JPH1180033A - トランスフェクション系、その作製および体細胞遺伝子治療におけるその使用 - Google Patents

トランスフェクション系、その作製および体細胞遺伝子治療におけるその使用

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JPH1180033A
JPH1180033A JP10197791A JP19779198A JPH1180033A JP H1180033 A JPH1180033 A JP H1180033A JP 10197791 A JP10197791 A JP 10197791A JP 19779198 A JP19779198 A JP 19779198A JP H1180033 A JPH1180033 A JP H1180033A
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JP
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transfection system
nucleic acid
catheter
transfection
infiltrator
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JP10197791A
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Juergen Schrader
ユルゲン、シュラーダー
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Original Assignee
Cardiogene Gentherapeutische Systeme AG
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 血管中に効率的にかつ最少の損傷で体細胞遺
伝子トランファーを行う。 【解決手段】 １以上のインフィルトレーターカテーテ
ルと、１以上の核酸と、場合によっては、適切な補助物
質および／または添加物とを含んでなるトランスフェク
ション系。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、１以上のインフィルトレーターカテーテル
と、１以上の核酸と、場合によっては、適切な補助物質
および／または添加物とを含んでなるトランスフェクシ
ョン系、並びにその作製および体細胞遺伝子治療におけ
るその使用に関する。
【０００２】背景技術 脈管性障害の局所遺伝子治療は、例えばバルーンカテー
テルで閉塞した血管を機械的に広げた（いわゆる経皮経
管冠動脈形成；ＰＴＣＡ）後に血管の再閉塞（再狭窄）
を防ぐ介入心臓学で、非常に有望と見込まれている。そ
の理由は再狭窄がＰＴＣＡ処置後も全ケースのうち３０
〜４０％でなお生じるからである。
【０００３】薬物の全身投与は、非常に有望な理論的考
え方にもかかわらず、ＰＴＣＡの長期的成功に更に改善
を加えることはなかったが、おそらく処置された狭窄領
域における治療剤の濃度が次第に不十分となるためであ
ろう。これらの結果から、特定の薬物で血管の損傷部位
の局所治療を行える様々な特殊なカテーテルの開発に至
った。
【０００４】しかしながら、特殊なカテーテルを用いた
薬剤、特に低分子量の薬剤の局所投与の１つの欠点は、
血管の治療部位からの速い消散である。必要なデポ形成
は短時間持続するだけである。
【０００５】治療効果の延長は、例えば、治療上有効な
遺伝子が体細胞遺伝子トランスファーにより血管壁中に
局所的にトランスファーされて、そこで発現されること
により達成できる。
【０００６】血管壁中への遺伝子トランスファーには、
特に３つの成分が必要である： ・局所発現で例えば再狭窄形成を阻止する因子を合成さ
せる治療上有効な遺伝子 ・（ａ）治療遺伝子による血管壁の最大効率的トランス
フェクションおよび （ｂ）トランスフェクションの局所化を行うトランスフ
ェクション系 ・（ａ）最少侵襲技術を用いた低または非外傷的な血管
の特定個別部位のin vivo トランスフェクション （ｂ）トランスフェクション系と共に、脈管周囲スペー
スまたは血液循環中への治療遺伝子の最少分布の確保、
および （ｃ）短い血管閉塞時間の保証を行う効率的カテーテル
技術。
【０００７】Schrader,J.& Godecke,A. （ＤＥ ４４
１１ ４０２）は、血管でリポソーム複合体の形をした
酸化窒素シンターゼ遺伝子によるトランスフェクション
が血管狭窄およびＰＴＣＡ後の再狭窄の治療上関連した
阻止を行うことを発見した。しかしながら、ポリエチレ
ンカテーテルがＤＮＡ‐リポソーム複合体でのトランス
フェクションに用いられたが、１５〜２０分間にわたり
血管中で血流を遮断した。加えて、トランスフェクショ
ンはいくつかのケースで血管の再開後に血栓症を生じ
た。
【０００８】一部他の特殊なカテーテルも、薬物の局所
投与の問題を解決する目的で、文献に既に記載されてい
る（Wilenksy,R.L.et al.(1993) Trends Cardiovasc.Me
d.3(5),163-170）。
【０００９】例えば、二重バルーンカテーテルは、バル
ーンを膨張させることで特定部分の血管を循環から分離
させて、血管の遠位から近位までの部分をトランスフェ
クトさせる（例えば、Nathan,A.& Edelman E.R.(1995),
Edelman E.R.(ed.),"Frontiers in Cardiology; Molecu
lar Interventions and Local Drug Delivery",Saunder
s Company Ltd.,london,GB,29-52参照）。こうして隔離
された管腔は治療剤で満たされ、拡散により血管壁には
いる。しかしながら、このカテーテルの欠点は使用時に
おける長時間の血管閉塞であり、本質的に最も内側の血
管細胞層に達するだけである（Flugelman,M.Y.(1995),T
hrombosis and Haemostasis,74(1),406-410 ）。したが
って、このタイプのカテーテルは体細胞遺伝子トランス
ファーにとり不適当である。
【００１０】多孔質バルーンは、膨張させたバルーンの
孔から加圧下で治療剤を血管壁中に押し出して、治療剤
の経壁分布を果たすように開発された。しかしながら、
注射に要する高圧（２〜５ａｔｍ）はしばしば血管壁に
深刻な機械的損傷を与え、これは中膜で切裂または壊死
ゾーンの発生により現される。加えて、トランスフェク
ション効率は極端に低く、局所化されない（Flugelman,
M.Y.(1995),supra；Flugelman,M.Y.et al.(1992),Circu
lation,85(3),1110-1117；）。したがって、このタイプ
のカテーテルも体細胞遺伝子トランスファーに不適当で
あるとわかった。
【００１１】Dispatchカテーテルの機能の原理は上記さ
れた二重バルーンカテーテルと大体似ている（例えば、
McKay,R.G.et al.(1994),Catheterization and Cardiov
ascular Diagnosis,33,181-188参照）。しかしながら、
治療される血管部分はこの場合に２つの末梢バルーンに
よって循環の残りから分離されていないが、膨張後に血
管壁と接触するコイルによって分離される。ベクター
は、らせん要素間にあるカテーテルシャフトのオリフィ
スから閉じたチャンバー中に注入される。トランスフェ
クションは拡散により生じる。血流から遠位領域を切り
離すことなく、約３０分間と必要な長いトランスフェク
ション時間を可能とさせるために、膨張したカテーテル
のシャフトを通る導管は血流を可能とするように適合さ
せた。
【００１２】針注入カテーテル（ＮＩＣ）は、カテーテ
ルの丸い先端から進行させて、血管壁中に侵入させるこ
とができる、３本の注入針で特徴付けられる（例えば、
Gonschior,P.et al.(1995) Coronary Artery Disease,
6,329-344参照）。血管壁中にこれらの針から薬物を注
入することが既に可能であった。
【００１３】しかしながら、針がカテーテルのヘッドか
らどの程度まで現れたかをチェックすることが容易でな
く、これが注入の深さを決めていることから、ＮＩＣの
操作は困難である。これは血管壁の穿孔と、ひいては脈
管周囲組織のトランスフェクションだけでなく、血管か
らの出血のリスクも伴う。この危険性は、離心性プラー
クのトランスフェクションに特にあてはまる。
【００１４】Janssens,S.et al.,The Second Annual In
ternational Symposium,October 13-15,1996,Cambridg
e,Massachusettsは、アデノウイルスベクターと、詳し
く記載されていないインフィルトレーターカテーテルと
による、遺伝子トランスファーについて記載している。
しかしながら、このトランスフェクション系の欠点は、
細胞毒性効果がアデノウイルスベクターで観察されたこ
とである（Flugelman,M.Y.(1995)，前掲）。
【００１５】
【発明の概要】したがって、本発明は、血管中に効率的
にかつ最少の損傷で体細胞遺伝子トランスファーを行う
ことが可能なトランスフェクション系を見つけ出すこと
をその目的とする。
【００１６】本発明は、第一に、１以上のインフィルト
レーターカテーテルと、非ウイルス形の１以上の核酸
と、場合によっては、適切な補助物質および／または添
加物とを含んでなるトランスフェクション系に関する。
【００１７】
【発明の具体的説明】インフィルトレーターカテーテル
(Infiltrator catheter)とは、血管壁中への薬物の血管
内注入のために開発された特別なカテーテルである。そ
れはバルーンカテーテルの形をとり、その表面からイン
ジェクター口（１種以上の活性物質を投与するための管
状スタッド様伸長部分）が突き出ている。インジェクタ
ー口の高さは通常約１００〜５００μｍ、好ましくは約
１００〜２５０μｍ、特に約１００μｍであり、バルー
ン当たりのインジェクター口の数は通常約５×７、好ま
しくは約３×７である。通常約２ａｔｍまでのバルーン
の膨張圧が、これらのインジェクター口を血管壁中に押
し込める。こうして、低圧下、好ましくは約１００〜２
００mmHg、特に約１５０mmHgで通常約５００μｌ以内、
好ましくは２５０〜３００μｌの活性物質をインジェク
ター口から血管壁中に注入することが可能である。カテ
ーテルは１以上の管腔 (lumen)を通常有しており、特に
二重管腔、特に好ましくは三重管腔のカテーテルであ
る。
【００１８】二重管腔カテーテルは、通常、管腔シャフ
トと、そのシャフト上の適切な箇所にかぶせた前記の膨
張しうるバルーンからなる。シャフトはバルーンが存在
する箇所に１以上オリフィスを含んでいて、そこにバル
ーンが膨張して、活性物質がバルーンに入り込める。活
性物質はそこからインジェクター口を経て血管壁中に入
る。米国特許第５，１１２，３０５号または米国特許第
５，２４２，３９７号に記載されたような二重管腔イン
フィルトレーターカテーテルが特に好ましい。
【００１９】中央管状シャフト、適切な箇所でそのシャ
フトにかぶせた膨張しうるバルーンと、その膨張しうる
バルーンが存在する箇所に上記インジェクター口を含む
管状スリーブを含んでなる、三重管腔インフィルトレー
ターカテーテルが特に好ましい。カテーテルの位置を決
めた後、バルーンを膨張させて、インジェクター口を有
する上記スリーブを血管壁に対して押しつける。そのと
き活性物質は、そこからインジェクター口を経て血管壁
中に入るように、管状スリーブ中に導入される。特に好
ましい三重管腔インフィルトレーターカテーテルは、Ｅ
Ｐ ０ ７５３３２２ Ａ１またはＥＰ ０ ７６８
０９８ Ａ２に記載されたようなカテーテルである。
【００２０】本発明によるトランスフェクション系は、
カテーテルの正確な位置決定を可能にするガイドワイヤ
を追加的に通常含んでいる。
【００２１】本発明によるトランスフェクション系の核
酸は、非ウイルス形で、好ましくは一本または二本鎖Ｄ
ＮＡまたはＲＮＡとして、例えばむき出しの(naked) 核
酸として、あるいは他の非ウイルス成分と一緒に存在し
ている。
【００２２】“非ウイルス”という用語は、例えばレト
ロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルス
ベクターのような遺伝的に操作されたウイルスベクター
の助けがあっても、核酸がトランスフェクトされないこ
とを、意味する。例えば、ウイロソーム(virosome)の形
でのセンダイウイルスの使用（下記参照）は、“非ウイ
ルス”という用語から除外されない。
【００２３】適切なむき出しの核酸は、例えば、プラス
ミドＤＮＡまたはいわゆるアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの形をした核酸である（例えば、Uhlmann,E.& Peym
an,A.(1990) Chemical Reviews,90,543-584,No.4参
照）。
【００２４】遺伝子治療に有効な核酸は、他の非ウイル
ス成分、好ましくはリポソームとの所要核酸の複合化に
よっても得られる。その理由はこれが特に血管壁の非常
に高いトランスフェクション効率を達成できるからであ
る（例えば、ＤＥ ４４ １１ ４０２ Ａ１参照）。
いわゆるＨＶＪリポソーム（ウイロソーム）の形でセン
ダイウイルスを用いた核酸／リポソーム複合体によるト
ランスフェクションが特に有利であり、これがトランス
フェクション率を更に高めうるからである。
【００２５】リポフェクション（lipofection ）では、
例えばカチオン性脂質の小さな単層小胞がリポソーム懸
濁液の超音波処理により作製される。核酸は、特に正味
の正電荷が残って、核酸がリポソームと１００％複合化
されるような比率で、リポソームの表面とイオン結合し
ている。Felgner et al.(Felgner,P.L.et al.(1987),Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413-7414 ）により用いられ
た脂質混合物、ＤＯＴＭＡ（１，２‐ジオレイルオキシ
‐３‐プロピルトリメチルアンモニウムブロミド）およ
びＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミ
ン）の他にも、多くの新しい脂質処方が合成され、様々
な細胞系をトランスフェクトするそれらの効率について
試験された（Behr,J.P.et al.(1989),Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,86,6982-6986 ；Felgner,J.H.et al.(1994) J.B
iol.Chem.,269,2550-2561 ；Gao,X.& Huang,L.(1991),B
iochim.Biophys.Acta,1189,195-203）。新しい脂質処方
の例は、ＤＯＴＡＰ Ｎ‐〔１‐（２，３‐ジオレオイ
ルオキシ）プロピル〕‐Ｎ，Ｎ，Ｎ‐トリメチルアンモ
ニウムメチルサルフェートまたはＤＯＧＳ（TRANSFECTA
M ；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）であ
る。ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリンおよ
びコレステロールからのＤＮＡ／リポソーム複合体の作
製例と、センダイウイルスを用いた血管壁のトランスフ
ェクションにおいて成功したその用法は、ＤＥ ４４
１１ ４０２に記載されている。
【００２６】核酸結合タンパク質、例えば染色体タンパ
ク質、好ましくはＨＭＧタンパク質（高速移動群タンパ
ク質）、特にＨＭＧ‐１またはＨＭＧ‐２、あるいはＨ
２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３またはＨ４のようなヌクレオソーム
ヒストンを含んでいることが核酸／リポソーム複合体に
とり特に有利である。その理由はこれが少くとも３〜１
０倍まで必要な核酸の発現を増加させうるからである。
染色体タンパク質は、例えば、遺伝学上公知の方法によ
り子牛胸腺またはラット肝臓から単離されるか、あるい
は遺伝子操作により作製される。ヒトＨＭＧ‐１は、例
えば、Wen,L.etal.(1989) Nucleic Acids Res.,17(3),1
197-1214 からのヒトｃＤＮＡ配列を用いて、当業者に
知られた方法による遺伝子操作で、特に直接的に作製で
きる。
【００２７】必要な核酸は、通常、治療上有効な遺伝子
産物をコードした核酸である。
【００２８】治療上有効な遺伝子産物をコードする核酸
の例は、酸化窒素シンターゼ遺伝子、特に誘導性酸化窒
素シンターゼをコードする遺伝子（例えば、ＤＥ ４４
１１ ４０２ Ａ１参照）、エリトロポエチン遺伝子
（例えば、ＥＰ ０ １４８６０５ Ｂ１参照）、イン
シュリン遺伝子（例えば、ＥＰ ０ ００１ ９２９
Ｂ１参照）または血液凝固因子、インターフェロン、サ
イトカイン、ホルモン、成長因子などについてコードす
る遺伝子である。特に好ましい遺伝子は、血中で生じる
タンパク質についてコードする遺伝子である。血管壁の
本発明による体細胞遺伝子治療では、特定活性物質の血
漿濃度を増加させることにより、例えば糖尿病患者でイ
ンシュリンの欠乏、血友病患者でVIII因子の欠乏、腎臓
患者でエリトロポエチンの欠乏、トロンボポエチンの欠
乏または成長阻害を伴うソマトスタチンの欠乏のよう
な、例えば病的欠乏現象を、特に簡単かつ持続的に解消
または軽減することができる。したがって、本発明は、
例えば動脈硬化症、狭窄または再狭窄のような純粋な脈
管性障害の治療に限定されず、全般的に適用しうる。
【００２９】ポリペプチドをコードする核酸の一部が、
好ましくはプロモーターとポリペプチド開始コドンとの
間にイントロン配列を含む１以上の非コード配列、およ
び／または特に遺伝子の３′末端にポリＡ配列、特に天
然ポリＡ配列またはＳＶ４０ウイルスポリＡ配列を含ん
でいることも、遺伝子治療について記載された使用にと
って有利であるが、これは細胞でｍＲＮＡの安定化を達
成できるからである（Jackson,R.J.(1993) Cell,74,9-1
4 およびPalmiter,R.D.et al.(1991) Proc.Natl.Acad.S
ci.USA,88,478-482 ）。
【００３０】本発明によるトランスフェクション系は、
上記されたまたは購入しうる１以上のインフィルトレー
ターカテーテルと、１以上の上記された核酸と、場合に
よって適切な補助物質および／または添加物と、場合に
よってはガイドワイヤとを組み合わせることにより、簡
単な手法で作製することができる。
【００３１】適切な補助物質および／または添加物の例
には、ヌクレアーゼインヒビターのような安定剤の形
で、好ましくはウイロソームでのトランスフェクション
前に加えられる、例えばＣａＣｌ２溶液のような、本発
明によるトランスフェクション系で特にセンダイウイル
スの使用時に、好ましくはＥＤＴＡ、プロテアーゼイン
ヒビターまたはアルカリ土類金属溶液のような錯体形成
剤の形で当業者に知られるものがある。
【００３２】記載されたインフィルトレーターカテーテ
ルは、例示により既に詳細に上記されたように、特に脈
管性障害、遺伝子障害および／または遺伝子トランスフ
ァーにより治療できる障害を治療する上で、その予防も
含めて、体細胞遺伝子治療のために本発明によるトラン
スフェクション系の形で適切かつ有利である。
【００３３】したがって、本発明は、好ましくは体細胞
遺伝子治療のために、本発明によるトランスフェクショ
ン系を作製するためのインフィルトレーターカテーテル
の使用にも及ぶ。本発明は、体細胞遺伝子トランスファ
ーのための、特に記載された障害の治療または予防のた
めの、本発明によるトランスフェクション系の使用にも
更に及ぶ。
【００３４】本発明の予想外の利点は、医薬の局所投与
用に開発された、文献に記載される他のトランスフェク
ション系とは対照的に、インフィルトレーターカテーテ
ルが体細胞遺伝子治療で１以上の核酸のトランスファー
にとって本発明で特に適している、という事実から導か
れる。血管中で正確にインフィルトレーターカテーテル
の位置を決めることが可能であって、バルーンの膨張に
より血管で漏出のない閉塞を起こすため、インジェクタ
ー口がバルーンにより血管壁に押しつけられ、核酸の注
入が低圧下で効果的に起こって、血管壁に最少の変化が
与えられる。これにより、短い血管閉塞時間（最大約３
０秒間）で、血管壁の効率的トランスフェクションおよ
び必要な核酸の恒久的発現が達成された。
【００３５】
【実施例】下記例は本発明を詳細に説明するためのもの
であり、本発明を限定するものではない。
【００３６】例：ブタ大腿動脈における誘導性酸化窒素
シンターゼ遺伝子の発現 １．トランスフェクションプロトコール １．１ ＤＮＡの作製 ２μg/μｌの濃度でＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・
ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に溶解された、誘導性マウス酸化
窒素シンターゼをコードする遺伝子トランスファーベク
ターｐＳＣＭＶ‐ｉＮＯＳ（ＤＥ ４４ １１ ４０２
Ａ１）２００μｇを、ＢＳＳ緩衝液（１４０ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、５．４ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ・Ｃ
ｌ、ｐＨ７．６）に溶解された子牛胸腺からのＨＭＧ‐
１タンパク質６４μｇと混合し、その溶液をＢＳＳ緩衝
液で２００μｌの最終容量に調整した。得られた溶液を
３７℃で３０分間インキュベートした。
【００３７】１．２ リポソーム調製 混合物中４．８：２：１の重量比でホスファチジルコリ
ン（ＰＣ）、コレステロール（Ｃ）およびホスファチジ
ルセリン（ＰＳ）からなる脂質混合物５ｍｇをジエチル
エーテル２ｍｌに溶解した。例１．１で調製されたＤＮ
Ａ溶液２００μｌを、溶解された脂質に加えた。次いで
混合液を２分間撹拌することによりホモゲナイズし、そ
の後超音波浴中で１０秒間にわたり音波処理した。次い
でエーテルを３７℃でロータリーエバポレーターで蒸発
させた。その後、得られたエマルジョンを乳光色が現れ
るまで約２分間撹拌した。
【００３８】１．３ センダイウイルスの調製 センダイウイルスを受精鶏卵からの漿尿液中で標準法に
より増殖させた（Nakanishi,M.et al.(1985) Exp.Cell.
Res.,159(2),399-409 ）。次いでウイルスをSorvall Ｇ
ＳＡローターにおいて４℃で下記遠心法により精製し
た： １．漿尿液： ３０００ｒｐｍで１０分間 ２．上澄： １３，０００ｒｐｍで３０分間 ３．ペレット： ＢＳＳ緩衝液に懸濁 ４．懸濁液： ３０００ｒｐｍで１０分間 ５．上澄： １３，０００ｒｐｍで３０分間 ６．ペレット： ＢＳＳ緩衝液に再懸濁 次いで力価を１６，０００赤血球凝集単位（ＨＡＵ）／
ｍｌに調整した。使用直前に、ウイルスを１１Ｊ／ｍ2
・ｓでＵＶ照射により不活化させた。
【００３９】１．４ ウイロソーム（ＨＶＪリポソー
ム）の作製および精製 例１．３のように調製されたＵＶ不活化ウイルス（１
６，０００ＨＡＵ）１ｍｌを例１．２のように調製され
たリポソームと混合し、１０分間にわたり氷上でインキ
ュベートした。次いで懸濁液をオービタルシェーカー
（１２０ｒｐｍ、３７℃）で６０分間にわたりウイルス
とリポソームとの融合のために振盪した。次いで、形成
されたウイロソームをＴＨ６４１ローター,Sorvall Ins
trumentsにおいて２８，０００ｒｐｍおよび４℃でスク
ロースクッション（３０％スクロース）での超遠心によ
り未取込みウイルスから除去した。ウイロソームはこの
場合にスクロースクッション上でバンド形成して、未取
込みウイルスはチューブの底に沈降した。次いでウイロ
ソームを除去して、トランスフェクトされるまで氷上に
おいた。トランスフェクションを行う直前に、ＣａＣｌ
２を２ｍＭの最終濃度まで加えた。
【００４０】１．５ トランスフェクション トランスフェクションは、記載されたカテーテルからMu
nichミニブタの腸骨動脈中に例１．４のように調製され
たウイロソーム３００μｌ（ＨＶＪリポソーム中に捕捉
されたｐＳＣＭＶ‐ｉＮＯＳ８〜１０μｇ、約１０００
ＨＡＵ）を注入することにより行った。注入には約１０
秒間かかった。ベクターｐＳＣＭＶ２を含有したウイロ
ソーム（ＤＥ ４４ １１ ４０２ Ａ１）をコントロ
ールとして用いた。
【００４１】２．外科的操作 左頸動脈を外科的操作により暴し、７‐Ｆまたは９‐Ｆ
サポートを修正Seldinger 技術により挿入した。更にす
べての血管造影または操作工程をこのサポートにより行
った。最後に、遠位大動脈および腸骨血管の検索血管造
影を較正ピグテイルカテーテル(pigtail catheter)によ
り行った。次いで局所トランスフェクション用のカテー
テルを大腿動脈までガイドワイヤで前進させた。次いで
トランスフェクション溶液を、血管中への薬物の局所投
与について製造業者の説明に従い、側部インジェクター
口から導入した。この場合に、発現ベクターおよびコン
トロールベクターを同動物の左右大腿動脈中に各々注入
した。カテーテルの摘出後、血管を縫合することにより
頸動脈を閉じた。次いで創傷を閉じた。
【００４２】３．免疫組織化学的検出 トランスフェクトされた血管壁部分の凍結セクション
（８μｍ）をモノクローナル抗ｉＮＯＳ抗体（Transduc
tion Laboratories,＃Ｎ３２０２０）と反応させた。抗
体結合は、Vecta Stain Elite キット（Vector Laborat
ories,＃ＰＫ‐６１００）でビオチニル化抗マウス抗体
（Vector Laboratories,＃ＢＡ‐２０００）を用いて、
ストレプトアビジン／ペルオキシダーゼ複合体により検
出した。
【００４３】４．生化学的検出 免疫組織化学に加えて、トランスフェクトされた血管に
よるＮＯ形成の増加は、外植トランスフェクト血管部分
からの培養上澄で硝酸／亜硝酸（ＮＯｘ）の蓄積に基づ
き直接検出した。トランスフェクトされた血管部分をKr
ebs-Hensel light緩衝液（mmol／ｌで：１１６ＮａＣ
ｌ；４．６ＫＣｌ；１．１ＭｇＳＯ４；２４．９ＮａＨ
ＣＯ３；２．５ＣａＣｌ２；１．２ＫＨ２ＰＯ４；１０
グルコースおよび０．５ＥＤＴＡ；９５％Ｏ２および５
％ＣＯ２で平衡化（ｐＨ７．４；３７℃））中でインキ
ュベートした。インキュベートは３７℃で２４時間行っ
た。ＮＯｘ蓄積は、化学発光法により硝酸＋亜硝酸でＮ
Ｏへの還元後に調べた（酸化窒素アナライザーＮＯＡ２
８０；Sievers Inc., ＵＳＡ）。
【００４４】５．結果 ５．１ Dispatchカテーテル Dispatchカテーテルの使用は、らせん要素の膨張により
しっかり閉じた隔離チャンバーを作ることができなかっ
たため、効率的トランスフェクションを行えなかった。
カテーテルシャフトからベクターの注入は、閉じたチャ
ンバーで予想される圧力の上昇を起こさない。チャンバ
ーの漏れがチャンバーからＸ線コントラスト媒体の急速
な流出により証明された。したがって、Dispatchカテー
テルは局所遺伝子トランスファーに不適当である。
【００４５】５．２ インフィルトレーターカテーテル Dispatchカテーテルまたは針注入カテーテルと対照的
に、正確なポジショニング（図１参照）がインフィルト
レーターカテーテル（縦軸に沿い３×７のインジェクタ
ー口を有する Barath 薬物デリバリーカテーテル、その
口は円筒形であって、やや上方向きの円錐形テーパーを
有している；モデルＮｏ．ＤＤ１４００１５、Interven
tional Technologies Europe Ltd.,Ireland ）で可能で
あり、バルーンの膨張は血管をしっかり閉じさせた。
【００４６】図２に示されたように、顕著な免疫反応が
トランスフェクトされた血管部分で検出でき、血管壁径
の５０％以内に及んだ。コントロール‐トランスフェク
ト血管は対応する染色を欠き、そのためこの検出はｉＮ
ＯＳの発現を特異的に示していた。
【００４７】図３は、明らかに増加したＮＯｘ放出が、
コントロールベクターでトランスフェクトされた部分と
比較して、トランスフェクション後に得られたことを示
している。
【００４８】このように、短い血管閉塞時間（最大３０
秒間）で、血管壁径の５０％以内に及ぶ、血管壁の効率
的in vivo トランスフェクションが、インフィルトレー
ターカテーテルにより達成された。
【図面の簡単な説明】
【図１】左腸骨動脈のトランスフェクションに際するブ
タの腸骨脈管系のラジオグラフを示す。フィルムは、ブ
タの腸骨動脈（Ａ）における、膨張したインフィルトレ
ーターカテーテル（Ｂ）を示している。カテーテルを導
入するために用いられるガイドワイヤ（Ｃ）は、カテー
テルよりも明らかに遠位にある。膨張したバルーンによ
る血管の漏出防止閉塞は、遠位大腿動脈でコントラスト
の欠如から明らかである（右側と比較する）。
【図２】コントロールベクター（ａ）およびｐＳＣＭＶ
‐ｉＮＯＳベクター（ｂ）とのトランスフェクション後
の、ブタの腸骨動脈におけるｉＮＯＳ発現の免疫組織化
学的検出を示す。ｂの暗色（矢印）は、強いｉＮＯＳ発
現を示している。
【図３】ｐＳＣＭＶ‐ｉＮＯＳベクター（Ａ）またはコ
ントロールベクター（Ｂ）でトランスフェクトされた血
管からの培養上澄中におけるＮＯｘ蓄積の検出を示す。
ＮＯｘシグナルはコントロールセグメントで検出しえな
いが（Ｂ）、トランスフェクトされた血管には明らかな
ＮＯｘ放出がある（Ａ）。（ｐｐＢ＝１／十億）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 598093521 ユルゲン、シュラーダー ＪＵＥＲＧＥＮ ＳＣＨＲＡＤＥＲ ドイツ連邦共和国デュッセルドルフ、メリ ースアレー、13 (72)発明者 ユルゲン、シュラーダー ドイツ連邦共和国デュッセルドルフ、メリ ースアレー、13

Claims (17)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）１以上のインフィルトレーターカテ
    ーテルと （ｂ）非ウイルス形の１以上の核酸と、場合によって
    は、 （ｃ）適切な補助物質および／または添加物とを含んで
    なる、トランスフェクション系。
  2. 【請求項２】インフィルトレーターカテーテルが約１０
    ０〜５００μｍの高さで１以上のインジェクター口を含
    んでなる、請求項１に記載のトランスフェクション系。
  3. 【請求項３】インフィルトレーターカテーテルが約５×
    ７のインジェクター口を含んでなる、請求項１または２
    に記載のトランスフェクション系。
  4. 【請求項４】インフィルトレーターカテーテルが１以上
    の管腔を有するカテーテルである、請求項１〜３のいず
    れか一項に記載のトランスフェクション系。
  5. 【請求項５】インフィルトレーターカテーテルが、中央
    管腔シャフトと、適切な箇所でそのシャフトにかぶせた
    膨張しうるバルーンと、その膨張しうるバルーンが存在
    する箇所に１以上のインジェクター口を含む管状スリー
    ブとを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載
    のトランスフェクション系。
  6. 【請求項６】トランスフェクション系がガイドワイヤを
    更に含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の
    トランスフェクション系。
  7. 【請求項７】核酸がむき出しの状態または他の非ウイル
    ス成分と一緒に存在している、請求項１〜６のいずれか
    一項に記載のトランスフェクション系。
  8. 【請求項８】核酸が、一本または二本鎖ＤＮＡまたはＲ
    ＮＡの形で、好ましくはプラスミドＤＮＡまたはアンチ
    センスオリゴヌクレオチドの形で存在している、請求項
    １〜７のいずれか一項に記載のトランスフェクション
    系。
  9. 【請求項９】核酸が核酸／リポソーム複合体の形で存在
    している、請求項１〜８のいずれか一項に記載のトラン
    スフェクション系。
  10. 【請求項１０】核酸／リポソーム複合体が１以上の核酸
    結合タンパク質を更に含んでなる、請求項９に記載のト
    ランスフェクション系。
  11. 【請求項１１】核酸が治療上有効な遺伝子産物をコード
    している、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のトラ
    ンスフェクション系。
  12. 【請求項１２】治療上有効な遺伝子産物が酸化窒素シン
    ターゼである、請求項１１に記載のトランスフェクショ
    ン系。
  13. 【請求項１３】治療上有効な遺伝子産物をコードする核
    酸が、１以上の非コード配列および／またはポリＡ配列
    を含んでなる、請求項１１または１２に記載のトランス
    フェクション系。
  14. 【請求項１４】請求項１〜５のいずれか一項に記載され
    た１以上のカテーテルと、非ウイルス形の１以上の核酸
    と、場合によっては、適切な補助物質および／または添
    加物と、場合によっては、ガイドワイヤとが組み合わさ
    れる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載されたトラ
    ンスフェクション系の作製法。
  15. 【請求項１５】体細胞遺伝子治療のための、請求項１〜
    １３のいずれか一項に記載されたトランスフェクション
    系の使用。
  16. 【請求項１６】脈管系障害、遺伝的に関連した障害およ
    び／または遺伝子トランスファーにより治療されうる障
    害を、それらの予防を含めて、治療するための、請求項
    １５に記載の使用。
  17. 【請求項１７】請求項１〜１３のいずれか一項に記載さ
    れたトランスフェクション系を作製するための、請求項
    １〜５のいずれか一項に記載されたカテーテルの使用。
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