド抗体 Ｌ鎖がｈ／ｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認め
られなかったが、ｍ／ｈＭＢＣ１Ｌａλあるいはｍ／ｈ
ＭＢＣ１Ｌｄλの場合はいずれもキメラ#23-57-137-1抗
体と同等の結合活性を示した（図７）。これらの結果
は、ＦＲ３，４はヒト型化抗体として問題ないが、ＦＲ
１，２内に置換すべきアミノ酸残基が存在することを示
唆する。 (ii-b)ＦＲ１／ＦＲ２ハイブリッド抗体 Ｌ鎖がｍｈｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合、活性は全く認め
られなかったが、ｈｍｍＭＢＣ１Ｌ（λ）の場合はキメ
ラ#23-57-137-1抗体と同等の結合活性を示した（図
８）。これらの結果は、ＦＲ１，２のうちＦＲ１はヒト
型化抗体として問題ないが、ＦＲ２内に置換すべきアミ
ノ酸残基が存在することを示唆する。

【０１７９】(iii) ヒト型化抗体の活性 Ｌ鎖としてバージョン"ａ" から"ｔ" の各々一つを用い
たヒト型化抗体について、抗原結合活性を測定した。そ
の結果、Ｌ鎖バージョン"ｊ" 、"ｌ" 、" ｍ"、"ｏ"
、"ｑ" 、"ｒ" 、"ｓ" 、"ｔ" を有するヒト型化抗体
はキメラ抗体と同等のＰＴＨｒＰ結合能を示した（図９
〜12）。

【０１８０】（８）ＣＨＯ安定産生細胞株の樹立 ヒト型化抗体の安定産生細胞株を樹立するため、前記発
現プラスミドをＣＨＯ細胞（ＤＸＢ１１）に導入した。
すなわちヒト型化抗体の安定産生細胞株樹立は、ＣＨＯ
細胞用発現プラスミドｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1とｈＭ
ＢＣ１Ｌｍλ／pCOS1またはｈＭＢＣ１ＨｃDNA／pCHO1
とｈＭＢＣ１Ｌｑλ／pCOS1あるいはｈＭＢＣ１ＨｃDNA
／pCHO1とｈＭＢＣ１Ｌｒλ／pCOS1の組み合わせで、Ｇ
ｅｎｅＰｕｌｓｅｒ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いてエレ
クトロポレーションによりＣＨＯ細胞に同時形質導入し
た。それぞれの発現ベクターを制限酵素ＰｖｕＩで切断
して直鎖DNAにし、フェノールおよびクロロホルム抽出
後、エタノール沈殿でDNAを回収し、エレクトロポレー
ションに用いた。ＰＢＳ（−）中に１×10⁷細胞／ｍｌ
の細胞濃度で懸濁されているＣＨＯ細胞０．８ｍｌに、
各プラスミドDNA１０μｇを加え、１，５００Ｖ，２５
μＦの静電容量にてパルスを与えた。室温にて１０分間
の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細
胞を１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ）添加、ＭＥＭ−
α培地（ＧＩＢＣＯ）に懸濁し、９６穴プレート（Ｆａ
ｌｃｏｎ）を用いてＣＯ₂ インキュベーターにて培養し
た。培養開始翌日に、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣ
Ｏ）および５００ｍｇ／ｍｌのＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（Ｇ
４１８Ｓｕｌｆａｔｅ、ＧＩＢＣＯ）添加、リボヌクレ
オシドおよびデオキシリボヌクレオシド不含ＭＥＭーα
培地（ＧＩＢＣＯ）の選択培地に交換し、抗体遺伝子の
導入された細胞を選択した。選択培地交換後、２週間前
後に顕微鏡下で細胞を観察し、順調な細胞増殖が認めら
れた後に、上記抗体濃度測定ＥＬＩＳＡにて抗体産生量
を測定し、抗体産生能の高い細胞を選別した。

【０１８１】樹立した抗体の安定産生細胞株の培養を拡
大し、ローラーボトルにて２％のUltra Low IgGウシ胎
児血清添加、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌク
レオシド不含ＭＥＭーα培地を用いて、大量培養を行っ
た。培養３ないし４日目に培養上清を回収し、0.2μmの
フィルター（Millipore）により細胞破片を除去した。
ＣＨＯ細胞の培養上清からのヒト型化抗体の精製は、PO
ROSプロテインAカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＣｏｎＳｅｐＬＣ１００
（Millipore）にて添付の処方に従って行い、中和活性
の測定および高カルシウム血症モデル動物での薬効試験
に供した。得られた精製ヒト型化抗体の濃度および抗原
結合活性は、上記ＥＬＩＳＡ系にて測定した。

【０１８２】〔参考例５〕中和活性の測定 マウス抗体、キメラ抗体およびヒト型化抗体の中和活性
の測定は、ラット骨肉腫細胞株ＲＯＳ１７／２．８-５
細胞を用いて行った。すなわち、ＲＯＳ１７／２．８-
５細胞を、１０％牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ）を含むＨａ
ｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）中にて、ＣＯ₂ インキ
ュベーターで培養した。ＲＯＳ１７／２．８-５細胞を
９６穴プレートに１０⁴ 細胞／１００μｌ／穴で蒔込み
１日間培養し、４ｍＭのヒドロコルチゾンと１０％牛胎
児血清を含むＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）に交
換する。さらに３ないし４日間培養した後、２６０μｌ
のＨａｍ'ＳＦ-１２培地（ＧＩＢＣＯ）にて洗浄し、１
ｍＭのイソブチル−１−メチルキサンチン（ＩＢＭＸ、
ＳＩＧＭＡ）および１０％の牛胎児血清と１０ｍＭのＨ
ＥＰＥＳを含む８０μｌのＨａｍ' ｓＦ-１２を加え、
３０分間３７℃でインキュベートした。

【０１８３】中和活性を測定するマウス抗体、キメラ抗
体またはヒト型化抗体を、あらかじめ１０μｇ／ｍｌ、
３．３μｇ／ｍｌ、１．１μｇ／ｍｌおよび０．３７μ
ｇ／ｍｌの群、１０μｇ／ｍｌ、２μｇ／ｍｌ、０．５
μｇ／ｍｌおよび０．０１μｇ／ｍｌの群、または１０
μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１．２５μｇ／ｍｌ、０．
６３μｇ／ｍｌおよび０．３１μｇ／ｍｌの群に段階希
釈し、４ｎｇ／ｍｌに調製したＰＴＨｒＰ（１−３４）
と等量混合し、各抗体とＰＴＨｒＰ（１−３４）の混合
液８０μｌを各穴に添加した。各抗体の最終濃度は、上
記抗体濃度の４分の１になり、ＰＴＨｒＰ（１−３４）
の濃度は、１ｎｇ／ｍｌになる。１０分間室温にて処理
した後、培養上清を捨て、ＰＢＳにて３回洗浄したした
後、１００μｌの０．３％塩酸９５％エタノールにて細
胞内のｃＡＭＰを抽出する。水流アスピレーターにて塩
酸エタノールを蒸発させ、ｃＡＭＰ ＥＩＡ ｋｉｔ
（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'Ｓ）付属のＥＩＡバ
ッファー１２０μｌを添加しｃＡＭＰを抽出後、ｃＡＭ
Ｐ ＥＩＡ ｋｉｔ（ＣＡＹＭＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬ'
Ｓ）添付の処方に従ってｃＡＭＰを測定した。その結
果、キメラ抗体と同等の抗原結合を有するＬ鎖バージョ
ンのうち、９１位のチロシンをイソロイシンに置換した
バージョン"ｑ"、"ｒ"、"ｓ"、"ｔ"を有するヒト型化抗
体がキメラ抗体に近い中和能を示し、その中でも、バー
ジョン"ｑ"がもっとも強い中和能を示した（図１３〜１
５）。

【０１８４】

【発明の効果】本発明により、副甲状腺ホルモン関連ペ
プチドとその受容体との結合を阻害する物質を有効成分
として含有する悪液質治療剤が提供される。上記物質
は、悪液質モデル動物での薬効試験において、体重減少
を対照と比較して抑制し、また、生存期間の延長効果も
奏することから、悪液質治療剤として有用である。

【０１８５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： AAATAGCCCT TGACCAGGCA 20

【０１８６】配列番号：２ 配列の長さ：３８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38

【０１８７】配列番号：３ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GGATCCCGGG CCAGTGGATA GACAGATG 28

【０１８８】配列番号：４ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GGATCCCGGG TCAGRGGAAG GTGGRAACA ２９

【０１８９】配列番号：５ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成ＤＮＡ） 配列： GTTTTCCCAG TCACGAC 17

【０１９０】配列番号：６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CAGGAAACAG CTATGAC 17

【０１９１】配列番号：７ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTCTAAGCTT CCACCATGAA ACTTCGGGCT C 31

【０１９２】配列番号：８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： TGTTGGATCC CTGCAGAGAC AGTGACCAGA 30

【０１９３】配列番号：９ 配列の長さ：３６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTCTGAATTC AAGCTTCCAC CATGGGGTTT GGGCTG 36

【０１９４】配列番号：１０ 配列の長さ：４１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： TTTCCCGGGC CCTTGGTGGA GGCTGAGGAG ACGGTGACCA G 41

【０１９５】配列番号：１１ 配列の長さ：１０９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCCCACGGTC ACCCTGTTCC 60 CGCCCTCCTC TGAGGAGCTC CAAGCCAACA AGGCCACACT AGTGTGTCT 109

【０１９６】配列番号：１２ 配列の長さ：１１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GGTTTGGTGG TCTCCACTCC CGCCTTGACG GGGCTGCCAT CTGCCTTCCA GGCCACTGTC 60 ACAGCTCCCG GGTAGAAGTC ACTGATCAGA CACACTAGTG TGGCCTTGTT 110

【０１９７】配列番号：１３ 配列の長さ：９８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GGAGTGGAGA CCACCAAACC CTCCAAACAG AGCAACAACA AGTACGCGGC CAGCAGCTAC 60 CTGAGCCTGA CGCCCGAGCA GTGGAAGTCC CACAGAAG 98

【０１９８】配列番号：１４ 配列の長さ：１０６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： TGTTGAATTC TTACTATGAA CATTCTGTAG GGGCCACTGT CTTCTCCACG GTGCTCCCTT 60 CATGCGTGAC CTGGCAGCTG TAGCTTCTGT GGGACTTCCA CTGCTC 106

【０１９９】配列番号：１５ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTA CTTGGCCAGC CCAAGGCCAA CCC 43

【０２００】配列番号：１６ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： TGTTGAATTC TTACTATGAA 20

【０２０１】配列番号：１７ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CAACAAGTAC GCGGCCAGCA GCTACCTGAG CCTGACGCC 39

【０２０２】配列番号：１８ 配列の長さ：３９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTAGCTGCTG GCCGCGTACT TGTTGTTGCT CTGTTTGGA 39

【０２０３】配列番号：１９ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTCTGAATTC AAGCTTAGTC CTAGGTCGAA CTGTGGCTGC ACCATC 46

【０２０４】配列番号：２０ 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： TGTTGAATTC TTACTAACAC TCTCCCCTGT TGAA 34

【０２０５】配列番号：２１ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTCTAAGCTT CCACCATGGC CTGGACTCCT CTCTT 35

【０２０６】配列番号：２２ 配列の長さ：４８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： TGTTGAATTC AGATCTAACT ACTTACCTAG GACAGTGACC TTGGTCCC 48

【０２０７】配列番号：２３ 配列の長さ：１２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG AGCTGGGTTT TCCTCGTTGC TCTTTTAAGA 60 GGTGTCCAGT GTCAGGTGCA GCTGGTGGAG TCTGGGGGAG GCGTGGTCCA GCCTGGGAGG 120 TCCCTGAG 128

【０２０８】配列番号：２４ 配列の長さ：１２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： ACCATTAGTA GTGGTGGTAG TTACACCTAC TATCCAGACA GTGTGAAGGG GCGATTCACC 60 ATCTCCAGAG ACAATTCCAA GAACACGCTG TATCTGCAAA TGAACAGCCT GAGAGCTGAG 120 GACAC 125

【０２０９】配列番号：２５ 配列の長さ：１３２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CTACCACCAC TACTAATGGT TGCCACCCAC TCCAGCCCCT TGCCTGGAGC CTGGCGGACC 60 CAAGACATGC CATAGCTACT GAAGGTGAAT CCAGAGGCTG CACAGGAGAG TCTCAGGGAC 120 CTCCCAGGCT GG 132

【０２１０】配列番号：２６ 配列の長さ：１１０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG GTTCCCTGGC CCCAGTAAGC AAAGTAAGTC 60 ATAGTAGTCT GTCTCGCACA GTAATACACA GCCGTGTCCT CAGCTCTCAG 110

【０２１１】配列番号：２７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GTCTAAGCTT CCACCATGGG GTTTGGGCTG 30

【０２１２】配列番号：２８ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： TGTTGGATCC CTGAGGAGAC GGTGACCAGG 30

【０２１３】配列番号：２９ 配列の長さ：１３３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： ACAAAGCTTC CACCATGGCC TGGACTCCTC TCTTCTTCTT CTTTGTTCTT CATTGCTCAG 60 GTTCTTTCTC CCAGCTTGTG CTGACTCAAT CGCCCTCTGC CTCTGCCTCC CTGGGAGCCT 120 CGGTCAAGCT CAC 133

【０２１４】配列番号：３０ 配列の長さ：１１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： AGCAAGATGG AAGCCACAGC ACAGGTGATG GGATTCCTGA TCGCTTCTCA GGCTCCAGCT 60 CTGGGGCTGA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGTC TGAGGATGAG GCTGACTA 118

【０２１５】配列番号：３１ 配列の長さ：１２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CTGTGGCTTC CATCTTGCTT AAGTTTCATC AAGTACCGAG GGCCCTTCTC TGGCTGCTGC 60 TGATGCCATT CAATGGTGTA CGTACTGTGC TGACTACTCA AGGTGCAGGT GAGCTTGACC 120 GAGGCTCC 128

【０２１６】配列番号：３２ 配列の長さ：１１４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CCCTCACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GTAATAGTCA GCCTCATCCT CAGA 114

【０２１７】配列番号：３３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： ACAAAGCTTC CACCATG 17

【０２１８】配列番号：３４ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CTTGGATCCG GGCTGACCT 19

【０２１９】配列番号：３５ 配列の長さ：７５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGT 75

【０２２０】配列番号：３６ 配列の長さ：４３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： AAAGGATCCT TAAGATCCAT CAAGTACCGA GGGGGCTTCT CTG 43

【０２２１】配列番号：３７ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： ACAAAGCTTA GCGCTACCTC ACCATCTCCA GCCTCCAGCC TGAGGA 46

【０２２２】配列番号：３８ 配列の長さ：１１１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CTTGGATCCG GGCTGACCTA GGACGGTCAG TTTGGTCCCT CCGCCGAACA CGTACACAAA 60 TTGTTCCTTA ATTGTATCAC CCACACCACA GATATAGTCA GCCTCATCCT C 111

【０２２３】配列番号：３９ 配列の長さ：４２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CTTCTCTGGC TGCTGCTGAT ACCATTCAAT GGTGTACGTA CT 42

【０２２４】配列番号：４０ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CGAGGGCCCT TCTCTGGCTG CTGCTG 26

【０２２５】配列番号：４１ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GAGAAGGGCC CTARGTACST GATGRAWCTT AAGCA 35

【０２２６】配列番号：４２ 配列の長さ：３５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： CACGAATTCA CTATCGATTC TGGAACCTTC AGAGG 35

【０２２７】配列番号：４３ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GGCTTGGAGC TCCTCAGA 18

【０２２８】配列番号：４４ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸（合成DNA） 配列： GACAGTGGTT CAAAGTTTTT 20

【０２２９】配列番号：４５ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser Phe Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu Lys Pro Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg 65 70 75 Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp Glu Ala Met Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０２３０】配列番号：４６ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 110 115

【０２３１】配列番号：４７ 配列の長さ：１１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 110 115

【０２３２】配列番号：４８ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０２３３】配列番号：４９ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０２３４】配列番号：５０ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０２３５】配列番号：５１ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０２３６】配列番号：５２ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０２３７】配列番号：５３ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０２３８】配列番号：５４ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Lys 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 １１５

【０２３９】配列番号：５５ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ
Ａｌａ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｓｅｒ Ｌｅｕ Ｇｌｙ １ 5 10 15 Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Gln His Ser Thr 20 25 30 Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu Lys Gly Pro Arg 35 40 45 Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His Ser Thr Gly Asp 50 55 60 Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Glu Arg 65 70 75 Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr 80 85 90 Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln Phe Val Tyr Val 95 100 105 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro 110 115

【０２４０】配列番号：５６ 配列の長さ：１１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly 1 5 10 15 Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr 50 55 60 Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser 65 70 75 Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 80 85 90 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr Met Thr Tyr Phe 95 100 105 Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 110 115

【０２４１】配列番号：５７ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG AAC TTC GGG CTC AGC TTG ATT TTC CTT GCC CTC ATT TTA AAA 45 Met Asn Phe Gly Leu Ser Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys -15 -10 -5 GGT GTC CAG TGT GAG GTG CAA CTG GTG GAG TCT GGG GGA GAC TTA 90 Gly Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu 1 5 10 GTG AAG CCT GGA GGG TCC CTG AAA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135 Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACT TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG ATT CGC CAG ACT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Ile Arg Gln Thr Pro 30 35 40 GAC AAG AGG CTG GAG TGG GTC GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225 Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 60 65 70 AGA GAC AAT GCC AAG AAC ACC CTA TAC CTG CAA ATG AGC AGT CTG 315 Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu 75 80 85 AAG TCT GAG GAC ACA GCC ATG TTT TAC TGT GCA AGA CAG ACT ACT 360 Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Phe Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAA GGG ACT CTG GTC ACT GTC 405 Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCT GCA 411 Ser Ala

【０２４２】配列番号：５８ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GGG TTT GGG CTG AGC TGG GTT TTC CTC GTT GCT CTT TTA AGA 45 Met Gly Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Leu Arg -15 -10 -5 GGT GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTG GTG GAG TCT GGG GGA GGC GTG 90 Gly Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val 1 5 10 GTC CAG CCT GGG AGG TCC CTG AGA CTC TCC TGT GCA GCC TCT GGA 135 Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly 15 20 25 TTC ACC TTC AGT AGC TAT GGC ATG TCT TGG GTC CGC CAG GCT CCA 180 Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro 30 35 40 GGC AAG GGG CTG GAG TGG GTG GCA ACC ATT AGT AGT GGT GGT AGT 225 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser 45 50 55 TAC ACC TAC TAT CCA GAC AGT GTG AAG GGG CGA TTC ACC ATC TCC 270 Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser 60 65 70 AGA GAC AAT TCC AAG AAC ACG CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG 315 Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu 75 80 85 AGA GCT GAG GAC ACG GCT GTG TAT TAC TGT GCG AGA CAG ACT ACT 360 Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Thr 90 95 100 ATG ACT TAC TTT GCT TAC TGG GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC 405 Met Thr Tyr Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val 105 110 115 TCC TCA 411 Ser Ser

【０２４３】配列番号：５９ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４４】配列番号：６０ 配列の長さ：７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４５】配列番号：６１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４６】配列番号：６２ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４７】配列番号：６３ 配列の長さ：１６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln Lys Phe Lys Gly 1 5 10 15

【０２４８】配列番号：６４ 配列の長さ：１１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド

【０２４９】配列番号：６５ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAA CTT GTG CTC ACT CAG TCA TCT TCA GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Ala Ser 1 5 10 TTC TCC CTG GGA GCC TCA GCA AAA CTC ACG TGC ACC TTG AGT AGT 135 Phe Ser Leu Gly Ala Ser Ala Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAA CAG CCA CTC 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Leu 30 35 40 AAG CCT CCT AAG TAT GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Pro Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCT GGA TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGT GCT GAT CGC TAC CTT AGC ATT TCC AAC ATC CAG CCA GAA GAT 315 Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ser Ile Ser Asn Ile Gln Pro Glu Asp 75 80 85 GAA GCA ATG TAC ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Met Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAT GTT TTC GGC GGT GGG ACC AAG GTC ACT GTC CTA GGT 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５０】配列番号：６６ 配列の長さ：４０５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG CAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp His Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT CGG TAC TTG ATG AAA CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Lys Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGT 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115

【０２５１】配列番号：６７ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５２】配列番号：６８ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５３】配列番号：６９ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５４】配列番号：７０ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT TAC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５５】配列番号：７１ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５６】配列番号：７２ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC CTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５７】配列番号：７３ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AAG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Lys Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５８】配列番号：７４ 配列の長さ：４１１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃDNA ｔｏ ｍＲＮＡ 配列： ATG GCC TGG ACT CCT CTC TTC TTC TTC TTT GTT CTT CAT TGC TCA 45 Met Ala Trp Thr Pro Leu Phe Phe Phe Phe Val Leu His Cys Ser -15 -10 -5 GGT TCT TTC TCC CAG CTT GTG CTG ACT CAA TCG CCC TCT GCC TCT 90 Gly Ser Phe Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ala Ser 1 5 10 GCC TCC CTG GGA GCC TCG GTC AAG CTC ACC TGC ACC TTG AGT AGT 135 Ala Ser Leu Gly Ala Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser 15 20 25 CAG CAC AGT ACG TAC ACC ATT GAA TGG TAT CAG CAG CAG CCA GAG 180 Gln His Ser Thr Tyr Thr Ile Glu Trp Tyr Gln Gln Gln Pro Glu 30 35 40 AAG GGC CCT AGG TAC GTG ATG GAT CTT AAG CAA GAT GGA AGC CAC 225 Lys Gly Pro Arg Tyr Val Met Asp Leu Lys Gln Asp Gly Ser His 45 50 55 AGC ACA GGT GAT GGG ATT CCT GAT CGC TTC TCA GGC TCC AGC TCT 270 Ser Thr Gly Asp Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser 60 65 70 GGG GCT GAG CGC TAC CTC ACC ATC TCC AGC CTC CAG TCT GAG GAT 315 Gly Ala Glu Arg Tyr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp 75 80 85 GAG GCT GAC TAT ATC TGT GGT GTG GGT GAT ACA ATT AAG GAA CAA 360 Glu Ala Asp Tyr Ile Cys Gly Val Gly Asp Thr Ile Lys Glu Gln 90 95 100 TTT GTG TAC GTG TTC GGC GGA GGG ACC AAA CTG ACC GTC CTA GGC 405 Phe Val Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 105 110 115 CAG CCC 411 Gln Pro

【０２５９】配列番号：７５ 配列の長さ：３４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列： Ala Val Ser Glu His Gln Leu Leu His Asp Lys Gly Lys Ser Ile 1 5 10 15 Gln Asp Leu Arg Arg Arg Phe Phe Leu His His Leu Ile Ala Glu 20 25 30 Ile His Thr Ala

【図面の簡単な説明】

【図１】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す
図である。

【図２】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す
図である。

【図３】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す
図である。

【図４】抗PTHrP抗体の悪液質に対する治療効果を示す
図である。

【図５】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図６】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図７】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図８】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図９】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図１０】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図１１】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図１２】抗体結合活性の測定結果を示す図である。

【図１３】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。

【図１４】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。

【図１５】ヒト型化抗体の中和活性を示す図である。

【図１６】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示
す図である。

【図１７】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示
す図である。

【図１８】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示
す図である。

【図１９】ヒト型化抗体の悪液質に対する治療効果を示
す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 副甲状腺ホルモン関連ペプチドとその受
   容体との結合を阻害する物質を有効成分として含む悪液
   質治療剤。
2. 【請求項２】 物質が副甲状腺ホルモン関連ペプチド受
   容体に対するアンタゴニストである請求項１記載の悪液
   質治療剤。
3. 【請求項３】 物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド
   抗体である請求項１記載の悪液質治療剤。
4. 【請求項４】 物質が抗副甲状腺ホルモン関連ペプチド
   抗体断片及び／又はその修飾物である請求項１記載の悪
   液質治療剤。
5. 【請求項５】 抗体がヒト型化又はキメラ化されたもの
   である請求項３又は４記載の悪液質治療剤。
6. 【請求項６】 ヒト型化抗体がヒト型化#23-57-137-1抗
   体である請求項５記載の悪液質治療剤。
7. 【請求項７】 抗体がモノクローナル抗体である請求項
   ３又は４記載の悪液質治療剤。
8. 【請求項８】 悪液質が癌由来のものである請求項１〜
   ７のいずれか１項に記載の悪液質治療剤。