JPH1189579A

JPH1189579A - 高等動物テロメラーゼ蛋白質及びそれをコードする遺伝子

Info

Publication number: JPH1189579A
Application number: JP9258450A
Authority: JP
Inventors: Fuyuki Ishikawa; 冬木石川; Yasuhiro Fujino; 泰寛藤野
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1997-09-24
Filing date: 1997-09-24
Publication date: 1999-04-06

Abstract

(57)【要約】【課題】細胞増殖及び細胞の老化等の生体制御機構の
解明や癌の治療薬の開発への有用性が期待される新規な
高等動物テロメラーゼ蛋白質及びそれをコードする遺伝
子を提供する。【解決手段】例えば配列表の配列番号１に記載のアミ
ノ酸配列で特定されるポリペプチドからなる高等動物テ
ロメラーゼ蛋白質及びそれをコードするヌクレオチド。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は高等動物のテロメラ
ーゼ蛋白質をコードする遺伝子及びその遺伝子産物に関
するものである。

【従来の技術】

【０００２】動物細胞などの真核細胞染色体の線状 DNA
の両末端はテロメアと呼ばれ、特殊な DNA配列とそれに
結合する蛋白質からなる複雑な高次構造をとっている。
テロメアDNA は、チミン(T) 及びグアニン(G) （反対鎖
はアデニン(A) 及びシトシン(C) ）の豊富な特徴的繰り
返し配列からなり、例えば、脊椎動物細胞染色体のテロ
メアDNA はTTAGGG（反対鎖はCCCTAA）の６塩基の繰り返
しで構成されている。この配列を利用したサザンブロッ
ティング解析により、ヒト体細胞のテロメア繰り返し配
列の平均長は７キロ〜10キロベースであることが明らか
にされた。

【０００３】テロメア構造は染色体の安定化に重要な機
能を有すると考えられている。例えば、テロメアが細胞
核の辺縁に位置することが酵母を用いた形態学的研究で
明かにされており、テロメアが染色体を核の特定の位置
に固定する「錨」として作用し、細胞核内で各染色体間
の物理的相互作用を制御している可能性が示唆されてい
る。また、以下のように、真核細胞の線状二本鎖DNA の
複製ごとの短縮化による染色体機能の不活化を防ぐ機能
を有することが示唆されている。

【０００４】線状二本鎖DNA の両鎖の同時複製の過程で
は、一方の DNA鎖（リーディング鎖）が3'末端をプライ
マーとして5'→3'DNA ポリメラーゼにより連続的に複製
されるのに対し、他方の DNA鎖（ラギング鎖）では小さ
い RNAプライマーを用いた断続的なものになる。従っ
て、新生鎖（ラギング鎖）の5'末端のRNA プライマーは
DNA に置き換えられないので、細胞分裂を繰り返す毎に
一方の娘細胞の5'末端が次第に短縮することになり、最
後には染色体が不安定になって細胞が死に至る。しかし
ながら、生殖細胞系列ではDNA の繰り返し複製によって
染色体機能が損なわれるような染色体DNA の短縮化が生
じないことが明らかにされており (Allsopp, R.C. et a
l., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 10114, 199
2) 、テロメアやそれに隣接する領域がヘアピン構造を
採ったり、短縮化に対する緩衝帯として機能している可
能性が示唆されている。

【０００５】テロメアが染色体の短縮化を防ぐ機能を有
することは、細胞の老化・不死化とテロメア繰り返し配
列の平均長の変化との関係からも強く示唆されている。
多細胞生物の線維芽細胞などをイン・ビトロで継代培養
すると、継代を経るにつれて増殖能が低下し、最終的に
は増殖能を失った「老化」細胞となるが、予め細胞内に
ある種の癌遺伝子を導入しておくと永久増殖能を獲得し
た不死化細胞が得られる場合がある。これらは細胞レベ
ル（イン・ビトロ）での老化現象及び発癌のモデルと理
解されているが、分子レベルでの研究により、正常細胞
では分裂回数の増加につれてテロメア繰り返し配列の平
均長が短縮化し、その平均長は継代可能回数と相関する
こと、並びに、不死化細胞ではテロメア繰り返し配列の
平均長が短いが、継代中にその平均長が変化しないこと
が明らかにされた。

【０００６】テロメア繰り返し配列平均長の制御機構の
一つとして、テロメア繰り返し配列を伸長させる RNA依
存性 DNAポリメラーゼ（テロメラーゼ）が注目されてい
る。この酵素は、原生動物テトラヒメナの大核抽出液中
から、テトラヒメナのテロメア繰り返し配列由来の合成
オリゴヌクレオチド(TTGGGG)の3'端に同じ６塩基の繰り
返し配列を付加する酵素として見い出されたものであ
り、活性に必要なサブユニットとしてテロメアDNA 配列
の5'-TTAGGG-3'に相補的な鋳型RNA を含み、鋳型RNA を
基にしてテロメアDNA の一本鎖を延長する一種の逆転写
酵素である。テロメラーゼの生物学的意義は、テトラヒ
メナや酵母などの下等真核生物で明らかにされた。すな
わち、テトラヒメナ・テロメラーゼRNA 遺伝子のテロメ
ア繰り返し配列の鋳型部分に点突然変異を導入した遺伝
子で形質転換された個体では、導入されたある種の点突
然変異に対応する変異テロメア繰り返し配列が生合成さ
れると同時に増殖不可能になる。また、パン酵母・テロ
メラーゼ RNA遺伝子である TLC1 が破壊されると、継代
を重ねるにつれてその酵母のテロメア繰り返し配列平均
長が短くなり、最終的には増殖不可能となる。従って、
単細胞真核生物ではテロメラーゼが細胞増殖に必須の酵
素であると理解されている。

【０００７】テロメラーゼに内蔵される鋳型RNAは、単
細胞真核生物を用いた研究で比較的早くから解析が進
み、哺乳類のテロメラーゼ構成因子としても、最初に同
定された。注目すべき知見として、ヒト子宮頚癌由来Ｈ
ｅＬａ細胞に対し、ヒト・テロメラーゼＲＮＡサブユニ
ット（ｈＴＲ）のアンチセンスＲＮＡを過剰発現させる
ことでテロメラーゼ活性を低下させると、その細胞は何
回か分裂した後、死滅した（Ｆｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２６９、１２３６、１９９５）との報告がある。こ
の結果は、癌細胞はその成立過程においてテロメラーゼ
活性の発現によりテロメアＤＮＡの短縮化を免れ、永久
増殖能を獲得しており、このような細胞はテロメラーゼ
の阻害に対して感受性を持つことを示唆するものであっ
た。

【０００８】一方、テロメラーゼの蛋白質因子について
も最近幾つかの知見が得られている。最初にテトラヒメ
ナ由来のテロメラーゼが精製され、そのcDNAがクローニ
ングされた (Ｃｏｌｌｉｎｓら、Cell、８１、６７７、
１９９５）。このテロメラーゼは鋳型RNA と結合する８
０ｋＤａのサブユニット（ｐ８０）及びプライマーとな
るDNA 末端に結合する95 kD のサブユニット（ｐ９５）
からなり、９５ｋＤａのサブユニットはRNA ウイルスの
RNAポリメラーゼに比較的類似の一次構造を有すること
が明かにされた。その後、ヒト及び齧歯類などの哺乳類
においてテトラヒメナｐ８０に構造的に類似する関連遺
伝子ＴＬＰ１／ＴＰ−１がクローニングされ、生細胞内
でテロメラーゼ活性複合体と結合していることが示され
た（Ｎａｋａｙａｍａら、Ｃｅｌｌ、８８、８７５、１
９９７、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、
２７５、９７３、１９９７）。さらに、ユープローテス
由来のテロメラーゼが精製され（Ｌｉｎｇｎｅｒら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３、
１０７１２、１９９６）、そのcDNAがクローニングされ
た。ユープローテステロメラーゼは鋳型RNA 及びプライ
マーとなるDNA 末端に結合する１２３ kD のサブユニッ
ト（ｐ１２３）と４５ kD のRNA結合サブユニットから
構成されており、さらにｐ１２３では、テロメラーゼが
特殊な逆転写酵素の一種であるとの予想どうり、逆転写
酵素に特徴的に保存されているアミノ酸配列モチーフが
全て保存されていた（Ｌｉｎｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、２７６、５６１、１９９７）。一方、出芽酵母の遺
伝学的スクリーニングからテロメラーゼの機能経路上に
存在すると予想される複数の遺伝子（ＥＳＴ１〜４）が
単離され、この中のひとつ、ＥＳＴ２は出芽酵母を用い
た遺伝子破壊の実験からテロメラーゼの活性発現に必須
であることが示された。ＥＳＴ２のcDNAがクローニング
され、一次構造が解析された結果、ＥＳＴ２もまたユー
プローテスｐ１２３同様の逆転写酵素モチーフが全て保
存されていた（Ｌｉｎｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２
７６、５６１、１９９７）。

【０００９】このようにテロメラーゼ蛋白質をコードす
るものとして複数の遺伝子群がすでに報告されている
が、いずれも各精製サブユニットを用いたテロメラーゼ
活性の試験管内再構成には至っておらず、その全貌は解
明されていない。また、出芽酵母の実験結果から、細胞
内でテロメラーゼが正常に機能するには、テロメラーゼ
活性複合体以外にも、テロメラーゼの機能経路上に存在
する遺伝子群の重要性が示唆されている。従って、新規
テロメラーゼ蛋白質を単離・同定することによって、高
等動物テロメラーゼの機能経路を含めた物質的実態を解
明するとともに、酵素学的見地からテロメラーゼの阻害
剤の研究を行い、テロメラーゼと癌の悪性度との関係を
解明することが強く望まれていた。

【００１０】

【問題点を解決するための手段】そこで本発明者らは、
高等動物テロメラーゼ蛋白質を単離・同定するべく鋭意
検討を重ね、構造的に全く新規のヒトテロメラーゼ蛋白
質をコードする遺伝子のクローニングに初めて成功し、
さらにその遺伝子から遺伝子産物である高等動物テロメ
ラーゼ蛋白質を発現させることに成功した。また、この
遺伝子産物を特異的に認識する抗体を作製し、これを用
いてテロメラーゼ活性とこの遺伝子産物との密接な関係
を証明することにも成功した。本発明はこれらの知見を
基にして完成されたものである。

【００１１】すなわち本発明は、配列表の配列番号１に
記載のアミノ酸配列に１又は２以上のアミノ酸残基によ
る置換、挿入、及び／又は欠失が存在しており、実質的
にヒトを含む高等動物テロメラーゼ蛋白質として機能す
ることを特徴とするポリペプチドに存し、その好ましい
態様として、ヒトの生体内でテロメラーゼ蛋白質として
機能することができる上記ポリペプチドが提供される。

【００１２】さらに本発明の別の態様によれば、上記の
各ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が提供さ
れる。このヌクレオチド配列としては、ＤＮＡ配列又は
ＲＮＡ配列を挙げることができ、例えば、その好ましい
態様として、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡ配列の
核酸番号２２４から核酸番号４８９１ (終始コドンを含
まず）で特定されるＤＮＡが提供される。以上に加え
て、上記ＤＮＡ配列を含む組換えベクター、該組換えベ
クターが導入された形質転換体、及び、該形質転換体を
培養した培養物から上記ＤＮＡ配列の遺伝子産物である
ポリペプチドを分離・採取する工程を含む、上記ポリペ
プチドの製造方法も提供される。

【００１３】本発明のさらに別の態様として、上記の各
ポリペプチドを特異的に認識することができる抗体、上
記の各ヌクレオチド配列の一部又は全部に相補的に結合
可能なヌクレオチド配列を含む核酸プローブが提供され
るが、これらの抗体又は核酸プローブは癌細胞検出用試
薬として有用であり、上記抗体又は核酸プローブを含む
癌診断用の医薬組成物が本発明の一態様として提供され
る。

【００１４】

【発明の実施の形態】本発明のポリペプチドの第一の態
様は、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列で特定
され、ヒト由来のテロメラーゼ蛋白質を構成するポリペ
プチドに相当するものである。本発明により提供される
上記ポリペプチドは、配列番号１に記載された特定のポ
リペプチドに限定されることはなく、配列表の配列番号
１に示されたアミノ酸配列に１又は２以上のアミノ酸残
基による置換、挿入、及び／又は欠失が存在しており、
実質的に高等動物、好ましくはヒトのテロメラーゼ蛋白
質として実質的に機能することができるポリペプチドも
本発明の範囲に包含される。また、このようなポリペプ
チドをサブユニットとして含む高等動物テロメラーゼ蛋
白質も本発明の範囲に包含される。

【００１５】本発明のポリペプチドには、上記の各ポリ
ペプチドを部分配列として含むポリペプチドも包含され
る。例えば、上記の各ポリペプチドに対してその発現効
率を向上させる性質を有する適宜のアミノ酸配列を結合
させたポリペプチド、上記の各ポリペプチドに対してシ
グナル配列を結合させたポリペプチド、上記ポリペプチ
ドの発現を確認するために読み枠が変わらないように他
の蛋白質と上記ポリペプチドとを結合させた、いわゆる
タグ配列との融合蛋白質なども本発明の範囲に包含され
る。

【００１６】上記のポリペプチドのうちのいずれかをコ
ードするヌクレオチド配列は、いずれも本発明のヌクレ
オチド配列に包含される。本発明のテロメラーゼ蛋白質
をコードする遺伝子（本明細書において「テロメラーゼ
蛋白質遺伝子」あるいは「ｈＴＬＰ２」という場合があ
り、ヒトテロメラーゼを構成する新規ポリペプチドの全
長又はその一部をコードするヌクレオチド配列を意味す
るものとして用いる）としては、上記の第一の態様及び
第二の態様に包含されるポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列、好ましくはＤＮＡ配列を挙げることがで
きる。

【００１７】本明細書において「高等動物」という用語
は、ヒトを含む哺乳類動物を包含する概念として用い
る。このような高等動物、好ましくは哺乳類動物に由来
するテロメラーゼ蛋白質を構成するポリペプチドは、そ
れぞれ高い相同性を有していることが期待される。従っ
て、本明細書に詳細に開示されたヒト由来のテロメラー
ゼ蛋白質遺伝子についてのクローニング方法及びその遺
伝子の情報を基にすれば、当業者は高等動物由来のテロ
メラーゼ蛋白質を構成するポリペプチドをコードする遺
伝子を容易に入手できるとともに、その遺伝子産物を取
得することが可能であることはいうまでもない。

【００１８】本発明のテロメラーゼ蛋白質遺伝子は、例
えば、次のような方法によって得られる。本発明のテロ
メラーゼ蛋白質遺伝子を含有するＤＮＡライブラリーと
しては、不死化した高等動物細胞株、好ましくはヒト、
サル、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラッ
ト、マウスなどの細胞株から調製したＲＮＡを用いて公
知の常法により作成したプラスミドｃＤＮＡライブラリ
ー若しくはファージｃＤＮＡライブラリー、又はファー
ジゲノミックライブラリーなどが利用できる。

【００１９】例えば、ファージｃＤＮＡライブラリーを
用いる場合には、まず、癌などの組織、あるいは不死化
した高等動物細胞株を液体窒素中で粉砕し、グアニジン
イソチオシアネート水溶液等中でホモジナイズした後、
Ｃｈｉｒｇｗｉｎらの方法［Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
１８、５２９４−５２９９（１９７９）］に従って塩
化セシウム平衡密度勾配遠心法によって全ＲＮＡを沈澱
として分離する。ＲＮＡの分離には市販のＲＮＡｚｏｌ
（ＴｅｌＴｅｓｔ社）などの抽出試薬を使用することも
できる。ＲＮＡの分離後、フェノール抽出、エタノール
沈澱により全ＲＮＡを精製し、オリゴ（ｄＴ）セルロー
スカラムクロマトグラフィーに付して精製することによ
り、目的のテロメラーゼ蛋白質のｍＲＮＡを含むポリ
（Ａ）含有ｍＲＮＡ（ｐｏｌｙＡ⁺ｍＲＮＡ）群を調製
することができる。

【００２０】次に、上記で調製したｍＲＮＡ群に対し
て、例えば、デオキシチミジンが１２個から１８個連結
したいわゆるＯｌｉｇｏ（ｄＴ）配列自体、又はネーチ
ャー［Ｎａｔｕｒｅ３２９、８３６−８３８（１９８
７）］に記載されているようなＯｌｉｇｏ（ｄＴ）配列
を含有するような合成ＤＮＡにより構成されるプライマ
ーＤＮＡをハイブリダイズさせ、逆転写酵素により１本
鎖ｃＤＮＡを合成する。市販のｃＤＮＡの合成キットに
もこれに類する配列が利用されているので、そのような
配列を用いてもよい。その後、市販プライマーに対する
ＰＣＲ反応用の合成ＤＮＡ（通常はキットに添付されて
いるもの自体）を用いてＰＣＲ反応を行えば良い。ま
た、前記文献［Ｎａｔｕｒｅ３２９、８３６−８３８
（１９８７）］に記載されているようなプライマーＤＮ
Ａを用いる場合には、その配列に相補的な配列を設計
し、ＰＣＲ反応用のプライマーとしてあらかじめ用意し
ておくことが好ましい。その後、大腸菌のＤＮＡポリメ
ラーゼＩ、大腸菌のＤＮＡリガーゼ、ＲＮａｓｅＨを用
いて、常法に従って２本鎖ｃＤＮＡを合成する。次い
で、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによりｃＤＮＡの末端を平
滑化した後、いわゆるＥｃｏＲＩアダプター等の、制限
酵素により切断された形をなすＤＮＡの小断片をＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼによりｃＤＮＡ鎖の両末端に付加する。

【００２１】この際、例えばＥｃｏＲＩメチレース等の
ＤＮＡメチレースでｃＤＮＡ中の制限酵素切断点をメチ
ル化し（例えば、ＥｃｏＲＩメチレースの場合はＥｃｏ
ＲＩ切断点のメチル化を行い）、制限酵素ＥｃｏＲＩの
切断からｃＤＮＡを保護しておき、次に、ｃＤＮＡの末
端に、いわゆるＥｃｏＲＩリンカー等をＴ４ＤＮＡリガ
ーゼにより付加した後、制限酵素ＥｃｏＲＩでリンカー
ＤＮＡ部分のみを切断しても同様な結果が得られる。ベ
クターのクローニングサイトとして、例えばＢａｍＨＩ
などの他の制限酵素の切断点を選択する場合には、前述
の一連の末端処理の操作を、例えばＢａｍＨＩアダプタ
ーの結合もしくはＢａｍＨＩメチレース、ＢａｍＨＩリ
ンカー、ＢａｍＨＩ等の組み合わせで処理することによ
っても同様な結果を得ることができる。

【００２２】上記の様に末端処理されたｃＤＮＡ鎖を市
販のλファージベクター、例えばλＺＡＰ（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ社）等のλファージベクターまたはｐＧＥＭ
２（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃｈ社）等のプラスミド
ベクターのＥｃｏＲＩ切断部位に常法に従って挿入する
ことにより、組換えλファージＤＮＡ群または組換えプ
ラスミドＤＮＡ群を製造することができる。あるいは、
ＰＣＲ反応を用いて断片を取得する場合には、ＰＣＲ反
応により増幅されたＤＮＡの断片の末端に特異的に
〔Ａ〕が付加されるために、それに相補的な〔Ｔ〕を付
加したベクター、例えばｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社）やｐＴ７（Ｎｏｖａｇｅｎ社）などのベクター
を用いて製造することができる。

【００２３】このようにして得られた組換えλファージ
ＤＮＡ群を材料として、市販のイン・ビトロ・パッケー
ジング・キット、例えばギガパック・ゴールド（プロメ
ガ・バイオテック社）などを用いていわゆるイン・ビト
ロ・パッケージングを行い、組換えλファージＤＮＡを
有するλファージ粒子を製造することができる。パッケ
ージングは、一般には、市販のキットの添付説明書の条
件に従って行えばよい。得られたλファージ粒子を常
法、例えばＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓらの方法（「Ｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ１９８２
年）に従い、例えば大腸菌などの宿主に形質導入し、得
られた形質転換体を増殖させることによってファージｃ
ＤＮＡライブラリーを作ることができる。また、組換え
プラスミドＤＮＡ群では、常法に従い、例えば大腸菌な
どの宿主に形質転換し、得られた形質転換体を増殖させ
ことによって、プラスミドｃＤＮＡライブラリーを得る
ことができる。

【００２４】次に、これらファージあるいは大腸菌など
の形質転換体を増殖させ、例えばジーンスクリーニング
プラス（Ｄｕｐｏｎ社）などのナイロン膜あるいはニト
ロセルロース膜上に移し取り、アルカリ存在下で蛋白を
除くことにより調製したλファージＤＮＡあるいはプラ
スミドＤＮＡに対して、後述の方法で増幅された高等動
物テロメラーゼ蛋白質遺伝子の部分断片から作製した［
³²Ｐ］標識プローブをハイブリダイズさせ、プラークハ
イブリダイゼーション法によって選択し、目的とする高
等動物テロメラーゼ蛋白質遺伝子をコードするｃＤＮＡ
クローンの全部または一部を得ることができる。

【００２５】ファージｃＤＮＡライブラリーまたはプラ
スミドｃＤＮＡライブラリーから目的とする高等動物テ
ロメラーゼ蛋白質遺伝子をコードするｃＤＮＡクローン
を選択する為に用いるプローブは、常法に従い、例えば
市販のキット等を用いて調製することができる。例え
ば、既知のテロメラーゼ蛋白質（Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｃ
ｅｌｌ、８１、６７７−６８６、１９９５）をコードす
る遺伝子に由来するＤＮＡ配列や、そのアミノ酸配列と
相同性を有するアミノ酸配列をコードし得る別の生物の
遺伝子のＤＮＡ配列をＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ
ｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）などの遺伝子バンク中でＴＢＬ
ＡＳＴＮなどのプログラムを用いて検索し、ある程度相
同性を有するアミノ酸配列について、それをコードし得
るＤＮＡ配列を参考にしてオリゴヌクレオチドを合成し
てプローブとして用いることができる。また、同様な遺
伝子のＤＮＡ配列を基にＰＣＲプライマーを設計し、い
わゆるｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅＰＣＲ法によって、
より長いＤＮＡを取得してプローブとして用いてもよ
い。この場合、ＰＣＲ法に用いる鋳型には、目的のプロ
ーブＤＮＡを含む細胞由来のファージｃＤＮＡライブラ
リー、プラスミドｃＤＮＡライブラリー、または抽出し
たＲＮＡから常法に従って合成したｃＤＮＡなどを用い
ることができる。

【００２６】また、上記のように遺伝子ライブラリーを
ハイブリダイゼーション法でスクリーニングせずに、プ
ローブＤＮＡを設計したようにＰＣＲプライマーを設計
し、いわゆるＰＣＲ法で高等動物のテロメラーゼ蛋白質
遺伝子の一部を取得することもできる。その場合、ＰＣ
Ｒ法に用いる鋳型としては、前述のファージｃＤＮＡラ
イブラリー、プラスミドｃＤＮＡライブラリーの他、不
死化細胞より抽出したＲＮＡから常法に従って合成した
ｃＤＮＡを直接用いることができる。ＰＣＲ反応後、反
応液をアガロースやポリアクリルアミドゲル電気泳動で
解析し、二種類のプライマーにより増幅されるＤＮＡ断
片の中から、予想される大きさの断片を回収、精製し、
例えばｐＣＲ−ＩＩの様なＰＣＲ断片を直接組み込むこ
とができる市販のベクターに結合し、得られた組み換え
ベクターで大腸菌などの宿主を形質転換して塩基配列の
解析に用いることができる。さらに、得られた高等動物
テロメラーゼ蛋白質遺伝子の部分配列を基にして新たに
ＰＣＲプライマーを設計、合成し、高等動物テロメラー
ゼ蛋白質の配列を基に設計したＰＣＲプライマー、ある
いはｃＤＮＡを合成する際に用いるプライマーに対して
相補的な配列のプライマー、またはｃＤＮＡの両端に付
加したアンカー配列に対応するＰＣＲ用プライマー、ｃ
ＤＮＡが組み込まれたベクターに対するプライマーと、
新たに合成した上記プライマーとの間でＤＮＡの増幅を
繰り返し行うことによって高等動物テロメラーゼ蛋白質
の全長をコードする遺伝子を取得することもできる。

【００２７】ＰＣＲ反応の終了後、ＤＮＡの断片をアガ
ロース又はポリアクリルアミドゲル電気泳動に付して常
法に従って解析、回収、及び精製を行うことができる。
得られた精製ＤＮＡ断片を、例えばｐＣＲ−ＩＩの様な
ＰＣＲ断片を直接組み込むことができるベクターに挿入
し、得られた組み換えベクターで大腸菌を形質転換して
常法に従ってＤＮＡを調製し、Ｓａｎｇｅｒらのジデオ
キシ法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ、７４、５４６３、１９７７年］によって目的ＤＮＡ
断片の塩基配列を決定することができる。配列の決定は
ＡＢＩ３７３Ａ（アプライド・バイオ・システムズ社）
の様な自動シークエンサーによって行うこともできる。

【００２８】またファージライブラリーやプラスミドラ
イブラリーから得られたクローンの場合、一般的には、
自動シークエンサーを用いて塩基配列を決定できる配列
長には限界があるため、ベクターに挿入されたｃＤＮＡ
の全領域を一度に解析することが困難な場合がある。こ
のような場合には、断片を適当な制限酵素で切断した
後、断片をゲル電気泳動で分離、回収し、さらに回収し
た断片を適宜のベクターに挿入し直すことにより解析を
容易にすることができる。このような操作（サブクロー
ニング）の他、自動シークエンサーが決定した塩基配列
の中から適当な配列を選び、新たなプライマーを設計し
て、そこから先を継続して解析することもできる。この
ようにして決定されるＤＮＡ断片の配列を互いに重なる
ようにつなぎ合わせることにより、例えば、配列表の配
列番号１に記載したような高等動物テロメラーゼ蛋白質
を構成する全長ポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列をコードするヌクレオチド配列を決定することがで
きる。

【００２９】本発明のヌクレオチドにはＤＮＡ及びＲＮ
Ａが包含されるが、配列表の配列番号１には、ヒト由来
テロメラーゼ蛋白質を構成する全長ポリペプチドをコー
ドするＤＮＡ配列を好ましい態様として記載した。本発
明のヌクレオチドには、上記の配列番号１により特定さ
れるＤＮＡ配列のほか、それらがコードするポリペプチ
ドのアミノ酸配列に対して１又は２以上のアミノ酸残基
による置換、挿入、及び／又は欠失が導入されており、
実質的に高等動物テロメラーゼ蛋白質の全長又は部分ポ
リペプチドとして機能するポリペプチドをコードするヌ
クレオチドが包含される。このようなアミノ酸残基の置
換、挿入、及び／又は欠失等によるアミノ酸配列の改変
は、例えば、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓ．，Ｖ
ｏｌ．１０，６４８７−６５００（１９８２）、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌ．，Ｖｏｌ．２１７，
２１８−２２７（１９９３），同Ｖｏｌ．２１７，２７
０−２７８（１９９３）等に記載の部位特異的変異技術
により行うことができるが、これらの方法に限定される
ことはなく、当業者に利用可能なものであればいかなる
方法を用いてもよい。

【００３０】以上のようにして得られた高等動物テロメ
ラーゼ蛋白質遺伝子ＤＮＡの少なくとも一部分をハイブ
リダイゼーション・プローブまたはＰＣＲプライマーと
して用いることにより、他の種の高等動物テロメラーゼ
蛋白質遺伝子を同様な方法で単離することができる。

【００３１】上記のようにして得られる高等動物テロメ
ラーゼ蛋白質遺伝子ＤＮＡ又はそのＤＮＡ断片は、その
両端あるいはどちらか一端を改変し、またはそれ自体
で、公知の発現ベクターにそれ自体公知の方法でプロモ
ーターの下流に挿入することができ、このようにして製
造される遺伝子発現用の組換えベクターを、大腸菌、酵
母、動物細胞宿主等、公知の細胞中にそれ自体公知の方
法により導入して形質転換体を製造することができる。

【００３２】本発明の高等動物テロメラーゼ蛋白質の産
生方法につき詳細に説明すると、発現用ベクターとして
は、上記のようにして得られた高等動物テロメラーゼ蛋
白質をコードするＤＮＡを転写できる位置にプロモータ
ーを含有しているものが使用される。

【００３３】高等動物テロメラーゼ蛋白質の工業的生産
のためには、安定した宿主−ベクター系を構築するこ
と、さらに生物学的に活性を有する高等動物テロメラー
ゼ蛋白質を発現しうる系を用いる必要がある。高等動物
テロメラーゼ蛋白質は比較的大きな蛋白質であり、その
リフォールディングが生理活性の獲得に重要である。一
般的には、リフォールディングを考慮した場合、宿主と
して動物細胞を用いることが有利である。高等動物テロ
メラーゼは、数種の蛋白質及びＲＮＡサブユニットから
なる複合体として存在する可能性があり、生理活性のあ
る高等動物テロメラーゼとして組換え体から精製する場
合には、導入する高等動物テロメラーゼ蛋白質の由来す
る生物種と宿主細胞の由来する生物主の一致することが
好ましい。もっとも、高等動物テロメラーゼ蛋白質を大
腸菌で生産させた後、活性を有する複合体としてｉｎ
ｖｉｔｒｏで他の構成成分と再構成することが可能であ
ることはいうまでもない。

【００３４】動物細胞としては、例えばＣＨＯ細胞（生
物種：ハムスター）、ＣＯＳ細胞（生物種：サル）、Ｎ
ＩＨ３Ｔ３細胞（生物種：マウス）、Ｒａｔ−１（生物
種：ラット）細胞、ＶＡ−１３（生物種：ヒト）細胞等
が挙げられる。これらの細胞を宿主とした発現用プラス
ミドは、プロモーターとしてはＳＶ４０プロモーター由
来またはウイルス遺伝子由来のプロモーターが好まし
い。この下流に高等動物テロメラーゼ蛋白質遺伝子を
５’側から挿入する。また高等動物テロメラーゼ蛋白質
の生産量を上げるために、高等動物テロメラーゼ蛋白質
遺伝子を５’側から２〜３個つなげたものを挿入しても
よいし、各高等動物テロメラーゼ蛋白質遺伝子の５’側
にＳＶ４０などのプロモーターを挿入したものを２〜３
個つなげてもよい。この高等動物テロメラーゼ蛋白質遺
伝子の下流にポリアデニル化部位を含むことが好まし
く、例えばＳＶ４０ＤＮＡ、β−グロビン遺伝子または
メタロチオネイン遺伝子由来のものを用いることができ
る。

【００３５】このような発現ベクターは、例えばＣＨＯ
細胞などの動物細胞に形質転換した際の選択マーカーを
有していてもよい。選択マーカーを用いる場合には、例
えば、メトトレキセート耐性を与えるＤＨＦＲ遺伝子、
ネオマイシン誘導体Ｇ−４１８耐性遺伝子などを用いる
ことができる。各耐性遺伝子の５’側に例えばＳＶ４０
由来のプロモーターが挿入されており、各耐性遺伝子の
３’側にポリアデニル化部位が含まれていることが好ま
しい。高等動物テロメラーゼ蛋白質の発現ベクターに対
してこれらの耐性遺伝子を挿入する場合、高等動物テロ
メラーゼ蛋白質遺伝子のポリアデニル化部位下流に挿入
すればよい。また、発現ベクターは形質転換体の選択マ
ーカーを有していなくてもよい。この場合には、高等動
物テロメラーゼ蛋白質の発現ベクターと共に形質転換体
選択のマーカーを有するベクター、例えばｐＳＶ２ｎｅ
ｏ、ｐＳＶ２ｇｐｔ、ｐＭＴＶｄｈｆｒなどを用いて二
重形質転換することが好ましい。

【００３６】上記の高等動物テロメラーゼ蛋白質発現ベ
クター、またはそれに加えて形質転換体選択マーカーを
有するベクターにより形質転換した動物細胞を選択する
ためには、該選択マーカーの発現による表現形質を利用
することができる。さらに、高等動物テロメラーゼ蛋白
質の発現量の上昇を目的として、高等動物テロメラーゼ
蛋白質の発現が確認された細胞に対し、選択マーカーを
変更して形質転換を繰り返してもよい。発現ベクターに
使用されるプラスミドベクターの具体例としては、ＳＶ
４０初期プロモーター、ウサギのβ−グロビン遺伝子に
由来するスプライス配列ＤＮＡ、ウサギのβ−グロビン
遺伝子からのポリアデニ化部位、ＳＶ４０初期領域から
のポリアデニル化部位、並びにｐＢＲ３２２由来の複製
開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含有するｐＫＣ
Ｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、
７８、１５２８、（１９８１））などが挙げられる。

【００３７】発現ベクターの動物細胞への移入はリン酸
カルシウムやｃａｔｉｏｎｉｃｌｉｐｉｄをＤＮＡの
キャリアとして用いるトランスフェクション法が一般的
である。形質転換された動物細胞の培養は、常法により
浮遊培養または付着培養で行うことができる。培地とし
ては、ＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０などを用い、５〜１０
％血清存在下もしくは適当量のインシュリン、デキサメ
サゾン、トランスフェリンの存在下で培養を行うか、又
は無血清下で培養を行うことができる。高等動物テロメ
ラーゼ蛋白質を発現している動物細胞中には高等動物テ
ロメラーゼ蛋白質が大量に存在していると考えられるの
で、この形質転換体の培養物から得た蛋白抽出液を用い
て高等動物テロメラーゼ蛋白質の分離精製を行うことが
可能である。生産された高等動物テロメラーゼ蛋白質を
含む培養上清は各種クロマトグラフィー、例えば、ヘパ
リンセファロースもしくはブルーセファロース等を用い
たクロマトグラフィーにより精製可能である。

【００３８】また大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主とし
て用いるときには、発現ベクターはプロモーター、リボ
ゾーム結合（ＳＤ）配列、高等動物テロメラーゼ蛋白質
遺伝子、転写終結配列、およびプロモーターを制御する
遺伝子を含むことが好ましい。プロモーターとしては、
大腸菌、ファージ等由来のもの、例えばトリプトファン
合成酵素（ｔｒｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、
λファージＰＬ、ＰＲ、Ｔ５ファージの初期遺伝
子のプロモーターであるＰ２５、Ｐ２６プロモーター等
が挙げられる。また、これらは例えばｐａｃプロモータ
ー［Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５２、９８３−
９８８、１９８８年］のように独自に改変、設計された
配列でも良い。

【００３９】リボゾーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでもよいが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリボプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。

【００４０】発現に必要なこれらの因子の発現プラスミ
ド上での配列順序は、例えば、５’上流から、プロモー
ター、ＳＤ配列、高等動物テロメラーゼ蛋白質遺伝子、
転写終結因子の順であることが望ましい。また発現ベク
ター上のＳＤ配列と高等動物テロメラーゼ蛋白質遺伝子
とのユニットを複数個同方向に挿入することにより、ベ
クター上の転写単位のコピー数を増加させる方法（特開
平１−９５７９８号公報などに記載の方法）を用いるこ
ともできる。

【００４１】発現した高等動物テロメラーゼ蛋白質を大
腸菌などの形質転換体からの簡便に回収、精製するため
に種々のアフィニティーカラムを利用することができ
る。例えば、ヒスチジンが６個以上並んだアミノ酸配
列、いわゆるヒスチジンタグを有する蛋白質がキレート
カラムに結合する性質を利用して、プロモーターの下流
に例えばヒスチジンが６個以上並んだアミノ酸配列をコ
ードするＤＮＡを配置し、さらにその下流に高等動物テ
ロメラーゼ蛋白質遺伝子を結合することにより、ヒスチ
ジンタグを含む高等動物テロメラーゼ蛋白質を発現させ
ることができ、発現した高等動物テロメラーゼ蛋白質を
キレートカラムにより容易に精製することができる。

【００４２】さらに、ヒスチジンタグと高等動物テロメ
ラーゼ蛋白質を構成するポリペプチドとの間に、例えば
トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、又は第Ｘ因子などの
プロテアーゼにより特異的に切断されるポリペプチド配
列を組み込み、キレートカラム精製後のポリペプチドを
対応のプロテアーゼで処理することにより、天然型の高
等動物テロメラーゼ蛋白質又はその部分ポリペプチドを
回収することができる。プロテアーゼによる切断後はＨ
ＰＬＣ等により分離、精製することができる。

【００４３】上記の他、発現ベクターとして使用できる
ものとして、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９８号公
報）や市販のｐＫＫ２３３−２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ
社）等を挙げることができる。また、日本住血吸虫由来
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合蛋白と
して発現させる発現ベクターとしてｐＧＥＸシリーズ
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を利用することができ、ヒス
チジン配列を利用した精製が可能なベクターとしてｐＰ
ｒｏＥＸ−Ｉ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を用いることがで
きる。宿主の形質転換法は、常法に従い行うことができ
る。また、昆虫細胞としては、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ社のバキュロウイルス発現キットであるマックスバ
ック（ＭＡＸＢＡＣ^TM、ＢＡＣＵＬＯＶＩＲＵＳＥＸ
ＰＲＥＳＳＩＯＮＳＹＳＴＥＭＭＡＮＵＡＬＶＥ
ＲＳＩＯＮ１．４）に従い、このキットを使用するこ
とができる。この時、発現量を上げるためにポリヘドリ
ンのプロモーターから開始コドンまでの距離を変えるこ
とが好ましい。

【００４４】形質転換体の培養は、当業者に利用可能な
常法に従って行うことができる。培養温度としては、２
８℃〜４２℃が適当である。ラクトースオペロン（ｌａ
ｃ）のプロモーターを利用する場合は、菌体培養液の６
００ｎｍの波長における吸光度がおよそ０．５になった
ところで、終濃度が１ｍＭ程度になるようにＩＰＴＧを
加えて発現誘導を行うことが必要である。

【００４５】上記方法で単離・精製された高等動物テロ
メラーゼ蛋白質を用いて、サル、ヒツジ、ウサギ、ラッ
ト、マウスなどの哺乳類動物を免疫することができ、高
等動物テロメラーゼ蛋白質を特異的に認識するポリクロ
ーナルまたはモノクローナル抗体を作製することができ
る。その特異性の検討には、高等動物テロメラーゼ蛋白
質遺伝子を含む発現ベクターを導入した形質転換体の培
養液又は遺伝子産物の抽出液を用いることができる。

【００４６】このような高等動物テロメラーゼ蛋白質に
特異的なポリクローナルまたはモノクローナル抗体を固
定化したアフィニティカラムを用いて、テロメラーゼ活
性を有する不死化細胞株または形質転換体の抽出液か
ら、高等動物テロメラーゼ複合体を濃縮・精製すること
ができる。また、テロメラーゼ活性を有する真核動物不
死化細胞株に対して、高等動物テロメラーゼ蛋白質とグ
ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ポリ・ヒスチジ
ンなどのいわゆる「タグ配列」との融合蛋白質を発現す
るベクターを導入し、得られた形質転換体の抽出液をグ
ルタチオン・セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）、
ニッケル・ＮＴＡ・アガロース（ＱＩＡＧＥＮ社）等の
「タグ配列」に特異的に結合するリガンドを固定化した
カラムに付して精製することにより、高等動物テロメラ
ーゼ複合体を濃縮・精製することができる。以上のよう
な方法で得られた高等動物テロメラーゼ複合体は、高活
性の高等動物テロメラーゼとして阻害剤の評価などに利
用することができるほか、新規な構成成分の解析、及び
それらの単離・精製の材料として用いることが可能であ
る。

【００４７】また、いわゆる「ツー・ハイブリッド（Ｔ
ｗｏ−ｈｙｂｒｉｄ）法」に従い、酵母を含む様々な形
質転換体を用いて、高等動物テロメラーゼ蛋白質に物理
的に強固に結合する蛋白質をコードする遺伝子を単離・
同定することができる。このような目的のためには、例
えばＣｌｏｎｔｅｃｈ社の「ＭａｔｃｈＭａｋｅｒキ
ット」などを用いることができる。

【００４８】上記の高等動物テロメラーゼ蛋白質の特異
抗体を用いることにより上記遺伝子の発現の程度を蛋白
質レベルで観測することができ、核酸プローブやＰＣＲ
プライマーを用いて遺伝子レベルでの発現状況を観測す
ることができる。このような方法によれば、癌細胞の検
出、並びにテロメラーゼ活性の変化に起因する疾患及び
テロメラーゼ活性の変化を伴う疾患の診断が可能であ
る。例えば、患者から分離・採取された試料を適宜の方
法で抽出した後、特異抗体を用いたＥＬＩＳＡ法もしく
はウェスタン・ブロット法、核酸プローブを用いたサザ
ンまたはノザン・ブロット法、またはオリゴヌクレオチ
ド・プライマーを用いたＰＣＲ法により判定を行うこと
ができる。従って、本発明のポリペプチドを特異的に認
識することができる抗体又は本発明のヌクレオチド配列
の一部又は全部に相補的に結合可能なヌクレオチド配列
を含む核酸プローブは、癌細胞の検出試薬、又は癌診断
用の医薬組成物の有効成分として有用である。

【００４９】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明するが、本発明の範囲は以下の実施例に限定される
ことはない。実施例１：ＹｅａｓｔＴｗｏ−ＨｙｂｒｉｄＳｙｓ
ｔｅｍを利用した新規ヒトテロメラーゼ蛋白質遺伝子
（ｈＴＬＰ２）の取得蛋白質間相互作用を検出、検索する手法であるＹｅａｓ
ｔＴｗｏ−ＨｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍを用いて、ヒ
ト・テロメラーゼ・サブユニット蛋白質ｈＴＬＰ１／ｈ
ＴＰ−１との結合活性を指標に、新規のヒト・テロメラ
ーゼ・サブユニット蛋白質遺伝子（ｈＴＬＰ２）を単離
した。

【００５０】(1) ベイトプラスミドの設計と構築Ｉｎｔｅｒｎｅｔにて、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅ
ｒＯｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍ
ａｔｉｏｎのｈｏｍｅｐａｇｅにアクセスし、Ｓｅａ
ｒｃｈｉｎｇＧｅｎＢａｎｋ、ＴｅｘｔＳｅａｒｃ
ｈｉｎｇ、ＧｅｎＢａｎｋａｎｄＧｅｎＢａｎｋ
ｕｐｄａｔｅｓとサービスリストを選択し、ｔｅｌｏｍ
ｅｒａｓｅのキーワードを入力することでテロメラーゼ
関連遺伝子をリストアップした。この中から〔ＲＮＵ８
９２８２〕Ｒａｔｔｕｓｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓｔｅ
ｌｏｍｅｒａｓｅｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎ
ｔ１（ＴＬＰ１）ｍＲＮＡと〔ＴＴＵ２５６４１〕Ｔ
ｅｔｒａｈｙｍｅｎａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａｔｅｌ
ｏｍｅｒａｓｅｃｏｍｐｏｎｅｎｔｐ８０ｍＲＮＡ
と〔ＨＳＵ８６１３６〕Ｈｕｍａｎｔｅｌｏｍｅａｓ
ｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＴＰ−１
ｍＲＮＡについてアミノ酸配列情報を入手した。それ
ぞれのｐ８０相同領域をアラインメントし、３つの蛋白
質に共通して保存されているアミノ酸配列を検索した。
その結果ＴＰ−１のアミノ酸番号３３７〜５７７の２４
１アミノ酸の領域に高度に保存された配列モチーフが存
在することがわかった。ＴＰ−１遺伝子を制限酵素Ｂａ
ｍＨＩとＸｈｏＩで切断し、この領域に対応するｃＤＮ
Ａ断片を切り出し、ＹｅａｓｔＴｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ
Ｓｙｓｔｅｍ用ベクターｐＢＴＭ１１６のＢａｍＨＩ
／ＸｈｏＩ部位に挿入した。このときｃＤＮＡ断片はｐ
ＢＴＭ１１６上にあらかじめコードされているＬｅｘＡ
蛋白質のＣ末端側にフレームを合わせて挿入した（図１
参照）。フレームが確実に連続することをＤＮＡ塩基配
列決定により確認した。以上の一連の過程を経て、べイ
トプラスミドｐＢＴＭ１１６−ＢＸを構築した。

【００５１】（２）Ｔｗｏ−ＨｙｂｒｉｄＳｃｒｅｅ
ｎｉｎｇと陽性ｃＤＮＡ断片の取得レポーター酵母株として、ＬｅｘＡ結合配列の下流にＨ
ＩＳ３遺伝子、あるいはβーガラクドシダーゼ遺伝子を
それぞれ接続した２つのレポーター遺伝子をもつＬ４０
株を使用した。Ｌ４０株をＹＰＤ培地で培養後コンピテ
ント化し、べイトプラスミドｐＢＴＭ１１６−ＢＸを導
入した。べイトプラスミドを保有するクローンを選択
し、培養を続けることで細胞数を増幅した。このべイト
プラスミド保有Ｌ４０株を再びコンピテント化し、Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ社から購入したライブラリープラスミドを
導入した。ライブラリープラスミドはＴｗｏ−Ｈｙｂｒ
ｉｄＳｙｓｔｅｍ用ベクターｐＡＣＴ２にヒト腎臓由来
２９３細胞株のｃＤＮＡを挿入したもので、２９３細胞
のｃＤＮＡ断片はｐＡＣＴ２上にあらかじめコードされ
ているＧＡＬ４転写活性化ドメインのＣ末端側にランダ
ムフレームで挿入されている（図１参照）。ベイトプラ
スミド、ライブラリープラスミドの両者を保有する約１
×１０⁷クローンを選択し、さらにレポーター遺伝子の
ひとつであるＨＩＳ３が陽性化した約２５０クローンを
選択した。以上の各過程でのクローンの選択はプラスミ
ド上の選択マーカー、およびレポーター遺伝子が、Ｌ４
０株の栄養要求性を相補する性質を利用しており、それ
ぞれ適切なアミノ酸組成の選択培地を用いることで実施
した。さらにＨＩＳ３陽性化クローンの中から、もうひ
とつのレポーター遺伝子であるβーガラクドシダーゼ遺
伝子が同時に陽性化している１１クローンをβーガラク
ドシダーゼ活性を利用した染色法により選択した（図１
参照）。

【００５２】このようにして得た重複陽性クローン（Ｈ
ＩＳ３陽性かつβーガラクドシダーゼ陽性）からプラス
ミドを回収し、大腸菌ＨＢ１０１株にエレクトロポレー
ションにより導入した。ＨＢ１０１株を栄養要求性選択
培地で培養し、ライブラリープラスミドだけを保有する
クローンとして単離した。これらの１１のクローンから
ライブラリープラスミドを回収し、ｐＡＣＴ２−ＤＰ−
０１〜１１と命名した。ｐＡＣＴ２−ＤＰ−０１〜１１
に挿入された２９３細胞株由来ｃＤＮＡ断片をＤＮＡ塩
基配列決定した。その結果、１１クローン中４クローン
は、末端の位置が少しづつ異なるだけで内部の配列は全
く同一のｃＤＮＡ断片が挿入されていた（図２参照）。
ｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４に代表されるこの４クローンは
今回のスクリーニングで最も高頻度にとれてきた陽性ク
ローンであった。更に、データベース検索の結果これま
でに報告がない新規遺伝子であることが判明した。これ
らの結果から、この遺伝子を新規ヒトテロメラーゼ蛋白
質遺伝子（ｈＴＬＰ２）と想定し、以下の解析を行っ
た。

【００５３】（３）再現性とベイト特異性の確認ベイトおよびライブラリープラスミドのどちらも保有し
ない新しいＬ４０株にｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４を導入し
ライブラリープラスミド保有クローンを選択した。これ
に改めてｐＢＴＭ１１６−ＢＸまたは空のｐＢＴＭ１１
６を導入し、ベイトおよびライブラリープラスミドの両
者を保有するクローンを選択し、βーガラクドシダーゼ
活性を調べた。その結果ｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４とｐＢ
ＴＭ１１６−ＢＸを保有するＬ４０株は非常に強いβー
ガラクドシダーゼ活性を示し、Ｔｗｏ−Ｈｙｂｒｉｄ
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇの結果を再現できた。さらにｐＡＣ
Ｔ２−ＤＰ−０４とｐＢＴＭ１１６を持つＬ４０株では
βーガラクドシダーゼ活性は全く検出されず、この結合
がベイトプラスミドｐＢＴＭ１１６−ＢＸ上のＴＰ１遺
伝子断片に依存することが明らかとなった（図２参
照）。以上の結果からｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４に挿入さ
れたｃＤＮＡ断片が、ｈＴＰ−１、即ち、ｈＴＬＰ１に
特異的に結合する蛋白質断片をコードしていることが示
された。

【００５４】（４）新規ヒトテロメラーゼ蛋白質遺伝子
（ｈＴＬＰ２）全長のｃＤＮＡクローニングと一次構造
解析ｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４は上流のＧＡＬ４転写活性化ド
メインと連続したＯＲＦが、挿入ｃＤＮＡ断片の３’末
端まで継続していた。このことから、ｐＡＣＴ２−ＤＰ
−０４に挿入されていたｃＤＮＡ断片はｈＴＬＰ２全長
の内、ｈＴＬＰ１結合領域を含む一部分をコードしてい
るにすぎず、ＯＲＦはこれより上流及び下流に継続する
と予想された。

【００５５】ｈＴＬＰ２全長のｃＤＮＡクローニングは
一般的なλファージｃＤＮＡライブラリーのスクリーニ
ングにより実施した。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社から購入した
ファージベクターλｇｔ１１の上に構築されたヒト精巣
由来ｃＤＮＡライブラリーを使用し、約１００万クロー
ンを常法に従い大腸菌ＬＥ３９２株に感染させ、プレー
ト上のＮＺＹ寒天培地上で培養した。ナイロン膜にファ
ージ粒子を写し取ったもののレプリカを２枚作製し、洗
浄及びアルカリ処理した。ｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４の挿
入ｃＤＮＡ断片を³²Ｐ標識してプローブとして用い、こ
のプローブにナイロン膜上でハイブリダイズするファー
ジ・クローンをスクリーニングした。その結果、０４λ
０１〜１４の合計１４の陽性クローンを得た。０４λ０
１〜１４のファージクローンをプレート上で培養、増幅
し、ファージＤＮＡを回収した。これをＥｃｏＲＩで切
断後、アガロース電気泳動にて挿入されたｃＤＮＡ断片
の大きさを調べた。挿入ｃＤＮＡ断片が比較的大きかっ
たクローンとして、０４λ０１、０４λ０９、０４λ１
２があり、各々２．１ｋｂｐ、２．３ｋｂｐ、２．８ｋ
ｂｐの断片が挿入されていた。これら３クローンについ
て制限酵素切断地図を作製したところ、図３に示すよう
に各々のｃＤＮＡが重複する位置にあることがわかっ
た。常法に従って欠失変異ｃＤＮＡを作製し、０４λ０
１、０４λ１２の全長と０４λ０９の一部分のｃＤＮＡ
塩基配列を決定した。この配列を制限酵素切断地図に従
って組み合わせたところ、その３’末端側に終始コドン
を見出した。しかし、開始コドンとその上流のインフレ
ーム終始コドン、および終始コドンより下流のポリＡ付
加シグナルが見出せなかった。そこで、これまでに明ら
かとなったｈＴＬＰ２のｃＤＮＡ塩基配列の５’末端と
３’末端に相同性を示す２つのＥＳＴクローン（Ｅｘｐ
ｒｅｓｓｉｏｎＳｅｑｕｅｎｃｅＴａｇ（ＥＳＴ）
ＤＮＡ配列のデータバンク（ｄｂＥＳＴ）に登録された
ヒト由来ｃＤＮＡ塩基配列の物理クローン）EST/zn42c0
1 （GeneBank Acc No.AA102574、Clone Id.550080-3'）
とEST/ yi25f03（GeneBank Acc No.R66814、Clone Id.1
40285-5'）をゲノムシステムズ社から購入し、ｃＤＮＡ
塩基配列を決定後、両末端の配列として加えた（図３参
照）。これにより、配列表１の塩基番号２２４から始ま
る開始コドンと、その上流の同じく塩基番号１２５から
始まるインフレーム終始コドンが見出された（図３参
照）。また、前述の塩基番号４８９２から始まる終始コ
ドンの下流に塩基番号５６５１から始まるポリＡ付加シ
グナルが見出された（図３参照）。塩基番号２２４から
４８９１まで連続したオープン・リーディング・フレー
ムが存在し、１５５６アミノ酸からなる分子量約１７９
ｋＤａ、ｐＩ＝６．２４の蛋白質をコードすることが
明らかとなった。

【００５６】次に全長アミノ酸配列をもとに一次構造の
解析を行った。アミノ酸番号１４５１から１５０９の５
９アミノ酸からなる領域には、未だ機能不明で一般にｂ
ｒｏｍｏｄｏｍａｉｎと呼ばれている構造が存在した。
またアミノ酸番号１１５１から１１９３の４３アミノ酸
からなる領域にはＤＮＡ結合活性を持つと予想されるＺ
ｎｆｉｎｇｅｒが存在した。ＴＬＰ２がテロメラーゼ
のサブユニットであると仮定すると、ＴＬＰ２が、この
Ｚｎｆｉｎｇｅｒを介してテロメア配列に結合する可
能性が、考えられた。Ｔｗｏ−ＨｙｂｒｉｄＳｃｒｅ
ｅｎｉｎｇでクローニングしたｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４
に挿入されたｈＴＬＰ２のｃＤＮＡ断片はアミノ酸番号
３０９から６７８の３７０アミノ酸からなる領域に対応
し、ｈＴＬＰ２はこの領域を介してｈＴＬＰ１に結合す
ることが明らかとなった。またＣｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ
構造形成予測アルゴリズムによる解析の結果、ｈＴＬＰ
２遺伝子産物中のｈＴＬＰ１結合領域の両サイドには２
つの大きなＣｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ構造形成予測値のピ
ークが存在した。Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ構造形成予測
値が高い領域は、同様にこの予測値が高い別の領域とＣ
ｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ構造をとることで結合する性質が
ある。この性質により、Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ構造形
成予測領域を持つ蛋白質は類似蛋白質と二量体を形成す
ることがしばしばある。以上の考察に基づきＴＬＰ２と
分子全体にわたって相同性を示す蛋白質を検索した。Ｉ
ｎｔｅｒｎｅｔにて、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒ
ｏｆＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔ
ｉｏｎにアクセスし、ＢＬＡＳＴ、Ａｄｖａｎｃｅｄ
ＢＬＡＳＴｓｅａｃｈ、と選択しｂｌａｓｔｐＰｒ
ｏｇｒａｍでＤａｔａｂａｓｅにｎｒを指定して検索す
ると、ｇｎｌ｜ＰＩＤ｜ｄ１０２１６１０（ＡＢ００２
３１２）ＫＩＡＡ０３１４〔Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ〕
がＰｒｏｂａｂｉｌｉｔｙＰ（Ｎ）＝３．５ｅ−５６
の高スコアでヒットし、実際にアライメントした結果、
ＴＬＰ２と分子全体にわたって相同性を示した。また、
Ｃｏｉｌｅｄ−Ｃｏｉｌ構造形成予測領域に関してもＴ
ＬＰ２とほぼ同様のパターンを示し、ＴＬＰ２とｇｎｌ
｜ＰＩＤ｜ｄ１０２１６１０（ＡＢ００２３１２）ＫＩ
ＡＡ０３１４がヘテロ二量体を形成する可能性が強く示
唆された。このような場合、ＴＬＰ２とｇｎｌ｜ＰＩＤ
｜ｄ１０２１６１０（ＡＢ００２３１２）ＫＩＡＡ０３
１４のヘテロ二量体と同時に、ＴＬＰ２のみ、あるいは
ｇｎｌ｜ＰＩＤ｜ｄ１０２１６０（ＡＢ００２３１２）
ＫＩＡＡ０３１４のみのホモ二量体も存在すると推測さ
れ、これらの量比などのパラメーターがテロメラーゼに
何らかの制御を与える可能性が考えられた。

【００５７】実施例２：ｈＴＬＰ２遺伝子産物を認識す
る特異抗体（抗ｈＴＬＰ２抗体）の作成日本住血吸虫グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼと
ｈＴＬＰ２のアミノ酸番号３０９から６７８に相当する
蛋白質断片（ｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４のクローンに対
応）との融合蛋白質（ＧＳＴ−０４）を大腸菌内で発現
させ、精製した融合蛋白質を抗原としてウサギを免疫し
た。次に、ｈＴＬＰ２蛋白質の同じ領域を別の発現ベク
ターを用いてヒスチジン・ヘキサマーとの融合蛋白質
（６Ｈｉｓ−０４）として発現させ、精製した融合蛋白
質を用いてアフィニティ・カラムを作製し、ウサギ抗血
清からｈＴＬＰ２を認識するポリクローナル抗体（配列
表の配列番号１のアミノ酸番号２１７〜３４５番目に相
当する部分に特異的なポリクローナル抗体）を取得し
た。

【００５８】（１）抗原の作成ｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４を制限酵素ＢｇｌＩＩとＸｈｏ
Ｉで切断し、挿入ｃＤＮＡ断片を切り出し回収した。こ
れを大腸菌用発現プラスミドｐＧＥＸ−５Ｘ−２（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ社）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入
し、発現ベクターｐＧＥＸ−０４を作製した。ｐＧＥＸ
−０４を大腸菌株ＸＬ１Ｂに導入し、ベクターを保有す
るクローンｐＧＥＸ−０４／ＸＬ１Ｂを取得した。ｐＧ
ＥＸ−０４／ＸＬ１Ｂを、アンピシリンを含む１０００
ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で６００ｎｍの吸光度
をモニターしながら培養した。吸光度が約０．５になっ
たら、ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭになるように加え、４
時間程培養を続けた。菌体を回収し、ＰＢＳ中で超音波
処理し、蛋白質を可溶化した。これに最終濃度１％トラ
イトンＸ−１００を加え、非特異的な蛋白質間相互作用
を除いた後、遠心分離し、上清を回収した。これに５０
０μｌグルタチオン・セファロース・ビーズ（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ社）を加えて懸濁した。４℃で４０分懸濁し
ながら融合蛋白質をビーズに吸着させた後、ビーズをＰ
ＢＳで洗浄した。ビーズに結合したＧＳＴ−０４組換え
蛋白質を２０ｍＭ還元型グルタチオンを含む５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ緩衝液で溶出した。

【００５９】（２）免疫と採血体重約２．６ｋｇのニュージーランドホワイト３羽（１
５週齢）を常法に従って毎週１回、１回につき１００μ
ｇのＧＳＴ−０４とフロイント・アジュバントの混合物
で免疫した。３回免疫から１週れで順次、抗血清を採取
した。（３）特異抗体のアフィニティ精製と評価上記抗血清からｈＴＬＰ２蛋白質特異的な抗体を精製す
るためのアフィニティ・カラムを作製するため、ＧＳＴ
の代わりにヒスチジン・ヘキサマーをタグ配列として用
いて同じ領域の抗原を発現させ、同様に精製した。ま
ず、ｐＡＣＴ２−ＤＰ−０４を制限酵素ＢａｍＨＩとＸ
ｈｏＩで切断し、挿入ｃＤＮＡ断片を切り出し回収し
た。これを大腸菌用発現プラスミドｐＥＴ−３２ｃ（Ｎ
ｖａｇｅｎ社）のＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ部位に挿入し、
発現ベクターｐＥＴ−０４を作製した。ｐＥＴ−０４を
大腸菌株ＢＬ２１に導入し、ベクターを保有するクロー
ンｐＥＴ−０４／ＢＬ２１を取得した。ｐＥＴ−０４／
ＢＬ２１を、アンピシリンを含む１０００ｍｌのＬＢ培
地に植菌し、３７℃で６００ｎｍの吸光度をモニターし
ながら培養した。吸光度が約０．５になったら、ＩＰＴ
Ｇを最終濃度１ｍＭになるように加え、４時間程培養を
続けた。菌体を回収し、６Ｍ尿素Ｔｒｉｓ／リン酸緩衝
液（ｐＨ８．０）で溶解した。溶解産物を遠心分離し、
上清をＨｉＴｒａｐキレートカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ社）に展開した。カラムを洗浄した後、結合した６Ｈ
ｉｓ−０４組換え蛋白質を６Ｍ尿素Ｔｒｉｓ／リン酸緩
衝液（ｐＨ４．０の）との濃度勾配で溶出した。精製さ
れた６Ｈｉｓ−０４組換え蛋白質を含む画分を中和した
後、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社推奨のアフィニティカラム作
製用のカップリング緩衝液（１００ｍＭＮａＨＣＯ
３、０．５ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．９）に対して透析し
て尿素を希釈し、不溶性物質を遠心分離で除いた。上清
をＨｉＴｒａｐＮＨＳ活性化カラムに展開し、６Ｈｉｓ
−０４をクロスリンクしたアフィニティカラムを作製し
た。ＧＳＴ−０４組換え蛋白質に対する抗血清を硫安沈
殿で粗精製し、透析後、アフィニティカラムに展開し
た。これを０．４ＭＮａＣｌ緩衝液で洗浄し、０．１ｍ
Ｍグリシン緩衝液（ｐＨ＝２．３）で結合した抗体を
溶出した。溶出した抗体をただちに適当な緩衝液でｐＨ
を中性にもどした。

【００６０】精製抗体がヒトテロメラーゼ蛋白質に特異
的に反応することを、２９３細胞株の全溶解産物を用い
たウェスタン・ブロット法で確認した。未免疫血清では
２９３細胞株内で過剰発現させた抗原蛋白断片（約４１
ｋＤａ）および内因性のｈＴＬＰ２（約１８０ｋＤａ）
のどちらに対しても反応性が見られないが、４回免疫血
清では両者に対する反応性が確認できた。この血清をア
フィニティ精製すると血清の状態で顕著に観察された非
特異的なシグナルがほどんど見られなくなり、特異性の
高い精製抗体を得ることに成功した。

【００６１】実施例３：免疫沈降法及びテロメラーゼ活
性測定による、ｈＴＬＰ２遺伝子産物とテロメラーゼ活
性複合本体の結合の証明実施例１で取得したｈＴＬＰ２遺伝子産物が、実際にテ
ロメラーゼ活性複合本体と結合し、ヒトテロメラーゼ蛋
白質としての条件を満たす事を以下のように証明した。
すなわち、実施例２で得られた抗ｈＴＬＰ２抗体を用い
て、ヒト細胞抽出液中のテロメラーゼ活性が免疫沈降さ
れるかどうかを検討した。

【００６２】まず、抗ｈＴＬＰ２抗体及び異なる特異性
をもつコントロール精製抗体ＡｎｔｉＣＤＫ２（ＵＢ
Ｉ社より入手）の２種類の抗体を各々予め１０μｌのプ
ロテインＡセファロースにコートした。ヒト腎臓由来２
９３細胞株からＣｏｕｎｔｅｒらの方法（ＥＭＢＯ
Ｊ．、１１、１９２１、１９９２）に従ってＳ１００抽
出液を調製した。この抽出液に等容量の１％ＣＨＡＰＳ
／１×Ｈｙｐｏ緩衝液（Ｃｏｕｎｔｅｒら、上掲論文）
を加えた混合物１００μｌに、３μｇの精製抗体をコー
トした上記プロテインＡセファロース・ビーズを加え、
４℃で２時間保温した。その後、０．５％ＣＨＡＰＳ／
１×Ｈｙｐｏ緩衝液で洗浄した各々のビーズをテロメラ
ーゼ反応液に懸濁して、テロメラーゼ活性を測定した。
テロメラーゼの活性は、Ｔａｔｅｍａｔｓｕらの方法
（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、１３、２２６５、１９９６）に従
った。この結果、コントロール精製抗体をコートしたビ
ーズにはテロメラーゼ活性が殆ど認められなかったが、
実施例２で得られた抗ｈＴＬＰ２抗体をコートしたビー
ズには有意に高いテロメラーゼ活性が認められた。

【００６３】実施例４：ヒト正常組織におけるｈＴＬＰ
２ｍＲＮＡの発現Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＭｕｌｔｉｐｌｅＴｉｓｓｕｅ
ＮｏｒｔｈｅｒｎＢｌｏｔを用いて、正常組織におけ
るｈＴＬＰ２のｍＲＮＡの発現を検討した。プローブと
しては実施例１の工程（２）で得られたｐＡＣＴ２−Ｄ
Ｐ−０４の挿入ｃＤＮＡ断片（配列表の配列番号１の塩
基番号１１４８から２２５７）を³²Ｐ標識して用い、ハ
イブリダイゼーションは５０％フォルムアミド存在下に
４２℃で一昼夜行った。各ブロット膜を０．１％ＳＤＳ
を含む１×及び０．１×ＳＳＰＥ緩衝液で洗浄した後
に、オートラジオグラフィーに付した。その結果、精
巣、肺、胎盤、末梢白血球、脾、胸腺、大腸、骨格筋、
小腸、肝、膵、心臓、腎、前立腺で６．４ｋｂのシグナ
ルが検出された。一方、脳、卵巣においては全くシグナ
ルが検出されなかった。また精巣、肺、末梢白血球では
６．４ｋｂのバンドに加えて、２．９ｋｂの短い分子種
が観察された。

【００６４】

【発明の効果】本発明により、細胞増殖に必須であり、
かつ癌細胞の増殖への関与が示唆されている高等動物由
来のテロメラーゼ蛋白質及びそれをコードする遺伝子が
提供された。本発明のテロメラーゼ蛋白質及びそれをコ
ードする遺伝子は、例えば、細胞増殖及び細胞の老化な
どの生体制御機構の解明に有用であり、癌の治療薬の開
発に特に有用性が期待される。また、本発明のテロメラ
ーゼ蛋白質を特異的に認識する抗体は癌細胞の検出のた
めの試薬として有用であり、癌の早期発見を目的とした
臨床検査薬としての有用性が期待される。

【００６５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：５６９６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｃＤＮＡ起源：生物名ヒト配列 CGGTGGGACG CAATTCCCCG CGCGGAGTCG GGCAGTGGCA GCGGGAGAAG CGGCAGCCAG 60 GGGCGCGGCG GGGCCGGAGA GAGGCGGTCC CCTGGGAGGA CGGGGTCTCC CCTCGTTGCC 120 TTTGTAGTGG AGAAGGTGGA CAAGTGGCAG TCGGCGTGAT CGCAGGGAAG CGGGGCCGGC 180 GCGGGCGGCC GAGGGTCCAG GCGAGCCCGC GGGCGGACGG GAG ATG CCG CTG CTA 235 Met Pro Leu Leu 1 CAC CGA AAG CCG TTT GTG AGA CAG AAG CCG CCC GCG GAC CTG CGG CCC 283 His Arg Lys Pro Phe Val Arg Gln Lys Pro Pro Ala Asp Leu Arg Pro 5 10 15 20 GAC GAG GAA GTT TTC TAC TGT AAA GTC ACC AAC GAG ATC TTC CGC CAC 331 Asp Glu Glu Val Phe Tyr Cys Lys Val Thr Asn Glu Ile Phe Arg His 25 30 35 TAC GAT GAC TTT TTT GAA CGA ACC ATT CTG TGC AAC AGC CTT GTG TGG 379 Tyr Asp Asp Phe Phe Glu Arg Thr Ile Leu Cys Asn Ser Leu Val Trp 40 45 50 AGT TGT GCT GTG ACG GGT AGA CCT GGA CTG ACG TAT CAG GAA GCA CTT 427 Ser Cys Ala Val Thr Gly Arg Pro Gly Leu Thr Tyr Gln Glu Ala Leu 55 60 65 GAG TCA GAA AAA AAA GCA AGA CAG AAT CTT CAG AGT TTT CCA GAA CCA 475 Glu Ser Glu Lys Lys Ala Arg Gln Asn Leu Gln Ser Phe Pro Glu Pro 70 75 80 CTA ATT ATT CCA GTT TTA TAC TTG ACC AGC CTT ACC CAT CGT TCG CGC 523 Leu Ile Ile Pro Val Leu Tyr Leu Thr Ser Leu Thr His Arg Ser Arg 85 90 95 100 TTA CAT GAA ATT TGT GAT GAT ATC TTT GCA TAT GTC AAG GAT CGA TAT 571 Leu His Glu Ile Cys Asp Asp Ile Phe Ala Tyr Val Lys Asp Arg Tyr 105 110 115 TTT GTC GAA GAA ACT GTG GAA GTC ATT AGG AAC AAT GGT GCA AGG TTG 619 Phe Val Glu Glu Thr Val Glu Val Ile Arg Asn Asn Gly Ala Arg Leu 120 125 130 CAG TGT AGG ATT TTG GAA GTC CTC CCT CCA TCA CAT CAA AAT GGT TTT 667 Gln Cys Arg Ile Leu Glu Val Leu Pro Pro Ser His Gln Asn Gly Phe 135 140 145 GCT AAT GGA CAT GTT AAC AGT GTG GAT GGA GAA ACT ATT ATC ATC AGT 715 Ala Asn Gly His Val Asn Ser Val Asp Gly Glu Thr Ile Ile Ile Ser 150 155 160 GAT AGT GAT GAT TCA GAA ACA CAA AGC TGT TCT TTT CAA AAT GGG AAA 763 Asp Ser Asp Asp Ser Glu Thr Gln Ser Cys Ser Phe Gln Asn Gly Lys 165 170 175 180 AAA AAA GAT GCA ATT GAT CCC TTA CTA TTC AAG TAT AAA GTG CAA CCC 811 Lys Lys Asp Ala Ile Asp Pro Leu Leu Phe Lys Tyr Lys Val Gln Pro 185 190 195 ACT AAA AAA GAA TTA CAT GAG TCT GCT ATT GTT AAA GCA ACA CAA ATC 859 Thr Lys Lys Glu Leu His Glu Ser Ala Ile Val Lys Ala Thr Gln Ile 200 205 210 AGC CGG AGA AAA CAC CTA TTT TCT CGT GAT AAA CTA AAG CTT TTT CTG 907 Ser Arg Arg Lys His Leu Phe Ser Arg Asp Lys Leu Lys Leu Phe Leu 215 220 225 AAG CAA CAC TGT GAA CCA CAA GAT GGA GTC ATT AAA ATA AAG GCA TCA 955 Lys Gln His Cys Glu Pro Gln Asp Gly Val Ile Lys Ile Lys Ala Ser 230 235 240 TCT CTT TCA ACG TAT AAA ATA GCA GAA CAA GAT TTT TCT TAT TTC TTC 1003 Ser Leu Ser Thr Tyr Lys Ile Ala Glu Gln Asp Phe Ser Tyr Phe Phe 245 250 255 260 CCT GAT GAT CCA CCC ACA TTT ATC TTC AGT CCT GCT AAC AGA CGA AGA 1051 Pro Asp Asp Pro Pro Thr Phe Ile Phe Ser Pro Ala Asn Arg Arg Arg 265 270 275 GGG AGA CCT CCC AAA CGA ATA CAT ATT AGT CAA GAG GAC AAT GTT GCT 1099 Gly Arg Pro Pro Lys Arg Ile His Ile Ser Gln Glu Asp Asn Val Ala 280 285 290 AAT AAA CAG ACT CTT GCA AGT TAT AGG AGC AAA GCT ACT AAA GAA AGA 1147 Asn Lys Gln Thr Leu Ala Ser Tyr Arg Ser Lys Ala Thr Lys Glu Arg 295 300 305 GAT AAA CTT TTG AAA CAA GAA GAA ATG AAG TCA CTG GCT TTT GAA AAG 1195 Asp Lys Leu Leu Lys Gln Glu Glu Met Lys Ser Leu Ala Phe Glu Lys 310 315 320 GCT AAA TTA AAA AGA GAA AAA GCA GAT GCC CTA GAA GCG AAG AAA AAA 1243 Ala Lys Leu Lys Arg Glu Lys Ala Asp Ala Leu Glu Ala Lys Lys Lys 325 330 335 340 GAA AAA GAA GAT AAA GAG AAA AAG AGG GAA GAA TTG AAA AAA ATT GTT 1291 Glu Lys Glu Asp Lys Glu Lys Lys Arg Glu Glu Leu Lys Lys Ile Val 345 350 355 GAA GAA GAG AGA CTA AAG AAA AAA GAA GAA AAA GAG AGG CTT AAA GTA 1339 Glu Glu Glu Arg Leu Lys Lys Lys Glu Glu Lys Glu Arg Leu Lys Val 360 365 370 GAA AGA GAA AAG GAA AGA GAG AAG TTA CGT GAA GAA AAG CGA AAG TAT 1387 Glu Arg Glu Lys Glu Arg Glu Lys Leu Arg Glu Glu Lys Arg Lys Tyr 375 380 385 GTG GAA TAC TTA AAA CAG TGG AGT AAA CCT AGA GAA GAT ATG GAA TGT 1435 Val Glu Tyr Leu Lys Gln Trp Ser Lys Pro Arg Glu Asp Met Glu Cys 390 395 400 GAT GAC CTT AAG GAA CTT CCA GAA CCA ACA CCA GTG AAA ACT AGA CTA 1483 Asp Asp Leu Lys Glu Leu Pro Glu Pro Thr Pro Val Lys Thr Arg Leu 405 410 415 420 CCT CCT GAA ATC TTT GGT GAT GCT CTG ATG GTT TTG GAG TTC CTT AAT 1531 Pro Pro Glu Ile Phe Gly Asp Ala Leu Met Val Leu Glu Phe Leu Asn 425 430 435 GCA TTT GGG GAA CTT TTT GAT CTT CAG GAT GAG TTT CCT GAT GGA GTA 1579 Ala Phe Gly Glu Leu Phe Asp Leu Gln Asp Glu Phe Pro Asp Gly Val 440 445 450 ACC CTA GAA GTA TTA GAG GAA GCT CTT GTA GGA AAT GAC AGT GAA GGC 1627 Thr Leu Glu Val Leu Glu Glu Ala Leu Val Gly Asn Asp Ser Glu Gly 455 460 465 CCA CTG TGT GAA TTG CTT TTT TTC TTC CTG ACT GCA ATC TTC CAG GCA 1675 Pro Leu Cys Glu Leu Leu Phe Phe Phe Leu Thr Ala Ile Phe Gln Ala 470 475 480 ATA GCT GAA GAA GAA GAG GAA GTA GCC AAA GAG CAA CTA ACT GAT GCT 1723 Ile Ala Glu Glu Glu Glu Glu Val Ala Lys Glu Gln Leu Thr Asp Ala 485 490 495 500 GAC ACC AAA GAT TTA ACA GAG GCT TTG GAT GAA GAT GCA GAC CCC ACA 1771 Asp Thr Lys Asp Leu Thr Glu Ala Leu Asp Glu Asp Ala Asp Pro Thr 505 510 515 AAA TCT GCA CTG TCT GCA GTT GCA TCT TTG GCA GCT GCA TGG CCA CAG 1819 Lys Ser Ala Leu Ser Ala Val Ala Ser Leu Ala Ala Ala Trp Pro Gln 520 525 530 TTA CAC CAG GGC TGC AGT TTG AAA AGT TTG GAT CTT GAT AGC TGC ACT 1867 Leu His Gln Gly Cys Ser Leu Lys Ser Leu Asp Leu Asp Ser Cys Thr 535 540 545 CTT TCA GAA ATC CTC AGA CTG CAC ATC TTA GCT TCA GGT GCT GAT GTA 1915 Leu Ser Glu Ile Leu Arg Leu His Ile Leu Ala Ser Gly Ala Asp Val 550 555 560 ACA TCA GCA AAT GCA AAG TAT AGA TAT CAA AAA CGA GGA GGA TTT GAT 1963 Thr Ser Ala Asn Ala Lys Tyr Arg Tyr Gln Lys Arg Gly Gly Phe Asp 565 570 575 580 GCT ACA GAT GAT GCT TGT ATG GAG CTT CGT TTG AGC AAT CCC AGT CTA 2011 Ala Thr Asp Asp Ala Cys Met Glu Leu Arg Leu Ser Asn Pro Ser Leu 585 590 595 GTG AAG AAA CTG TCA AGC ACC TCA GTG TAT GAT TTG ACA CCA GGA GAA 2059 Val Lys Lys Leu Ser Ser Thr Ser Val Tyr Asp Leu Thr Pro Gly Glu 600 605 610 AAA ATG AAG ATA CTC CAT GCT CTC TGT GGA AAG CTA CTG ACC CTA GTT 2107 Lys Met Lys Ile Leu His Ala Leu Cys Gly Lys Leu Leu Thr Leu Val 615 620 625 TCA ACT AGG GAT TTT ATT GAA GAT TAT GTT GAT ATA TTA CGA CAG GCA 2155 Ser Thr Arg Asp Phe Ile Glu Asp Tyr Val Asp Ile Leu Arg Gln Ala 630 635 640 AAG CAG GAG TTC CGG GAA TTA AAA GCA GAA CAA CAT CGA AAA GAG AGG 2203 Lys Gln Glu Phe Arg Glu Leu Lys Ala Glu Gln His Arg Lys Glu Arg 645 650 655 660 GAA GAA GCA GCT GCC AGA ATT CGT AAA AGG AAG GAA GAA AAA CTT AAG 2251 Glu Glu Ala Ala Ala Arg Ile Arg Lys Arg Lys Glu Glu Lys Leu Lys 665 670 675 GAG CAA GAA CAA AAA ATG AAA GAG AAA CAA GAA AAA CTG AAA GAA GAT 2299 Glu Gln Glu Gln Lys Met Lys Glu Lys Gln Glu Lys Leu Lys Glu Asp 680 685 690 GAG CAA AGA AAT TCA ACG GCA GAT ATA TCT ATT GGG GAG GAA GAA AGG 2347 Glu Gln Arg Asn Ser Thr Ala Asp Ile Ser Ile Gly Glu Glu Glu Arg 695 700 705 GAA GAT TTT GAT ACT AGC ATT GAG AGC AAA GAC ACA GAG CAA AAG GAA 2395 Glu Asp Phe Asp Thr Ser Ile Glu Ser Lys Asp Thr Glu Gln Lys Glu 710 715 720 TTA GAT CAA GAT ATG GTC ACT GAA GAT GAA GAT GAC CCA GGA TCA CAT 2443 Leu Asp Gln Asp Met Val Thr Glu Asp Glu Asp Asp Pro Gly Ser His 725 730 735 740 AAA AGA GGC AGA AGG GGG AAA AGA GGA CAA AAT GGA TTT AAA GAA TTT 2491 Lys Arg Gly Arg Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asn Gly Phe Lys Glu Phe 745 750 755 ACA AGG CAA GAA CAG ATC AAC TGT GTA ACA AGA GAG CCT CTT ACT GCT 2539 Thr Arg Gln Glu Gln Ile Asn Cys Val Thr Arg Glu Pro Leu Thr Ala 760 765 770 GAT GAG GAA GAA GCA TTA AAA CAG GAA CAC CAA CGA AAA GAG AAA GAG 2587 Asp Glu Glu Glu Ala Leu Lys Gln Glu His Gln Arg Lys Glu Lys Glu 775 780 785 CTC TTA GAA AAA ATC CAA AGT GCC ATA GCC TGT ACC AAT ATC TTT CCC 2635 Leu Leu Glu Lys Ile Gln Ser Ala Ile Ala Cys Thr Asn Ile Phe Pro 790 795 800 TTG GGT CGC GAC CGC ATG TAT AGA CGA TAC TGG ATT TTC CCT TCT ATT 2683 Leu Gly Arg Asp Arg Met Tyr Arg Arg Tyr Trp Ile Phe Pro Ser Ile 805 810 815 820 CCT GGA CTC TTT ATT GAA GAG GAT TAT TCT GGT CTT ACT GAA GAC ATG 2731 Pro Gly Leu Phe Ile Glu Glu Asp Tyr Ser Gly Leu Thr Glu Asp Met 825 830 835 CTG TTG CCT AGA CCT TCA TCA TTT CAG AAT AAT GTA CAG TCT CAA GAT 2779 Leu Leu Pro Arg Pro Ser Ser Phe Gln Asn Asn Val Gln Ser Gln Asp 840 845 850 CCT CAG GTA TCC ACT AAA ACT GGA GAG CCT TTG ATG TCT GAA TCT ACC 2827 Pro Gln Val Ser Thr Lys Thr Gly Glu Pro Leu Met Ser Glu Ser Thr 855 860 865 TCC AAC ATT GAC CAA GGT CCA CGT GAC CAT TCT GTG CAG CTG CCA AAA 2875 Ser Asn Ile Asp Gln Gly Pro Arg Asp His Ser Val Gln Leu Pro Lys 870 875 880 CCA GTG CAT AAG CCA AAT CGG TGG TGC TTT TAC AGT TCT TGT GAA CAG 2923 Pro Val His Lys Pro Asn Arg Trp Cys Phe Tyr Ser Ser Cys Glu Gln 885 890 895 900 CTA GAC CAG CTT ATT GAA GCT CTT AAT TCT AGA GGA CAT AGA GAA AGT 2971 Leu Asp Gln Leu Ile Glu Ala Leu Asn Ser Arg Gly His Arg Glu Ser 905 910 915 GCC TTA AAA GAA ACT TTG TTA CAA GAG AAA AGC AGA ATA TGT GCA CAG 3019 Ala Leu Lys Glu Thr Leu Leu Gln Glu Lys Ser Arg Ile Cys Ala Gln 920 925 930 CTA GCC CGT TTT TCT GAA GAG AAA TTT CAT TTT TCA GAC AAA CCT CAG 3067 Leu Ala Arg Phe Ser Glu Glu Lys Phe His Phe Ser Asp Lys Pro Gln 935 940 945 CCT GAT AGC AAA CCA ACA TAT AGT CGG GGA AGA TCT TCC AAT GCA TAT 3115 Pro Asp Ser Lys Pro Thr Tyr Ser Arg Gly Arg Ser Ser Asn Ala Tyr 950 955 960 GAT CCA TCT CAG ATG TGT GCA GAA AAG CAA CTT GAA CTA AGG CTG AGA 3163 Asp Pro Ser Gln Met Cys Ala Glu Lys Gln Leu Glu Leu Arg Leu Arg 965 970 975 980 GAT TTT CTT TTA GAT ATT GAA GAT AGA ATC TAC CAA GGA ACA TTA GGA 3211 Asp Phe Leu Leu Asp Ile Glu Asp Arg Ile Tyr Gln Gly Thr Leu Gly 985 990 995 GCC ATC AAG GTT ACA GAT CGA CAT ATC TGG AGA TCA GCA TTA GAA AGT 3259 Ala Ile Lys Val Thr Asp Arg His Ile Trp Arg Ser Ala Leu Glu Ser 1000 1005 1010 GGA CGG TAT GAG CTG TTA AGT GAG GAA AAC AAG GAA AAT GGG ATA ATT 3307 Gly Arg Tyr Glu Leu Leu Ser Glu Glu Asn Lys Glu Asn Gly Ile Ile 1015 1020 1025 AAA ACT GTG AAT GAA GAT GTA GAA GAG ATG GAA ATT GAT GAA CAA ACA 3355 Lys Thr Val Asn Glu Asp Val Glu Glu Met Glu Ile Asp Glu Gln Thr 1030 1035 1040 AAG GTC ATA GTA AAA GAC AGA CTT TTG GGG ATA AAA ACA GAA ACT CCA 3403 Lys Val Ile Val Lys Asp Arg Leu Leu Gly Ile Lys Thr Glu Thr Pro 1045 1050 1055 1060 AGT ACT GTA TCA ACA AAT GCA AGT ACA CCA CAA TCA GTG AGC AGT GTG 3451 Ser Thr Val Ser Thr Asn Ala Ser Thr Pro Gln Ser Val Ser Ser Val 1065 1070 1075 GTT CAT TAT CTG GCA ATG GCA CTC TTT CAA ATA GAG CAG GGC ATT GAG 3499 Val His Tyr Leu Ala Met Ala Leu Phe Gln Ile Glu Gln Gly Ile Glu 1080 1085 1090 CGG CGT TTT CTG AAA GCT CCA CTT GAT GCC AGT GAC AGT GGG CGT TCT 3547 Arg Arg Phe Leu Lys Ala Pro Leu Asp Ala Ser Asp Ser Gly Arg Ser 1095 1100 1105 TAT AAA ACA GTT CTG GAC CGT TGG AGA GAG TCT CTC CTT TCT TCT GCT 3595 Tyr Lys Thr Val Leu Asp Arg Trp Arg Glu Ser Leu Leu Ser Ser Ala 1110 1115 1120 AGT CTA TCC CAA GTT TTT CTT CAC CTA TCC ACC TTG GAT CGT AGC GTG 3643 Ser Leu Ser Gln Val Phe Leu His Leu Ser Thr Leu Asp Arg Ser Val 1125 1130 1135 1140 ATA TGG TCT AAA TCT ATA CTG AAT GCG CGT TGC AAG ATA TGT CGA AAG 3691 Ile Trp Ser Lys Ser Ile Leu Asn Ala Arg Cys Lys Ile Cys Arg Lys 1145 1150 1155 AAA GGC GAT GCT GAA AAC ATG GTT CTT TGT GAT GGC TGT GAT AGG GGT 3739 Lys Gly Asp Ala Glu Asn Met Val Leu Cys Asp Gly Cys Asp Arg Gly 1160 1165 1170 CAT CAT ACC TAC TGT GTT CGA CCA AAG CTC AAG ACT GTG CCT GAA GGA 3787 His His Thr Tyr Cys Val Arg Pro Lys Leu Lys Thr Val Pro Glu Gly 1175 1180 1185 GAC TGG TTT TGT CCA GAA TGT CGA CCA AAG CAA CGT TCT AGA AGA CTC 3835 Asp Trp Phe Cys Pro Glu Cys Arg Pro Lys Gln Arg Ser Arg Arg Leu 1190 1195 1200 TCC TCT AGA CAG AGA CCA TCC TTG GAA AGT GAT GAA GAT GTG GAA GAC 3883 Ser Ser Arg Gln Arg Pro Ser Leu Glu Ser Asp Glu Asp Val Glu Asp 1205 1210 1215 1220 AGT ATG GGA GGT GAG GAT GAT GAA GTT GAT GGC GAT GAA GAA GAA GGT 3931 Ser Met Gly Gly Glu Asp Asp Glu Val Asp Gly Asp Glu Glu Glu Gly 1225 1230 1235 CAA AGT GAG GAG GAA GAG TAT GAG GTA GAA CAA GAT GAA GAT GAC TCT 3979 Gln Ser Glu Glu Glu Glu Tyr Glu Val Glu Gln Asp Glu Asp Asp Ser 1240 1245 1250 CAA GAA GAG GAA GAA GTC AGC CTA CCC AAA CGA GGA AGA CCA CAA GTT 4027 1255 1260 1265 AGA TTG CCA GTT AAA ACA AGA GGG AAA CTT AGC TCT TCT TTC TCA AGT 4075 Arg Leu Pro Val Lys Thr Arg Gly Lys Leu Ser Ser Ser Phe Ser Ser 1270 1275 1280 CGT GGC CAA CAA CAA GAA CCT GGA AGA TAC CCT TCA AGG AGT CAG CAG 4123 Arg Gly Gln Gln Gln Glu Pro Gly Arg Tyr Pro Ser Arg Ser Gln Gln 1285 1290 1295 1300 AGC ACA CCC AAA ACA ACT GTT TCT TCT AAA ACT GGT AGA AGC CTA AGA 4171 Ser Thr Pro Lys Thr Thr Val Ser Ser Lys Thr Gly Arg Ser Leu Arg 1305 1310 1315 AAG ATA AAC TCT GCT CCT CCT ACA GAA ACA AAA TCT TTA AGA ATT GCC 4219 Lys Ile Asn Ser Ala Pro Pro Thr Glu Thr Lys Ser Leu Arg Ile Ala 1320 1325 1330 AGT CGT TCT ACT CGC CAC AGT CAT GGC CCA CTG CAA GCA GAT GTA TTT 4267 Ser Arg Ser Thr Arg His Ser His Gly Pro Leu Gln Ala Asp Val Phe 1335 1340 1345 GTG GAA TTG CTT AGT CCT CGT AGA AAA CGC AGA GGC AGG AAA AGT GCT 4315 Val Glu Leu Leu Ser Pro Arg Arg Lys Arg Arg Gly Arg Lys Ser Ala 1350 1355 1360 AAT AAT ACA CCA GAA AAT AGT CCC AAC TTC CCT AAC TTC AGA GTC ATT 4363 Asn Asn Thr Pro Glu Asn Ser Pro Asn Phe Pro Asn Phe Arg Val Ile 1365 1370 1375 1380 GCC ACA AAG TCA AGT GAA CAG TCA AGA TCT GTA AAT ATT GCT TCA AAA 4411 Ala Thr Lys Ser Ser Glu Gln Ser Arg Ser Val Asn Ile Ala Ser Lys 1385 1390 1395 CTT TCT CTC CAA GAG AGT GAA TCC AAA AGA AGA TGC AGA AAA AGA CAA 4459 Leu Ser Leu Gln Glu Ser Glu Ser Lys Arg Arg Cys Arg Lys Arg Gln 1400 1405 1410 TCT CCA GAG CCA TCG CCT GTG ACA CTG GGT CGA AGG AGT TCT GGC CGA 4507 Ser Pro Glu Pro Ser Pro Val Thr Leu Gly Arg Arg Ser Ser Gly Arg 1415 1420 1425 CAG GGA GGA GTT CAT GAA TTG TCT GCT TTT GAA CAA CTT GTT GTA GAA 4555 Gln Gly Gly Val His Glu Leu Ser Ala Phe Glu Gln Leu Val Val Glu 1430 1435 1440 TTG GTA CGA CAT GAT GAC AGC TGG CCT TTT TTG AAA CTT GTT TCT AAA 4603 Leu Val Arg His Asp Asp Ser Trp Pro Phe Leu Lys Leu Val Ser Lys 1445 1450 1455 1460 ATC CAG GTC CCA GAC TAC TAT GAC ATC ATC AAA AAG CCC ATT GCC TTA 4651 Ile Gln Val Pro Asp Tyr Tyr Asp Ile Ile Lys Lys Pro Ile Ala Leu 1465 1470 1475 AAT ATA ATT CGT GAA AAA GTG AAT AAG TGT GAA TAT AAA TTA GCA TCT 4699 Asn Ile Ile Arg Glu Lys Val Asn Lys Cys Glu Tyr Lys Leu Ala Ser 1480 1485 1490 GAG TTT ATT GAT GAC ATT GAG TTA ATG TTT TCG AAC TGC TTT GAA TAC 4747 Glu Phe Ile Asp Asp Ile Glu Leu Met Phe Ser Asn Cys Phe Glu Tyr 1495 1500 1505 AAC CCT CGT AAC ACA AGT GAA GCA AAA GCT GGA ACT AGG CTT CAA GCA 4795 Asn Pro Arg Asn Thr Ser Glu Ala Lys Ala Gly Thr Arg Leu Gln Ala 1510 1515 1520 TTT TTT CAT ATT CAG GCT CAA AAG CTT GGA CTC CAC GTC ACA CCC AGT 4843 Phe Phe His Ile Gln Ala Gln Lys Leu Gly Leu His Val Thr Pro Ser 1525 1530 1535 1540 AAT GTG GAC CAA GTT AGC ACA CCA CCG GCT GCG AAA AAG TCA CGA ATC 4891 Asn Val Asp Gln Val Ser Thr Pro Pro Ala Ala Lys Lys Ser Arg Ile 1545 1550 1555 TGA 4894 CTTTGTCCTT CTAAAGGATA TATTTGAAGA AAAACAAATT GTTCATGAAA ATGGAACATT 4954 AAATCATGCT GTATAAAGCA ATAACAAACA ATTGATTGAC CACATGAAAG TGTGGCCTGC 5014 ACTATATTCT CAATTTTAAT ATTAAGCACT CAGGAGAATG TAGGAAAGAT ATCCTTTGCT 5074 ACAGTTTTGT TCAGTATCTA ATAAGTTTGA TAGATGTATT GGATACAGTA CTGGTTTACA 5134 GAGGTTTTTG TACATTTTTG AGATCATTCA TGTGTCCAGA GATCTTGGAA AATATTTTTT 5194 CACCCACGAT TTATTTTGTT ATTGATGATT TTTTTTTAAA GTGGTGGTAT TAAGGGAGAG 5254 TTATCTACAT GGATGAGTCT TCCGCTATAG CACAGTTTAG AAAAGGTGTT TATGTCTTAA 5314 TTAATTGTTT GAGTACATTC TTTCAACACT ACACATGAAT GAATCCAATC TTATAACCTT 5374 GAAGTGCTGT ACCAGTGCTG GCTGCAGGTA TTAAGTCCAA GTTTATTAAC TAGATATTTA 5434 TTTAGTATTG AGAGTAATTT GTGAATTTGT TTTGTATTTA TAAAATTTAT ACCTGAAAAA 5494 TGTTCCTTAA TGTTTTAAAC CTTTTACTGT GTTTTTATTC CTCTAACTTC CTTAATGATC 5554 AATCAAAAAA AGTAACACCC TCCCTTTTTC CTGACAGTTC TTTCAGCTTT ACAGAACTGT 5614 ATTATAAGTT TCTATGTATA ACTTTTTAAC TGTACAAATA AAATAACATT TTTTCAAAAA 5674 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AA 5696

【図面の簡単な説明】

【図１】ｈＴＬＰ１をベイトに用いたＹｅａｓｔＴｗｏ
−ＨｙｂｒｉｄＳｙｓｔｅｍの概略を示した図であ
る。

【図２】ｈＴＬＰ１をベイトに用いたＹｅａｓｔＴｗｏ
−ＨｙｂｒｉｄＳｃｒｅｅｎｉｎｇの結果を示した図
である。

【図３】新規ヒトテロメラーゼ蛋白質遺伝子ｈＴＬＰ２
のｃＤＮＡクローンの位置関係と制限酵素切断地図を示
した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＧ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配
列に１又は２以上のアミノ酸残基による置換、挿入、及
び／又は欠失が存在しており、実質的にテロメラーゼ蛋
白質として機能することを特徴とするポリペプチド。
【請求項２】ヒトの生体内でテロメラーゼ蛋白質とし
て機能することができる請求項１に記載のポリペプチ
ド。
【請求項３】請求項１または２に記載のポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４】ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列である請求項
３に記載のヌクレオチド配列。
【請求項５】請求項４に記載のＤＮＡ配列を含む組換
えベクター。
【請求項６】請求項５に記載の組換えベクターが導入
された形質転換体。
【請求項７】請求項６に記載の形質転換体を培養した
培養物から請求項５に記載のＤＮＡ配列の遺伝子産物で
あるポリペプチドを分離・採取する工程を含む、請求項
１または２に記載のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】請求項１または２に記載のポリペプチド
を特異的に認識することができる抗体。
【請求項９】請求項３に記載のヌクレオチド配列の一
部又は全部に相補的に結合可能なヌクレオチド配列を含
む核酸プローブ。
【請求項１０】請求項８に記載の抗体又は請求項９に
記載の核酸プローブを含む、癌細胞検出用試薬。
【請求項１１】請求項８に記載の抗体又は請求項９に
記載の核酸プローブを含む、癌診断用の医薬組成物。
【請求項１２】請求項１に記載のポリペプチドをサブ
ユニットとして含む高等動物テロメラーゼ複合体。