JPH1189587A - 遺伝的に改変された細胞および疾患の予防または治療におけるそれらの使用 - Google Patents

遺伝的に改変された細胞および疾患の予防または治療におけるそれらの使用

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JPH1189587A
JPH1189587A JP10205261A JP20526198A JPH1189587A JP H1189587 A JPH1189587 A JP H1189587A JP 10205261 A JP10205261 A JP 10205261A JP 20526198 A JP20526198 A JP 20526198A JP H1189587 A JPH1189587 A JP H1189587A
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cells
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Hafueman Kurausu
クラウス、ハフェマン
Miyuuraa Rorufu
ロルフ、ミューラー
Zetoratsuetsuku Hansuuhararuto
ハンス‐ハラルト、ゼトラツェック
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Aventis Pharmaceuticals Inc
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Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH
Hoechst Marion Roussel Inc
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 遺伝子治療に用いられる細胞の提供。 【解決手段】 ａ）単核非接着性細胞を単離する；ｂ）
内皮細胞に対する増殖因子を含んでなる培地中において
工程ａ）で得られた細胞を培養する；ｃ）癌遺伝子によ
る形質転換、癌遺伝子の活性化またはサプレッサー遺伝
子の不活化により工程ａ）またはｂ）で得られた細胞を
不死化する；およびｄ）適切なプロモーター系により活
性化できるエフェクター遺伝子を含む遺伝子治療用の核
酸構築物により、工程ａ）およびｂ）または工程ｃ）で
得られた細胞をトランスフェクションすることにより得
られる、遺伝子治療用細胞。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、遺伝子治療に用いられる細胞に関する。
【０００２】背景技術 １）序論 活性化合物の発現のために形質導入された、in vitroで
トランスフェクトされた体細胞の投与が、前臨床的にお
よび臨床的に試験する上で現在広く用いられている遺伝
子治療である。繊維芽細胞、リンパ球、ケラチン細胞お
よび腫瘍細胞を含めた異なる細胞がここでは用いられ
る。
【０００３】内皮細胞が１９８９年に初めてこの目的の
ために用いられた。このために、内皮細胞は活性化合物
を発現させる上でレトロウイルスベクター（Zwiebel et
al.,Science,243: 220 (1989)）の補助によりin vitro
でトランスフェクトされた。
【０００４】プラスチック血管プロテーゼ上においてin
vitroで増殖させた、このタイプの形質導入された内皮
細胞は、これらプロテーゼのin vivo 移植後に、トラン
スジーンを発現することができた（Zwiebel et al.,Sci
ence,243: 220 (1989)；Wilson et al.,Science,244: 1
344 (1989)）。結果として、プラスチックまたはコラー
ゲン担体に接着している形質導入された内皮細胞を遺伝
子治療のために患者に投与することが、Zwiebel および
Wilsonにより提示されたのである。この提示はNathan e
t al.（PNAS USA,92: 8130 (1995)）により実験的に行
われた。
【０００５】この提示の延長として、遺伝子治療ルート
として血流中への形質導入内皮細胞の細胞懸濁液の投与
の可能性はNabel et al.（Science,244: 1342 (1989)）
により初めて示された。その著者らは、掻きとりにより
生きた哺乳動物の血管から得られて、例えば内皮細胞損
傷を有する血管への局所投与後にリポーター遺伝子を発
現するようにin vitroで形質導入された内皮細胞が、そ
こで増殖して、リポーター遺伝子を発現することを示す
ことができた。これらの結果に基づき、その著者らは遺
伝子治療の目的で遺伝子修飾された内皮細胞を投与する
可能性を記載しており、活性化合物は全身性または遺伝
性疾患の治療の目的で血液循環中に直接これらの内皮細
胞によりデリバリーされる。この考え方はBernstein et
al.（FASEB J.4: 2665 (1990)）により更に発展させら
れた。肺内皮細胞は活性化合物を発現させるためにin v
itroでプラスミドでトランスフェクトされ、ヌードマウ
スにその後腹腔内、静脈内、皮下または腎臓皮膜下で注
入した。こうして治療された動物では、内皮細胞移植片
により産生された活性化合物が局所的に（腎臓の嚢胞
で）または血中で（ｉ．ｐ．、ｉ．ｖ．またはｓ．ｃ．
投与後に）検出され、遺伝子治療にとりin vitroで形質
導入された内皮細胞のin vivo 投与の有用性を証明し
た。
【０００６】その後で、Zwiebel et al.,1992 （ＷＯ９
３／１３８０７）および Ojeifo etal.（Cancer Res.5
5: 2240 (1995)）は、遺伝子治療の目的のために血液循
環中へのin vitroで形質導入された内皮細胞の投与方法
の使用の可能性をいくつかの実施例で示した。
【０００７】Zwiebel et al.(1992)は活性化合物を発現
させるためにレトロウイルスベクターを用いてヒト臍帯
内皮細胞およびラットの脂肪組織からの内皮細胞にin v
itroで形質導入し、局所脈管損傷および血管形成が放射
線照射ＦＧＦ分泌細胞の注入により最初に作り出された
動物中にこれら内皮細胞を静脈内注入した。彼らは、注
入された内皮細胞が脈管損傷および血管形成の部位に局
在していて、そこで活性化合物を発現することを示すこ
とができた。このバックグラウンドに対して、著者らは
アデノシンアミナーゼ、血液凝固因子、増血増殖因子、
サイトカイン、抗トロンビン剤、酵素インヒビターおよ
びホルモンの発現のためのin vitro形質導入内皮細胞の
使用を彼らの特許出願で請求した。
【０００８】これらの研究と並行して、内皮細胞の単離
技術が改善され、in vitroで形質導入された内皮細胞の
移動挙動性も他の著者らにより更に詳細に研究された。
【０００９】こうして Messiana et al.（PNAS USA,89:
12018 (1992) ）は、in vitroでトランスフェクトされ
た内皮細胞が、循環中への注入後に、元の内皮細胞層に
接着して、この中に組み込まれることを示すことができ
た。このように、脈管損傷および血管形成のあるゾーン
で脈管内投与された内皮細胞の排他的局在化をなくすこ
とができた。他方、腫瘍細胞との混合物として注入され
てin vitroでトランスフェクトされた内皮細胞が腫瘍脈
管床の血管形成に関与することを示すことも可能であっ
た（Lal et al.,PNAS USA,91: 9695 (1994) ；Nam et a
l.,Brain Res.731: 161 (1996)）。このため、内皮細胞
との混合物として移植された腫瘍細胞はin vivo で明ら
かな増殖効果を有している（Stopeck et al.,Proc.Am.A
ssoc.Cancer Res.38: 265 (1997)）。
【００１０】他方、形質導入された内皮細胞は、トラン
スジーンによりコードされた活性化合物の発現により、
薬理学的に活性であるか、または局所的に抗腫瘍活性を
有していて、例えば脳または脳腫瘍中に投与される（Na
m et al.,Brain Res.731: 161 (1996)；Quinonero et a
l.,Gene Ther.4: 111 (1997)）。例えば、Robertsonet
al.（Proc.Am.Assoc.Cancer Res.38: 382 (1997) ）
は、ヒト卵巣癌細胞との混合物として、ＨＳＶ‐ＴＫを
発現させるためにＡＶベクターを用いて、in vitroで形
質導入されたヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を投与した。
静細胞効果を発揮するようにＨＳＶ‐ＴＫにより腫瘍で
活性化されるガンシクロビアの投与後に、それらはヌー
ドマウスで顕著な腫瘍抑制を観察することができた。
【００１１】しかしながら、遺伝子治療でトランスジー
ンの細胞キャリアとして内皮細胞の使用は、２つの重大
な問題により、これまで著しく制限されてきた：‐十分
な数で適切な内皮細胞の入手がこれまで極端に困難であ
ることがわかった。
【００１２】同種内皮細胞は臍帯または細胞培養物から
得ることが確かに比較的簡単であるが、それらの免疫原
性の結果として、それらはレシピエントで限定的に使え
るだけであり、他方細胞培養でのそれらの増殖は限られ
た程度に可能なだけである。
【００１３】自己内皮細胞は、実際に、例えば拡張蛇行
静脈の“掻きとり”によりまたは脂肪組織から機械的に
得られる。しかしながら、このタイプの入手はすべての
患者の場合に可能なわけではなく、しかも患者への著し
い損傷を意味する。したがって、血管芽細胞または内皮
細胞の前駆細胞が代わりに末梢血から得られた（Asahar
a et al.,Science,275: 964 (1997)）。これに必要な血
液の収集は患者にとり確かにストレスが少ないが、しか
しながら単核血液細胞から想定した血管芽細胞の単離
と、内皮細胞からのこれら血管芽細胞の区別は非常に面
倒である。そのため、わずかに低濃度（≦０．１％）で
血中に存在するだけの単核血液細胞は、キャリア結合モ
ノクローナル抗体（ＣＤ３４またはＦｌｋ‐１に特異
的）での免疫吸着により（密度勾配遠心の補助で単離さ
れた）白血球から単離される。その後で、これらの細胞
は、内皮細胞への分化および増殖のために、牛脳含有培
地で約４週間にわたり１型コラーゲンまたはフィブロネ
クチンの組織皿で層化される。しかしながら、これら細
胞の増殖は限られた程度に可能なだけである。加えて、
内皮細胞と脳物質、例えば牛脳とのインキュベートは著
しい安定性問題を生じる。
【００１４】‐内皮細胞の移動と、望ましい標的領域に
おけるトランスジーンの選択的発現は、十分にコントロ
ールしえない。
【００１５】内皮細胞の脈管内投与後に、これらは血管
新生領域と、休止内皮細胞層上および中に（既に上記さ
れたように）局在化する。加えて、前駆細胞から細胞培
養で形成された内皮細胞が、注入後in vivo で前駆細胞
に再分化して、体全体に分散するかどうかは、不明であ
る。
【００１６】
【発明の概要】本発明によると、上記２つの重要な問題
が解決される。
【００１７】２）本発明の一般的記載 本発明は、 １）体の血液および他の細胞含有液から単核細胞、特に
内皮前駆細胞、の単離および培養のための改善された、
即ち簡単で安全な、方法と、障害の予防または治療にお
けるこれら細胞の使用； ２）あるいは、細胞培養によりやや多量のこのような細
胞が得られるような、これら細胞の細胞、特に内皮細
胞、特異的な、場合により薬理学的にコントロールしう
る形質転換； ３）１）または１）および２）により作製されたこれら
の細胞中に、細胞、特に内皮細胞、特異的に、場合によ
り低酸素症の結果として、細胞周期特異的および／また
はウイルス特異的に適切なプロモーター系の選択により
発現される、少くとも１つのエフェクター遺伝子が挿入
されるような、エフェクター遺伝子用のベクターとして
の、細胞、特に内皮細胞、の作製； ４）障害の予防または治療のための、こうして得られた
これら遺伝子修飾細胞、特に内皮細胞、の投与に関す
る。
【００１８】したがって、本発明は ａ）体の血液または細胞含有液からの単核細胞の単離； ｂ）ガングリオシド、リン脂質、糖脂質、および／また
は分化、生存、移動および／または血管新生に影響を与
える因子を含めた内皮細胞用の増殖因子を含んでなる細
胞培地中における、工程ａ）で得られた細胞の培養； ｃ）場合により、癌遺伝子での形質転換、癌遺伝子の活
性化またはサプレッサー遺伝子の不活化による、工程
ａ）またはｂ）で得られた細胞の不死化； ｄ）標的細胞特異的に、細胞周期特異的に、ウイルス特
異的におよび／または低酸素症の結果として適切なプロ
モーター系により活性化できるエフェクター遺伝子を含
む遺伝子治療用の核酸構築物による、工程ａ）および
ｂ）または工程ｃ）で得られた細胞のトランスフェクシ
ョンにより得られる、遺伝子治療用細胞に関する。
【００１９】
【発明の具体的説明】更に、本発明の主題、本発明の態
様および対応例は以下に記載されている。 ３）内皮細胞の作製 ３．１．）内皮細胞の前駆細胞の単離および培養 内皮細胞から前駆細胞の単離に関する本発明による方法
は、下記セクションに細分化することができる：体の細
胞含有液は、当業者に知られる侵襲手順を用いて各臓器
から取り出される。体のこれら細胞含有液には、例えば
以下がある： ‐静脈、毛細血管、動脈、臍帯または胎盤から得られる
血液 ‐骨髄細胞懸濁液 ‐脾臓細胞懸濁液 ‐リンパ節細胞懸濁液 ‐腹膜細胞懸濁液 ‐胸膜細胞懸濁液 ‐リンパ ‐結合組織液（例えば外面的な、例えば機械的な損傷を
うけた表皮の表面から出てくる） 赤血球、顆粒球および他の細胞成分は密度勾配遠心によ
りこれらの体液から分離され、血小板は当業者に知られ
る方法に従い分画遠心により分離される。
【００２０】こうして単離された単核（核含有）細胞は
血清含有細胞培地に懸濁される。用いられる細胞培地
は、以下に挙げられるガングリオシド、リン脂質および
／または増殖因子を含有している。
【００２１】本発明の具体的態様において、単離された
単核（核含有）細胞はこの細胞培地で培養されて、内皮
細胞様細胞を与えるように分化される。
【００２２】本発明の別な具体的態様において、単離さ
れた核含有単核細胞は、多糖コート鉄または酸化鉄粒子
とカップリングする、単球／マクロファージ典型的表面
マーカー（ＣＤ１１、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１
４、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ６８）に対する抗体とイ
ンキュベートされ、洗浄され、その後こうしてコートさ
れた細胞は磁石により回収される。細胞は下記のガング
リオシド、リン脂質および／または増殖因子を含有した
細胞培地に加えられ、内皮細胞を得るために更にin vit
roで増殖および分化される。不死化および／またはトラ
ンスフェクションは細胞の増殖および分化後にin vitro
で行われる。
【００２３】本発明の別な態様において、単離された核
含有細胞は更に分化および増殖のために＞１時間にわた
り前記細胞培地でプレインキュベートされる。これらの
条件下で、内皮前駆細胞として認識される細胞は、単球
／マクロファージに典型的な表面マーカー（ＣＤ１１、
ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ３４、ＣＤ６
４、ＣＤ６８）を次第に形成していく。次いでこれらの
細胞は単離され、例えばそれらは、これらの単球マーカ
ー（例えば、ＣＤ１１、ＣＤ１４）に対する、デキスト
ランコート鉄粒子とカップリングする抗体を用いて、磁
石により回収される。細胞は更にin vitroで増殖され、
分化されて、内皮細胞を与える。
【００２４】これの代わりに、ＣＤ３４陽性細胞（造血
幹細胞）が、例えばAsahara et al.,Science,275: 964
(1997)に記載されたような非接着性単核細胞から単離さ
れ、更にin vitroで増殖され、分化されて、内皮細胞を
与える。
【００２５】本発明の具体的な態様において、単離され
た核含有細胞は細胞培地に懸濁され、得られた貪食細胞
（例えば、単球、マクロファージ、顆粒球）は、表面に
接着するか、磁石によりタンパク質担持、デキストラン
コート鉄粒子の食作用により、および／または当業者に
知られる方法に従い向流遠心により除去され、得られた
単核細胞含有ＣＤ３４陽性細胞は本発明に従い細胞培地
で培養され、分化されて、内皮細胞様細胞を与える。
【００２６】細胞培養容器は、例えばフィブロネクチン
のような細胞外マトリックス成分（例えばSigma のatta
chment and matrix factors 参照）でコートすることが
できる。ガングリオシド、リン脂質および／または糖脂
質が細胞培地に加えられ、および／または、しかしなが
ら、好ましくは本発明によると下記のような内皮細胞用
の増殖因子： ‐脈管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）および／または他のＫ
ＤＲまたはＦｌｔリガンド ‐繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦα、ＦＧＦβ）および／
または ‐表皮増殖因子（ＥＧＦ）および／または ‐インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ‐１、ＩＧＦ‐２）
および／または ‐β‐内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）および／または ‐内皮細胞付着因子（ＥＣＡＦ）および／または ‐インターロイキン‐３（ＩＬ‐３）および／または ‐ＧＭ‐ＣＳＦおよび／または ‐Ｇ‐ＣＳＦおよび／または ‐インターロイキン‐４（ＩＬ‐４）および／または ‐インターロイキン‐１（ＩＬ‐１）および／または ‐コロニー刺激因子（ＣＳＦ‐１）および／または ‐インターロイキン‐８（ＩＬ‐８）および／または ‐血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）および／または ‐インターフェロンγ（ＩＦＮγ）および／または ‐オンコスタチンＭおよび／または ‐ＬＩＦおよび／または ‐Ｂ６１および／または ‐血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤＥＧＦ）および／
または ‐幹細胞因子（ＳＣＦ）および／または ‐トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ‐β）およ
び／または ‐アンギオゲニンおよび／または ‐プレオトロフィンおよび／または ‐Ｆｌｔ‐３リガンド（ＦＬ） ‐アンギオポエチン‐１のようなＦｉｅ‐２リガンドお
よび／または ‐間質由来因子‐１（ＳＤＦ‐１）および／または ‐ミドキネス が加えられる。
【００２７】６時間〜８週間の間で選択された時間後に
増殖された細胞は、本発明に従い更に処理される。
【００２８】こうして単離された内皮細胞も、損傷血管
の内皮化を促進させて、血管新生を促進させるために、
直接用いることができる。
【００２９】３．２．）内皮細胞の単離 しかしながら、セクション３．１．）に示された本発明
による方法の代わりに、内皮細胞は、当業者に知られる
方法を用いて、例えば脂肪組織から、静脈の掻きとりに
より、または臍帯内皮の除去によっても得られる。その
培養はセクション３．１．）で既に記載されたように行
われる。
【００３０】４）内皮細胞の不死化 本発明によると、タンパク質のヌクレオチド配列（成分
ａ）が本発明による１以上の非接着性単核細胞または内
皮細胞中に挿入されて、これらの細胞を細胞分裂周期に
継続的に移行させ、非交互的な“永久に”分裂する細胞
系にさせる。このような不死化ヌクレオチド配列または
遺伝子は既に知られている。これらのヌクレオチド配列
には、例えば癌遺伝子がある。本発明によると、癌遺伝
子は細胞起源でもまたはウイルス起源でもよい。細胞癌
遺伝子の例は、Wynford-Thomas,J.Pathol.165: 187 (19
91) ；Harrington et al.,Curr.Opin.Genet.Developm.
4:120 (1994)；Gonos et al.,Anticancer Res.13: 1117
(1993) ；Baserga et al.,Cancer Surveys,16: 201 (1
993)で既に包括的に記載されている。このタイプの癌遺
伝子は当業者に知られる方法を用いて細胞中に導入でき
る。しかしながら、それらのゲノムにおいては、細胞
が、本発明に従い当業者に知られる方法を用いて細胞中
で活性化できる、即ち癌遺伝子に変換させうる、癌原遺
伝子も有している。
【００３１】本発明の具体的態様において、成分ａ）は
サプレッサー遺伝子のタンパク質を不活化するタンパク
質をコードしたヌクレオチド配列を表す。
【００３２】サプレッサー遺伝子の例は、Karp and Bro
der,Nature Med.4: 309 (1995)；Skuse and Ludlow,The
Lancet,345: 902 (1995) ；Duan et al.,Science,269:
1402 (1995)；Hugh et al.,Cancer Res.55: 2225 (199
5)；Knudson,PNAS USA,90: 10914 (1993) ）で既に包括
的に記載されている。
【００３３】サプレッサー遺伝子の発現産物を不活化す
るタンパク質をコードする遺伝子（成分ａ）の例： 表１： サプレッサー遺伝子 以下をコードする のタンパク質 本発明による遺伝子（成分ａ） 網膜芽細胞腫タンパク質 ‐アデノウイルスのＥ１Ａタンパク質 （Ｒｂタンパク質） （Whyte et al.,Nature,334:124(1988) ） および関連タンパク質 ‐ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原 例えばｐ１０７ （De Caprio et al.,Cell,54:275(1988)） およびｐ１３０ ‐パピローマウイルスのＥ７タンパク質 （例えば、ＨＰＶ‐１６、ＨＰＶ‐１８） （Dyson et al.,Science,243:934(1989) ‐アミノ酸配列LXDXLXXL-II-LXCXEXXXXXSDDE （配列番号１）を含むタンパク質 配列表フリーテキスト：Ｘは可変アミノ酸であり 、‐II‐は（翻訳産物に存在する２０の天然アミ ノ酸から選択される） ７〜８０アミノ酸のいずれか望ましいアミノ酸鎖 である（Munger et al.,Cancer Surveys,12:197 (1992)） ｐ５３ ‐アデノウイルスのＥ１Ｂタンパク質 （Sarnow et al.,Cell,28:287(1982) ） ‐ＳＶ４０ウイルスのラージＴ抗原 （Lane et al.,Nature,278:261(1979)） ‐パピローマウイルスのＥ６タンパク質 （例えば、ＨＰＶ‐１６、ＨＰＶ‐１８） （Werness et al.,Science,248:76(1990) ； Scheffner et al.,Cell,63:1129(1990)） ‐ＭＤＭ‐２タンパク質 （Momand et al.,Cell,69:1237(1992)；Oliner et al.,Nature,362:857(1993)；Kussie et al., Science,274:948(1996)）
【００３４】本発明の別な具体的態様において、成分
ａ）は、細胞周期を依然として十分に活性化しうるが、
細胞インヒビターによりこの機能についてもはや阻害さ
れないように、変異により修飾された細胞周期調節タン
パク質についての変異ヌクレオチド配列である。本発明
の意味内において、これらには、変異にもかかわらずそ
れらのキナーゼ活性を留めているが、細胞ｃｄｋインヒ
ビターと結合する能力を失った、サイクリン依存性キナ
ーゼについてコードする変異ヌクレオチド配列も含む。
【００３５】成分ａ）の例は： ‐ｐ１６、ｐ１５および／またはｐ２１がもはや阻害で
きないように変異されたｃｄｋ‐４ ‐ｐ１５および／またはｐ１８がもはや阻害できないよ
うに変異されたｃｄｋ‐６ ‐ｐ２１および／またはｐ２７および／またはＷＡＦ‐
１がもはや阻害できないように変異されたｃｄｋ‐２ 例えば、ｃｄｋ４の変異は、この変異ｃｄｋ４がキナー
ゼ活性を有しているが、もはやｐ１５およびｐ１６によ
り阻害されないような、２４位におけるアルギニンから
システインへの置換である（Wolfel et al.,Science,26
9: 1281 (1995)）。
【００３６】本発明の別な具体的態様において、成分
ａ）は、適宜に薬理学的にコントロールしうるプロモー
ターと組み合わされた、発現が自己増幅プロモーター要
素により調節される、形質転換遺伝子である（これにつ
いてはセクション６．４参照）。
【００３７】本発明の別な好ましい態様において、内皮
細胞中に、特に内皮細胞の前駆細胞中に、あるいは血液
と比較して増加した割合の内皮細胞または内皮細胞の前
駆細胞、またはＣＤ３４‐、ＣＤ１１‐、ＣＤ１１ｂ
‐、ＣＤ１４‐、ＣＤ１３‐、ＣＤ６４‐およびＣＤ６
８‐陽性細胞を含有した細胞混合物の細胞中に、内皮細
胞特異性プロモーターまたはエンハンサー配列からなる
ヌクレオチド配列（成分ｂ）と成分ａ）が挿入され；成
分ａ）の転写は成分ｂ）への内皮細胞の転写因子の結合
により活性化される。
【００３８】成分ａ）の発現産物が細胞核中にうまく残
るように、成分ａ）に核局在化シグナル（成分ｃ）を結
合させることが可能である。そこから得られる成分の並
び方は図１で例示されている。
【００３９】図１に示された成分を含む核酸構築物の導
入により、不死化段階の異種細胞混合物、即ち永続的分
裂細胞中に含有された内皮細胞および内皮細胞の前駆体
だけが変換され、そのため数日後にこれらの内皮細胞は
細胞培養物中で割合優勢になり、培養条件に依存した時
間後に、但し明らかに、細胞培養物中で排他的に存在す
る。
【００４０】これらの核酸構築物と本発明による方法を
用いると、わずかな内皮細胞または内皮細胞のわずかな
前駆細胞からでも、それらが異種細胞混合物中に存在し
ていたとしても、予防または治療用に多量の同種内皮細
胞を作製することが低経費で比較的短時間に可能であ
る。
【００４１】５）予防および／または治療用の遺伝子修
飾内皮細胞の作製 本発明によると、核酸構築物は本発明による方法の１つ
により得られる内皮細胞中に導入され、これは少くとも
下記成分： ‐プロモーター（成分ｄ） ‐活性化合物または酵素をコードする構造遺伝子（成分
ｅ） を含んでいる。
【００４２】６）プロモーター配列の選択 本発明の意味内において、転写因子の結合後に、例えば
構造遺伝子のような、３′末端に隣接されたトランスジ
ーンの転写を活性化させるヌクレオチド配列が、プロモ
ーター配列として用いられる。本発明の意味内には、少
くとも１つの内皮細胞特異性プロモーター配列（成分
ｂ）および／または成分ｄ）が内皮細胞中に挿入され
る。この内皮細胞特異性プロモーター配列は、少くとも
１つの別なプロモーター配列と組み合わせることができ
る。内皮細胞特異性プロモーターと組み合わされるプロ
モーター配列の選択は、治療される障害に依存する。こ
のため、追加のプロモーター配列は、無制限に、内皮細
胞特異的に、ある代謝条件下で、例えば低酸素症により
誘導させるか、あるいはファルマコンまたは活性化ウイ
ルス特異的および／または細胞周期特異的に切換えるこ
とが可能である。このタイプのプロモーターは、特許出
願ＥＰ９５９３１２０４．２；ＥＰ９５９３０５２４．
４；ＥＰ９５９３１２０５．９；ＥＰ９５９３１９３
３．６；ＥＰ９６１１０９６２．２；ＤＥ１９７０４３
０１．１；ＥＰ９７１０１５０７．８；ＥＰ９７１０２
５４７．３；ＤＥ１９７１０６４３．９；およびＥＰ９
７１１０９９５．８で既に記載されている。これらの特
許出願が参考にされる。選択されるプロモーター配列に
は、例えば以下がある：
【００４３】６．１．）無制限に活性化しうるプロモー
ターおよびアクチベーター配列 例えば ‐ＲＮＡポリメラーゼIII のプロモーター ‐ＲＮＡポリメラーゼIIのプロモーター ‐ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー ‐ＳＶ４０プロモーター
【００４４】６．２．）代謝的に活性化しうるプロモー
ターおよびエンハンサー配列 例えば低酸素症により誘導しうるエンハンサー（Semenz
a et al.,PNAS,88: 5680 (1991) ；McBurney et al.,Nu
cl.Acids Res.19: 5755 (1991)）
【００４５】６．３．）細胞周期特異的に活性化しうる
プロモーター これらには、例えばｃｄｃ２５Ｂ遺伝子、ｃｄｃ２５Ｃ
遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、ｃｄｃ２遺伝子、Ｂ‐ｍ
ｙｂ遺伝子、ＤＨＦＲ遺伝子、Ｅ２Ｆ‐１遺伝子のプロ
モーター、あるいは細胞増殖中に生じるかまたは活性化
される転写因子についての結合配列がある。これらの結
合配列には、例えばｃ‐ｍｙｃタンパク質についての結
合配列がある。これらの結合配列の中には、ＭｙｃＥボ
ックスとしてデザインされたヌクレオチド配列（５′‐
ＧＧＡＡＧＣＡＧＡＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＴＧＣＴＴＣ
Ｃ‐３′（配列番号２）；Blackwood and Eisenmann,Sc
ience,251: 1211 (1991)）のモノマーまたはマルチマー
が含まれる。
【００４６】６．４．）自己エンハンシングおよび／ま
たは薬理学的に制御しうるプロモーター 最も簡単な場合において、同一または異なるプロモータ
ーと組み合わせて、１つのプロモーターは、例えば適切
なリプレッサーと組み合わされたテトラサイクリンオペ
レーターの形でテトラサイクリンにより活性化または切
換えしうるプロモーターの形として誘導できる。
【００４７】しかしながら、本発明によると、プロモー
ターは薬理学的にコントロールしうるプロモーター単位
と共にまたはそれなしに自己エンハンシングすることも
できる。
【００４８】このタイプの自己エンハンシングおよび／
または薬理学的にコントロールしうるプロモーターは、
特許出願ＤＥ１９６５１４４３．６で既に記載されてお
り、参考にされる。
【００４９】６．５．）内皮細胞特異的に活性化しうる
プロモーター これらには、好ましくは内皮細胞で形成されるタンパク
質をコードする遺伝子のプロモーターまたはエンハンサ
ーのプロモーターまたはアクチベーター配列がある。
【００５０】本発明の意味内では、例えば下記タンパク
質に関する遺伝子のプロモーターが用いられる： ‐脳特異的、内皮グルコース‐１‐トランスポーター ‐エンドグリン ‐ＶＥＧＦレセプター１（ｆｌｔ‐１） ‐ＶＥＧＦレセプター２（ｆｌｋ‐１、ＫＤＲ） ‐ｔｉｅ‐１またはｔｉｅ‐２ ‐Ｂ６１レセプター（Ｅｃｋレセプター） ‐Ｂ６１ ‐エンドセリン、特にエンドセリンＢまたはエンドセリ
ン‐１ ‐エンドセリンレセプター、特にエンドセリンＢレセプ
ター ‐マンノース‐６‐リン酸レセプター ‐フォンビルブラント因子 ‐ＩＬ‐１α、ＩＬ‐１β ‐ＩＬ‐１レセプター ‐脈管細胞接着分子（ＶＣＡＭ‐１） ‐間質細胞接着分子（ＩＣＡＭ‐３） ‐合成アクチベーター配列 使用できる天然内皮細胞特異性プロモーターの代替物に
は、内皮細胞で優先的にまたは選択的に活性である転写
因子のオリゴマー化結合部位からなる合成アクチベータ
ー配列もある。これらの一例は転写因子ＧＡＴＡ‐２で
あり、エンドセリン‐１遺伝子におけるその結合部位は
５′‐ＴＴＡＴＣＴ‐３′である（Leeet al.,Biol.Che
m.16188 (1991) ；Dormann et al.,J.Biol.Chem.1279
(1992)；Wilson et al.,Mol.Cell Biol.4854 (1990)
）。
【００５１】７）同一または異なるプロモーターの組合
せ 同一プロモーターの組合せは、例えばヌクレオチド配列
の５′から３′への読取り方向でいくつかのプロモータ
ーの連続結合により行われる。
【００５２】しかしながら、同一または異なるプロモー
ターの組合せのためには、特許出願ＧＢ９４１７３６
６．３；ＥＰ９７１０１５０７．８；ＥＰ９７１０２５
４７．３；ＤＥ１９７１０６４３．９；ＤＥ１９６１７
８５１．７；ＤＥ１９６３９１０３．２；およびＤＥ１
９６５１４４３．６で既に詳細に記載された技術が好ま
しくは用いられる。本発明の関係でこれらの特許出願が
参考にされる。このタイプの技術の例には以下がある。
【００５３】７．１．）キメラプロモーター キメラプロモーターとは、上流に位置する細胞特異的、
代謝的またはウイルス特異的に活性化しうるアクチベー
ター配列と、下流に位置するプロモーターモジュールと
の組合せを表し、ヌクレオチド配列ＣＤＥ‐ＣＨＲまた
はＥ２ＦＢＳ‐ＣＨＲを含んで、それには抑制タンパク
質が結合していて、これにより細胞周期のＧ０およびＧ
１期で上流に位置するアクチベーター配列の活性化を阻
害できる（ＧＢ９４１７３６６．３；Lucibello et a
l.,EMBO J.,12 (1994)）。
【００５４】特にプロモーター要素ＣＤＥ‐ＣＨＲの機
能様式に関する継続的研究では、上流に位置するアクチ
ベーター配列のＣＤＥ‐ＣＨＲ要素による細胞周期依存
性調節が、グルタミンに富む活性化ドメインにより活性
化される転写因子の活性化配列にかなり依存しているこ
とを示した（Zwicker et al.,Nucl.Acids Res.3822 (19
95) ）。
【００５５】このタイプの転写因子には、例えばＳｐ１
およびＮＦ‐Ｙがある。
【００５６】結果的に、これはキメラプロモーターにと
りプロモーター要素ＣＤＥ‐ＣＨＲの使用を制限してい
る。同様のことが、Ｂ‐ｍｙｂ遺伝子のプロモーター要
素Ｅ２Ｆ‐ＢＳ‐ＣＨＢについても考えられる（Zwicke
r et al.,Nucl.Acids Res.23,3822 (1995)）。
【００５７】７．２．）ハイブリッドプロモーター ハイブリッドプロモーターは特許出願ＤＥ１９６３９１
０３．２で既に記載されている。内皮細胞特異的プロモ
ーターと少くとも１つの別なプロモーターとの組合せで
は、例えば下記成分を一緒に含んだ遺伝子構築物が選択
される：転写因子の少くとも１つの結合部位が変異され
た形をとる内皮細胞特異的プロモーターのヌクレオチド
配列。この変異により、エフェクター遺伝子の転写の開
始は阻止される。エフェクター遺伝子として活性化合物
をコードするトランスジーン。非特異的に、細胞特異的
に、ウイルス特異的に、テトラサイクリンでおよび／ま
たは細胞周期特異的に活性化でき、少くとも１つの転写
因子に関する少くとも１つの遺伝子の転写を活性化し
て、内皮細胞特異的プロモーターにおける変異結合部位
と結合してこれを活性化しうるように変異された、少く
とも１つの別なプロモーターまたはエンハンサー配列。
【００５８】本発明の例示態様では、プロモーター配列
における変異、例えばｃｄｃ２５ＢプロモーターのＴＡ
ＴＡボックスの変異を示すことができる。
【００５９】ＴＡＴＡの変異には、例えばＴＧＴＡＴＡ
Ａがある。この変異により、正常ＴＡＴＡボックス結合
タンパク質（ＴＢＰ）のＤＮＡ結合部位はもはや認識さ
れず、エフェクター遺伝子はもはや効率的に転写されな
い。したがって、ＴＢＰをコードする核酸配列は共変異
を有していなければならない。この共変異により、ＴＢ
Ｐは変異ＴＡＴＡボックスと（例えば、ＴＧＴＡＴＡＡ
で）結合し、こうしてエフェクター遺伝子の効率的転写
に至る。このタイプのＴＢＰ遺伝子の共変異は、例えば
Strubin and Struhl (Cell,721 (1992))およびHeard et
al.(EMBO J.3519 (1993))に記載されている。
【００６０】７．３．）核保持シグナルおよび核輸出因
子と組み合わせたマルチプロモーター この技術は特許出願ＤＥ１９６１７８５１．７で既に詳
細に記載されており、本特許出願に引用される。
【００６１】このタイプのプロモーターは、本発明によ
ると、下記成分を含んでいる： ‐トランスジーンの基礎転写を活性化する、第一の内皮
細胞特異的に活性化しうるプロモーターまたはエンハン
サー配列 ‐エフェクター遺伝子として活性化合物をコードするト
ランスジーン ‐ｃＤＮＡが構造遺伝子（ｂ）の３′末端に間接的また
は直接に５′末端で結合された、核保持シグナル（ＮＲ
Ｓ） ‐好ましくは、核保持シグナルの転写産物は核輸出因子
についての結合構造を有している ‐核輸出因子の基礎転写を活性化する、別な非特異的、
細胞特異的、ウイルス特異的、代謝的および／または細
胞周期特異的に活性化しうるプロモーターまたはエンハ
ンサー配列 ‐核保持シグナルの転写産物と結合して、それにより細
胞核からトランスジーンの転写産物の輸送を媒介する、
核輸出因子（ＮＥＦ）をコードする核酸。
【００６２】好ましくは、核保持シグナルをコードする
遺伝子は、ＨＩＶ‐１またはＨＩＶ ‐２のＲｅｖ応答要素（ＲＲＥ）、レトロウイルスのＲ
ＲＥ相当保持シグナル、またはＨＢＶのＲＲＥ相当保持
シグナルからなる群より選択される。
【００６３】核輸出因子は、好ましくは、ウイルスＨＩ
Ｖ‐１、ＨＩＶ‐２、maedi-visnaウイルス、ヤギ関節
炎脳炎ウイルス、ウマ感染性貧血ウイルス、ネコ免疫不
全ウイルスの、レトロウイルスの、ＨＴＬＶのＲｅｖ遺
伝子、またはｈｎＲＮＰ‐Ａ１タンパク質の遺伝子、ま
たは転写因子ＴＦIII-Ａの遺伝子からなる群より選択さ
れる遺伝子である。
【００６４】７．４．）アクチベーター応答プロモータ
ー単位 アクチベーター応答プロモーター単位は特許出願ＤＥ１
９６１７８５１．７で既に詳細に記載されており、本特
許出願に引用される。
【００６５】アクチベーター応答プロモーター単位は下
記成分からなる： ‐例えば、細胞周期特異的、細胞増殖依存的、代謝的、
内皮細胞特異的またはウイルス特異的に、あるいは細胞
周期特異的と代謝的、内皮細胞特異的またはウイルス特
異的との双方（いわゆるキメラプロモーター）で活性化
しうる、１以上の同一または異なるプロモーターまたは
エンハンサー配列 ‐各場合に、プロモーターまたはエンハンサー配列の下
流に位置して、それらの基礎転写でこれらにより活性化
される、１以上の同一または異なるアクチベータ−サブ
ユニット ‐１以上のアクチベータ−サブユニットの発現産物によ
り活性化されるアクチベータ−応答プロモーター。
【００６６】好ましい態様において、本発明によるアク
チベータ−応答プロモーター単位にはＤＮＡ結合ドメイ
ン、タンパク質‐タンパク質相互作用ドメインおよびト
ランス活性化ドメインからのキメラ転写因子に関する結
合配列がある。本出願に記載されたすべての転写因子結
合部位は、単独（モノマー）でも、またはいくつかのコ
ピー（例えば、１０以内のコピーのマルチマー）で存在
してもよい。
【００６７】２つのアクチベータ−サブユニットにより
活性化されるアクチベータ−応答プロモーター単位の例
は、ＳＶ４０プロモーターと組み合わされたＬｅｘＡオ
ペレーターである。
【００６８】‐第一のアクチベータ−サブユニットはア
ミノ酸１‐８１または１‐２０２をコードするＬｅｘＡ
‐ＤＮＡ結合タンパク質に関するｃＤＮＡを含んでい
て、その３′末端はＧａｌ８０タンパク質（アミノ酸１
‐４３５）に関するｃＤＮＡの５′末端に結合されてい
る。
【００６９】‐第二のアクチベータ−サブユニットはア
ミノ酸８５１‐８８１をコードするＧａｌ４タンパク質
のＧａｌ８０結合ドメインのｃＤＮＡを含んでいて、そ
の３′末端はアミノ酸１２６‐１３２をコードするＳＶ
４０ラージＴ抗原のｃＤＮＡの５′末端に結合され、更
にその３′末端はアミノ酸４０６‐４８８をコードする
ＨＳＶ‐１のＶＰ１６のトランス活性化ドメインに関す
るｃＤＮＡの５′末端に結合されている。
【００７０】２つのアクチベータ−サブユニットにより
活性化されるアクチベータ−応答プロモーターの別な例
は、ＳＶ４０プロモーターと組み合わされたＧａｌ４タ
ンパク質の結合配列である。 ‐第一の活性化単位はＧａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合
ドメイン（アミノ酸１‐１４７）に関するｃＤＮＡを含
んでいて、その３′末端はＧａｌ８０タンパク質（アミ
ノ酸１‐４３５）に関するｃＤＮＡの５′末端に結合さ
れている。
【００７１】‐第二の活性化サブユニットはＧａｌ４の
Ｇａｌ８０結合ドメイン（アミノ酸８５１‐８８１）に
関するｃＤＮＡを含んでいて、その３′末端はＳＶ４０
の核局在化シグナル（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２
６‐１３２）のｃＤＮＡの５′末端に結合され、更にそ
の３′末端はアミノ酸４０６‐４８８をコードするＨＳ
Ｖ‐１のＶＰ１６のトランス活性化ドメインに関するｃ
ＤＮＡの５′末端に結合されている。
【００７２】Ｇａｌ４タンパク質の結合配列およびＳＶ
４０プロモーターからなる、アクチベータ−応答プロモ
ーターを活性化する、２つのアクチベータ−サブユニッ
トの別な例は、以下である： ‐第一の活性化単位は、ＣＤ４ Ｔ細胞抗原の細胞質ド
メイン（アミノ酸３９７‐４３５）に関するｃＤＮＡを
含んでいて、その５′末端はＨＳＶ‐１のＶＰ１６のト
ランス活性化ドメイン（アミノ酸４０６‐４８８）に関
するｃＤＮＡの３′末端に結合され、更にその５′末端
はＳＶ４０の核局在化シグナル（ＳＶ４０ラージＴ；ア
ミノ酸１６‐１３２）のｃＤＮＡの３′末端に結合され
ている。
【００７３】‐第二の活性化単位はＳＶ４０の核局在化
シグナル（ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸１２６‐１３
２）のｃＤＮＡ、Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメ
イン（アミノ酸１‐１４７）に関するｃＤＮＡを含んで
いて、その３′末端はｐ５６ｌｃｋタンパク質のＣＤ４
結合配列（アミノ酸１‐７１）に関するｃＤＮＡの５′
末端に結合されている。
【００７４】８）エフェクター遺伝子の選択 本発明の意味内において、本発明によるヌクレオチド配
列は、障害の予防および／または治療用の薬理活性化合
物をコードする、少くとも１つのエフェクター遺伝子
（成分ｅ）を含んでいる。この活性化合物は、サイトカ
イン、増殖因子、抗体または抗体断片、サイトカインま
たは増殖因子のレセプター、抗増殖、アポトーシスまた
は静細胞作用を有するタンパク質、血管形成インヒビタ
ー、凝固インヒビター、フィブリン溶解活性を有する物
質、血漿タンパク質、補体活性化タンパク質、ペプチド
ホルモン、ウイルスコートタンパク質、細菌抗原および
寄生虫抗原、血液循環およびリボザイムで作用するタン
パク質からなる群より選択される。
【００７５】好ましくは、トランスジーンは、細胞周期
制御タンパク質、特にサイクリンＡ、サイクリンＢ、サ
イクリンＤ１、サイクリンＥ、Ｅ２Ｆ１‐５、ｃｄｃ
２、ｃｄｃ２５Ｃ、ＤＰ１、ウイルスタンパク質、サイ
トカイン、増殖因子またはそれらのレセプターからなる
群より選択されるタンパク質をコードするｍＲＮＡを不
活化するリボザイムについてコードしている構造遺伝子
である。別な態様において、エフェクター遺伝子はファ
ルマコンの前駆体をファルマコンに開裂する酵素につい
てコードすることができる。
【００７６】別な態様において、エフェクター遺伝子は
リガンド‐エフェクター融合タンパク質についてコード
でき、その場合にリガンドは抗体、抗体断片、サイトカ
イン、増殖因子、接着分子またはペプチドホルモンであ
り、エフェクターは上記のような薬理学上活性な化合物
または酵素である。例えば、構造遺伝子はリガンド‐酵
素融合タンパク質についてコードでき、その酵素はファ
ルマコンの前駆体をファルマコンに開裂して、リガンド
は細胞表面、好ましくは内皮細胞または腫瘍細胞と結合
する。
【００７７】本発明の意味内において、内皮細胞特異的
プロモーターと場合により組み合わされるエフェクター
遺伝子および別なプロモーター要素の選択は、具体的障
害の予防および／または治療の様式に依存している。
【００７８】例えば、プロモーター配列およびエフェク
ター遺伝子の下記組合せが下記障害の場合に選択される
（詳細な記載は特許出願ＥＰ９７１０１５０７．８；Ｅ
Ｐ９７１０２５４７．３；ＤＥ１９７１０６４３．９；
ＤＥ１９７７０４３０１．１；ＤＥ１９６１７８５１．
７；ＤＥ１９６３９１０３．２；ＤＥ１９６５１４４
３．６；ＥＰ９５９３１２０４．２；ＥＰ９５９３０５
２４．４；ＥＰ９５９３１２０５．９；ＥＰ９５９３１
９３３．６；およびＤＥ１９７０１１４１．１で既にな
されており、これらが本出願に引用される）。
【００７９】８．１．）腫瘍の治療 ８．１．１．）追加プロモーター ‐非特異的および／または ‐細胞周期特異的および／または ‐代謝的に活性化しうる
【００８０】８．１．２．）細胞増殖のインヒビター、
例えば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ＝ｐ１１０）または
関連ｐ１０７およびｐ１３０タンパク質 ‐網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ／ｐ１１０）または
関連ｐ１０７およびｐ１３０タンパク質はリン酸化によ
り不活化される。好ましくは、用いられるこれら細胞周
期インヒビターの遺伝子は発現されるタンパク質の不活
性化部位に変異を有したものである。但し変異によって
それらの機能が損なわれることはない。これら変異の例
はｐ１１０について記載されている。ｐ１０７タンパク
質またはｐ１３０タンパク質についてのＤＮＡ配列も同
様に変異される。
【００８１】‐ｐ５３タンパク質 ‐タンパク質ｐ５３は、例えばＭＤＭ２のような特定タ
ンパク質と結合するか、または脱リン酸化Ｃ末端セリン
でｐ５３のオリゴマー化により、細胞中で不活化され
る。好ましくは、セリン３９２によりＣ末端で切り取ら
れたｐ５３タンパク質のＤＮＡ配列が用いられる。
【００８２】‐ｐ２１（ＷＡＦ‐１） ‐ｐ１６タンパク質 ‐他のｃｄｋインヒビター ‐ＧＡＤＤ４５タンパク質 ‐ｂａｋタンパク質
【００８３】８．１．３．）凝固誘導因子および血管形
成インヒビター、例えば以下に関するエフェクター遺伝
子： ‐プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター‐１
（ＰＡＩ‐１） ‐ＰＡＩ‐２ ‐ＰＡＩ‐３ ‐アンギオスタチン ‐インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβまたはＩＦＮ
γ） ‐血小板因子４ ‐ＴＩＭＰ‐１ ‐ＴＩＭＰ‐２ ‐ＴＩＭＰ‐３ ‐白血病阻止因子（ＬＩＦ） ‐組織因子（ＴＦ）および凝固活性を有するその断片 ‐特許出願Ｄ１９７０１１４１．１（本出願に引用され
る）に相当する因子Ｘまたは因子Ｘの変異体
【００８４】８．１．４．）静細胞および細胞毒性タン
パク質、例えば以下に関するエフェクター遺伝子： ‐パーフォリン ‐グランザイム ‐ＩＬ‐２ ‐ＩＬ‐４ ‐ＩＬ‐１２ ‐インターフェロン、例えばＩＦＮα、ＩＦＮβまたは
ＩＦＮγ ‐ＴＮＦ、例えばＴＮＦαまたはＴＮＦβ ‐オンコスタチンＭ ‐スフィンゴミエリナーゼ ‐マガイニンおよびマガイニン誘導体
【００８５】８．１．５．）静細胞または細胞毒性抗体
に関する、および抗原結合抗体断片と静細胞、細胞毒性
または炎症タンパク質または酵素との融合タンパク質に
関するエフェクター遺伝子： ‐静細胞または細胞毒性抗体には、例えばBurrows et a
l.(Pharmac.Ther.64,155 (1994))、Hughes et al.(Canc
er Res.49,6214 (1989))およびMaruyama et al.(PNAS U
SA,87,5744 (1990))に記載されたような内皮細胞の膜構
造に対するものがある。特に、これらにはＶＥＧＦレセ
プターに対する抗体を含む。 ‐加えて、これらには腫瘍細胞の膜構造に対する静細胞
または細胞毒性抗体を含む。このタイプの抗体は、例え
ばSedlacek et al.,Contrib.to Oncol.32 KargerVerla
g,Munich (1988) およびContrib.to Oncol.43 Karger V
erlag,Munich (1992) で包括的に記載されている。別な
例は、シアリル Lewisに対する；Ｔ細胞により認識され
る腫瘍上のペプチドに対する；癌遺伝子により発現され
るタンパク質に対する；ＧＤ３、ＧＤ２、ＧＭ２、９‐
Ｏ‐アセチルＧＤ３、フコシルＧＭ１のようなガングリ
オシドに対する；血液型抗原およびそれらの前駆体に対
する；多形性上皮ムチン上の抗原に対する；熱ショック
タンパク質上の抗原に対する抗体である。
【００８６】‐加えて、これらには白血病細胞の膜構造
に対する抗体を含む。このタイプの多数のモノクローナ
ル抗体が診断および治療操作について既に記載されてい
る（Kristensen,Danish Medical Bulletin,41,52 (199
4) ；Schranz,Therapia Hungarica 38,3 (1990)；Drexl
er et al.,Leuk.Res.10,279 (1986) ；Naeim,Dis.Marke
rs,7,1 (1989)；Stickney et al.,Curr.Opin.Oncol.4,8
47 (1992)；Drexleret al.,Blut.57,327 (1988) ；Free
dman et al.,Cancer Invest.9,69 (1991) ）。白血病の
タイプに応じて、適切なリガンドは例えば下記膜抗原に
対するモノクローナル抗体またはそれらの抗原結合抗体
断片である：
【００８７】 表２：細胞 膜抗原 ＡＭＬ ＣＤ１３ ＣＤ１５ ＣＤ３３ ＣＡＭＡＬ シアロシル‐Ｌｅ Ｂ‐ＣＬＬ ＣＤ５ ＣＤ１ｃ ＣＤ２３ 膜免疫グロブリンのイディオタイプおよびイソタイプ Ｔ‐ＣＬＬ ＣＤ３３ Ｍ３８ ＩＬ‐２レセプター Ｔ‐細胞レセプター ＡＬＬ ＣＡＬＬＡ ＣＤ１９ 非ホジキンリンパ腫
【００８８】‐マウス抗体のヒト化、Ｆａｂおよび組換
えＦｖ断片に関する遺伝子の作製および最適化は、当業
者に知られる技術に従い行われる（Winter et al.,Natu
re,349,293 (1991) ；Hoogenbooms et al.,Rev.Tr.Tran
sfus.Hemobiol.36,19 (1993)；Girol.Mol.Immunol.28,1
379 (1991)またはHuston et al.,Intern.Rev.Immunol.1
0,195 (1993)）。組換えＦｖ断片と静細胞、細胞毒性ま
たは炎症タンパク質または酵素の遺伝子との融合は、当
業者に知られる先行技術に従い同様に行われる。
【００８９】８．１．６．）別な内皮細胞または腫瘍細
胞結合リガンドと静細胞および細胞毒性タンパク質また
は酵素との融合タンパク質に関するエフェクター遺伝子 リガンドには、例えば内皮細胞の膜構造または膜レセプ
ターと結合するすべての物質がある。例えば、これらに
は以下がある： ‐抗体または抗体断片 ‐例えばＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦのよう
な内皮細胞により発現されるレセプターと結合する、例
えばＩＬ‐１または増殖因子あるいはそれらの断片また
はそれらの部分配列のようなサイトカイン ‐加えて、これらには活性化および／または増殖内皮細
胞と結合する接着分子を含む。これらには、例えばＳＬ
ｅｘ、ＬＦＡ‐１、ＭＡＣ‐１、ＬＥＣＡＭ‐１、ＶＬ
Ａ‐４またはビトロネクチンがある。
【００９０】‐これらには、更に、腫瘍または白血病細
胞の膜構造または膜レセプターと結合する物質を含む。
例えば、これらには白血病細胞または腫瘍細胞により発
現されるレセプターと結合する、増殖因子、その断片ま
たはそれらの部分配列がある。
【００９１】このタイプの増殖因子は既に記載されてい
る（Cross et al.,Cell,64,271 (1991) ；Aulitzky et
al.,Drugs,48,667 (1994) ；Moore,Clin.Cancer Res.1,
3 (1995)；Van Kooten et al.,Leuk.Lymph.12,27 (199
3) ）。 ‐標的細胞と結合するこれらリガンドの遺伝子と、静細
胞、細胞毒性または炎症タンパク質または酵素との融合
は、当業者に知られる方法を用いて先行技術に従い行わ
れる。
【００９２】８．１．７．）炎症インデューサー、例え
ば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐ＩＬ‐１ ‐ＩＬ‐２ ‐ＲＡＮＴＥＳ（ＭＣＰ‐２） ‐単球走化性および活性化因子（ＭＣＡＦ） ‐ＩＬ‐８ ‐マクロファージ炎症タンパク質‐１（ＭＩＰ‐１α、
‐β） ‐好中球活性化タンパク質‐２（ＮＡＰ‐２） ‐ＩＬ‐３ ‐ＩＬ‐５ ‐ヒト白血病阻止因子（ＬＩＦ） ‐ＩＬ‐７ ‐ＩＬ‐５ ‐エオタキシン ‐ＩＬ‐１３ ‐ＧＭ‐ＣＳＦ ‐Ｇ‐ＣＳＦ ‐Ｍ‐ＣＳＦ ‐機能的にヒト補体因子Ｃ３ｂに相当する、即ち補体因
子Ｂに結合して、因子Ｄによる開裂後、Ｃ３コンバータ
ーゼを産生する、コブラ毒因子（ＣＶＦ）またはＣＶＦ
の部分配列 ‐ヒト補体因子Ｃ３またはそのサブ配列Ｃ３ｂ ‐機能的および構造的にＣＶＦと類似している、ヒト補
体因子Ｃ３の開裂産物 ‐補体を活性化するかまたは炎症を起こす細菌タンパク
質、例えばSalmonellatyphimuriumのポーリン、Staphyl
ococcus aureus の“凝集”因子、特にグラム陰性菌の
モジュリン、Legionella、Haemophilus influenza Ｂ型
またはKlebsiellaの“主要外膜タンパク質”、streptoc
occus Ｇ型のＭ分子
【００９３】８．１．８．）静細胞剤の前駆体の活性化
のための酵素、例えば不活性前駆物質（プロドラッグ）
を活性静細胞剤（薬物）に開裂する酵素に関するエフェ
クター遺伝子 このタイプの物質および関連プロドラッグおよび各場合
の薬物は、Deonarainet al.(Br.J.Cancer,70,786 (199
4)) ；Mullen,Pharmac.Ther.63,199 (1994) およびHarr
is et al.(Gene Ther.1,170 (1994)) で既に包括的に記
載されている。例えば、下記酵素の１つのＤＮＡ配列が
用いられる： ‐単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ ‐水痘ウイルスチミジンキナーゼ ‐細菌ニトロレダクターゼ ‐細菌β‐グルクロニダーゼ ‐Secale cerealeの植物β‐グルクロニダーゼ ‐ヒトβ‐グルクロニダーゼ ‐ヒトカルボキシペプチダーゼ（ＣＢ）、例えばマスト
細胞のＣＢ‐Ａ、膵臓のＣＢ‐Ｂ、または細菌カルボキ
シペプチダーゼ ‐細菌β‐ラクタマーゼ ‐細菌シトシンデアミナーゼ ‐ヒトカタラーゼまたはペルオキシダーゼ ‐ホスファターゼ、特にヒトアルカリホスファターゼ、
ヒト酸性前立腺ホスファターゼおよび５型酸性ホスファ
ターゼ ‐オキシダーゼ、特にヒトリシルオキシダーゼまたはヒ
ト酸性Ｄ‐アミノオキシダーゼ ‐ペルオキシダーゼ、特にヒトグルタチオンペルオキシ
ダーゼ、ヒト好酸球ペルオキシダーゼまたはヒト甲状腺
ペルオキシダーゼ ‐ガラクトシダーゼ
【００９４】８．２．）自己免疫障害および炎症の治療 ８．２．１．）追加プロモーター： ‐非特異的および／または ‐細胞周期特異的および／または ‐代謝的に活性化しうる
【００９５】８．２．２．）アレルギーの治療、例えば
以下に関するエフェクター遺伝子 ‐ＩＦＮβ ‐ＩＦＮγ ‐ＩＬ‐１０ ‐ＩＬ‐４に対する抗体または抗体断片 ‐可溶性ＩＬ‐４レセプター ‐ＩＬ‐１２ ‐ＴＧＦβ
【００９６】８．２．３．）移植臓器の拒絶予防、例え
ば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐ＩＬ‐１０ ‐ＴＧＦβ ‐可溶性ＩＬ‐１レセプター ‐可溶性ＩＬ‐２レセプター ‐ＩＬ‐１レセプター拮抗剤 ‐可溶性ＩＬ‐６レセプター ‐免疫抑制抗体、またはそれらのＶＨおよびＶＬ保有断
片、またはリンカーで結合されたそれらのＶＨおよびＶ
Ｌ断片。免疫抑制抗体は、例えば、Ｔ細胞レセプターま
たはそのＣＤ３複合体に特異的な、ＣＤ４またはＣＤ８
に対する、更にＩＬ‐２レセプター、ＩＬ‐１レセプタ
ーまたはＩＬ‐４レセプターに対する、または接着分子
ＣＤ２、ＬＦＡ‐１、ＣＤ２８またはＣＤ４０に対する
抗体である。
【００９７】８．２．４．）抗体媒介自己免疫障害の治
療、例えば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐ＴＧＦβ ‐ＩＦＮα ‐ＩＦＮβ ‐ＩＦＮγ ‐ＩＬ‐１２ ‐可溶性ＩＬ‐４レセプター ‐可溶性ＩＬ‐６レセプター ‐免疫抑制抗体またはそれらのＶＨおよびＶＬ保有断片
【００９８】８．２．５．）細胞媒介自己免疫障害の治
療、例えば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐ＩＬ‐６ ‐ＩＬ‐９ ‐ＩＬ‐１０ ‐ＩＬ‐１３ ‐ＴＮＦαまたはＴＮＦβ ‐免疫抑制抗体またはそのＶＨおよびＶＬ保有断片
【００９９】８．２．６．）細胞増殖、静細胞または細
胞毒性タンパク質、炎症インデューサーのインヒビター
と、静細胞剤の前駆体の活性化のための酵素に関するエ
フェクター遺伝子 このタイプのタンパク質をコードする遺伝子の例は、
“腫瘍治療用の構造遺伝子”セクションで既に掲載され
ている。
【０１００】そこで既に記載されたのと同様の形で、本
発明の意味内において、抗体、またはこれら抗体のＦａ
ｂまたは組換えＦｖ断片、または標的細胞に特異的な他
のリガンドと、前記サイトカイン、増殖因子、レセプタ
ー、静細胞または細胞毒性タンパク質および酵素との融
合タンパク質についてコードする構造遺伝子が使用でき
る。
【０１０１】８．２．７．）関節炎の治療のための構造
遺伝子 本発明の意味内において、発現されたタンパク質が、例
えば関節で炎症を直接または間接的に抑制する、および
／または関節で細胞外マトリックス（軟骨、結合組織）
の再形成を促進するような、構造遺伝子が選択される。
【０１０２】これらには、例えば以下がある： ‐ＩＬ‐１レセプター拮抗剤（ＩＬ‐１‐ＲＡ） ＩＬ‐１‐ＲＡはＩＬ‐１α、βの結合を阻害する ‐可溶性ＩＬ‐１レセプター 可溶性ＩＬ‐１レセプターはＩＬ‐１と結合して、不活
化させる ‐ＩＬ‐６ ＩＬ‐６はＴＩＭＰおよびスーパーオキシドの分泌を増
加させ、滑膜細胞および軟骨細胞によるＩＬ‐１および
ＴＮＦαの分泌を減少させる ‐可溶性ＴＮＦレセプター 可溶性ＴＮＦレセプターはＴＮＦと結合して、不活化さ
せる ‐ＩＬ‐４ ＩＬ‐４はＩＬ‐１、ＴＮＦαおよびＭＭＰの形成およ
び分泌を阻害する ‐ＩＬ‐１０ ＩＬ‐１０はＩＬ‐１、ＴＮＦαおよびＭＭＰの形成お
よび分泌を阻害し、ＴＩＭＰの分泌を増加させる ‐インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ‐１） ＩＧＦ‐１は細胞外マトリックスの合成を刺激する ‐ＴＧＦβ、特にＴＧＦβ１およびＴＧＦβ２ ＴＧＦβは細胞外マトリックスの合成を刺激する ‐スーパーオキシドジスムターゼ ‐ＴＩＭＰ、特にＴＩＭＰ‐１、ＴＩＭＰ‐２またはＴ
ＩＭＰ‐３
【０１０３】８．３．）血液細胞の欠陥形成の治療 ８．３．１．）追加プロモーター ‐細胞非特異的および／または ‐細胞周期特異的および／または ‐代謝的に活性化しうる
【０１０４】８．３．２．）貧血の治療、例えば以下に
関するエフェクター遺伝子 ‐エリトロポエチン
【０１０５】８．３．３．）白血球減少症の治療、例え
ば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐Ｇ‐ＣＳＦ ‐ＧＭ‐ＣＳＦ ‐Ｍ‐ＣＳＦ
【０１０６】８．３．４．）血小板減少症の治療、例え
ば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐ＩＬ‐３ ‐白血病阻止因子（ＬＩＦ） ‐ＩＬ‐１１ ‐トロンボポエチン
【０１０７】８．４．）神経系に対する損傷の治療 ８．４．１．）追加プロモーター ‐非特異的および／または ‐細胞周期特異的および／または ‐代謝的に活性化しうる
【０１０８】８．４．２．）神経増殖因子、例えば以下
に関するエフェクター遺伝子 ‐ＦＧＦ ‐神経増殖因子（ＮＧＦ） ‐脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ） ‐ノイロトロフィン‐３（ＮＴ‐３） ‐ノイロトロフィン‐４（ＮＴ‐４） ‐毛様体神経栄養性因子（ＣＮＴＦ）
【０１０９】８．４．３．）酵素、例えば以下に関する
エフェクター遺伝子 ‐チロシンヒドロキシラーゼ ‐ドーパデカルボキシラーゼ
【０１１０】８．４．４．）ＴＮＦαの神経毒性作用を
阻害または中和するサイトカインおよびそれらのインヒ
ビター、例えば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐ＴＧＦβ ‐可溶性ＴＮＦレセプター ＴＮＦレセプターはＴＮＦαを中和する ‐ＩＬ‐１０ ＩＬ‐１０はＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ‐２およびＩＬ
‐４の形成を阻害する ‐可溶性ＩＬ‐１レセプター ‐ＩＬ‐１レセプターＩ ‐ＩＬ‐１レセプターII 可溶性ＩＬ‐１レセプターはＩＬ‐１の活性を中和する ‐ＩＬ‐１レセプター拮抗剤 ‐可溶性ＩＬ‐６レセプター
【０１１１】８．５．）血液凝固および血液循環系の障
害の治療 ８．５．１．）追加プロモーター ‐細胞周期特異的および／または ‐細胞非特異的および／または ‐代謝的に活性化しうる
【０１１２】８．５．２．）凝固の阻害またはフィブリ
ン溶解の促進、例えば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ） ‐ウロキナーゼタイププラスミノーゲンアクチベーター
（ｕＰＡ） ‐ｔＰＡおよびｕＰＡのハイブリッド ‐タンパク質Ｃ ‐ヒルジン ‐セリンプロテイナーゼインヒビター（セルピン）、例
えばＣ‐１Ｓインヒビター、α１‐抗トリプシンまたは
抗トロンビンIII ‐組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）
【０１１３】８．５．３．）凝固の促進、例えば以下に
関するエフェクター遺伝子 ‐Ｆ VIII ‐Ｆ IX ‐フォンビルブラント因子 ‐Ｆ XIII ‐ＰＡＩ‐１ ‐ＰＡＩ‐２ ‐組織因子およびその断片
【０１１４】８．５．４．）血管形成因子、例えば以下
に関するエフェクター遺伝子 ‐ＶＥＧＦ ‐ＦＧＦ
【０１１５】８．５．５．）血圧を低下させる、例えば
以下に関するエフェクター遺伝子 ‐カリクレイン ‐内皮細胞“酸化窒素シンターゼ”
【０１１６】８．５．６．）内皮層への損傷後における
平滑筋細胞の増殖の阻害のための、例えば以下に関する
エフェクター遺伝子 ‐抗増殖、静細胞または細胞毒性タンパク質 ‐（腫瘍下における）既に上記されたような静細胞剤へ
の静細胞剤の前駆体の開裂のための酵素 ‐これら活性化合物の１つと、リガンド、例えば筋肉細
胞に特異的な抗体または抗体断片との融合タンパク質
【０１１７】８．５．７．）別な血漿タンパク質、例え
ば以下に関するエフェクター遺伝子 ‐アルブミン ‐Ｃ１インアクチベーター ‐血清コリンエステラーゼ ‐トランスフェリン ‐１‐抗トリプシン
【０１１８】８．６．）予防接種 ８．６．１．）追加プロモーター ‐非特異的および／または ‐細胞周期特異的
【０１１９】８．６．２．）感染症の予防に関するエフ
ェクター遺伝子 常法で有効なワクチンを作る可能性は限られている。
【０１２０】したがって、ＤＮＡワクチンの技術が開発
された。しかしながら、これらのＤＮＡワクチンは効力
の問題を生じる（Fynan et al.,Int.J.Immunopharm.17,
79 (1995) ；Donnelly et al.,Immunol.2,20 (1994)
）。
【０１２１】本発明によると、ＤＮＡワクチンのもっと
大きな効力が予想される。
【０１２２】選択される活性物質は、免疫反応を誘発さ
せることにより、即ち抗体結合および／または細胞毒性
Ｔリンパ球により、原因体の中和および／または破壊を
起こす、感染体により形成されるタンパク質のＤＮＡで
ある。このタイプのいわゆる中和抗原はワクチン抗原と
して既に用いられている（Ellis,Adv.Exp.Med.Biol.32
7,263 (1992) 参照）。
【０１２３】下記原因体の中和抗原をコードするＤＮＡ
が、本発明の意味内では好ましい： ‐インフルエンザＡウイルス ‐ＨＩＶ ‐狂犬病ウイルス ‐ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス） ‐ＲＳＶ（呼吸器多核体ウイルス） ‐パラインフルエンザウイルス ‐ロタウイルス ‐ＶＺＶ（水痘ウイルス） ‐ＣＭＶ（サイトメガロウイルス） ‐麻疹ウイルス ‐ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス） ‐ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス） ‐ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス） ‐ＨＤＶ（Ｄ型肝炎ウイルス） ‐ＨＥＶ（Ｅ型肝炎ウイルス） ‐ＨＡＶ（Ａ型肝炎ウイルス） ‐ビブリオコレラ抗原 ‐Borrelia burgdorferi ‐Helicobacter pylori ‐マラリア抗原 ‐しかしながら、本発明に意味内におけるこのタイプの
活性物質には抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合
断片のＤＮＡも含み、その抗原結合構造（“相補的決定
領域”）は感染体の中和抗原のタンパク質または炭水化
物構造のコピーを産生する。
【０１２４】このタイプの抗イディオタイプ抗体は、細
菌感染体で炭水化物抗原と特に置き換わることができ
る。
【０１２５】このタイプの抗イディオタイプ抗体および
それらの開裂産物は、Hawkins et al.(J.Immunother.1
4,273 (1993))およびWesterink and Apicella (Springe
r Seminars in Immunopathol.15,227 (1993))で包括的
に記載されている。
【０１２６】８．６．３．）“腫瘍ワクチン”に関する
エフェクター遺伝子 これらには腫瘍細胞上の抗原を含む。このタイプの抗原
は、例えばSedlacek et al.,Contrib.to Oncol.32 Karg
er Verlag,Munich (1988) およびContrib.to Oncol.43
Karger Verlag,Munich (1992) で包括的に記載されてい
る。
【０１２７】別な例は、下記抗原または下記抗イディオ
タイプ抗体に関する遺伝子である： ‐シアリルルイス ‐Ｔ細胞により認識される、腫瘍上のペプチド ‐癌遺伝子により発現されるタンパク質 ‐血液型抗原およびそれらの前駆体 ‐多形性上皮ムチン上の抗原 ‐熱ショックタンパク質上の抗原
【０１２８】８．７．）慢性感染症の治療 ８．７．１．）追加プロモーター ‐ウイルス特異的および／または ‐細胞周期特異的および／または ‐非特異的
【０１２９】８．７．２．）例えば以下に関するエフェ
クター遺伝子 ‐静細胞、アポトーシスまたは細胞毒性作用を有するタ
ンパク質 ‐抗ウイルスまたは細胞毒性物質の前駆体を活性物質に
開裂させる酵素
【０１３０】８．７．３．）抗ウイルスタンパク質に関
するエフェクター遺伝子 ‐抗ウイルス活性を有するサイトカインおよび増殖因
子。これらには、例えばＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮ
γ、ＴＮＦβ、ＴＮＦα、ＩＬ‐１またはＴＧＦβがあ
る。
【０１３１】‐各ウイルスまたはそのＶＨおよびＶＬ保
有断片を不活化するか、あるいは既に記載されたように
リンカーで結合されたそのＶＨおよびＶＬ断片を産生す
る、特異的な抗体 ウイルス抗原に対する抗体は、例えば： 抗‐ＨＢＶ 抗‐ＨＣＶ 抗‐ＨＳＶ 抗‐ＨＰＶ 抗‐ＨＩＶ 抗‐ＥＢＶ 抗‐ＨＴＬＶ 抗‐Coxsackie ウイルス 抗‐Hantaan ウイルスである。
【０１３２】‐Ｒｅｖ結合タンパク質。これらのタンパ
ク質はＲｅｖ ＲＮＡと結合して、レトロウイルス遺伝
子発現のＲｅｖ依存性転写後段階を阻害する。Ｒｅｖ結
合タンパク質の例は： ＲＢＰ９‐２７ ＲＢＰ１‐８Ｕ ＲＢＰ１‐８Ｄ ＲＢＰ１‐８の偽遺伝子である。
【０１３３】‐細胞周期コントロールタンパク質に関す
る遺伝子のｍＲＮＡまたはウイルスのｍＲＮＡを切断す
るリボザイム。ＨＩＶに触媒性のリボザイムは、例えば
Christoffersen et al.,J.Med.Chem.38,2033 (1995) で
既に包括的に記載されている。
【０１３４】８．７．４．）抗菌タンパク質に関するエ
フェクター遺伝子 抗菌タンパク質には、例えば細菌毒素を中和するかまた
は細菌をオプソナイズする抗体を含む。例えばこれらに
は以下に対する抗体がある： 髄膜炎菌ＣまたはＢ coli Borrelia Pseudomonas Helicobacter pylori Staphylococcus aureus
【０１３５】９）同一または異なる構造遺伝子の組合せ 本発明は、２つの同一または２つの異なる構造遺伝子の
ＤＮＡ配列の組合せが存在している、核酸構築物にも更
に関する。双方のＤＮＡ配列の発現のために、別なプロ
モーター配列または好ましくは“内部リボソームエント
リー部位”（ＩＲＥＳ）のｃＤＮＡが、２つの構造遺伝
子間のレギュレーター要素として結合される。
【０１３６】ＩＲＥＳは、ＩＲＥＳで互いに結合された
２つのＤＮＡ配列の発現を可能とさせる。
【０１３７】このタイプのＩＲＥＳは、例えばMontford
and Smith (TIG,11,179 (1995))；Kaufman et al.,Nuc
l.Acids Res.19,4485 (1991)；Morgan et al.,Nucl.Aci
ds Res.20,1293 (1992) ；Dirks et al.,Gene,128,247
(1993)；Pelletier and Sonenberg,Nature,334,320 (19
88) およびSugitomo et al.,BioTechn.12,694 (1994)に
記載されている。
【０１３８】このように、例えば、ポリオウイルスのＩ
ＲＥＳ配列のｃＤＮＡ（５′ＵＴＲの≦１４０ ≧６３
０位）が使用できる。
【０１３９】好ましくは、本発明の意味内において、追
加作用を有する構造遺伝子は別なプロモーター配列また
はＩＲＥＳ配列で結合される。
【０１４０】本発明の意味内において、例えば以下に関
する構造遺伝子の組合せが好ましい： ９．１．）腫瘍の治療 ‐同一または異なる、静細胞、アポトーシス、細胞毒性
または炎症タンパク質 ‐静細胞剤の前駆体の開裂のための同一または異なる酵
素
【０１４１】９．２．）自己免疫疾患の治療 ‐細胞性および／または体液性免疫反応の阻害について
相乗作用を有する、異なるサイトカインまたはレセプタ
ー ‐異なるまたは同一のＴＩＭＰ
【０１４２】９．３．）血液細胞の欠陥形成の治療 ‐異なる、階層的逐次サイトカイン、例えばＩＬ‐１、
ＩＬ‐３、ＩＬ‐６またはＧＭ‐ＣＳＦおよびエリトロ
ポエチン、Ｇ‐ＣＳＦまたはトロンボポエチン
【０１４３】９．４．）神経細胞損傷の治療 ‐神経増殖因子およびサイトカインまたはサイトカイン
のインヒビター
【０１４４】９．５．）血液凝固および血液循環系の障
害の治療 ‐抗トロンビンおよびフィブリン溶解（例えば、ｔＰＡ
またはｕＰＡ） ‐静細胞、アポトーシスまたは細胞毒性タンパク質およ
び抗トロンビンまたはフィブリン溶解 ‐相乗作用を有するいくつかの異なる血液凝固因子、例
えばＦ VIII およびｖＷＦまたはＦ VIII およびＦ IX
【０１４５】９．６．）予防接種 ‐抗原および免疫刺激サイトカイン、例えばＩＬ‐１
α、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐２、ＧＭ‐ＣＳＦ、ＩＬ‐３ま
たはＩＬ‐４レセプター ‐感染体または異なる感染体の異なる抗原 ‐腫瘍タイプまたは異なる腫瘍タイプの異なる抗原
【０１４６】９．７．）ウイルス感染症の治療 ‐抗ウイルスタンパク質および静細胞、アポトーシスま
たは細胞毒性タンパク質 ‐ウイルスまたはいくつかのウイルスの異なる表面抗原
に対する抗体
【０１４７】９．８．）細菌感染症の治療 ‐微生物の異なる表面抗原および／または毒素に対する
抗体
【０１４８】１０）シグナル配列および貫膜ドメインの
挿入 技術の詳細な説明は特許出願ＤＥ１９６３９１０３．２
およびＤＥ１９６５１４４３．６で既になされており、
本出願に引用される。
【０１４９】１０．１．）翻訳を高めるためには、ヌク
レオチド配列ＧＣＣＡＣＣまたはＧＣＣＧＣＣがプロモ
ーター配列の３′末端と、シグナルまたはトランスメン
ブレン配列の開示シグナル（ＡＴＧ）の５′末端に直接
挿入できる（Kozak,J.Cell Biol.108,299 (1989)）。
【０１５０】１０．２．）構造遺伝子の発現産物の分泌
の促進のためには、構造遺伝子のＤＮＡ配列に場合によ
り含まれる相同シグナル配列は細胞内分泌を改善する異
種シグナル配列で置き換えることができる。
【０１５１】こうして、例えば、免疫グロブリンのシグ
ナル配列（ＤＮＡ位置≦６３ ≧１０７；Riechmann et
al.,Nature,332,323 (1988)）またはＣＥＡのシグナル
配列（ＤＮＡ位置≦３３ ≧１３４；Schrewe et al.,M
ol.Cell Biol.10,2738 (1990) ；Berling et al.,Cance
r Res.50,6534 (1990)）またはヒト呼吸シンシチアルウ
イルス糖タンパク質のシグナル配列（アミノ酸≦３８
≧５０または４８〜６５のｃＤＮＡ；Lichtenstein et
al.,J.Gen.Virol.77,109 (1996) ）が挿入できる。
【０１５２】１０．３．）活性化合物を形成する形質導
入細胞の細胞膜に活性化合物をつなぎ留めるためには、
貫膜ドメインの配列がシグナル配列の代わりにまたはそ
れに加えて導入できる。
【０１５３】こうして、例えば、ヒトマクロファージコ
ロニー形成因子の貫膜配列（ＤＮＡ位置≦１４８５ ≧
１５５４；Cosman et al.,Behring Inst.Mitt.83,15 (1
988)）またはヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）糖タ
ンパク質Ｇのシグナルおよび貫膜領域のＤＮＡ配列（ア
ミノ酸１〜６３またはそれらの部分配列、アミノ酸３８
〜６３；Vijaya et al.,Mol.Cell Biol.8,1709 (1988)
；Lichtenstein et al.,J.Gen.Virol.77,109 (1996)
）またはインフルエンザウイルスノイラミニダーゼの
シグナルおよび貫膜領域のＤＮＡ配列（アミノ酸７〜３
５またはサブ配列アミノ酸７〜２７；Brown et al.,J.V
irol.62,3824 (1988) ）が、プロモーター配列と構造遺
伝子の配列との間に挿入できる。
【０１５４】１０．４．）しかしながら、活性化合物を
形成する形質導入細胞の細胞膜に活性化合物をつなぎ留
めるためには、糖リン脂質アンカーのヌクレオチド配列
も挿入できる。
【０１５５】糖リン脂質アンカーの挿入は構造遺伝子に
関するヌクレオチド配列の３′末端で行い、シグナル配
列の挿入のために追加的に行うことができる。
【０１５６】糖リン脂質アンカーは、例えばＣＥＡ、Ｎ
‐ＣＡＭおよび別な膜タンパク質、例えばＴｈｙ‐１に
ついて記載されている（Ferguson et al.,Ann.Rev.Bioc
hem.57,285 (1988) 参照）。
【０１５７】１０．５．）本発明による細胞膜への活性
化合物のつなぎ止めの別な可能性は、リガンド‐活性化
合物融合タンパク質に関するＤＮＡ配列の使用である。
この融合タンパク質のリガンドの特異性は、選択された
標的細胞の細胞膜上の膜構造に対するものである。
【０１５８】１０．５．１．）細胞の表面と結合するリ
ガンドには、例えば以下の表面上の構造に対する抗体ま
たは抗体断片がある： ‐内皮細胞。特に、これらにはＶＥＧＦレセプターまた
はキニンレセプターに対する抗体がある。
【０１５９】‐または筋肉細胞。例えばアクチンに対す
る抗体、アンギオテンシンIIレセプターに対する抗体、
増殖因子のレセプターに対する、例えばＥＧＦレセプタ
ー、ＰＤＧＦレセプターまたはＦＧＦレセプターに対す
る抗体、またはエンドセリンＡレセプターに対する抗体 ‐リガンドには、腫瘍細胞膜上の腫瘍特異的または腫瘍
関連抗原に対する抗体またはそれらの断片も含む。
【０１６０】マウスモノクローナル抗体は、好ましくは
ヒト化形で用いられる。Ｆａｂおよび組換えＦｖ断片お
よびそれらの融合産物は、既に記載されているように、
当業者に知られる技術を用いて作製される。
【０１６１】１０．５．２．）リガンドには、各選択細
胞上の膜構造または膜レセプターと結合する、例えばサ
イトカインまたは接着分子、増殖因子またはそれらの断
片またはそれらの部分配列、メディエーターまたはペプ
チドホルモンのようなすべての活性化合物を更に含む。
例えば、これらには以下を含む： ‐内皮細胞のリガンド、例えばＩＬ‐１、ＰＤＧＦ、ｂ
ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＧβ（Pusztain et al.,J.Path
ol.169,191 (1993) ）、またはキニンとキニンの誘導体
またはアナログ ‐加えて、これらには接着分子を含む。このタイプの接
着分子、例えばＳＬｅｘ、ＬＦＡ‐１、ＭＡＣ‐１、Ｌ
ｅＣＡＭ‐１、ＶＬＡ‐４またはビトロネクチンとビト
ロネクチンの誘導体またはアナログは、内皮細胞につい
て既に記載されている（Augustin-Voss et al.,J.Cell
Biol.119,483 (1992) ；Pauli et al.,Cancer Metast.R
ev.9,175 (1990) ；Honn et al.,Cancer Metast.Rev.1
1,353 (1992) ；Varner et al.,Cell Adh.Commun.3,367
(1995)）。
【０１６２】１１）核酸構築物の作製および使用 核酸構築物は好ましくはＤＮＡからなる。核酸構築物と
いう用語は、標的細胞で転写されうる核酸の人工構造を
意味するとして理解されている。それらは好ましくはベ
クター、プラスミドベクターに挿入され、非ウイルスキ
ャリアと複合化されたプラスミド（Fritz et al.,Hum.G
ene Ther.7: 1395 (1996) ；Solodin etal.,Biochem.3
4: 13537 (1995) ；Abdallak et al.,Hum Gene Ther.7:
1947 (1996)；Ledley,Hum.Gene Ther.6: 1129 (1995)
；Schofield et al.,Br.Med.Bull.51: 56 (1995)；Beh
r,Bioconj.Chem.5: 382 (1994) ；Cotten et al.,Curr.
Opin.Biotechnol.4: 705 (1993)；Hodgson et al.,Natu
re Biotechnol.14:339 (1996)）が特に好ましい。ベク
ターは当業者に知られる技術を用いて内皮細胞の前駆細
胞または内皮細胞中に導入される（Cotten et al.,Cur
r.Opin.Biotechnol.4:705 (1993)；Scheffield et al.,
Br.Med.Bull.51: 56(1995)；Ledley,Hum.GeneTher.6: 1
129 (1995) ）。別な態様において、本発明による核酸
構築物はウイルスベクターに挿入され（Weir et al.,Hu
m.Gene Ther.7: 1331 (1996)；Flotte et al.,Gene The
r.2: 357 (1995) ；Efstathion et al.,Br.Med.Bull.5
1: 45 (1995) ；Kremer et al.,Br.Med.Bull.51: 31 (1
995) ；Vile et al.,Br.Med.Bull.51: 12 (1995) ；Ran
drianarison et al.,Biologicals 23: 145 (1995)；Jol
lyCancer Gene Ther.1: 51 (1994) ）、これらの内皮細
胞でトランスフェクトされる。これらの手段で形質導入
された細胞は、外的または内的に、局所的に、体腔、臓
器、血液循環、気道、胃腸管、尿生殖路、創傷腔、筋肉
内または皮下で患者に投与される。
【０１６３】本発明による核酸構築物により、構造遺伝
子は、内皮細胞または内皮細胞の前駆細胞で、細胞特異
的に、場合によりウイルス特異的に、ある代謝条件下で
および／または細胞周期特異的に発現され、および／ま
たは医薬により誘導され、構造遺伝子は、薬理学的に活
性な化合物、またはファルマコンの不活性前駆体を活性
ファルマコンに開裂する酵素についてコードする遺伝子
であることが好ましい。構造遺伝子は、薬理学的に活性
な化合物または酵素がリガンドとの融合タンパク質とし
て発現され、このリガンドが細胞の表面と結合して、例
えば内皮または腫瘍細胞を増殖させるように、選択する
ことができる。
【０１６４】
【実施例】本発明は下記例により更に詳細に説明されて
いるが、これらに限定されるわけではない。 １２）本発明の概念を説明するための例 １２．１．）フィブロネクチンおよび牛脳を使用せずに
培養したＣＤ３４陽性血液細胞由来の内皮細胞 Asahara et al.,Science 275,964: (1997)に記載された
ような単離されたＣＤ３４陽性血液細胞を、 ‐Asahara により開示されたようなバッチａ）では、フ
ィブロネクチンでコートされたプラスチックボトルに牛
脳抽出物（１００μg/ml）を加えて培養するか、 ‐または（バッチｂでは）、フィブロネクチンコーティ
ングせず、牛脳抽出物の添加なしに、但しＶＥＧＦおよ
びｂＦＧＦ（Sigma,各場合に１％v/v ）を加えて、プラ
スチックボトルで本発明に従い培養した。
【０１６５】各場合に、培地（培地１９９）に牛胎児血
清（ＦＣＳ、２０％）を加えて、３７℃および５％ＣＯ
２通気下で行った。６日間後に、紡錘状でキャピラリー
様の構造を形成する付着性増殖細胞の割合を顕微鏡で調
べ、内皮細胞の割合を内皮細胞特異性抗体（抗ＣＤ３
１、抗ｖＷＦ、抗Ｆｌｉｋ１）で標識することによりＦ
ＡＣＳ分析により調べた。これら細胞の数および形態の
差異は、バッチａ）とバッチｂ）との間でみられなかっ
た。双方のバッチの実験シリーズにおいて、内皮細胞の
割合は１〜１０％の間で変動しており、増殖因子ＶＥＧ
ＦおよびｂＦＧＦの添加がフィブロネクチンによる培養
ボトルのコーティングと脳抽出物の添加に置き換わりう
ることを確信させる。
【０１６６】１２．２．）単核血液細胞由来の内皮細胞
の培養 単核細胞をFicoll勾配で遠心により血液１２０ｍｌから
単離し、非接着性単核血液細胞を細胞培養ボトルで１時
間のインキュベートとその後デカンテーションにより分
離した。
【０１６７】これらの細胞をバッチｂ）による培養ボト
ル中に接種し、３７℃および５％ストレンクスＣＯ２通
気下で６日間にわたり培養した。６日間後、内皮細胞の
割合を１２．１．）に記載されたように調べた。それは
異なる実験シリーズで２〜２０％であった。
【０１６８】１２．３．）ＣＤ１４陽性血液細胞からの
内皮細胞の培養 単核細胞をFicoll勾配（Ficoll-Paque,Pharmacia,Uppsa
la）で遠心により健常ドナーからの血液１２０ｍｌから
単離し、非接着性単核血液細胞を細胞培養ボトルで６０
分間のインキュベートとその後デカンテーションにより
分離した。こうして単離された非接着性単核細胞（ＮＭ
Ｃ）は、０．３〜０．０５％のＣＤ３４陽性および５〜
１０％のＣＤ１４陽性細胞（単球および単球様細胞）を
含有している。
【０１６９】１×１０６ＮＭＣを２０％牛胎児血清（Gi
bco から）および１００μｇのＥＣＧＳ（Harbor Biopr
oducts,Norwood,MA ）またはＶＥＧＦ（Pepro Techn.,L
ondon,England ）を含んだ培地１９９（Gibco から）の
ｍｌ当たり１×１０６細胞に調整し、フィブロネクチン
（Harbor Bioproducts,Norwood,MA ）コートプラスチッ
ク容器中で１〜３時間にわたり３７℃でインキュベート
した。このインキュベートの結果として、ＣＤ１４陽性
細胞の含有率は５〜１０％から２５〜３０％に増加し
た。
【０１７０】ＮＭＣを慎重な洗浄により分離し、ＣＤ１
４陽性またはＣＤ１１陽性細胞を製造業者の説明に従い
抗ＣＤ１４または抗ＣＤ１１（ＣＤ１４／ＣＤ１１ Mic
ro Beads,Miltenyi Biotec,Bergisch-Gladbach,German
y）でコートされた磁気ビーズを用いて単離した。
【０１７１】約≧８０％のＣＤ１４陽性細胞を含んだＮ
ＭＺを、湿気雰囲気下、３７℃、５％ＣＯ２で、フィブ
ロネクチンコートプラスチック容器中、ＦＣＳおよびＥ
ＣＧＳまたはＶＥＧＦで補充された上記培地１９９でイ
ンキュベートした。
【０１７２】培養物中の細胞を、６時間、３日間および
５日間後に、モノクローナル抗体の介助で、およびＲＴ
‐ＰＣＲにより調べた。
【０１７３】６時間後に、小さな単核ＣＤ１４陽性細胞
が既に観察され、これは内皮細胞特異的マーカーアセチ
ルＬＤＬレセプター、ＣＤ３４、Ｆｌｋ‐１およびフォ
ンビルブラント因子について陽性であった。３日目に、
これらの細胞は増殖の強いサインを示した。
【０１７４】５日目に、接着性の大きな顆粒卵形細胞お
よび紡錘細胞が観察され、すべて上記の内皮細胞マーカ
ーを有していたが、ＣＤ１４マーカーはもはや有してい
なかった。
【０１７５】これら内皮細胞が密集してくるとすぐに、
それらはＶＥ‐カドヘリンを更に発現した。１〜２週間
後に、培養物中の細胞の＞８０％が内皮細胞であった。
【０１７６】１２．４．）内皮細胞特異的形質転換と、
単核血液細胞由来の内皮細胞の培養 単核細胞をFicoll勾配で遠心により血液１２０ｍｌから
単離し、非接着性単核血液細胞を細胞培養ボトルで１時
間のインキュベートとその後デカンテーションにより分
離した。これらの血液細胞を１×１０７／ｍｌ培地の濃
度に調整し、６０ｍｍ培養皿中に接種し、本発明による
プラスミドおよび Superfect（Quiagen）の複合体と共
に３７℃で１０分間インキュベートした。
【０１７７】複合体の作製は Superfectの製造業者の説
明に従い行った。本発明によるプラスミドは５′から
３′へのリーディングフレームに下記ＤＮＡ配列を含ん
でいる： ‐ヒトエンドグリン遺伝子のプロモーター（ＮＳ１‐２
４１５；特許出願Ｄ１９７０４３０１．１） ‐コドン２４に変異〔アルギニン（ＣＧＴ）からシステ
イン（ＴＧＴ）への置換；Wolfel et al.,Science,269:
1281 (1997)〕を有するヒトサイクリン依存性キナーゼ
４（ｃｄｋ‐４）のｃＤＮＡ ‐ＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）〔配列フリー
テキスト：ＳＶ４０ラージＴ；アミノ酸 １２６‐１３２；ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３）；Ding
wall et al.,TIBS,16: 478 (1991) 〕 構築物の個別成分の結合を適切な制限部位により行い、
様々な要素の末端へのＰＣＲ増幅により続ける。結合
は、当業者に知られる制限部位に特異的な酵素およびＤ
ＮＡリガーゼにより行う。これらの酵素は市販されてい
る。こうして作製されたヌクレオチドをこれら酵素によ
りクローニングする。
【０１７８】単核血液細胞と Superfect／プラスミド複
合体とのインキュベート後に、血液細胞をセクション１
２．２．）に記載されたような細胞培地で洗浄および培
養する。
【０１７９】６日後に、内皮細胞の割合をセクション１
２．１．）に記載されたように調べる。異なる実験シリ
ーズでは、それは１０〜６０％で変動する。
【０１８０】１２．５．）ベクターとしての形質導入内
皮細胞の作製および使用 セクション１２．４．）に記載されたように単離、形質
導入および増殖された内皮細胞を６０ｍｍ培養皿に接種
し、本発明による別なプラスミドおよび Superfect（Qu
iagen ）の複合体と共に３７℃で１０分間インキュベー
トする。
【０１８１】この複合体の作製は Superfectの製造業者
の説明に従い行う。
【０１８２】本発明によるプラスミドは５′から３′へ
のリーディングフレームに下記ＤＮＡ配列を含んでい
る： アクチベーターサブユニットＡ） ‐ｃｄｃ２５Ｃ遺伝子のプロモーター（核酸２９０〜＋
１２１；Zwicker etal.,EMBO J.14,4514 (1995)；Zwick
er et al.,Nucl.Acids Res.23,3822(1995)） ‐ＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）〔ＳＶ４０ラ
ージＴ；アミノ酸１２６‐１３２；ＰＫＫＫＲＫＶ（配
列番号３）；Dingwall et al.,TIBS,16: 478 (1991)〕 ‐ＨＳＶ‐１ ＶＰ１６の酸性トランス活性化ドメイン
（ＴＡＤ）（アミノ酸４０６‐４８８；Triezenberg et
al.,Genes Developm.2,718 (1988)；Triezenberg,Cur
r.Opin.Gen.Developm.5,190 (1995) ） ‐ＣＤ４糖タンパク質の細胞質部分についてのｃＤＮＡ
（アミノ酸３９７‐４３５；Simpson et al.,Oncogene,
4,1141 (1989) ；Maddon et al.,Cell,42,93 (1985)） アクチベーターサブユニットＢ ‐ヒトエンドグリン遺伝子のプロモーター（核酸１‐２
４１５；特許出願Ｄ１９７０４３０１．１） ‐ＳＶ４０の核局在化シグナル（ＮＬＳ）〔ＳＶ４０ラ
ージＴ；アミノ酸１２６‐１３２；ＰＫＫＫＲＫＶ（配
列番号３）；Dingwall et al.,TIBS,16: 478 (1991)〕 ‐Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインについての
ｃＤＮＡ（アミノ酸１〜１４７；Chasman and Kornber
g,Mol.Cell.Biol.10,2916 (1990) ） ‐ｐ５６ ｌｃｋタンパク質のＣＤ４結合配列について
のｃＤＮＡ（アミノ酸１〜７１；Shaw et al.,Cell,59,
627 (1989)；Turner et al.,Cell,60,755(1990)；Perlm
utter et al.,J.Cell.Biochem.38,117 (1988)） アクチベーター応答プロモーター ‐ヌクレオチド配列５′‐ＣＧＧＡＣＡＡＴＧＴＴＧＡ
ＣＣＧ‐３′を有するＧａｌ４結合タンパク質について
の結合配列（配列表フリーテキスト）×１０（配列番号
４；Chasman and Kornberg,Mol.Cell.Biol.10,2916 (19
89) ） ‐ＳＶ４０の基礎プロモーター（核酸４８‐５１９１；
Tooze (ed).DNA TumorViruses (Cold Spring Harbor Ne
w York,New York,Cold Spring HarborLaboratory) ） エフェクター遺伝子 ‐ヒトβ‐グルクロニダーゼについてのｃＤＮＡ（ヌク
レオチド配列９３‐１９８２；Oshima et al.,PNAS US
A,84,65 (1987) ） 記載されたアクチベーター配列の機能は下記のとおりで
ある： ‐プロモーターｃｄｃ２５Ｂは、ＶＰ１６の活性化ドメ
インおよびＣＤ４の細胞質部分についての組合せｃＤＮ
Ａの転写を細胞周期特異的に調節する（アクチベーター
サブユニットＡ）。
【０１８３】‐ヒトエンドグリン遺伝子のプロモーター
は、Ｇａｌ４のＤＮＡ結合タンパク質およびｐ５６ ｌ
ｃｋタンパク質のＣＤ４結合部分についての組合せｃＤ
ＮＡの転写を内皮細胞特異的に調節する（アクチベータ
ーサブユニットＢ）。
【０１８４】‐アクチベーターサブユニットＡおよびＢ
の発現産物はｐ５６ ｌｃｋドメインへのＣＤ４ドメイ
ンの結合により二量体化する。
【０１８５】‐二量体タンパク質は、エフェクター遺伝
子（＝ルシフェラーゼ遺伝子）の転写のためのアクチベ
ーター応答プロモーター（Ｇａｌ４結合ドメイン／ＳＶ
４０プロモーターについてのＤＮＡ配列）に関するキメ
ラ転写因子である。
【０１８６】構築物の個別成分の結合を適切な制限部位
により行い、様々な要素の末端へのＰＣＲ増幅により続
ける。結合は、当業者に知られる制限部位に特異的な酵
素およびＤＮＡリガーゼにより行う。これらの酵素は市
販されている。
【０１８７】これら酵素により、こうして作製されたヌ
クレオチド構築物をｐＸＰ２プラスミドベクター（Nord
een,BioTechniques,6,454 (1988)）中にクローニングす
る。単核血液細胞と Superfect／プラスミド複合体との
インキュベート後に、血液細胞をセクション１２．
２．）に記載されたような細胞培地で洗浄および培養す
る。
【０１８８】６日後に、内皮細胞により産生されたβ‐
グルクロニダーゼの量を、基質として４‐メチルウンベ
リフェリル‐β‐グルクロニドにより測定する。
【０１８９】細胞周期特異性をチェックするために、内
皮細胞をメチオニンの遮断により４８時間にわたりＧ０
／Ｇ１に同期させる。細胞のＤＮＡ含有量をHoechst ３
３２５８で染色した後に蛍光活性化細胞選別機で調べる
（Lucibello et al.,EMBO J.14,132 (1995) ）。
【０１９０】下記結果が得られる：トランスフェクトさ
れた内皮細胞では、非トランスフェクト繊維芽細胞と比
較して、β‐グルクロニダーゼの増加がみられない。
【０１９１】トランスフェクトされた内皮細胞は、非ト
ランスフェクト内皮細胞よりも著しく多くβ‐グルクロ
ニダーゼを発現する。増殖している内皮細胞（ＤＮＡ＞
２Ｓ；Ｓ＝単純染色体セット）は、Ｇ０／Ｇ１に同期さ
れた内皮細胞の場合（ＤＮＡ＝２Ｓ）よりも、著しく多
くβ‐グルクロニダーゼを分泌する。
【０１９２】このように、記載されたアクチベーター応
答プロモーター単位は、構造遺伝子β‐グルクロニダー
ゼの細胞特異的な細胞周期依存性発現に至る。
【０１９３】例えば腫瘍部位への局所投与後、あるいは
頭蓋内またはくも膜下投与、または全身、好ましくは静
脈内または動脈内投与後に、本発明による内皮細胞は、
好ましくは細胞損傷のある領域にこれら内皮細胞が入り
込むことを可能とさせ、排他的でなければ主に、アクチ
ベーター応答プロモーター単位の細胞周期‐および内皮
細胞特異性のおかげで、増殖している内皮細胞のみがβ
‐グルクロニダーゼを分泌している。このβ‐グルクロ
ニダーゼは、次に注入された高度に抵抗性のドキソルビ
シンを開裂させる。これは内皮細胞増殖を阻害して、こ
れらの細胞と隣接腫瘍細胞で静細胞的に作用する。結果
として、腫瘍増殖が阻害される。
【０１９４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH <120> Genetically modified cells and their use in the prophylaxis or therapy of disorders <130> 11651201 <140> <141> <150> DE19731154.7 <151> 1997-07-21 <150> DE19752299.8 <151> 1997-11-26 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Xaa is a variable amino acid. The 9th Xaa is a desired amino acid chain of 7-80 amino acids. <400> 1 Leu Xaa Asp Xaa Leu Xaa Xaa Leu Xaa Leu Xaa Cys Xaa Glu Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Ser Asp Asp Glu 20 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Myc E-Box <400> 2 ggaagcagac cacgtggtct gcttcc 26 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> SV40 <400> 3 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 1 5 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:binding sequence for Gal4 <400> 4 cggacaatgt tgaccg 16
【図面の簡単な説明】
【図１】細胞の形質転換に用いた核酸構築物を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＣ Ａ６１Ｋ 39/00 ＡＣＣＡ 38/22 ＡＣＢ 39/395 ＡＢＥＨ 39/00 ＡＣＣ ＡＢＮＡ 39/395 ＡＢＥ 48/00 ＡＢＦ ＡＢＮ ＡＤＺ 48/00 ＡＢＦ 37/02 ＡＢＣ ＡＤＺ 37/24 ＡＣＢ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ロルフ、ミューラー ドイツ連邦共和国マールブルク、ポイティ エールスシュトラーセ、８ (72)発明者 ハンス‐ハラルト、ゼトラツェック ドイツ連邦共和国マールブルク、ゾネンハ ンク、３

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）体の血液または細胞含有液から単核非
    接着性細胞を単離する； ｂ）ガングリオシド、リン脂質、糖脂質、および／また
    は分化、生存、移動および／または血管新生に影響を与
    える因子を含めた内皮細胞に対する増殖因子を含んでな
    る培地中において、工程ａ）で得られた細胞を培養す
    る； ｃ）あるいは、癌遺伝子による形質転換、癌遺伝子の活
    性化またはサプレッサー遺伝子の不活化により、工程
    ａ）またはｂ）で得られた細胞を不死化する；および ｄ）あるいは、標的細胞特異的に、細胞周期特異的に、
    ウイルス特異的におよび／または低酸素的に適切なプロ
    モーター系により活性化できるエフェクター遺伝子を含
    む遺伝子治療用の核酸構築物により、工程ａ）および
    ｂ）または工程ｃ）で得られた細胞をトランスフェクシ
    ョンすることにより得られる、遺伝子治療用細胞。
  2. 【請求項２】細胞がＣＤ３４‐、ＣＤ１４‐、ＣＤ１１
    ‐、ＣＤ１１ｂ‐、ＣＤ１３‐、ＣＤ６４‐またはＣＤ
    ６８‐陽性細胞、または内皮細胞である、請求項１に記
    載の細胞。
  3. 【請求項３】細胞が、静脈、毛細血管、動脈、臍帯また
    は胎盤中の血液、骨髄、脾臓、リンパ節、腹膜腔、胸膜
    腔、リンパ、静脈、動脈、毛細血管および／または結合
    組織液に由来している、請求項１または２に記載の細
    胞。
  4. 【請求項４】請求項１の工程ｂ）における増殖因子が、
    ＥＣＧＦ、ＦＧＦα、ＦＧＦβ、ＶＥＧＦ、ＥＣＡＦ、
    ＩＧＦ‐１、ＩＧＦ‐２、ＳＣ‐３、ＥＧＦ、ＳＣＦ、
    ＴＧＦβ、アンギオゲニン、プレオトロフィンおよびＦ
    ｌｔ‐３リガンドからなる群より選択される、請求項３
    に記載の細胞。
  5. 【請求項５】請求項１の工程ｃ）における癌遺伝子が、
    癌遺伝子遺伝産物が細胞周期を依然として完全に活性化
    できるが、細胞周期の活性化が細胞インヒビターにより
    もはや阻害されないように変異される、請求項３または
    ４に記載の細胞。
  6. 【請求項６】癌遺伝子が変異ｃｄｋ‐４、ｃｄｋ‐６お
    よびｃｄｋ‐２からなる群より選択される、請求項５に
    記載の細胞。
  7. 【請求項７】２４位におけるｃｄｋ‐４のヌクレオチド
    配列が、現にコードされるアルギニンがシステインに置
    き換えられるように変異されている、請求項６に記載の
    細胞。
  8. 【請求項８】請求項１の工程ｃ）におけるサプレッサー
    遺伝子の不活化が、少くとも１つのサプレッサー遺伝子
    遺伝産物を不活化するタンパク質をコードする核酸配列
    により細胞を形質転換することにより行われる、請求項
    ３または４に記載の細胞。
  9. 【請求項９】サプレッサー遺伝子遺伝産物を不活化する
    タンパク質が、アデノウイルスのＥ１Ａタンパク質、ア
    デノウイルスのＥ１Ｂタンパク質、ＳＶ４０ウイルスの
    ラージＴ抗原、パピローマウイルスのＥ６タンパク質、
    パピローマウイルスのＥ７タンパク質、ＭＤＭ‐２タン
    パク質および少くとも１つのアミノ酸配列ＬＸＤＸＬＸ
    ＸＬ‐II‐ＬＸＣＸＥＸＸＸＸＸＳＤＤＥを含むタンパ
    ク質（Ｘは可変アミノ酸であり、‐II‐は７〜８０アミ
    ノ酸からなる望ましいアミノ酸鎖である）からなる群よ
    り選択される、請求項８に記載の細胞。
  10. 【請求項１０】細胞が内皮細胞であり、形質転換に用い
    られる癌遺伝子またはサプレッサー遺伝子の不活化に用
    いられる核酸配列が、癌遺伝子または前記ヌクレオチド
    配列の転写を制御する内皮特異的活性化配列に結合され
    ている、請求項５〜９のいずれか一項に記載の細胞。
  11. 【請求項１１】請求項１の工程ｄ）における核酸構築物
    が、 ・少くとも１つの無制限に活性化しうる、１つの内皮細
    胞特異的、ウイルス特異的、１つの代謝的に活性化しう
    るおよび／または１つの細胞周期特異的に活性化しうる
    活性化配列、および ・発現が活性化配列により制御される、少くとも１つの
    エフェクター遺伝子を含んでなる、請求項１〜１０のい
    ずれか一項に記載の細胞。
  12. 【請求項１２】エフェクター遺伝子の発現が、少くとも
    ２つの同一または異なる活性化配列により制御される、
    請求項１１に記載の細胞。
  13. 【請求項１３】活性化配列の活性化が自己エンハンシン
    グする、および／または薬理学的に制御されうる、請求
    項１１または１２に記載の細胞。
  14. 【請求項１４】第二のアクチベーター配列が、ＨＢＶ、
    ＨＣＶ、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＥＢＶ、ＨＴＬＶ、ＣＭＶま
    たはＨＩＶのようなウイルスのプロモーター配列；ｃｄ
    ｃ２５Ｃ、ｃｄｃ２５Ｂ、サイクリンＡ、ｃｄｃ２、Ｅ
    ２Ｆ‐１、Ｂ‐ｍｙｂおよびＤＨＦＲに関する遺伝子
    の、低酸素により活性化されるプロモーターまたはエン
    ハンサー配列、または細胞周期特異的活性化配列；およ
    び細胞増殖依存的に生じる転写因子または活性化転写因
    子に関する結合配列、例えばＭｙｃＥボックスのモノマ
    ーまたはマルチマーからなる群より選択される、請求項
    １２または１３に記載の細胞。
  15. 【請求項１５】エフェクター遺伝子が、サイトカイン、
    ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、ケモカインまた
    は増殖因子用のレセプター、抗増殖、静細胞またはアポ
    トーシス作用を有するタンパク質、抗体、抗体断片、血
    管新生インヒビター、ペプチドホルモン、凝固因子、凝
    固インヒビター、フィブリン溶解タンパク質、血液循環
    で作用するペプチドまたはタンパク質、感染体、細胞ま
    たは腫瘍の血漿タンパク質および抗原、免疫反応を誘発
    する選択された抗原からなる群より選択される活性化合
    物をコードする遺伝子である、請求項１３または１４に
    記載の細胞。
  16. 【請求項１６】エフェクター遺伝子が、ファルマコンの
    前駆体をファルマコンに開裂する酵素をコードする遺伝
    子である、請求項１３または１４に記載の細胞。
  17. 【請求項１７】エフェクター遺伝子がリガンド‐活性化
    合物融合タンパク質またはリガンド‐酵素融合タンパク
    質をコードする遺伝子であり、リガンドがサイトカイ
    ン、増殖因子、抗体、抗体断片、ペプチドホルモン、メ
    ディエーター、細胞接着タンパク質およびＬＤＬレセプ
    ター結合タンパク質からなる群より選択される、請求項
    １３または１４に記載の細胞。
  18. 【請求項１８】内皮細胞中に導入される核酸構築物がＤ
    ＮＡである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細
    胞。
  19. 【請求項１９】核酸構築物がベクターに挿入されてい
    る、請求項１８に記載の細胞。
  20. 【請求項２０】プラスミドベクターである、請求項１９
    に記載の細胞。
  21. 【請求項２１】ウイルスベクターである、請求項１９に
    記載の細胞。
  22. 【請求項２２】障害の予防または治療のために、外的、
    経口、嚢内、鼻内、気管支内にまたは胃腸管中に投与さ
    れるか、または臓器、体腔、筋肉組織、皮下または血液
    循環中に注入される、請求項１〜２１のいずれか一項に
    記載の細胞。
  23. 【請求項２３】腫瘍、白血病、自己免疫障害、アレルギ
    ー、関節炎、炎症、臓器拒絶、移植片対宿主反応、血液
    凝固障害、循環障害、貧血、感染、ホルモン障害および
    ＣＮＳ損傷からなる群より選択される障害の治療療法剤
    の作製に関する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載
    された細胞の使用。
  24. 【請求項２４】下記工程： ａ）体の血液または細胞含有液から細胞を単離する； ｂ）ガングリオシド、リン脂質、糖脂質および／または
    増殖因子を含んでなる細胞培地中において、工程ａ）で
    得られた細胞を培養する； ｃ）あるいは、癌遺伝子による形質転換、癌遺伝子の活
    性化またはサプレッサー遺伝子の不活化により、工程
    ａ）またはｂ）で得られた細胞を不死化する； ｄ）標的細胞特異的に、細胞周期特異的に、ウイルス特
    異的におよび／または低酸素的に適切なプロモーター系
    により活性化できるエフェクター遺伝子を含む、遺伝子
    治療用の核酸構築物による、工程ａ）およびｂ）または
    工程ｃ）で得られた細胞のトランスフェクションを行う
    ことからなる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載さ
    れた細胞の作製法。
  25. 【請求項２５】請求項１〜２２のいずれか一項に記載さ
    れた細胞を含んでなる医薬。
  26. 【請求項２６】損傷血管の内皮化のための、請求項１に
    記載されたように得られる細胞。
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