JPH1198997A

JPH1198997A - インターフェロン−γの製造方法

Info

Publication number: JPH1198997A
Application number: JP10216310A
Authority: JP
Inventors: Fumiyoshi Okano; 文義岡野; Masanari Yamada; 勝成山田
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 1997-08-01
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 1999-04-13

Abstract

(57)【要約】【課題】遺伝子組換えインターフェロンーγの製造方
法を提供する。【解決手段】インターフェロンーγ遺伝子組換えバキ
ュロウイルスを酸またはアルカリ処理により不活化し、
それにより失活したインターフェロンーγを中性、低温
下で保存することにより活性型インターフェロンーγを
製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、有用蛋白質であ
り、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤および抗アレルギー剤の候
補であるインタ−フェロンーγを遺伝子組換え手法を用
いて生産し、医薬品として製造する過程において、遺伝
子組換え体の封じ込めおよび失活したインターフェロン
ーγの活性を回復させることによって、遺伝子組換えイ
ンターフェロンーγの効率的生産化を可能とし、以って
大量かつ安価にインターフェロンーγを医薬品として製
造する事を目的とした、インタ−フェロンーγの製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え手法を用いた有用蛋白質の
生産方法には多くの技術が知られており、例えば、遺伝
子組換えしたバキュロウイルスを用いて有用蛋白質を大
量に生産する方法がネコインターフェロン（文献１）等
で報告されている。このような遺伝子組換え手法を用い
て生産した有用蛋白質を医薬品として製造する場合、安
全性の面から、遺伝子組換え体の封じ込め（不活化）を
行う必要がある。例えば、遺伝子組換えしたバキュロウ
イルスを用いて有用蛋白質を生産する場合、細胞培養液
もしくは昆虫体液中に多量の組換えウイルスが存在する
ため、組換えウイルスの不活化が必須である。バキュロ
ウイルスの不活化方法に関しては文献２のように化学的
あるいは物理的手法による種々の不活化方法が報告され
ており、また塩酸処理による遺伝子組換え体（遺伝子組
換えカイコ核多角体病ウイルス）の不活化の例もネコイ
ンターフェロンの製造において報告されている（特開平
４ー２０７１９８）。有用蛋白質の生産の場合、組換え
ウイルスの不活化と同時に活性の維持が必要であるが、
これまでの方法では有用蛋白質が失活する条件がほとん
どである。インターフェロンーγは、化学的、物理的処
理に極めて弱く、またｐＨ安定性も極めて低いため、生
産性の高いバキュロウイルス発現系を用いて医薬品とし
て製造することは困難であった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】インターフェロンーγ
は熱処理、酸・アルカリ処理などあらゆる物理化学的処
理により失活する極めて不安定な蛋白質である。そのた
め、インターフェロンーγを遺伝子組換え手法を用いて
医薬品として製造する場合、その製造過程において失活
することが非常に多く、製造方法がかなり限定される。

【０００４】そこで、一度失活したインターフェロンー
γの活性を回復させることが可能となれば、遺伝子組換
えインターフェロンーγの製造が容易になり、幅広い生
産方法で効率的にインターフェロンーγを医薬品として
製造することが可能になることが期待される。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は、かかる状況
に鑑み、遺伝子組換えインターフェロンーγの医薬品と
しての効率的製造を目的とし、創意工夫を成し、インタ
ーフェロンーγ遺伝子組換えバキュロウイルスを酸性あ
るいはアルカリ性下で処理することにより不活化し、そ
れによって完全に生物学的活性を失ったインターフェロ
ンーγを中性、低温下で保存することによって驚くべき
ことに活性が完全に回復することを見出し、以ってイン
ターフェロンーγを効率的に大量に製造する方法を確立
し、かくして本発明を完成させるに至った。

【０００６】すなわち本発明は、インターフェロンーγ
遺伝子組換えバキュロウイルスを酸またはアルカリ処理
により不活化する方法と酸またはアルカリ処理により生
物学的活性を失ったインターフェロンーγの活性を回復
させる方法ならびにそうして得られたインターフェロン
ーγを提供するものである。

【０００７】

【発明の実施の形態】以下、本発明に関し詳細に説明す
る。

【０００８】本発明のインターフェロンーγは全ての動
物種を含むものとする。本発明の方法は、特にイヌイン
ターフェロン−γを製造する際に、好ましく用いられ
る。イヌインターフェロン−γは糖鎖を結合したもの、
糖鎖が存在しないもの、Ｃ末端構造が１部欠損したもの
など、イヌインターフェロン−γの活性を有するものは
全て含まれる。

【０００９】イヌインターフェロンーγの蛋白をコード
するＤＮＡは例えば次のようにして製造することができ
る。すなわち、イヌの細胞からポリ（Ａ）ＲＮＡを抽出
した後、ｃＤＮＡに転換し、イヌインターフェロンーγ
をコ−ドする遺伝子配列を元にしたプライマ−を用いて
ポリメラーゼ連鎖反応（以下ＰＣＲと略す）を行うこと
によってイヌインターフェロンーγをコ−ドする遺伝子
を得ることができる。イヌの細胞、例えばマイト−ジェ
ンなどで刺激されたイヌリンパ球などよりＲＮＡを得る
方法としては、通常の方法、例えば、ポリソ−ムの分
離、ショ糖密度勾配遠心や電気泳動を利用した方法など
があげられる。上記イヌ細胞よりＲＮＡを抽出する方法
としては、グアニジン・チオシアネ−ト処理後ＣｓＣｌ
密度勾配遠心を行うグアニジン・チオシアネ−ト−塩化
セシウム法（文献２）バナジウム複合体を用いてリボヌ
クレア−ゼインヒビタ−存在下に界面活性剤で処理した
のちフェノ−ル抽出を行う方法（文献３），グアニジン
・チオシアネ−ト−ホット・フェノ−ル法、グアニジン
・チオシアネ−ト−グアニジン塩酸法、グアニジン・チ
オシアネ−ト−フェノ−ル・クロロホルム法、グアニジ
ン・チオシアネ−トで処理したのち塩化リチウムで処理
してＲＮＡを沈殿させる方法などの中から適当な方法を
選んで行うことができる。

【００１０】イヌリンパ球などより通常の方法、例え
ば、塩化リチウム／尿素法、グアニジン・イソチオシア
ネ−ト法、オリゴｄＴセルロ−スカラム法等によりｍＲ
ＮＡを単離し、得られたｍＲＮＡから通常の方法、例え
ば、Ｇｕｂｌｅｒらの方法（文献４），Ｈ．Ｏｋａｙａ
ｍａらの方法（文献５）等によりｃＤＮＡを合成する。
得られたｍＲＮＡからｃＤＮＡを合成するには、基本的
にはトリ骨芽球ウイルス（ＡＭＶ）などの逆転写酵素な
どを用いるほか１部プライマ−を用いてＤＮＡポリメラ
−ゼなどを用いる方法を組み合わせてよいが、市販の合
成あるいはクロ−ニング用キットを用いるのが便利であ
る。このｃＤＮＡを鋳型としてイヌインターフェロンー
γの塩基配列を基にしたプライマ−を用いてＰＣＲを行
うことによってイヌインターフェロンーγの蛋白質をコ
−ドするＤＮＡを得ることができる。

【００１１】イヌインターフェロンーγは、カイコに感
染する組換えカイコ核多角体病ウイルスを作製すること
によって、カイコ発現系を用いても生産することができ
る。組換えカイコ核多角体病ウイルスは、イヌインター
フェロンーγの蛋白質をコ−ドするＤＮＡをカイコのク
ローニングベクター（文献６）に連結して作製した組み
換え体プラスミドとカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡと
を、カイコ樹立細胞にコトランスフェクションして作製
することができる。従って、組み換え体ウイルスは、ｉ
ｎｖｉｖｏ的な方法で作製することができる。すなわ
ち、イヌインターフェロンーγの蛋白質をコードするＤ
ＮＡ部分を、例えばｐＢＭ０３０（文献６）などのカイ
コのクローニングベクターの発現調節部分の下流に連結
するという一般的な遺伝子操作に従って組換え体プラス
ミドを作製することができる。この組換え体プラスミド
とカイコ核多角体病ウイルスＤＮＡ（文献６）とを、文
献のような方法でカイコ樹立細胞、例えばＢＭ−Ｎ株
（文献６）にコトランスフェクションした後、培養を続
け、培養液中に出現した非組換え体（野性型）と組換え
体のウイルスの中から限界希釈法、もしくはプラーク法
などの一般的な方法によって組換え体ウイルスをクロー
ニングすることができる。組換え体ウイルスは多角体の
形成能がないことから、野性型ウイルスと容易に区別で
きる。イヌインターフェロンーγの生産は、前記の組換
えカイコ核多角体ウイルスをカイコ樹立細胞中、または
カイコ生体中で増殖させることにより行なう。

【００１２】カイコ樹立細胞を用いる場合は、前記組換
え体ウイルスを含む培溶液により、ＢＭ−Ｎ細胞を感染
させ、平面培養または浮遊培養により培養する。ＢＭ−
Ｎ細胞を培養する培地としては、例えば牛血清を添加し
たＴＣ−１０培地（文献７）やＴＣ−１００培地（日本
農産工業（株）製）を使用することができる。培養温度
は２５〜２８℃が適当である。培養後、培養液を遠心分
離しその上清からイヌインターフェロンーγを回収す
る。

【００１３】カイコ生体を用いる場合は、前記の組換え
体ウイルスを含む培養液をカイコ幼虫に注射して、人工
飼料を与えて飼育する。飼育後、体液を採取しその上清
からイヌインターフェロンーγを回収する。

【００１４】イヌインターフェロンーγ遺伝子組換えバ
キュロウイルスの不活化に使用する酸またはアルカリと
しては、塩酸、硫酸、酢酸、リン酸、蟻酸、水酸化ナト
リウムなどが用いられるが、これらに限定されない。

【００１５】使用される酸またはアルカリ溶液のｐＨは
イヌインターフェロンーγ遺伝子組換えバキュロウイル
スの不活化に十分な値であればよく、通常３以下または
９以上が適当である。またこの方法は凍結点より高い温
度で、好ましくは４〜４０℃で実施される。処理時間は
少なくとも１分間であるが、それより長い処理も可能
で、１〜１２時間処理することにより良好な結果が得ら
れる。

【００１６】処理により生物学的活性を失ったイヌイン
ターフェロンーγを中性、低温で処理することにより活
性を向上させることができる。ここで中性とは、ｐＨ６
〜８で処理をするのが好ましい。バキュウウイルスの不
活化工程で酸性またはアルカリ性で処理をした液を中和
後、遠心してその上清を０〜１５℃でインキュベートす
るのが好ましい。インキュベートの時間は少なくとも１
２時間以上が好ましく、さらに好ましくは１〜７日間で
ある。

【００１７】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明をさらに具体的
に説明する。

【００１８】参考例１＜イヌインターフェロンーγ遺伝子組換えカイコ核多角
体病ウイルスの作製（１）＞イヌｃＤＮＡの調製イヌ末梢血よりリンパ球を分離し、フィトヘムアグルチ
ニン（ＰＨＡ）を５０μｇ／ｍｌの終濃度で４８時間刺
激した。刺激後、ＩＳＯＧＥＮ（ニッポンジ−ン（株）
製）を用いて総ＲＮＡを調製した。得られたＲＮＡを１
ｍＭＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）（以下ＴＥと略する。）に溶解し、７０℃で
５分間処理した後、１ＭＬｉＣｌを含むＴＥを同量加
えた。０．５ＭＬｉＣｌを含むＴＥで平衡化したオリ
ゴｄＴセルロ−スカラムにＲＮＡ溶液をアプライし、同
緩衝液にて洗浄した。さらに０．３ＭＬｉＣｌを含む
ＴＥにて洗浄後、０．０１％ＳＤＳを含む２ｍＭＥ
ＤＴＡ（ｐＨ７．０）で吸着したポリ（Ａ）ＲＮＡを溶
出した。こうして得られたポリ（Ａ）ＲＮＡを用いて一
本鎖ｃＤＮＡを合成した。すなわち、滅菌した０．５ｍ
ｌのミクロ遠心チュ−ブに５μｇのポリ（Ａ）ＲＮＡと
０．５μｇのオリゴｄＴプライマ−（１２−１８ｍｅ
ｒ）を入れ、ジエチルピロカルボネ−ト処理滅菌水を加
えて１２μｌにし、７０℃で１０分間インキュベ−トし
たのち氷中に１分間つけた。これに２００ｍＭトリス
塩酸（ｐＨ８．４），５００ｍＭＫＣｌ溶液を２μ
ｌ，２５ｍＭＭｇＣｌ２を２μｌ，１０ｍＭｄＮ
ＴＰを１μｌおよび０．１ＭＤＴＴを２μｌそれぞれ
加え、４２℃で５分間インキュベ−トしたのち、２００
ユニットの逆転写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、Ｓｕｐ
ｅｒＳｃｒｉｐｔII）を１μｌ加え、４２℃でさらに５
０分間インキュベ−トしてｃＤＮＡ合成反応を行った。
さらに７０℃で１５分間インキュベ−トして反応を停止
し、氷上に５分間置いた。この反応液に１μｌのＥ．ｃ
ｏｌｉＲＮａｓｅＨ（２ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）を加え、
３７℃で２０分間インキュベ−トした。

【００１９】（２）イヌインターフェロンーγ遺伝子の
調製イヌインターフェロンーγの塩基配列（文献２）をもと
に、５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡ
ＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´（配列番号１）と５
´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴＧ
ＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号２）の２種類の
末端にＥｃｏＲＩ切断部位を付加したプライマ−をＤＮ
Ａシンセサイザ−にて合成した。（１）で得られたｃＤ
ＮＡを０．５ｍｌのミクロ遠心チュ−ブに２μｌづつ取
り、各プライマ−を２０ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８．０）、１．５ｍＭＭｇＣｌ2 、２５
ｍＭＫＣｌ，１００μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ
各ｄＮＴＰ、４単位ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ
（宝酒造（株）製）となるように各試薬を加え、全量１
００μｌとする。ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プ
ライマ−のアニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ
−の伸長条件を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−
ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−
を用い、３０サイクル反応させた。これを１％アガロ−
スゲルにて電気泳動し、約５６０ｂｐのＤＮＡ断片を常
法（文献８）に従って調製した。このＤＮＡ断片をＩｎ
ｖｉｔｒｏｇｅｎ社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）
のＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅｒ．１を用
いて１６℃、２時間反応を行い、連結した。これを用い
て常法に従い大腸菌を形質転換し、得られた形質転換体
よりプラスミドＤＮＡを常法に従い調製した。次にこの
プラスミドにＰＣＲ断片が挿入されていることを前述と
同じ条件のＰＣＲによって確認し、蛍光ＤＮＡシーケン
サー（パーキンエルマー社製ＤＮＡシーケンサー３７３
Ｓ）を用い、その添付プロトコールに従って、パーキン
エルマー社のダイターミネーターサイクルシーケンシン
グキットを用いて、得られたＤＮＡ断片がイヌインター
フェロンーγ ＤＮＡの塩基配列であることを確認し
た。

【００２０】（３）カイコ発現用プラスミドの作製ベクターｐＢＭ０３０（文献７）１μｇを３０ユニット
の制限酵素ＥｃｏＲＩで３７℃、１６時間消化した後、
１ユニットのバクテリア由来アルカリホスファターゼ
（宝酒造（株）製）で末端を脱リン酸化した。これを１
％アガロ−スゲルにて電気泳動し、約１１．３ＫｂのＤ
ＮＡ断片を常法に従い調製した。

【００２１】ＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔＶｅ
ｒ．１を用いて、１６℃、１６時間ライゲ−ション反応
を行い、上記のように調製した、ｐＢＭ０３０と（２）
で調製したイヌインターフェロンーγのＤＮＡ断片を連
結した。これを用いて常法に従い大腸菌ＨＢ１０１を形
質転換した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬ
Ｂプレート上に生育するコロニーの中から、イヌインタ
ーフェロンーγをコードするＤＮＡの開始コドンから２
７ｂｐまでを含むプライマー、すなわち、５’ＡＴＧＡ
ＡＴＴＡＴＡＣＡＡＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３’
（配列番号３）とｐＢＭ０３０のクローニングサイトＥ
ｃｏＲＩから下流の２６ｂｐのプライマー、すなわち、
５’ＡＴＣＡＡＣＡＡＣＧＣＡＣＡＧＡＡＴＣＴＡＡＣ
ＧＣＴ３’（配列番号７）の２種類のプライマーを用い
て、ＤＮＡの変性条件を９４℃，１分、プライマ−のア
ニ−リング条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長条件
を７２℃、３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
Ｃｅｔｕｓ社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、３０
サイクルでＰＣＲを行い、約６５０ｂｐのＤＮＡ断片が
得られた、イヌインターフェロンーγをコードするＤＮ
ＡがｐＢＭ０３０に正方向に組み込まれているプラスミ
ドを得た。この組換え体プラスミドをｐＢＭγとした。
このプラスミドを含有する大腸菌をＥ．ｃｏｌｉ（ｐＢ
Ｍγ）と名付けた。

【００２２】また、イヌＩＦＮ-γの塩基配列をもと
に、５´ＧＣＡＧＡＴＣＴＡＴＧＡＡＴＴＡＴＡＣＡＡ
ＧＣＴＡＴＡＴＣＴＴＡＧＣＴ３´（配列番号：８）と
５´ＧＣＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＧＡＴＧＣＴＣＴ
ＧＣＧＧＣＣＴＣＧＡＡＡ３´（配列番号：９）の２種
類のプライマ−を日本バイオサービス（株）に依頼し合
成した。（１）で得られたｃＤＮＡを０．５ｍｌのミク
ロ遠心チュ−ブに２μｌづつ取り、各プライマ−を２０
ｐｍｏｌ，２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、
１．５ｍＭＭｇＣｌ₂ 、２５ｍＭＫＣｌ，１００
μｇ／ｍｌゼラチン、５０μＭ各ｄＮＴＰ、４単位
ＥｘＴａｑＤＮＡポリメラ−ゼ（宝酒造（株）製）とな
るように各試薬を加え、全量１００μｌとする。ＤＮＡ
の変性条件を９４℃，１分、プライマ−のアニ−リング
条件を５５℃、２分、プライマ−の伸長条件を７２℃、
３分の各条件でＰｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ
社のＤＮＡサ−マルサイクラ−を用い、３０サイクル反
応させた。これを１％アガロ−スゲルにて電気泳動し、
５１７ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号：１０）を常法に従
って調製した。このＤＮＡ断片をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ
社のＴ−Ｖｅｃｔｏｒに宝酒造（株）に常法に従い連結
した。これを用いて常法に従い大腸菌を形質転換し、得
られた形質転換体よりプラスミドＤＮＡを常法に従い調
製した。次に蛍光ＤＮＡシーケンサー（パーキンエルマ
ー社製ＤＮＡシーケンサー３７３Ｓ）を用い、その添付
プロトコールに従って、パーキンエルマー社のダイター
ミネーターサイクルシーケンシングキットを用いて、得
られたＤＮＡ断片がイヌＩＦＮ-γをコードするＤＮＡ
の塩基配列であることを確認した。

【００２３】次にこのＤＮＡ断片を鋳型として３種類の
プライマーの組合せ（配列番号：１１〜１６）で上記と
同様の条件でＰＣＲを行い、３種類のＰＣＲ増幅断片
（配列番号：１７〜１９）を得た。これらを常法に従い
回収し、配列番号：１７に示す断片を制限酵素ＢａｍＨ
ＩおよびＥｃｏＲＶで、配列番号：１８に示す断片を
制限酵素ＨｉｎｃＩＩおよびＳｎａｂＩで、配列番
号：１９に示す断片を制限酵素ＥｃｏＲＶおよびＥｃｏ
ＲＩで、それぞれ切断後、制限酵素処理した配列番号：
１７に示す断片と制限酵素処理した配列番号：１９に示
す断片を混和してｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ
部位へ常法に従い挿入し、組換えベクターを得た。さら
にこのベクターを制限酵素ＥｃｏＲＶで切断後、配列
番号：１８に示す断片を常法に従い挿入し組換えベクタ
ーを得、挿入されたＤＮＡの塩基配列（配列番号：２
０）を上記と同様にして確認した。その後、制限酵素Ｂ
ａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで挿入されたＤＮＡを回収
し、これを制限酵素ＢｇｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで切断
したｐＢＭ０３０に常法に従い挿入して、カイコ発現用
組換えベクターｐＢＭγＳ２(-)を作製した。また、ｐ
ＢＭγＳ２(-)を鋳型として配列番号：２１と配列番
号：２２に示すプライマーを用いてＰＣＲを行い、配列
番号：２３に示すＤＮＡ断片を得、これを同様にして制
限酵素処理後、ｐＢＭ０３０のＢｇｌＩＩおよびＥｃｏ
ＲＩ部位に挿入し、ｐＢＭγＳ２(-)／-２０を作製し
た。

【００２４】（４）イヌインターフェロンーγをコード
するＤＮＡで組換えられた組換えカイコ核多角体病ウイ
ルスの作製文献２の方法で組換えウイルスを作製した。すなわち、
５０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．１）、０．
２８ＭＮａＣｌ、０．７ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄、０．７
ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄からなる２．５ｍｌの溶液に、２．
５ｍｌのＤＮＡ混合液（０．２５ＭＣａＣｌ₂、カイ
コ核多角体病ウイルスＢｍＮＰＶＴ３株（文献２）の
ＤＮＡ１０μｇ、組換え体プラスミドｐＢＭγのＤＮＡ
６５μｇを含む）を滴下し、生じた懸濁液０．５ｍｌを
５ｍｌの１０％ＦＢＳを添加したＴＣ−１０培地（文献
２）中、２５ｃｍ²のフラスコで平面培養した約３×１
０⁵個のＢＭ−Ｎ細胞の培養基に加え、カイコ細胞にＤ
ＮＡを導入した。２０時間後、新鮮な培地と交換し、さ
らに７日間培養後、培養液を回収した。その培養液を遠
心して清澄化した上清を希釈して平面に培養したＢＭ−
Ｎ細胞の培養基に添加して８日間培養後、顕微鏡観察に
よりウイルス感染が見られ、かつ多角体が形成していな
い培養基を選択した（限界希釈法）。

【００２５】限界希釈法を７回繰り返し、組換え体ウイ
ルスをクローニングした。ここで作製したイヌインター
フェロンーγおよびイヌインターフェロンーγ変異体を
コードするＤＮＡを含む組換えウイルスをｒＢＮＶγ、
ｒＢＮＶγＳ２(-)およびｒＢＮＶγＳ２(-)／-２０と
した。

【００２６】（５）組換え体ウイルス液の調製７５ｃｍ²のフラスコ底面で、１５ｍｌの１０％ＦＢＳ
を含むＴＣ−１０培地中で平面培養した約３×１０⁶個
のＢＭ−Ｎ細胞に、前記（４）でクローニングした組換
え体ウイルスを含むＢＭ−Ｎ細胞の培養液５０μｌをＢ
Ｍ−Ｎ細胞に添加して、２７℃で５日間培養後、培養液
を３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、遠心上清を
組換え体ウイルス液として得た。ウイルス液を１０^ー7倍
希釈し、その１ｍｌをＢＭ−Ｎ細胞の培養基に添加して
２７℃で７日間培養を続けると、顕微鏡観察によって培
養基のＢＭ−Ｎ細胞にウイルス感染が認められた。

【００２７】参考例２＜抗ウイルス活性測定法＞ウイルスはＶｅｓｉｃｕｌａ
ｒＳｔｏｍａｔｉｔｉｓＶｉｒｕｓ，感受性細胞は
イヌＭＤＣＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ−３４）を用い、文献
１１のＣＰＥ法に従って抗ウイルス活性を測定した。

【００２８】参考例３＜カイコ樹立細胞でのイヌインターフェロンーγの生産
＞実施例１で得た組換え体ウイルス液を、０．５ｍｌづ
つ、２５ｃｍ²のフラスコで１０％のＦＢＳを含むＴＣ
−１００培地中で平面培養した約３×１０⁶個のＢＭ−
Ｎ細胞に加えた。３０分後、新鮮な５ｍｌの１０％ＦＢ
Ｓを含むＴＣ−１０培地と交換し、２７℃で３日間培養
した。培養液の遠心上清をとり、活性を調べた結果、１
０⁴希釈単位／ｍｌの抗ウイルス活性が得られた。

【００２９】参考例４＜カイコ生体中でのイヌインターフェロンーγの生産＞
５令２日目のカイコ幼虫に、実施例１で得た組換え体ウ
イルスのウイルス液を５０μｌ／頭注射し、２５℃で４
日間、市販の人工飼料（カネボウシルクエレガンス社
製）を与えて飼育後、１０頭のカイコの腹部を切り、体
液を氷冷したエッペンドルフチューブに採取し、遠心分
離後の上清を得、０．２２μｍのフィルターでろ過滅菌
後、活性を測定した結果、１０⁷希釈単位／ｍｌの抗ウ
イルス活性が得られた。

【００３０】参考例５＜細胞変性効果によるウイルス濃度の定量＞文献１２の
方法に従って、イヌインターフェロンーγ遺伝子組換え
ウイルスの濃度を定量した。すなわち、組換えウイルス
を感染させたカイコＢＭ−Ｎ細胞の培養上清、またはカ
イコ幼虫体液抽出液を希釈し、５x１０⁵個のＢＭ−Ｎ細
胞培溶液に添加した。２７℃で１０日間培養後、顕微鏡
観察によってＢＭ−Ｎ細胞に対する細胞変性効果を確認
し、感染性ウイルス量を算定した。感染性ウイルス量
は、文献１３に従ってＴＣＩＤ₅₀を求めることによって
決定した。

【００３１】実施例１＜イヌインターフェロンーγ遺伝子組換えカイコ核多角
体病ウイルスの不活化＞実施例４で得られたカイコ体液
を１００ｍｌの０．１Ｎ塩酸に浸漬し、４℃で６時間イ
ンキュベートした。得られた抽出液を２Ｎの水酸化ナト
リウムでｐＨ７にし、１０、０００ｇで３０分間遠心後
の上清を得た。この上清を用いて、組換えカイコ核多角
体病ウイルスの量を調べた結果、組換えカイコ核多角体
病ウイルスは完全に不活化していた。また、この上清の
抗ウイルス活性を測定した結果、抗ウイルス活性は認め
られなかった。このことから、塩酸処理によりイヌイン
ターフェロンーγ組換えカイコ核多角体病ウイルスは不
活化したが、それにより、イヌインターフェロンーγの
生物学的活性が失われたことが判明した。

【００３２】実施例２＜生物学的活性を失ったイヌインターフェロンーγの活
性の回復＞実施例６で得られた上清をさらにｐＨ７で４
℃で１週間インキュベートした。インキュベート後、抗
ウイルス活性を測定した結果、１０⁷希釈単位／ｍｌの
抗ウイルス活性が得られた。これは、塩酸処理する前の
活性とほぼ同等であり、イヌインターフェロンーγの生
物学的活性が完全に回復したことが示された。

【００３３】

【発明の効果】本発明によれば、遺伝子組換えインター
フェロンーγの効率的生産化ができ、以って大量かつ安
価にインターフェロンーγを医薬品として製造すること
が可能となる。

【００３４】参考文献１．桜井ら：Ｊ.Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、５４、５
６３（１９９２）．２．Ｃｈｉｒｇｗｉｎら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、
１８、５２９４（１９７９）．３．Ｂｅｒｇｅｒら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
８，５１４３（１９７９）．４．Ｇｕｂｌｅｒら：Ｇｅｎｅ．２５，２３６−２６９
（１９８３）．５．Ｏｋａｙａｍａら：Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，２，１６１，（１９８２）＆３，２８０，
（１９８３）．６．Ｔ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉら：Ａｇｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．，５１，１５７３−１５８０，（１９８７）．７．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬｏｂｏｒａｔｏｒｙ．
ＮｅｗＹｏｒｋ．１９８２．

【００３５】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GAATTCATGAATTATACAAGCTATATCTTAGC

【００３６】配列番号：２配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGAATTCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAAA

【００３７】配列番号：３配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATGAATTATACAAGCTATATCTTAGCT

【００３８】配列番号：４配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCC

【００３９】配列番号：５配列の長さ：４２配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCGACCATGGCTCAGGCCATGTTTTTTAAAGAAATAGAAAAC

【００４０】配列番号：６配列の長さ：３６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGATCCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAAACAG

【００４１】配列番号：７配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジ−：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATCAACAACGCACAGAATCTAACGCT

【００４２】配列番号：８配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCAGATCTATCAATTATACAAGCTATATCTTAGCT

【００４３】配列番号：９配列の長さ：35 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGAATTCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCGAAA

【００４４】配列番号：１０配列の長さ：517 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCAGATCTAT GAATTATACA AGCTATATCT TAGCTTTTCA GCTTTGCGTG ATTTTGTGTT 60 CTTCTGGCTG TAACTGTCAG GCCATGTTTT TTAAAGAAAT AGAAAACCTA AAGGAATATT 120 TTCAGGCAAG TAATCCAGAT GTATCGGACG GTGGGTCTCT TTTCGTAGAT ATTTTGAAGA 180 AATGGAGAGA GGAGAGTGAC AAAACAATCA TTCAGAGCCA AATTGTCTCT TTCTACTTGA 240 AACTGTTTGA CAACTTTAAA GATAACCAGA TCATTCAAAG GAGCATGGAT ACCATCAAGG 300 AAGACATGCT TGGCAAGTTC TTACAGTCAT CCACCAGTAA GAGGGAGGAC TTCCTTAAGC 360 TGATTCAAAT TCCTGTGAAC GATCTGCAGG TCCAGCGCAA GGCGATAAAT GAACTCATCA 420 AAGTGATGAA TGATCTCTCA CCAAGATCCA ACCTAAGGAA GCGGAAAAGG AGTCAGAATC 480 TGTTTCGAGG CCGCAGAGCA TCGAAATAAG AATTCGC

【００４５】配列番号：１１配列の長さ：30 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATAGGATCCATGAATTATACAAGCTATATC

【００４６】配列番号：１２配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTGGATATCTGGATTACTTGCCTGAAAATATTC

【００４７】配列番号：１３配列の長さ：27 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCATACGTATCGGACGGTGGGTCTCTT

【００４８】配列番号：１４配列の長さ：36 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GGTGGTCGACTGTAAGAACTTGCCAAGCATGTCTTC

【００４９】配列番号：1５配列の長さ：36 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCGATATCCACCAGTAAGAGGGAGGACTTCCTTAAG

【００５０】配列番号：１６配列の長さ：33 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CTCGAATTCTTATTTCGATGCTCTGCGGCCTCG

【００５１】配列番号：１７配列の長さ：147 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 ATAGGATCCA TGAATTATAC AAGCTATATC TTAGCTTTTC AGCTTTGCGT GATTTTGTGT TCTTCTGGCT GTAACTGTCA GGCCATGTTT TTTAAAGAAA TAGAAAACCT AAAGGAATAT TTTCAGGCAA GTAATCCAGA TATCCAG

【００５２】配列番号：１８配列の長さ：201 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCATACGTAT CGGACGGTGG GTCTCTTTTC GTAGATATTT TGAAGAAATG GAGAGAGGAG AGTGACAAAA CAATCATTCA GAGCCAAATT GTCTCTTTCT ACTTGAAACT GTTTGACAAC TTTAAAGATA ACCAGATCAT TCAAAGGAGC ATGGATACCA TCAAGGAAGA CATGCTTGGC AAGTTCTTAC AGTCGACCAC C

【００５３】配列番号：１９配列の長さ：195 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 CCGATATCCA CCAGTAAGAG GGAGGACTTC CTTAAGCTGA TTCAAATTCC TGTGAACGAT CTGCAGGTCC AGCGCAAGGC GATAAATGAA CTCATCAAAG TGATGAATGA TCTCTCACCA AGATCCAACC TAAGGAAGCG GAAAAGGAGT CAGAATCTGT TTCGAGGCCG CAGAGCATCG AAATAAGAAT TCGAG

【００５４】配列番号：２０配列の長さ：517 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCAGATCTAT GAATTATACA AGCTATATCT TAGCTTTTCA GCTTTGCGTG ATTTTGTGTT 60 CTTCTGGCTG TAACTGTCAG GCCATGTTTT TTAAAGAAAT AGAAAACCTA AAGGAATATT 120 TTAATGCAAG TAATCCAGAT GTATCGGACG GTGGGTCTCT TTTCGTAGAT ATTTTGAAGA 180 AATGGAGAGA GGAGAGTGAC AAAACAATCA TTCAGAGCCA AATTGTCTCT TTCTACTTGA 240 AACTGTTTGA CAACTTTAAA GATAACCAGA TCATTCAAAG GAGCATGGAT ACCATCAAGG 300 AAGACATGCT TGGCAAGTTC TTAAATAGCA GCACCAGTAA GAGGGAGGAC TTCCTTAAGC 360 TGATTCAAAT TCCTGTGAAC GATCTGCAGG TCCAGCGCAA GGCGATAAAT GAACTCATCA 420 AAGTGATGAA TGATCTCTCA CCAAGATCCA ACCTAAGGAA GCGGAAAAGG AGTCAGAATC 480 TGTTTCGAGG CCGCAGAGCA TCGAAATAAG AATTCGC

【００５５】配列番号：２１配列の長さ：42 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGGAATTCTTATCTTGGTGAGAGATCATTCATCACTTTGAT

【００５６】配列番号：２２配列の長さ：42 配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCGGGATCCTTATCTTGGTGAGAGATCATTCATCACTTTGAT

【００５７】配列番号：２３配列の長さ：４５７配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：他の核酸合成DNA 配列 GCAGATCTAT GAATTATACA AGCTATATCT TAGCTTTTCA GCTTTGCGTG ATTTTGTGTT 60 CTTCTGGCTG TAACTGTCAG GCCATGTTTT TTAAAGAAAT AGAAAACCTA AAGGAATATT 120 TTCAGGCAAG TAATCCAGAT GTATCGGACG GTGGGTCTCT TTTCGTAGAT ATTTTGAAGA 180 AATGGAGAGA GGAGAGTGAC AAAACAATCA TTCAGAGCCA AATTGTCTCT TTCTACTTGA 240 AACTGTTTGA CAACTTTAAA GATAACCAGA TCATTCAAAG GAGCATGGAT ACCATCAAGG 300 AAGACATGCT TGGCAAGTTC TTACAGTCAT CCACCAGTAA GAGGGAGGAC TTCCTTAAGC 360 TGATTCAAAT TCCTGTGAAC GATCTGCAGG TCCAGCGCAA GGCGATAAAT GAACTCATCA 420 AAGTGATGAA TGATCTCTCA CCAAGATAAG AATTCGC

【００５８】配列番号：２４配列の長さ：501 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：イヌ配列の特徴配列の特徴特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..498 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG AAT CTG TTT CGA 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg GGC CGC AGA GCA TCG AAA TAA 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys ***

【００５９】配列番号：２５配列の長さ：441 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：イヌ配列の特徴特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..438 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TAA 441 Pro Arg ***

【００６０】配列番号：２６配列の長さ：453 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：イヌ配列の特徴特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..450 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT CAG GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Gln Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA CAG TCA TCC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Gln Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG TAA 453 Pro Arg Ser Asn Leu Arg ***

【００６１】配列番号：２７配列の長さ：501 配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：イヌ配列の特徴配列の特徴特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：1..72 特徴を決定した方法：S 特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：73..498 特徴を決定した方法：S 配列 ATG AAT TAT ACA AGC TAT ATC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ATT TTG 48 Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu TGT TCT TCT GGC TGT AAC TGT CAG GCC ATG TTT TTT AAA GAA ATA GAA 96 Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu AAC CTA AAG GAA TAT TTT AAT GCA AGT AAT CCA GAT GTA TCG GAC GGT 144 Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly GGG TCT CTT TTC GTA GAT ATT TTG AAG AAA TGG AGA GAG GAG AGT GAC 192 Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp AAA ACA ATC ATT CAG AGC CAA ATT GTC TCT TTC TAC TTG AAA CTG TTT 240 Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe GAC AAC TTT AAA GAT AAC CAG ATC ATT CAA AGG AGC ATG GAT ACC ATC 288 Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile AAG GAA GAC ATG CTT GGC AAG TTC TTA AAT AGC AGC ACC AGT AAG AGG 336 Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Asn Ser Ser Thr Ser Lys Arg GAG GAC TTC CTT AAG CTG ATT CAA ATT CCT GTG AAC GAT CTG CAG GTC 384 Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val CAG CGC AAG GCG ATA AAT GAA CTC ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTC TCA 432 Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser CCA AGA TCC AAC CTA AGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG AAT CTG TTT CGA 480 Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg GGC CGC AGA GCA TCG AAA TAA 501 Gly Arg Arg Ala Ser Lys ***

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】インターフェロン−γの蛋白質をコード
するＤＮＡにより遺伝子組換えされたバキュロウイルス
を感染させた昆虫培養細胞の培養上清または該バキュロ
ウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液抽出液に含まれ
る組換えバキュロウイルスを酸性またはアルカリ性条件
下で処理することにより不活化する工程を含むインター
フェロン−γの製造方法。
【請求項２】酸性条件下の処理に用いる酸が塩酸、硫
酸、酢酸、リン酸および蟻酸から選ばれる少なくとも１
種であることを特徴とする請求項１に記載のインターフ
ェロン−γの製造方法。
【請求項３】ｐＨを３以下にすることを特徴とする請求
項１または２に記載のインターフェロン−γの製造方
法。
【請求項４】生物学的活性を失ったインターフェロン
ーγを中性、低温下で処理することを特徴とするインタ
ーフェロンーγの製造方法。
【請求項５】ｐＨ６〜８で処理することを特徴とする
請求項４に記載のインターフェロンーγの製造方法。
【請求項６】１５℃以下で処理することを特徴とする
請求項４または５に記載のインターフェロンーγの製造
方法。
【請求項７】インターフェロン−γの蛋白質をコード
するＤＮＡにより遺伝子組換えされたバキュロウイルス
を感染させた昆虫培養細胞の培養上清または該バキュロ
ウイルスを感染させたカイコ幼虫の体液抽出液に含まれ
る組換えバキュロウイルスを酸性またはアルカリ性条件
下で処理することにより活性を失ったインターフェロン
−γであることを特徴とする請求項４から６のいずれか
１項記載のインターフェロンーγの製造方法。
【請求項８】遺伝子組換えバキュロウイルスが配列番
号：２４から配列番号：２７のいずれかに記載のＤＮＡ
配列により遺伝子組換えされた組換えカイコ核多角体病
ウイルスであることを特徴とする請求項１から７のいず
れか１項記載のインターフェロン−γの製造方法。