JPH1180034A - フェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤 - Google Patents
フェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤Info
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- JPH1180034A JPH1180034A JP9248974A JP24897497A JPH1180034A JP H1180034 A JPH1180034 A JP H1180034A JP 9248974 A JP9248974 A JP 9248974A JP 24897497 A JP24897497 A JP 24897497A JP H1180034 A JPH1180034 A JP H1180034A
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- Japan
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- phenylalanine
- hydroxylase activity
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- phenylalanine hydroxylase
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 １位の炭素が13Ｃで標識されたフェニル
アラニンを含むフェニルアラニン水酸化酵素活性検査
剤。 【効果】 本発明によれば、被験者の身体的負担が小さ
く、正確な検査結果を即時に知ることができ、かつ副作
用がなく安全に使用できるフェニルアラニン水酸化酵素
活性検査剤が提供される。
アラニンを含むフェニルアラニン水酸化酵素活性検査
剤。 【効果】 本発明によれば、被験者の身体的負担が小さ
く、正確な検査結果を即時に知ることができ、かつ副作
用がなく安全に使用できるフェニルアラニン水酸化酵素
活性検査剤が提供される。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、生体内のフェニル
アラニン水酸化酵素活性を簡便に測定することのできる
フェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤に関する。
アラニン水酸化酵素活性を簡便に測定することのできる
フェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】フェニルアラニン水酸化酵素はフェニル
アラニン代謝の第一反応を触媒する酵素であり、代謝経
路における鍵酵素である。フェニルアラニン水酸化酵素
の活性測定に関する従来技術には、生体から採取した組
織や臓器の一部を用いる生検による方法がある [Hebere
r, M. et al., Tongweisu, 58, 1189 (1980)] 。しかし
ながら、生体からの組織の採取には高度な技術が必要で
あり、生検後の感染症のリスク、疾病によっては生検自
体が病態を悪化させるリスクが存在する。このため、一
般的な検査法とはなっていない。また、生体からの組織
の採取を繰り返すことは、当然禁忌であり、したがって
生検によって疾病の動的な変化を追うことは現実的には
不可能である。
アラニン代謝の第一反応を触媒する酵素であり、代謝経
路における鍵酵素である。フェニルアラニン水酸化酵素
の活性測定に関する従来技術には、生体から採取した組
織や臓器の一部を用いる生検による方法がある [Hebere
r, M. et al., Tongweisu, 58, 1189 (1980)] 。しかし
ながら、生体からの組織の採取には高度な技術が必要で
あり、生検後の感染症のリスク、疾病によっては生検自
体が病態を悪化させるリスクが存在する。このため、一
般的な検査法とはなっていない。また、生体からの組織
の採取を繰り返すことは、当然禁忌であり、したがって
生検によって疾病の動的な変化を追うことは現実的には
不可能である。
【０００３】生検以外には一例の測定方法が報告されて
いる。重水素で標識したフェニルアラニンを静脈内投与
し、フェニルアラニン水酸化酵素の反応生成物であるチ
ロシンの重水素標識体の血漿中の量をＧＣ−ＭＳを用い
て測定することによりフェニルアラニン水酸化酵素活性
を測定する方法である [Dai, T. et al., Tongweisu,5:
31 (1992)] 。しかし、この方法では高価な測定機器、
高度の技術を必要とし、結果が得られるまでに時間がか
かり簡便さにかけるなどの理由により、現実の臨床検査
として一般化できるものではない。
いる。重水素で標識したフェニルアラニンを静脈内投与
し、フェニルアラニン水酸化酵素の反応生成物であるチ
ロシンの重水素標識体の血漿中の量をＧＣ−ＭＳを用い
て測定することによりフェニルアラニン水酸化酵素活性
を測定する方法である [Dai, T. et al., Tongweisu,5:
31 (1992)] 。しかし、この方法では高価な測定機器、
高度の技術を必要とし、結果が得られるまでに時間がか
かり簡便さにかけるなどの理由により、現実の臨床検査
として一般化できるものではない。
【０００４】かかる状況下、フェニルアラニン水酸化酵
素活性の測定には、被験者への負担が小さく、かつ結果
が即時に精度よく得られる薬剤の開発が望まれるところ
である。一方、米国出願第5,386,832 号は、被験者に13
Ｃ−フェニルアラニンを経口投与し、呼気中の13ＣＯ2
濃度を測定して健常者のそれと比較することによる肝機
能の試験方法を開示する。しかしながら、フェニルアラ
ニン水酸化酵素活性との関連については何ら記載はされ
ていない。
素活性の測定には、被験者への負担が小さく、かつ結果
が即時に精度よく得られる薬剤の開発が望まれるところ
である。一方、米国出願第5,386,832 号は、被験者に13
Ｃ−フェニルアラニンを経口投与し、呼気中の13ＣＯ2
濃度を測定して健常者のそれと比較することによる肝機
能の試験方法を開示する。しかしながら、フェニルアラ
ニン水酸化酵素活性との関連については何ら記載はされ
ていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、被検
者の負担が小さく、正確な測定結果を即時に得ることが
できるフェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤を提供す
ることにある。
者の負担が小さく、正確な測定結果を即時に得ることが
できるフェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤を提供す
ることにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、１位の炭素が13Ｃ
で標識されたフェニルアラニンの投与後に測定した呼気
ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率が肝組織内のフェニルアラ
ニン水酸化酵素活性と高い相関があることを見いだし、
本発明を完成するに到った。
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、１位の炭素が13Ｃ
で標識されたフェニルアラニンの投与後に測定した呼気
ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率が肝組織内のフェニルアラ
ニン水酸化酵素活性と高い相関があることを見いだし、
本発明を完成するに到った。
【０００７】すなわち、本発明は、１位の炭素が13Ｃで
標識されたフェニルアラニンを含むフェニルアラニン水
酸化酵素活性検査剤である。以下、本発明を詳細に説明
する。
標識されたフェニルアラニンを含むフェニルアラニン水
酸化酵素活性検査剤である。以下、本発明を詳細に説明
する。
【０００８】
【発明の実施の形態】本発明のフェニルアラニン水酸化
酵素活性検査剤のフェニルアラニンは、１位の炭素が13
Ｃで標識されたフェニルアラニン（１−13Ｃ−フェニル
アラニン）である。13Ｃは安定同位体であるので、放射
線被曝の危険は一切なく、検査を安全に行うことができ
る。
酵素活性検査剤のフェニルアラニンは、１位の炭素が13
Ｃで標識されたフェニルアラニン（１−13Ｃ−フェニル
アラニン）である。13Ｃは安定同位体であるので、放射
線被曝の危険は一切なく、検査を安全に行うことができ
る。
【０００９】本発明のフェニルアラニン水酸化酵素活性
検査剤は、投与後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度を測定し、
投与後一定時間（例えば２分）経過後における呼気ＣＯ
2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))から、予め作成
しておいた検量線により、フェニルアラニン水酸化酵素
活性を知ることができる。ここで、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ
濃度の測定は、ガスクロマトグラフ−質量分析法（GC-M
S)、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ
（核磁気共鳴）法で行うことができる。
検査剤は、投与後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度を測定し、
投与後一定時間（例えば２分）経過後における呼気ＣＯ
2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))から、予め作成
しておいた検量線により、フェニルアラニン水酸化酵素
活性を知ることができる。ここで、呼気ＣＯ2 中の13Ｃ
濃度の測定は、ガスクロマトグラフ−質量分析法（GC-M
S)、赤外分光法、質量分析法、光電音響分光法、ＮＭＲ
（核磁気共鳴）法で行うことができる。
【００１０】本発明のフェニルアラニン水酸化酵素活性
検査剤は、上記の１位の炭素が13Ｃで標識されたフェニ
ルアラニン（以下、標識フェニルアラニンという）を単
独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、投与経路に
応じて経口剤（錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤
等）、注射剤などに製剤化される。賦形剤または担体と
しては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容さ
れるものであればよく、その種類及び組成は、投与経路
や投与方法によって適宜変更される。例えば、液状担体
としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキ
シプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステア
リン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。
注射剤の場合、一般に水、生理食塩水、各種緩衝液が望
ましい。また、凍結乾燥製剤とし経口剤として用いた
り、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌
水、生理食塩水、電解質溶液等の静脈投与用液体に溶解
して投与することもできる。
検査剤は、上記の１位の炭素が13Ｃで標識されたフェニ
ルアラニン（以下、標識フェニルアラニンという）を単
独で、あるいは賦形剤または担体と混合し、投与経路に
応じて経口剤（錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、液剤
等）、注射剤などに製剤化される。賦形剤または担体と
しては、当分野で常套的に使用され、薬剤学的に許容さ
れるものであればよく、その種類及び組成は、投与経路
や投与方法によって適宜変更される。例えば、液状担体
としては水が用いられる。固体担体としては、ヒドロキ
シプロピルセルロースなどのセルロース誘導体、ステア
リン酸マグネシウムなどの有機酸塩などが使用される。
注射剤の場合、一般に水、生理食塩水、各種緩衝液が望
ましい。また、凍結乾燥製剤とし経口剤として用いた
り、それを投与時に注射用の適当な溶剤、例えば滅菌
水、生理食塩水、電解質溶液等の静脈投与用液体に溶解
して投与することもできる。
【００１１】製剤中における標識フェニルアラニンの含
量は、製剤の種類により異なるが、通常10〜100 重量
％、好ましくは50〜100 重量％である。例えば注射剤の
場合には、通常１〜３重量％となるよう標識フェニルア
ラニンを添加すればよい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、
粉剤の場合は、標識フェニルアラニンの含量は、約10〜
100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は
担体である。
量は、製剤の種類により異なるが、通常10〜100 重量
％、好ましくは50〜100 重量％である。例えば注射剤の
場合には、通常１〜３重量％となるよう標識フェニルア
ラニンを添加すればよい。カプセル剤、錠剤、顆粒剤、
粉剤の場合は、標識フェニルアラニンの含量は、約10〜
100 重量％、好ましくは50〜100 重量％であり、残部は
担体である。
【００１２】本発明のフェニルアラニン水酸化酵素活性
検査剤の投与量は、投与による呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度
の増加率を確認できる量が必要であり、被験者の年齢、
体重、検査目的により異なるが、例えば１回当たりの投
与量は成人の場合、１〜500mg/kg体重程度である。以下
に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明
の範囲はこれらの何ら限定されるものではない。
検査剤の投与量は、投与による呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度
の増加率を確認できる量が必要であり、被験者の年齢、
体重、検査目的により異なるが、例えば１回当たりの投
与量は成人の場合、１〜500mg/kg体重程度である。以下
に、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明
の範囲はこれらの何ら限定されるものではない。
【００１３】
〔実施例１〕本発明に使用する標識フェニルアラニンの
13Ｃ標識位置における13Ｃ純度は99%以上である。その
他特に明記しない限り特級試薬を用いた。尚、実験終了
後のラットは過剰量のネンブタールを投与し屠殺した。
13Ｃ標識位置における13Ｃ純度は99%以上である。その
他特に明記しない限り特級試薬を用いた。尚、実験終了
後のラットは過剰量のネンブタールを投与し屠殺した。
【００１４】［１］方法 (1) 試験用ラットの作成 被験動物として、雄性Sprague-Dawley (SD) ラットを、
日本チャールズリバー社より購入した。購入したラット
は、23±２℃、湿度 55 ±10% の条件で使用時まで飼育
した。10週齢の当該ラットにネンブタール腹腔内投与
（50 mg/kg）で麻酔後、フェニルアラニン水酸化酵素活
性を低下させるためにガラクトサミン塩酸塩（200 mg/m
l 生理食塩水溶液）を 1〜1.2 g/kg腹腔内投与した [Ko
ff, S. etal., Proc. Soc. Exptl. Med 137, 696 (197
1) ; Keppler, D. et al., Exp. Mol. Pathology, 9,
279 (1968) ;（疾患別）モデル動物の作製と新薬開発の
ための試験・実験法、内貴正治 監修、126 (1993)] 。
2 日後に以下の試験に供した。ガラクトサミン投与ラッ
ト群、非投与ラット群とも試験前日には一晩絶食を行っ
た。
日本チャールズリバー社より購入した。購入したラット
は、23±２℃、湿度 55 ±10% の条件で使用時まで飼育
した。10週齢の当該ラットにネンブタール腹腔内投与
（50 mg/kg）で麻酔後、フェニルアラニン水酸化酵素活
性を低下させるためにガラクトサミン塩酸塩（200 mg/m
l 生理食塩水溶液）を 1〜1.2 g/kg腹腔内投与した [Ko
ff, S. etal., Proc. Soc. Exptl. Med 137, 696 (197
1) ; Keppler, D. et al., Exp. Mol. Pathology, 9,
279 (1968) ;（疾患別）モデル動物の作製と新薬開発の
ための試験・実験法、内貴正治 監修、126 (1993)] 。
2 日後に以下の試験に供した。ガラクトサミン投与ラッ
ト群、非投与ラット群とも試験前日には一晩絶食を行っ
た。
【００１５】(2) 赤外分光装置による13Ｃ濃度連続測
定 静脈内投与 (1)で作成したガラクトサミン投与ラット群、非投与ラ
ット群をネンブタール腹腔内投与（50mg/kg)で麻酔し、
手術台に固定し、頭部に呼気吸引用のキャップを被せ
た。ストロークポンプ〔バリアブル・ストロークポンプ
VS-500、（株）柴田科学工業〕を用いて呼気を約100ml/
min の速度で吸引し、そのまま13ＣＯ2 アナライザーEX
-130S 〔（株）日本分光〕のフローセルに導入した。呼
気吸引用のキャップとストロークポンプの間にはシリカ
ゲルを充填したカラムを設置し、呼気中の水蒸気を除去
した。13ＣＯ2 アナライザーから出力されるデータはＡ
Ｄ変換した後、パーソナルコンピュータ（Apple Power
Macintosh 8500) に取り込み、データ処理ソフトウェア
Lab VIEW (National Instruments）を用いて5 秒後間隔
で100msec 毎10点のデータを積算平均し、13Ｃatom% 、
Δ13Ｃ（‰）、炭酸ガス濃度(%) に変換することで連続
測定結果を得た。変換したデータはリアルタイムで画面
表示した後、ハードディスクに保存した。１−13Ｃ−フ
ェニルアラニン水酸化酵素 (ICON社製) は生理食塩水に
溶解して大腿静脈より投与した。呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃
度測定中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントロ
ーラTR-100（Fine Scinece Tools Inc.)により、37±0.
5 ℃に維持した。また、呼気中の炭酸ガス濃度は3 ±0.
5%に維持した。尚、Δ13Ｃ（‰）は各時点の呼気ＣＯ2
中の13Ｃ濃度(13C tmin)とCO2 標準ガスの13Ｃ濃度( 13
C std)から下式により算出した。
定 静脈内投与 (1)で作成したガラクトサミン投与ラット群、非投与ラ
ット群をネンブタール腹腔内投与（50mg/kg)で麻酔し、
手術台に固定し、頭部に呼気吸引用のキャップを被せ
た。ストロークポンプ〔バリアブル・ストロークポンプ
VS-500、（株）柴田科学工業〕を用いて呼気を約100ml/
min の速度で吸引し、そのまま13ＣＯ2 アナライザーEX
-130S 〔（株）日本分光〕のフローセルに導入した。呼
気吸引用のキャップとストロークポンプの間にはシリカ
ゲルを充填したカラムを設置し、呼気中の水蒸気を除去
した。13ＣＯ2 アナライザーから出力されるデータはＡ
Ｄ変換した後、パーソナルコンピュータ（Apple Power
Macintosh 8500) に取り込み、データ処理ソフトウェア
Lab VIEW (National Instruments）を用いて5 秒後間隔
で100msec 毎10点のデータを積算平均し、13Ｃatom% 、
Δ13Ｃ（‰）、炭酸ガス濃度(%) に変換することで連続
測定結果を得た。変換したデータはリアルタイムで画面
表示した後、ハードディスクに保存した。１−13Ｃ−フ
ェニルアラニン水酸化酵素 (ICON社製) は生理食塩水に
溶解して大腿静脈より投与した。呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃
度測定中、直腸温をモニターし、小動物用体温コントロ
ーラTR-100（Fine Scinece Tools Inc.)により、37±0.
5 ℃に維持した。また、呼気中の炭酸ガス濃度は3 ±0.
5%に維持した。尚、Δ13Ｃ（‰）は各時点の呼気ＣＯ2
中の13Ｃ濃度(13C tmin)とCO2 標準ガスの13Ｃ濃度( 13
C std)から下式により算出した。
【００１６】
【式１】 Δ13C （‰）＝｛(13C tmin-13C 0min)/13C st
d ｝×1000 経口投与 ラットを無麻酔のままマイクロ波照射装置用ラットホル
ダー内に固定し、ストロークポンプ〔バリアブル・スト
ロークポンプVS-500、（株）柴田科学工業〕を用いて呼
気を約100 〜300ml/min の速度で吸引し、そのまま13Ｃ
Ｏ2 アナライザーEX-130S 〔（株）日本分光〕のフロー
セルに導入した。静脈内投与の場合を同様に呼気測定を
開始し、炭酸ガス濃度が安定した状態でいったん固定用
ホルダーからラットを出して、蒸留水に溶解した１−13
Ｃ−フェニルアラニン (ICON社製) を経口投与用ゾンデ
を用いて胃内に投与した。呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度測定
中、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は3 ±1.0%に維持した。
d ｝×1000 経口投与 ラットを無麻酔のままマイクロ波照射装置用ラットホル
ダー内に固定し、ストロークポンプ〔バリアブル・スト
ロークポンプVS-500、（株）柴田科学工業〕を用いて呼
気を約100 〜300ml/min の速度で吸引し、そのまま13Ｃ
Ｏ2 アナライザーEX-130S 〔（株）日本分光〕のフロー
セルに導入した。静脈内投与の場合を同様に呼気測定を
開始し、炭酸ガス濃度が安定した状態でいったん固定用
ホルダーからラットを出して、蒸留水に溶解した１−13
Ｃ−フェニルアラニン (ICON社製) を経口投与用ゾンデ
を用いて胃内に投与した。呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度測定
中、吸引呼気中の炭酸ガス濃度は3 ±1.0%に維持した。
【００１７】(3) 肝フェニルアラニン水酸化酵素活性の
測定 呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度測定後、開腹し脱血後全肝を摘
出した。摘出した肝臓は100ml の氷冷した生理食塩水で
洗浄し、キムワイプ（十条キンバリー社製）で余分な水
を拭き取った後、50mlファルコンチューブに移して秤量
した。チューブに同重量の50mM Pipes-Kバッファー（pH
7.0)を加え、ポリトロン(Model PCU-11with PTA20S 、K
INEMATICA) (2000〜3000rpm)を用いて破砕し、2 倍重量
の50mMPipes-Kバッファー（pH7.0)を加え一様に混ぜ
た。破砕液の一部をマイクロチューブに移し、12,000×
g 、10分間遠心し、上清に粗抽出液を得た。得られた粗
抽出液は-80 ℃に保存した。
測定 呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度測定後、開腹し脱血後全肝を摘
出した。摘出した肝臓は100ml の氷冷した生理食塩水で
洗浄し、キムワイプ（十条キンバリー社製）で余分な水
を拭き取った後、50mlファルコンチューブに移して秤量
した。チューブに同重量の50mM Pipes-Kバッファー（pH
7.0)を加え、ポリトロン(Model PCU-11with PTA20S 、K
INEMATICA) (2000〜3000rpm)を用いて破砕し、2 倍重量
の50mMPipes-Kバッファー（pH7.0)を加え一様に混ぜ
た。破砕液の一部をマイクロチューブに移し、12,000×
g 、10分間遠心し、上清に粗抽出液を得た。得られた粗
抽出液は-80 ℃に保存した。
【００１８】0.75ml の粗抽出液を予め50mM Pipes-Kバ
ッファー（pH7.0)で平衡化したHi-Trap desalting カラ
ム（φ16mm×25mm, Pharmacia)で脱塩し、1.5ml のタン
パク質画分を得、さらに200,000 ×g 、30分間遠心し、
得られた上清を粗酵素液とした。タンパク質の濃度の測
定にはBIO-RAD Protein Assay を用いた。
ッファー（pH7.0)で平衡化したHi-Trap desalting カラ
ム（φ16mm×25mm, Pharmacia)で脱塩し、1.5ml のタン
パク質画分を得、さらに200,000 ×g 、30分間遠心し、
得られた上清を粗酵素液とした。タンパク質の濃度の測
定にはBIO-RAD Protein Assay を用いた。
【００１９】フェニルアラニン水酸化酵素活性の測定
は、酵素反応終了後、反応産物のチロシンの定量をする
ことで行った。まず、10mMフェニルアラニン 60 U/μL
カタラーゼ、50mM Pipes-Kバッファー(pH7.0) 粗酵素液
(0.3mg/ml protein)を含む反応溶液を25℃で20分間プレ
インキュベートした。0.15mM (終濃度) 6,7 −ジメチル
−4,5,6,7 −テトラヒドロプロテイン (0.005N塩酸溶液
に溶解) 、10mM (終濃度) 1,4 −ジチオエリトリトール
を加えて反応を開始し、25℃で20分間反応した。終濃度
が10% になるようにトリクロロ酢酸を加えて反応を停止
した。
は、酵素反応終了後、反応産物のチロシンの定量をする
ことで行った。まず、10mMフェニルアラニン 60 U/μL
カタラーゼ、50mM Pipes-Kバッファー(pH7.0) 粗酵素液
(0.3mg/ml protein)を含む反応溶液を25℃で20分間プレ
インキュベートした。0.15mM (終濃度) 6,7 −ジメチル
−4,5,6,7 −テトラヒドロプロテイン (0.005N塩酸溶液
に溶解) 、10mM (終濃度) 1,4 −ジチオエリトリトール
を加えて反応を開始し、25℃で20分間反応した。終濃度
が10% になるようにトリクロロ酢酸を加えて反応を停止
した。
【００２０】酵素反応停止後30分以上放置したのち、1
0,000×g 、10分間遠心し、得られた上清200 μl に、1
00 μl の1mg/mlニトロソ−ナフトール（エタノール
中）およびHNO3-NaNO2混液（20% HNO3, 0.5mg/ml NaN
O2) を添加し、55℃で30分間インキュベートした。氷上
で冷却した反応液に1ml のジクロロエタンを添加し、よ
く混合し、10,000×g 、2 分間遠心し、上清300 μl を
96穴マイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダ
ー(SPECTRA MAX250 、Molecular Devices Inc.) を用い
て450nm の吸光度を測定した。１Ｕのフェニルアラニン
水酸化酵素は1 分間に1nmol のチロシンを生成する。
0,000×g 、10分間遠心し、得られた上清200 μl に、1
00 μl の1mg/mlニトロソ−ナフトール（エタノール
中）およびHNO3-NaNO2混液（20% HNO3, 0.5mg/ml NaN
O2) を添加し、55℃で30分間インキュベートした。氷上
で冷却した反応液に1ml のジクロロエタンを添加し、よ
く混合し、10,000×g 、2 分間遠心し、上清300 μl を
96穴マイクロプレートに移し、マイクロプレートリーダ
ー(SPECTRA MAX250 、Molecular Devices Inc.) を用い
て450nm の吸光度を測定した。１Ｕのフェニルアラニン
水酸化酵素は1 分間に1nmol のチロシンを生成する。
【００２１】[2] 結果 (1) フェニルアラニン水酸化酵素活性 ガラクトサミン投与ラット群(12 〜24) および非投与ラ
ット群（ラット１〜11）について、フェニルアラニン水
酸化酵素活性を上記方法により測定した。その結果、ガ
ラクトサミン投与ラット群(12 〜24) は、フェニルアラ
ニン酵素活性が0.99〜6.17U/mg proteinの範囲にあり、
一方、非投与ラット群（ラット１〜11）ではフェニルア
ラニン酵素活性が5.81〜12.10U/mg protein の範囲であ
った。よって、ガラクトサミン投与ラット群は非投与ラ
ット群に比べて低いフェニルアラニン酵素活性を示すこ
とが確認された。
ット群（ラット１〜11）について、フェニルアラニン水
酸化酵素活性を上記方法により測定した。その結果、ガ
ラクトサミン投与ラット群(12 〜24) は、フェニルアラ
ニン酵素活性が0.99〜6.17U/mg proteinの範囲にあり、
一方、非投与ラット群（ラット１〜11）ではフェニルア
ラニン酵素活性が5.81〜12.10U/mg protein の範囲であ
った。よって、ガラクトサミン投与ラット群は非投与ラ
ット群に比べて低いフェニルアラニン酵素活性を示すこ
とが確認された。
【００２２】
【表１】
【００２３】(2) 呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率
（Δ13Ｃ（‰))の経時変化 (2-1) 静脈内投与 上記のラット１〜24からなるラット群のうち、ラット1
〜7 および12〜20に１−13Ｃ−フェニルアラニンを静脈
内投与し（投与量20mg/kg)、その後の呼気ＣＯ2 中の13
Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経時変化を調べた。そ
の結果を図１に示す。
（Δ13Ｃ（‰))の経時変化 (2-1) 静脈内投与 上記のラット１〜24からなるラット群のうち、ラット1
〜7 および12〜20に１−13Ｃ−フェニルアラニンを静脈
内投与し（投与量20mg/kg)、その後の呼気ＣＯ2 中の13
Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経時変化を調べた。そ
の結果を図１に示す。
【００２４】フェニルアラニン水酸化酵素活性が9.85U/
mg proteinであったラット５では投与後約３分で231.00
‰に達するまで直線的に増加し、その後徐々に減少し、
投与後10分では120.52‰であった。一方、フェニルアラ
ニン水酸化酵素活性が1.05U/mg proteinであったラット
18では投与後約３分で3.15‰で、その後もΔ13Ｃ（‰)
はほとんど増加せず、投与後10分で3.21‰であった。フ
ェニルアラニン水酸化酵素活性が6.17U/mg proteinであ
ったラット12では投与後約３分で115.00‰に達するまで
Δ13Ｃ（‰) が直線的に増加し、その後徐々に減少し投
与後10分で45.28 ‰と、10分間の測定時間中ラット５に
比べ、低い値をとり続けた。
mg proteinであったラット５では投与後約３分で231.00
‰に達するまで直線的に増加し、その後徐々に減少し、
投与後10分では120.52‰であった。一方、フェニルアラ
ニン水酸化酵素活性が1.05U/mg proteinであったラット
18では投与後約３分で3.15‰で、その後もΔ13Ｃ（‰)
はほとんど増加せず、投与後10分で3.21‰であった。フ
ェニルアラニン水酸化酵素活性が6.17U/mg proteinであ
ったラット12では投与後約３分で115.00‰に達するまで
Δ13Ｃ（‰) が直線的に増加し、その後徐々に減少し投
与後10分で45.28 ‰と、10分間の測定時間中ラット５に
比べ、低い値をとり続けた。
【００２５】呼気測定時間中、いずれの測定時間におい
てもフェニルアラニン水酸化酵素活性が低いラットほど
低いΔ13Ｃ（‰) を示す傾向が見られた。同一個体にお
ける呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))と
フェニルアラニン水酸化酵素活性をプロットしたとこ
ろ、投与後２分のΔ13Ｃ（‰）とフェニルアラニン水酸
化酵素活性との間には高い相関が見られた（n=16, r=0.
795)（図２）。
てもフェニルアラニン水酸化酵素活性が低いラットほど
低いΔ13Ｃ（‰) を示す傾向が見られた。同一個体にお
ける呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))と
フェニルアラニン水酸化酵素活性をプロットしたとこ
ろ、投与後２分のΔ13Ｃ（‰）とフェニルアラニン水酸
化酵素活性との間には高い相関が見られた（n=16, r=0.
795)（図２）。
【００２６】(2-2) 経口投与 上記のラット１〜24からなるラット群のうち、ラット8
〜11および21〜24に１−13Ｃ−フェニルアラニンを経口
投与し（投与量60mg/kg)、その後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ
濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経時変化を調べた。その
結果を図３に示す。
〜11および21〜24に１−13Ｃ−フェニルアラニンを経口
投与し（投与量60mg/kg)、その後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ
濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経時変化を調べた。その
結果を図３に示す。
【００２７】フェニルアラニン水酸化酵素活性が7.5U/m
g protein であったラット10では投与後約15分で378.13
‰に達するまで直線的に増加し、その後徐々に減少し、
投与後30分では228.4 ‰であった。一方、フェニルアラ
ニン水酸化酵素活性が1.95U/mg proteinであったラット
23では投与後15分で22.1‰で、その後もΔ13Ｃ（‰)の
増加は非常に穏やかで、投与後30分では26.0‰であっ
た。フェニルアラニン水酸化酵素活性が3.83U/mg prote
inであったラット21では投与後15分で176.2 ‰に達する
までΔ13Ｃ（‰) が直線的に増加し、その後減少に転
じ、投与後30分では126.6 ‰であった。ラット19のΔ13
Ｃ（‰) の経時変化と比べると、30分間の測定時間中、
ラット21のΔ13Ｃ（‰) は常に低かった。
g protein であったラット10では投与後約15分で378.13
‰に達するまで直線的に増加し、その後徐々に減少し、
投与後30分では228.4 ‰であった。一方、フェニルアラ
ニン水酸化酵素活性が1.95U/mg proteinであったラット
23では投与後15分で22.1‰で、その後もΔ13Ｃ（‰)の
増加は非常に穏やかで、投与後30分では26.0‰であっ
た。フェニルアラニン水酸化酵素活性が3.83U/mg prote
inであったラット21では投与後15分で176.2 ‰に達する
までΔ13Ｃ（‰) が直線的に増加し、その後減少に転
じ、投与後30分では126.6 ‰であった。ラット19のΔ13
Ｃ（‰) の経時変化と比べると、30分間の測定時間中、
ラット21のΔ13Ｃ（‰) は常に低かった。
【００２８】呼気測定時間中、いずれの測定時間におい
てもフェニルアラニン水酸化酵素活性が低いラットほど
低いΔ13Ｃ（‰) を示す傾向が見られた。同一個体にお
ける呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))と
フェニルアラニン水酸化酵素活性をプロットしたとこ
ろ、経口投与した場合も、投与後15分のΔ13Ｃ（‰))と
フェニルアラニン水酸化酵素活性との間には高い相関が
見られた（n=8, r=0.941) （図４）。
てもフェニルアラニン水酸化酵素活性が低いラットほど
低いΔ13Ｃ（‰) を示す傾向が見られた。同一個体にお
ける呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))と
フェニルアラニン水酸化酵素活性をプロットしたとこ
ろ、経口投与した場合も、投与後15分のΔ13Ｃ（‰))と
フェニルアラニン水酸化酵素活性との間には高い相関が
見られた（n=8, r=0.941) （図４）。
【００２９】以上の結果から、１−13Ｃ−フェニルアラ
ニンを投与し、一定時間後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の
増加率（Δ13Ｃ（‰))を調べることによって、生体のフ
ェニルアラニン水酸化酵素活性を知ることが可能である
ことが明らかとなった。
ニンを投与し、一定時間後の呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の
増加率（Δ13Ｃ（‰))を調べることによって、生体のフ
ェニルアラニン水酸化酵素活性を知ることが可能である
ことが明らかとなった。
【００３０】〔製剤例１〕 （注射剤) １−13Ｃ−フェニルアラニン１０重量部に対し、生理食
塩水を加え全量を１００重量部として、これを溶解後ミ
リポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバ
イアル瓶にとり、密封して注射剤を得た。
塩水を加え全量を１００重量部として、これを溶解後ミ
リポアフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバ
イアル瓶にとり、密封して注射剤を得た。
【００３１】〔製剤例２〕 （内服液剤） １−13Ｃ−フェニルアラニン１０重量部に対し、精製水
を加え全量を１００重量部として、これを溶解後ミリポ
アフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイア
ル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。
を加え全量を１００重量部として、これを溶解後ミリポ
アフィルターを用いて除菌濾過した。この濾液をバイア
ル瓶にとり、密封して内服液剤を得た。
【００３２】
【発明の効果】本発明によれば、被験者の身体的負担が
小さく、正確な検査結果を即時に知ることができ、かつ
副作用がなく安全に使用できるフェニルアラニン水酸化
酵素活性検査剤が提供される。
小さく、正確な検査結果を即時に知ることができ、かつ
副作用がなく安全に使用できるフェニルアラニン水酸化
酵素活性検査剤が提供される。
【図１】 １−13Ｃ−フェニルアラニン静脈内投与によ
る呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経
時変化を示す。
る呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経
時変化を示す。
【図２】 １−13Ｃ−フェニルアラニン静脈内投与後２
分のΔ13Ｃ（‰) とフェニルアラニン水酸化酵素活性と
の相関を示す。
分のΔ13Ｃ（‰) とフェニルアラニン水酸化酵素活性と
の相関を示す。
【図３】 １−13Ｃ−フェニルアラニン経口投与による
呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経時
変化を示す。
呼気ＣＯ2 中の13Ｃ濃度の増加率（Δ13Ｃ（‰))の経時
変化を示す。
【図４】 １−13Ｃ−フェニルアラニン経口投与後２分
のΔ13Ｃ（‰) とフェニルアラニン水酸化酵素活性との
相関を示す。
のΔ13Ｃ（‰) とフェニルアラニン水酸化酵素活性との
相関を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 柴田 邦彦 千葉県船橋市滝台町104−１−405
Claims (1)
- 【請求項１】 １位の炭素が13Ｃで標識されたフェニル
アラニンを含むフェニルアラニン水酸化酵素活性検査
剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9248974A JPH1180034A (ja) | 1997-09-12 | 1997-09-12 | フェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9248974A JPH1180034A (ja) | 1997-09-12 | 1997-09-12 | フェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1180034A true JPH1180034A (ja) | 1999-03-23 |
Family
ID=17186163
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9248974A Pending JPH1180034A (ja) | 1997-09-12 | 1997-09-12 | フェニルアラニン水酸化酵素活性検査剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1180034A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2003071271A1 (ja) * | 2002-02-21 | 2005-06-16 | 東京瓦斯株式会社 | 医薬品の薬理作用を評価するための検査薬、並びに酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法および試薬 |
| JPWO2013168694A1 (ja) * | 2012-05-07 | 2016-01-07 | 株式会社明治 | 非糖質性エネルギー産生増強剤 |
-
1997
- 1997-09-12 JP JP9248974A patent/JPH1180034A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPWO2003071271A1 (ja) * | 2002-02-21 | 2005-06-16 | 東京瓦斯株式会社 | 医薬品の薬理作用を評価するための検査薬、並びに酵素、酵素阻害剤若しくは受容体リガンドからなる薬物および／またはそのプロドラッグの中から投与効果が高いものおよび／または副作用が小さいものをスクリーニングする方法および試薬 |
| JPWO2013168694A1 (ja) * | 2012-05-07 | 2016-01-07 | 株式会社明治 | 非糖質性エネルギー産生増強剤 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050906 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20060328 |