JPS58129996A - 免疫酵素細胞化学的方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼがトレーナ−として
使用されることからなる組織中の抗原を同定するための
免疫酵素細胞化学的方法に関する。

本発ｆＩＡねまた前記方法を集塊するための試薬をも包
含する。

辱嵩ラベルされ九および螢光ラベルされた抗体は組織中
の抗原の局在を実証する丸めに免疫組織化学において普
通に使用される（「Ｐｒｏａ、Ｅｌｏｏ。

ｌｘｐ、Ｂｉｏｌ、Ｍ＠ｄ、　Ｊ　ｊｉ　４７　Ｉ／Ｉ
ｋ７１１４２００〜２０２貫（１９４１年）、「Ｊ、工
ｍｍｕｎｏ１．Ｊ第４５巻第１５９〜１７０頁（１９４
２年）、「Ｊ、ｌｘｐ、Ｍｏａ、　Ｊ　第９１巻第１〜
１３貞（１９５０年）、「ムｒｏｈ、Ｐａｔｈｏ１．Ｌ
ａｂ、Ｍ＠ｄ、　Ｊ　７７４１０２４ｉ＋第１１３〜１
２１頁（１９７８年）および「ｙ。

０１１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、Ｊ　Ｊ１２７巻Ｊ１４〜２０
真（１９７４年）参照〕。

しかしながら、−嵩免５２局在はそれが病壇字者に免疫
螢光よシ幾分明獣な利点を提供するので近年よル一般的
となって寝ている。これらの利点には、佛本がよル安定
で、対比できてぞして微細に詳しく着色されていること
、スライドが永久的であること、周囲組織のｍ察できる
こと、および大抵の抗原にとっては光学朧微鏡のための
襟準的固足および射場操作を用いて調製された物質が使
用で龜ることが包含される。

前記利点のおかげで、免疫酵−素法／Ｉ′ｉ為感度でそ
して１ｌｉ６ｆＫ精密な方法であることとなｐ、従って
免疫組織化学的技法のうちでは、免疫酵素組織化学的方
法／ｆｉ現在診断病珊字において最も制用される方法で
ある。免疫ｗＩ票細胞化学的方法、％Ｋｆｆｉ織化学的
方法は腎臓病理学、例えば縮重性およびウィルス性疾患
の研究、免疫系の生理病理学ならびにホルモンの分泌に
おける重要な情報を与える。

さらに所定の疾患および細胞型に特定の標識が示され、
癌の組織形成および相異についての重大な情報が得られ
る。

酵素、ポリペプチドおよびステロイドホルモン、免疫グ
ロブリン、厘瘍発達抗原、ウィルス性抗原およびその他
のＭＡ廁特異的蛋白質を包含する広い櫨譲の細胞生成物
がこれら技法の使用によシ凍結され友かまたは慣用の固
定されそして封ｍ（・鳳ｂ・ｄｓｌｉｎｇ）され九組織
切片において実証された。

これら方法の主１な適用には、伺えばり／パ網状起原訃
よびＳ型的すンパ増涜過橿の癌における種々の免疫グロ
ブリン櫨虜の実証、内分泌性癌におけるポリペプチドホ
ルモンの同定、および新生物性および前新生物性状態に
おける瘉胚子性抗原およびα−胎児蛋白質のような種実
の＃Ｉ標鐵の実証が包含される。

組織病１字における免役ｒ！＃卓的技法のいくつかの適
用についての簡単な螢約は［Ｈｕｍａｎ　Ｐａｔ−ｈｏ
ｌｏｇｙｊ第、１２１１ｋｌＫ　５９０〜５９６ｘ（１
９８１年）に報告されている。

７０以上の可能な使用分野が列挙されうる。

その多くが所定の疾患に対し％異的でＴｏ９そしていく
つかは病因ですらある広範囲の標識を常用の同定されそ
してワックス封埋され九細胞および組織中で同定する可
能性は、伝統的なしばしば主鏡的で純粋に形態学的であ
る助変数とは対照的に社しい客綱的診１ｌｊｒ４Ｉｌ準
を病理学者に提供するものである。

過酸化酵＊Ｖｉ現在免疫細胞化学において最も広く使用
される＃素を代表する［「Ａｍ、Ｊ、０１ｉｎ。

Ｐａｔｈｏｌ、Ｊ第７１巻第４８３〜４８８頁（１９７
９年）］。

この＃素は一方では着しい安定性、不溶性の高［Ｋ限定
された基質を使用する可能性、および免疫１字的蓋の結
合のみを用いて複数の抗体！−からなる鎖を形成する可
能性（すなわちＰＡ濾過酸化１１素−抗通酸化＃素系）
のような利点を提供するが、「免疫過酸化１１１票」な
る用語の下に一緒に分類されるこれら方法を使用するに
際していくつかの欠点に遭遇する。

内因性過酸化酵素および偽過酸化酵素はいくつかの組織
中に存在しそしてこれらは誤まった陽性結果をもたらし
うる。最奄広く使用される色原体基質３．３’、４．４
″−ジアミノベンジジンテトラ塩酸塩（ＤムＢ）は有意
な発癌作用を有しておシ（ｌＲ＠ｇｉｓｔｒｙ　ｏｆ　
ｔｏｘｉａ　＠ｆｆ＠ｅｔｓ　ｏｆ　０Ｍｍ１ｏａ１８
ｕｂｓｔａｎｏ＠５ｊ（Ｕ、８．Ｄ＠ｐｔ、ｏｆ　　ｌ
＠ａｌｔｈ　　ａｎｄ　　Ｈｕｍａｎ８・ｒｖｉＯ・−
）１９８０年版〕そして市場で有意な純度を有する化合
物を見出すのは益々困難となってきている［「Ｊ、ａｔ
ｓｔｏｏｈ＠ｍ、　Ｊ　Ｉｇ　２８号１８１９１〜１９
２頁（１９８０年）］。

過酸化ＷＩＩ票の東証に使用される溶液は不安定でそし
て使用２〜３分前にのみ１％ｌｌｌ製されるべきである
（Ｌ、ム、　８ｔ＠ｒｎｂ＠ｒｇ＠ｒ氏著「工ｍｍｕｎ
ｏｏｙｔｏｏ−ｈｓｍｉｓｔｒｙＪ第２版（Ｊｏｈｎ　
ｆｉｌｍｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ　１９７９年発行〕。

その上、４１１Ｉ化酵素基質色原体は淡褐色背景に対し
て深褐色を示し、これは標本の評価における重大問題を
時として提起しそして間違った陽性度を招来しうる。

過酸化酵Ｉｓま九は他の陣索列えばグルコース酸化＃累
およびアルカリホスファターゼの代替基質が提案された
。しかし特に多くの方法は標本の脱水および透明化に使
用される有機溶媒中に可溶の色原体化合物ま九は組織抗
原を発現する感度が比較的低い色原体化合物の形成を来
すので、過酸化酵素＋ＤＡＢ系により得られるそれと比
較しうる結果は今日まで得られなかった。

本発明者らは、β−Ｄ−ガラクトクダーゼをトレーサー
として使用すると既知免疫酵素細胞化学的技法、特に免
″疫過酸化酵素細胞化学的方法に関連した欠点を克服し
うろことを見出した。

従って本発明はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼをトレーサー
として使用することを４Ｉ黴とする、組ｉｔ籍にヒトの
組織中の抗原の免疫Ｉ＃素細胞化学的同定法に関する。

本発明によれば、組織中の抗原の同定は、特定の色原体
基質にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを作用させることによ
シ得られる不溶性で且つ着色した生成物の形成によシ遍
成される。よシ正確には本発明は同定される予定の抗原
に任意の籍異的結合剤によりβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
鯵素を結合させそしてβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの作用
により不溶性で且つ着色した生成物を生じうる特定の基
質との反応によりβ−Ｄ−ガ２クトシダーゼ活性を示す
ことからなる４１ｉ繊中の抗原を同定する方法を提供す
るものである。

本発明方法で使用されるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ＃素
は微生物起原のいずれのβ−Ｄ−ガ２クトシダーゼでも
よいが、大腸−から得られるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
が好ましい。

本発明によればβ−Ｄ−ガ２クトシダーゼは任意の種類
の特定の結合剤によシ、同定される予定の抗原に結合さ
れうる。特に、例えば免疫過酸化酵素法における過酸化
酵素にすでに記載された任意の標示技法また一架憤技法
も顕現される予定の抗原にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを
結合させるのに使用されうる。

好ましい技法によれば、前記抗原を抗原それ自体に％異
的な第１番目の抗体と反応させ、そしてこれを次にβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼに直接にかまたはβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼ共役物を生じうる任意の共役系を介して結合
させる。

適当なβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ共役物は特に１例えば
「ＦＩＢ８　Ｌ＠ｔｔ＠ｒＪ第９５ＩＩｋ３４３１１頁
（１９７８年）を九は［ムｍ＠ｒ、Ｊ、ｏｌｉｎ、Ｐａ
ｔｈｏ１．　Ｊ第７゛１巻＃１４８３頁（１９７９年）
Ｋ記載され丸型の鯵素共役抗抗体（ａｎｔｉ−ａｎｔｉ
ｂｏｄｙ）、または例えば「ｚ。

ＨｌｓｔｏａＭｍ、０ｙｔｏａｈ＠ｍ、Ｊ第２７巻第８
号第１１３１頁（１９７９年）Ｋ報告され丸型の可能な
配置のいずれかをしｆ＃：、ｌＦ素共役ビオチン−アビ
ジン（ｎｔｏｔｔｎムｖｉｄｉｍ　）系であ）うる。

同定される予定の抗原を抗原それ自体に対して％異的な
第１番目の抗体と反応させる工程および続く該特異的抗
体とメーク−ガラクトシダーゼとの間に架橋を確立させ
る工１ｉ（単一ま九は複数工程）Ｆｉ連続して実施され
るのが好ましい。

本発明方法によればβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を示
す九、めＫｄβ−Ｄ−ガラクトシダー　　　　）ゼ酵素
に対して特異的であシ、そして加うるに、β−Ｄ−ガツ
クトシダー（の作用によ）着色した、不溶性でそして安
定な反応生成物を生じうる任意の色原体基質が使用され
うる。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼの作用によシ前配色原体基質
から生ずる生成物は、着色しそして安定であることと並
んで、組織学において組織を処理するのに普通に１ｊｌ
！用される水性または有機性溶媒のいずれかに不溶であ
らねばならず、好ましくは前記水性および有機溶媒の両
方に不溶であるべきである。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼに特異的な色原体基質は同じ
溶媒中に溶解するのが好ましい。

β−Ｄ−ガ２クトシダーゼ特異性を有するこの色原体基
質は、−たん＃素によ如解袈されると前記し九着色した
不溶性で且つ安定し九反応生成物を生じうるいずれのβ
−Ｄ−ガラクトシド鱒導体でもよい０本発明方法におい
て特に有用な色原体基質の伺は、例えばある種のインド
リル−およびす７チルーβ−Ｄ−ガラクトシド１１４体
である。籍に好ましい基質はインドリル−β−Ｄ−ガフ
クトシド誘導体であシそしてこれらの中では５−プロモ
ー４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド
がよ如特別に好ましい。

ナフチル−β−Ｄ−ガラクトシド誘導体のうちではる一
ブロモー２−ナフチルーβ−Ｄ−ガ２クトシドが好まし
いものである。

β−Ｄ−ガツクトシダーゼ活性を呈示するには、例えば
カップリング剤、酸化剤または電子移動剤でる如うる１
種ま九はそれ以上の付加的な試薬の存在下に色原体基質
を反応させることが時々必要であｐうる。

従って、例えばナフチル−β−Ｄ−ガラクトシド誘導体
が色原体基質として使用される場合、ｗＩＩ素活性を呈
示する丸めに適当なアゾカツプリング剤の存在が必要と
されそしてアゾカップリング剤はまたインドリルβ−Ｄ
−ガ２クトシド色原体が使用される場合は場合によル呈
示試薬中に存在してもよい。

遣尚なアゾカップリング剤は、例えばヘキサアゾ化ｐ−
ローザニリン、７アストプルーＶＢ　。

ＢＢおよびＲＲ，７アストガーネツトＧＢＯおよび類似
物であ夛得、ヘキサアゾ化され九ｐ−ａ−ザニリンが特
に好ましい。

さらに、特にインドリルβ−クーガラクトシド基質が使
用される場合に、酵素で触媒作用された呈示返応を促進
させるために、反応媒体中に場合によシ酸化剤を九は電
子移動剤が存在してもよい。

酸化剤ま九は電子移動剤′は、適当である＠シ、無機お
よび有機化学に知られた任意の酸化剤および電子移動剤
であシ、無模試秦が一般に好ましい。

好ましい酸化剤または電子移動剤の列は、籍にフェナジ
ンメトサルフェート、テトラゾリウム塩、または任意の
適当なレドックスイオン対である。

適当なテトツゾリウム塩は、書えばＰ−二）ロブルーテ
トラゾリウムクロ２イドまたはテトラニトロブルーテト
ラゾリウムクロライドであｐうる。

適当なレドックスイオン対は、丙えばイオン対ν・２＋
ρ・ト、０・２＋１０・４＋、ニー／ｖＯト、Ｉ　−、
／Ｖ　Ｏｓ−１Ｓ ｌ−／Ｗ０１−１Ｘ−Ａ３，０，２−１Ｘ２−１Ｘ−７
，ニー／Ｍｏ、０２４ｍ−およびＩｌ似物からなる評か
ら選ばれうる。

１・２＋ρ−十型の対が籍に例えばそれぞれのシアン化
物錯体ま九ね硫酸塩によシ提供されうる。

シアン化物一体は好ましくはアルカリ性へキサシアノ鉄
（１）鹸塩／ヘキナシアノ鉄＠戚塩、時にヘキサシアノ
鉄（ＩＩ）　＠カリウム／ヘキサシアノ鉄（−鈑カリシ
ムである。

Ｃ・２”１０＊４＋対は好ましくはそれぞれの硫酸塩に
よシ提供される。

陰イオン対はそれぞれの塩、好ましくはアルカリまたは
アルカリ土類金属との塩によシ提供される。

本発明方法によれば組織試料は組織化学に普通に用いら
れる任意の既知操作、湾えば凍結、固定および封埋操作
によシ！４製されうる。

例えば、ホルマリン固定およびパラフィン封環された組
織は本発明方法を用いて非常に容易に検査されうる。

試料の評価は２０〜８００倍に拡大する任意の通常の光
学顕微鏡を用いて実施されうる。

β−Ｄ−ガフクトシダーゼ＃素および適当な特定の色原
体ム質の使用は既に記載したように例えば過酸化酵素を
用いる場合に遭遇する不胸を回避せしめる。

籍に、伺えば同じく既に記載され丸ように過酸化酵素−
免疫組織化学的方法を大きく限定する内因性過酸化酵素
および偽４鹸化１１素が組織試料中に存在することによ
〉惹起される問題は本発明方法において回避される。な
ぜならβ−・Ｄ−ガラクトシダーゼ酵素は通常人間組織
中には存在せず、そしていずれの場合においてもヒトの
β−Ｄ−ガツクトシメーゼ活性のｐＨ範囲は本！１ｌｊ
ｌｉ方法で使用される微生物性β−Ｄ−ガツクトシダー
ゼ活性のｐＨＭｉＦｊｊｉとは完全に相違しているから
である。ヒトの７−Ｄ−ガラクトシダーゼの活性範囲は
約１５〜６であ如、一方例えば大腸菌β−Ｄ−ガツクト
シ〆−ゼの活性な一範囲は約１０〜７．５である。

加えてβ−Ｄ−ガツクトシダーゼは慣用の封壌操作期間
中に通常到遍する温度である約５５℃で１分以内に不活
性化される（　ｐ、Ｄ、ＢＯｙ＠ｒ　％Ｈ，Ｌａｒｄｙ
およびに、ＭｙｒｂＫａｋ氏等編「Ｔｈｅ　−声５Ｊ（
１９６０年第２版）第４巻第４０９〜４３０貞（ムａａ
−ｄ＠ｒｎｉａ　Ｐｒｏｓ−出版）〕。

〕内因性β−Ｄ−ガ２クトシダーから生ずる妨害が存在
しないことによル、組織中の過酸化＊＊＊活性のゆえに
普通に使用される過酸化酵率で生ずる背景（バックグラ
ウンド）汚染の問題はβ−Ｄ−ガラクトシダーゼでは生
じない。

微生物性β−Ｄ−ガラクトシダーゼは哺乳類の組織にお
いて何ら背景汚染を生ぜずそして入手しうる色原体基質
と反応してコントラストの大きいそして容易に識別され
る形態学的・ぞターンを創成する。得られた汚染（ステ
ィン）Ｆｉ、使用されるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ色原
体基質の大部分がｔｈとんと完全に白い背景を有するこ
とが許容されるという事実を考えても、過−化＃票技法
を用いて通常得られるそれよルはるかに良好に明確であ
りそして区別できる。その結果として特定の免疫反応性
位置の視覚化および解釈が太いに容易にされ皮。

このことは本Ｉｉ＆ｑｓｏｕ的であるβ−Ｄ−ガ２クト
シダーゼ法の感度が増大したことを暗示しセして出血性
または炎症性病変を有する組織の検査にとってこの方法
を％に有用なものとなすものである。

加うるに、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ組繊学的反応に使
用される試薬、籍に肉えば最も好ましく使用されるイン
ドリルβ−Ｄ−ガラクトシド色原体は過酸化酵素染色に
最も使用されるコントラストの強い基質ジアミノベンジ
ジンと異な夛発瘉性であることは知られていない。

さらに、本発明方法を遂行するのに使用される試′Ｉｋ
は安定でめシ、そして恒久的に安定であシそして単純な
、通常の光学顧１ｉｌ鏡の使用を費するスライドを生ず
る。

上記に蒙約した利点の故に本発明のβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼー免疫細胞化学的方法は少くとも過酸化酵素技法
のそれと比較しうる非常に高い＃１度および感度を示し
、同時に後者の技法を特徴ずける欠点が々い。

その高感度ゆえに１本発明方法は、残留抗原性が凍結さ
れ九組織中のそれの７ラクシ１ンのみである常用の固定
および封埋された物質上の抗原局在においても至適結果
を達成しうる。

本発明方法では組織試料の予備処理は通常不必要である
が、それにも拘らずこの技法の感度をさらに増大させる
ためには、ガえばＨｅＳｅｎｍｎｎ氏による予備処）Ｅ
ｌ　（「Ｊ、０１１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、　Ｊ第３２巻ｊ
１９７１〜９７８頁（１９７９年）〕が内因性過酸化酵
素および／ｌたは組織の鉄から生じうるわずがな妨害を
除去すゐのに時として有用でｈシうる。

本発明方法は広いａｉ＊ｏａｉ、ｓｉ生成物、特にその
多くが所定のｌｌｉ！ｊＫ特異的でｓｂそしていぐつか
は病因ですらある広範囲の４１１［織の同定を可能なら
しめる。これら細胞生成物および（Ｉｌｌ織は例えば本
明細書において前記しえものであｐうる。

本発明はまえ前記β−Ｄ−ガラクトシダーゼ免疫組織化
学的方法をｌＩ現する丸めの試薬をも提供するものであ
る。

試娯は１）または２）のいずれでもよい。

１）必須成分として ＆）同定される予定の抗原に対して特異的な抗体、 ｂ）β−Ｄ−ガ２クトシダーゼまたはβ−Ｄ−ガ２クト
シダーゼ共役物、および Ｃ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対して特異的でめ）且
つβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの作用により不溶性で且つ
着色した生成物を、生じうる色原体基質 を包含する％異的な試薬、ま九は ２）必須成分として ａ″’）／−Ｄ−ガンクトシダーゼ共役抗抗体および Ｖ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼに対して特異的であり且
つβ−Ｄ−ガラクトシダーゼの作用によｐ不溶性で且つ
着色した生成物を生じうる色原体基質 を包含する試薬。

明らかに前記１）項に記載し九種類の試薬は抗原上れ自
体に対して特異的な抗体成分ａ）によって職別されうる
その特定の抗原の決定にとってのみ有用である。

これと反対に、前記２）項に記載した種類の賦桑は任意
の抗原の決定に適する。

事実、成分ａ″）におけるβ−Ｄ−ガンクト７ダーゼと
共役した抵抗体は、同定される予定の任意の抗原に対す
る任意の抗体が成分、′）の抵抗体が「アンチ（抗）」
である梳において発現されるという条件で、同定される
予定の任意の抗原に対する任意の抗体を区別なく識別し
うる。

従って成分ａ′）の抵抗体は「ｆ１１Ｉ％＾的」すなわ
ち同定される予定の抗原に対する抗体が発現された種に
対して特異的である。

従って例えば抗ウサギ（すなわちウテギ掘に対して「抗
」）である抵抗体ねウサギに発現された任意の抗体を職
別し得よう、抗ヤギ筐九は抗羊である抵抗体はヤギま九
は羊において発ｉＡｌされた任意の抗体をそれぞれ識別
し得よう、そして同様に、抗マクスである抵抗体はマウ
スにおいて発現された任意の抗体全識別し得よう。

恢って４弛明ＯＮえば成分ａｌ　）としてβ−ｎ−ガラ
クトシダーゼ共役抗ウサギ抗血清を含有するクサギ％異
的な試薬、成分ａ′）としてｐ−Ｄ−カラクトシダーセ
共役抗ヤキ（または抗羊）抗血清を含有するヤギ％異的
（また―羊％異的）賦粂、および成分、／）としてβ−
Ｄ−ガ２クトシダ′−セ共役抗マウス抗血清を含有する
！ウス特異的ＩＫ条のような「権特異性」に関する限多
相互に相違する創記種拳２）の種々の試薬を提供するも
のである。

前記した極意の試薬２）のそれぞれは適尚な種において
紳起された抗原に対する抗体が使用されるならは任意の
抗原の同定に使用されうる。

この撞Ｖｉ内えはウサギ％異的試薬に対するウサギ、ヤ
ギ％集的試薬に対するヤギ、羊％異的試亀に対する羊お
よびマウス特異的試薬に対するマウスであろう。

しかしながら、いずれの場合も、証明されるべき抗原に
対して特異的な抗体は、それが九とえ前記わの試薬中に
包含されないとしても、その抗原を検出しうる九めに常
に使用されねばならないことは明白である。

所望ならば、同定される予定の抗原に対して特異的な抗
体または同定される予定の一連の抗原に対して特異的な
一連の抗体は試薬２）と−緒に別々に供給されつる。

前記試薬１）および２）のそれぞれはガえばアゾカップ
リング剤、酸化剤または電子移動剤および緩衝液のよう
な多数の他の成分を付加的に包含しうる。

各試薬の種々の成分は一緒にかまたは別々にして、その
試薬を容易にそしで速かに使用せしめる任意の慣用の方
法で包装されつる。

各試薬において種々の成分の特徴は本発明方法を記述す
るに当って先に記載し丸ものであり、好ましい成分も同
じく前記説明において好ましいものとして記載され喪も
のである。

従って、例えば好ましい特徴においては、前記０項に示
される試薬は、必須成分としてａ）同定される予定の抗
原に対して％異的な抗体、 ｂ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ共役物、およびＣ）色原
体基質としてのインドリル−β−Ｄ−ガラクトシド からなる。

好ましい特徴においては前記２）項記載の試薬は必須成
分として ｄ）β−Ｄ−ガラクトシダーゼ共役種％輿的抗抗体およ
び ν）色原体基質としてのインドリルβ−クーガラクトシ
ド からなる。

前記の試薬１）の好ましい特徴においては、特異的なβ
−Ｄ−ガラクトシダーゼ共役物は好ましくはβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ共役抗抗体またはβ−Ｄ−ガツクトシダ
ーゼ共役ビオチン−アビジン系である。

前記試薬２）の好ましい特徴においてはβ−Ｄ−ガ２ク
トシメーゼ共役種籍異的抗抗体は好ましくはβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ共役抗ウサギ抗体、１７ｔ＃ｉ／−Ｄ−
ガラクトシダーゼ共役抗ヤギま走は抗羊抗体、または、
／−ｎ−ガラクトシダーゼ共役抗マウス抗体である。

前記試薬１）および２）の好ましい特徴においては、イ
ンドリルβ−０−ガラクトシド色原体基質ね、好ましく
は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−
ガ２クトシドである。

以下の例により本発明を説明するが本発明はそれらに限
定されるものではない。

例　　１ ヒト膵臓中のヒトインシュリンを下記操作によｐ同定し
た。

１〇−燐酸塩緩衝され九ホルマリン中に固定されそして
パラフィン中に常法によｐ紺埋され九ヒト膵臓組織を使
用した。

パラフィン切片をｐＨ７，２の燐酸塩緩衝され九★塩水
（以下「ｐＢｓＪと略記する）中に入れそして７．５　
％　）（２０２で５分間そして終りＫ　［１０２％　Ｎ
ａＩＩ（４で２分関処場した（［、ｒ、ｏｌｌｎ、ｐａ
ｔｈｏｘ、　Ｊ　第３２巻第９７１〜９７８頁（１９７
９年）］。ＰＢＳ中にて数回洗ったのち、切片をＰＢＳ
で１０００倍に希釈したウサギ抗インシュリン抗血清と
４℃で一夜培養した。

ＰＢＳ中で洗った後、ロバに由来しそして「ＦＭ３８Ｌ
＠ｔｔｅｒａＪ　Ｍ　９５巻第３１１頁（１９７８年）
記載の操作によシ大腸謔から′４＃られた／−Ｊ）−ガ
ラクトシダーゼに共役され、１ｓ正常豚血清を含有する
ＰＢ８中に３０倍に希釈された抗ウサギ免疫グロブリン
抗体を切片に加えた。室温で６０分値組織をＰＢ１３で
洗いセして下記物質ｆ：ｐＨ７，２の層中に溶解して得
られた溶液を用いて＃本活性を呈示した。

塩化マグネシウム　　　　　　　Ｌ１ｍＭ／Ｊヘキナク
アノ鉄＠酸カリウム　　　　　　　五〇鳳Ｍ／ｊヘキサ
シアノ鉄（ｉｆ）酸カリウム　　　　　　五ＯｍＭ／ｊ
この呈示溶液での処理は３７℃で１時間培養することに
より遂行され九、洗浄後、核をニュートラルレッドで逆
染色しそして切片を脱水しそしてニーキット（ｍｕｈｔ
ｔｔ”）中に据えた。この組織を倍率２００で光学顯黴
鏡により検査し友。

陽性反応は強く實色Ｋｍわれ九、背景が染色されてない
ので陽性染色は弗常に明瞭でありそして執は赤色Ｋ１１
ｌわれた。この結果を同じ抗インシエリン抗血清で処理
しそして次に過酸化−素ＰＡＰ操作（［Ｊ、Ｈｌｇｔｏ
ｃｈｅｍ、＆　Ｏｙｔｏｏｈｅｍ、　Ｊ　［１１８巻第
３１５頁（１９７０年）〕Ｋ従って処理した同じ組織で
得られたそれと比較し友、過酸化酵素法で得られ九結朱
は強い褐色をし九陽性反応で６つえ、しかしながら陽性
染色は背景がわずかに褐色に染まっているのでβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ法で得られえそれよプ明瞭さおよび明
白さが劣った。従ってβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ法はＰ
Ａ濾過酸化酵素法を用いて得られたそれよルはるかに良
好な色の証拠が祷られた。

例　　２ 例１記載の操作を用いるがしかし抗インシュリン抗血清
の代ｐに、すべてクテギで饅起されヒト乳房組織中のヒ
トカゼイン、 ヒト肝臓中の肝炎Ｂｆｉｌｌ抗原（ＨＢｓＡｇ）、ヒト
小腸中のヒトリゾチーム、 ヒト骨格筋中のヒトミオグロビン、およびζト膵臓中の
ヒトグルカゴン。

内１において得られ九ぞれと同様の結果が得らｔ′Ｌ丸
。

例　　３ 骨格筋中のヒトミオグロビンを以下の操作によプ同定し
た。１〇−燐酸塩ａｉｍされたホルマリン中に固定され
そしてフッフィン中に所定の方法で封埋されたヒト骨格
筋組織を用い丸、ノソラフイン切片をＰＢ１３に入れそ
してＦＢＳで５００倍に希釈し九りｔギ抗建オグロビン
抗血清（ｍｈ−’ｒｔｎｇｗ＠ｒｍ・社製品）と共に４
℃で一夜培養した。

ＰＢｉｉ中で洗ったのち例１記載の操作を行いぞして同
じ皺の！！米が得られた。

同様の操作および適当な抗血清を用いることにより下記
抗原が同定された。

ヒト膵臓中のヒトインクュリン。

ヒト乳房組織中のヒトカセイ／。

ヒト肝臓中の゛肝炎Ｂ表面抗［（ＨＢ−ムｇ）、ヒト小
腸中のヒトリゾチーム、 ヒト膵臓中のヒトグルカゴン。

例　　４ ヒト肝臓中の肝炎Ｂ表面抗原（ＨＢ−ムｇ）を以下のよ
うにして同定した１例１記載のようにして固定されそし
て封埋されたヒト肝臓組織を使用し九６例１記載の操作
に従うが、抗インシュリン抗血清に代えてＰＢｉｉで５
００倍に希釈し九つｆ　キ抗ＨＢ−ムｇ（ベーリングウ
エルケ社製品）抗血清を使用した。さらに例１で用いら
れ九かへキサシアノ鉄（１）酸カリウムおよびヘキテシ
アノ鉄（２）酸カリウム試薬を含有しない呈示ＦＢ＆　
８減が用いられえ、この操作によ）例１で得られたと同
じ製の結果が得られ友、同様に操作するが逼ｉな抗血清
を使用することによ如下記抗原が同定され九。

ヒト膵臓中のヒトインシエリン、 ヒト乳房組織中のヒトカゼイン、 ヒト小腸中のヒトリゾチーム、 ヒト骨格筋中のヒトミオグロビン、 ヒト膵臓中のヒトグルカゴン。

５ ヒト小腸中のヒトリゾチームを以下の操作によル同定し
九０例１記載のようにして固定されそしてｊｗ壊され九
ヒト小腸組織を用い喪０例１記載の操作に従うが、抗イ
ンシュリン抗血清に代えてＰＢ８で５００倍に希釈し九
つテギ抗リゾチーム（ＤＡＫＯ）抗血清を使用しそして
呈示溶液として、 塩化マグネシウム　　　　　　ｔ１威／ｌ沃化カリクム
　　　　　　１ｓ タングステン酸ナトリクム　　　　　　　　ａ００１５
ｓを含有するｐＨ７，２のＰＨ８Ｉｆ液を使用した。

例１で得られ九と同様の結果が得られ友。

同様に操作しそして適当な抗血清を使用することによプ
下配抗原が同定され虎。

ヒト膵臓中のヒトインシュリン、 ヒト乳房組織中のヒトカゼイン、　　／ヒト肝臓中の肝
炎１表面抗原（ＨＢ−ムｇ）、ヒト骨格筋中のとトξオ
グ口ビン、 ヒト膵臓中のヒトグルカゴン。

例　　６ ヒト乳房組織中のヒトカゼインを以下の操作によシ同定
した。ヒト乳房凍結組織を用い友。

低温状切片を調製し、そして例１における抗イ゛ンシュ
リン抗血清に代えてＰＨ８で１０００倍に希釈し九りテ
ギ抗カゼイン抗血清を使用してｆｉｌと同様に操作した
。

例１で得られたのと同様のＭＪ４が連成された。

凍結し九組織に対し同様に操作しそして適蟲な抗血清を
使用することにより下記抗原が同定された。

ヒト膵臓中のとトインシエリン、 ヒト肝臓中の肝炎１表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、ヒト小腸
中のヒトリゾチーム、 ヒト骨格筋中のヒ）（オダａビン、 ヒト膵臓中のヒトグルカゴン。

例　　７ ヒト肝臓組織中の肝炎Ｂｆｉｌｆｆｉ抗原（ＨｎｓＡｇ
）ｔ−１以下のようＫして同だした。

例１記載のようにして固定されそして麹雛され九ヒト肝
臓組織を使用し友。

ｚＲｙ　フィン切片をＰＨ７，２のＰＨ８中に入れた。

このスライドをＰＨ８で１５分間洗いそして次にクサギ
抗ＨＢ−ムｇ抗血清（ｐｕｓ中１：５００希釈）と３７
℃で２時間培養し九。

ＰＨ５中で１５分間洗ったのち、ロバから得られそして
［ＦＪＣＢ８　Ｌ＠ｔｔ＠ｒｓＪ第９５巻ｇ３１１頁（
１９７８年）Ｋ記載の操作に従い大腸麿からのβ−Ｄ−
ガラクトシダーゼ（ｔ５Ｘ１０−’μＭ）Ｋ共役され九
抗ウサギＦｃ断片免疫グロブリンを含有しそして正常ロ
バ血清１１ｓを含有するＰＨ８溶液（５０声ｌ）をこの
切片に加えた。

′１１１ｉｊＡで３０分後この切片をＰＨ８で１５分間
洗い、次に 塩化マグネシウム　　　　　　α９ｘｈＭ／１沃　化　
　す　　ト　　リ　　り　　ム　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１ｇ４タングステン酸ナトリウム　　　
　　　　［１００１５％をｐＨ７，２のＰＨ５中に嬉屏
して得られた呈示齢液茫これに通用し友。

室赫で３０分間培養しそしてＰＢｉＪで洗ったのち、核
をニュートラルレッドで逆染色しそして切片を脱水しそ
してニーキット申に姻えた。

組織を光学顕微−（Ｌｅｉｔｉｉ　０ｒｔｈｏｐｌａｎ
）によｐ倍＄２００倍で検査した。陽性反応Ｖｉ彊い青
色に出た。背景が染色されていないので陽性染色は非常
に明瞭でそして仮は赤色に視われ九、その結果を、同じ
組ｍｔ−同じ抗）ｉＢｓムｇ抗血渭で処理しそして次に
スターンバーガー氏（例１記叡の文献参照）による過酸
化＃嵩ＰＡＰ　ｉ作Ｋ［い処理して得られた結果と比較
した。

例１で得られ九と同様の結果が一察された。

例７と同じ操作を行うがｕｏｏｉｂ＊タングステン酸ナ
トリウムの代ｐにα００１５％テトラ硼酸ナトリウム１
７１；ｉ［１００７５％モリブデン酸ナトリウムをそれ
ぞれ含有する呈示溶液を用い丸。

これらの場合においても例１に記載されたと同様の結果
がｍ祭され九。

告　８ ５０個のヒト肝臓組織切片上の肝炎３表面抗原（ａＢｓ
Ａｇ）を組織化学的に同定するための試薬を＃＃した。

この試薬は ＆）　　ＰＢＢ中（Ｄつ？ギ抗ＨＢｓＡｇ抗血清（７）
５００倍希釈溶液２，５−１ １））　　ＰＨ１中の大腸−β−Ｄ−ガラクト７ダーゼ
共役抗ウサギＦｃ断片免疫グロブリンの１００倍希釈溶
液２．５ｄ、および Ｃ）下記の組成すなわち ５−　Ｂｒ　−４−ＣＩ　−３−イン　　　　　　α４
４９／１ドリル−β−Ｄ−ガラクトシド 塩化マグネシウム　　　　　　　［Ｌ９ｍＭ／）沃化ナ
トリウム　　　　　１ｓ タングステン酸ナトリウム　　　　　　　　ｕｏｏｉｓ
ｓを１１′ｔろ水溶液２．５ｍｌを生ずるようＫＭ曽水
申に使用前に溶解させる丸めの凍結乾燥された成分から
なる。

試薬の成分ａ）、ｂ）およびＣ）は９１７記載の操作に
従い使用され虎。

［１００１５１１タングステン酸ナトリウムの代〕に［
ＬＯＣＮ５１１テトラ硼酸ナトリウムまたはＣＬＯＯ７
５１１１モリプデ／酸ナトリウムをそれぞれ含有する凍
結乾燥され皮成分Ｃ）を用いる以外は前記と同じ成分を
用いて同様の試薬が調製された。テトラ硼酸ナトリウム
をよびモリプデｙａナトリウムのａｆｓはなお水滴液２
．５ｍに関する。

前記試薬もｅ１７記載の操作に従いヒト肝誰組　　　１
織中のＨ胸Ａｇ抗原の同定に使用された。

例　　９ ５０種のヒト組織切片上の任意の種類の抗原を組織化学
的Ｊ１こ夷征するのに有用なウサヤ特異的試薬を調製し
た。この試薬は ａ’）　　ＰＨ１３中の大Ｉｊｈｔｊｉβ−Ｄ−ガ’）
クトｖｌ’−セ共役抗つサギ１０断片免疫グロブリンの
１００倍希釈溶液２，５ｄおよび ｂ″）下記の組成 ５−　Ｂｒ　−４−ＣＩ　−３−イン　　　　　　α４
０／１ドリル−β−Ｄ−ガラクトシド 塩化マグネシウム　　　　　　ＣＪ、９ｍＭ／１沃　化
　す　　ト　　リ　　ウ　　ム　　　　　　　　　　　
　　　　　１　ｓタングステン酸ナトリウム　　　　　
　　　ｕｏｏｉｓｓを有する水溶液２．５　ＷＬｌを生
ずるように蒸留水中に使用前に溶解させるための凍結乾
燥された成分 からなる。

試薬の成分ａｌ）およびｂ’）は ヒト膵臓中のヒトインシュリン、 ヒト乳房山のヒトカゼイン、 ヒト肝臓中の肝炎３表面抗原（ＨＢ−ムｇ）、ヒト小腸
中のヒトリゾチーム、 ヒト骨格筋中のヒト安オグロビンおよびヒト膵臓中のヒ
トグルカゴン の同定ＫＮ１および７記載と同様の操作に従って使用さ
れ、込ずれの場合においてもつｔギにおいて生起され九
抗血清、すなわちそれぞれウサギで生起された抗インシ
ュリン抗血清、ウサギで生起され九抗カゼイン抗血清、
ウサギで生起された抗ＨＢ―ムｇ、ウサギで生起され九
抗リゾチーム抗血清、ウサギで生起された抗ｉオグロビ
ン抗血清およびウサギで生起された抗ダルカゴン抗血清
が使用された。

前記と同じ組成物を用いるがしかしく１００１５−タン
グステン酸ナトリウムの代りにα００１５−テトラ硼酸
ナトリウムまたｔｊ［１ＬＯＯ７５’ｊ６モリプデン酸
ナトリウムをそれぞれ含有する凍結乾燥された化合物ｂ
’）を用いて同様のウサギ特異的試薬を調製した。テト
ラｌｌＡ酸ナトリウムおよびモリブデン酸ナトリウムの
濃度−はなお水溶液２．５ｄＫ関する。

前記試薬を、Ｎ１およびｆ１１７記載と同様の操作に従
いこの例において前記し九すべての抗原の同定に使用し
た。

例　　１０ 例９記載の試薬と同じ組成を有するが、β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ共役抗ウサつＦａＷＲ片免疫グロブリンの代
如にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ共役抗ヤギＦｃ断片免疫
グロブリンを含有する、５０１１のヒト組織切片上の抗
原を組織化学的に同定するためのヤギ４１４的試薬を調
製した。

β−Ｄ−ガラクトシダーゼ共役抗ウサつＦａ断片免疫グ
ロブリンの代Ｊ）Ｋβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ共役抗羊
Ｆｏ＃片免−疫グロブリンまたはＩ。

−Ｄ−ガンクトシダーゼ共役抗マウスｔｏ断片免疫グロ
ブリンをそれぞれ含有する同僚の試薬を調製し丸。

各試薬は、それぞれヤギｔたは羊筐九はマクスで生起さ
れ九抗ンオメロビン抗血清および抗ＨＢ−ムｇ抗血清を
それぞれ使用する以外Ｆｉ例１および例７の記載と同様
の操作に従いヒト骨格筋中のヒトイオグロビンおよびヒ
ト肝臓組織中の肝炎］ｌｌ１ｒＩＥ抗原（ＨＢ−ムｇ）
の同定に使用され九。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）β−Ｄ−ガフクトシダーゼがトレーサーととして使
   用されることを特徴とする組織中の抗原を同定するため
   の免疫酵素細胞化学的方法。 ２）組織中の抗原の同定がβ−Ｄ−ガ２クトシダーゼト
   レーサーを特定の色原体基質に作用させることＫよシ得
   られる不溶性且つ着色し九生成物の形成によ）ｉ１成さ
   れ、そしてβ−Ｄ−ガンクトシダーゼトレーサーが同定
   される予定の抗原に特異的な結合剤によシ結合されるこ
   とからなる前記特許請求の範囲第１貴記載の免疫酵素細
   胞化学的方法。 ３）β−Ｄ−ガラクトシダーゼが微生物性β−Ｄ−ガラ
   クトシダーゼである前記％１ＰＦ−績求の範８第２項記
   載の免疫酵素細胞化学的方法。 ４）　　Ｉｍｍ生物性−Ｄ−ガラクトシダーゼが大腸−
   から得られるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼである前記特許
   請求の範８第３項記載の免疫酵素細胞化学的方法。 ５）同定される予定の抗原にβ−Ｄ−ガククトシダーゼ
   を結合させる特異的な結合剤が抗原それ自身に対して！
   異的な抗体からなる前記％＃！ＦＩＩ求の範８第２項記
   載の免疫酵素細胞化学的方法。 ６）同定される予定の抗原にβ−Ｄ−ガツクトシダーゼ
   を結合させる％異的な結合剤が抗原それ自体に対して特
   異的な抗体およびβ−り一ガツクトシダーゼ共役物を生
   じうる共役系からなる前記特許請求の範凹第２項記載の
   免疫酵素細胞化学的方法。 ７）β−Ｄ−ガ２クトシダーセ共役物がβ−Ｄ−ガラク
   トシダーゼ共役抗抗俸（ａｎｔｉ−ａｎｔｉｂｏｄｙ）
   である創記特ｆｆｆｉｌ求の範囲第６項記載の免疫ｉ１
   １嵩ＩＩＡｊｌｉ化学的方法。 ８）β−Ｄ−ガ２クトシダーゼ共役物がβ−Ｄ−ガラク
   トシダーゼ共役ビオチン−アビジン系である前記特許請
   求の範囲第６項記載の免疫＃単細胞化学的方法。 ９）物足の色原体基質がβ−Ｄ−がラクトシト−導体で
   ある前記％昨請求の範囲第２項記載の免疫帥素１ＩｉＵ
   胞化学的方法。 １０）β−Ｄ−ガラクトシド誘導体がインドリルβ−ク
   ーガラクトシド鰺導体である前記特許請求の範囲第９項
   記載の方法。 １１）インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド＃導体が５−
   ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガ２ク
   トシドである前記％軒蹟求の範囲第１０項記載の方法。 １２）β−Ｄ−ガ２クトシド向導体がナフチル−β−Ｄ
   −ガラクトシドである前記待＃Ｔ−請求の範囲第９ＪＪ
   記載の方法。 １３）す７チルーβ−Ｄ−ガラクトシドが６−ブロモー
   ２−ナフチル−β−Ｄ−ガラクトシドである前記特許請
   求の範Ｓ第１２ｇ４記載の方法。 １４）インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド＃導体が色原
   体基質として使用されそしてアゾカップリング剤が場合
   によル存在してもよいことを特徴とする前記％＃！Ｆ請
   求の範囲第２項記載の方法。 １５）す７チルーβ−Ｄ−ガラクトシド鱒導体が色原体
   基質として使用されそしてアゾカップリング剤が付カロ
   的反応体として存在することを特徴とする前記特許ｉｂ
   ｌ求の範囲第２項記載の方法。 １６）インドリル−β−Ｄ−ガンクトシドまたはナフチ
   ル−β−Ｄ−ガラクトシド鱒導体が色原体基質として使
   用されそしてアゾカップリング剤が存在することからな
   る前記％杵請求の範囲第２項記載の方法においてアゾカ
   ップリング剤がヘキサアゾ化ｐ−ローザニリン、ファス
   トブルーＶＢ、７アストブルーＢＢ、　７アストプルー
   ＲＲおよびファストガーネットＧＢＯからなる群から選
   ばれることを特徴とする方法。 １７）インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド誘導体が色原
   体基質として使用されそして酸化剤または電子移動剤が
   場合によ如存在してもよいことを特徴とする特許 記載の方法。 １８）　　ａｍ化剤または電子移動剤が７エナジ／メト
   スルヘートまたはテトラゾリウム塩である前記４１’Ｆ
   ｉｌＸｏ範囲＃！１７項記幀の方法。 １９）酸化剤または電子移動剤がレドックスイオン対で
   ある前記特＃’ＦｌｌｌＩ累の範囲−１８積記幀の方法
   。 ２０）レドックスイオン対がハ２”７ＩＩ＠”＋イオン
   ま九は０●２◆／０●４＋イオンからなる前記％ｆｆｉ
   Ｉ１１求の範ｍ第１９項記載の方法。 ２１）レドックスイオン対がＸ−／ＶＯｌ−、Ｉ　−／
   ＶＯ　５−、Ｘ−／ＷＯ＊−、Ｘ−７ＭＯ”−、！ー／
   Ｍｏ，Ｏｌ，；、および４ Ｉ″’／Ｂ４０７トからなる群から選ばれる前記％軒請
   求の範囲第１９項記載の方法。 ２２）　　β一Ｄ−ガラクトシ〆−ゼがトレーｔ−とし
   て使用されることを特徴とする組織中の抗原を同定する
   丸めの免疫酵素細胞化学的方法を実現するＫあ九シ、必
   須成分として、１）同定される予定の抗原に対して特異
   的な抗体。 ｂ）β一Ｄ−ガツクトシ〆−ゼを九はβ一Ｄ−ガラクト
   シダーゼ共役物、およびＣ）β−Ｄ−ガフクトシダーゼ
   に％異的でそして／−Ｄ−ガラクトシダーゼの作用によ
   如不溶性且つ着色し喪生成物を生じうる色原、体基質か
   らなる試薬。 ２３）β−Ｄ−ガラクトシダーゼが大腸菌から得られる
   β−Ｄ−ガツクトシダーゼである前記特許請求の範囲第
   ２２項記載の試楽。 ２４）β−Ｄ−ガ２クトシダーゼ共役物がβ−Ｄ−ガツ
   クトシダーゼ共役抗抗体またはβ−Ｄ−ガラクトシダー
   ゼ共役ビオチンーアビジ／系である前記％ｒ’ｒｇ＊求
   の範囲第２２項記載の試薬。