JPS5817595B2 - 微生物電極によるｌ−アミノ酸の定量法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は微生物電極を用いるアミノ酸の定量法に関し、
更に詳しくは、定量せんとするアミノ酸に対して脱アミ
ノ酸素活性を有する微生物菌体および硝化細菌の活性菌
体を溶存酸素電極面に固定化した微生物電極を用いるア
ミノ酸の定量法に関する３Ｌ−アミノ酸の定量法として
は、従来からかぼちや、エシェリヒア・コリ、またはク
ロストリジウム・ウェルシュ由来のし一グルタミン酸脱
炭酸酵素（Ｌ−ｇｌ ｕｔａｍａｔｅ ｄｅｃａｒｂｏ
ｘｙｌａｓｅ）あるいは、エシェリヒア・コリまたはバ
クテリウム・キャダベリス由来のＬ−ＩＪレジン炭酸酵
素（Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅｄｅｃａｒｂｏｘｙｌ ａｓｅ）
を用いて、次の式（Ｉ）の反応：Ｌ−アミノ酸脱炭酸酵
素 Ｌ−アミノ酸 該当するアミン＋ＣＯ３
によって発生する炭酸ガスの量を、マノメトリーで測定
するワールブルグ検圧法、あるいは発生する炭酸ガスを
比色定量するオートアナライザ法が知られている。

これらは、正確ですぐれた方法であるが、酵素の連続的
使用が困難なため、高価な酵素を測定のたびに新たに使
用しなければならず、経済的でなく、又、オートアナラ
イザー法の場合には装置が複雑で、高価な上、酵素の調
整が必要である。

ここで酵素を固定化して連続的に使用する方法も考えら
れるが、実用化されるに至っていないのが現状である。

以上の問題点をふまえて、本発明者らは簡便で正確なア
ミノ酸の定量法について研究した結果、定量せんとする
アミノ酸の脱アミノ酵素活性を有する微生物菌体および
アンモニアを唯一の栄養源として資化し酸化するニトロ
ソモナス（Ｎｉ ｔｒｏｓｏ−ｍｏｎａｓ）属（および
Ｎ１ｔｒｏｂａｃｔｏｒ属）に属する硝化細菌の活性菌
体を溶存酸素電極の隔膜近傍に固定化した微生物電極を
被験液に接触することによって生ずる微生物電極の出力
電流の減少値又は電流の減少速度を測定することによっ
て目的のアミノ酸を迅速かつ精度よく定量しうること発
見し、本発明を完成するに至った。

本発明の方法の測定原理は次の通りである。

微生物菌体の酵素による反応によって目的のアミノ酸か
らアンモニアを生成せしめ、ついでこの生成したアンモ
ニアは硝化細菌によって資化され、次式のように亜硝酸
または硝酸に酸化される。

Ｎｉ ｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ属硝化細菌 ２ＮＨ３＋３０２ ２ＨＮ０２＋２Ｈ２Ｏ
Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ属硝化細菌 ２ＨＮ０２＋０□ ２ＨＮ０３その際酸
素が消費され、このため微生物電極の膜内溶存酸素が減
少し溶存酸素電極の出力電流が減少する。

この出力電流の減少値は被験液中の目的のアミノ酸濃度
に比例するので、そのアミノ酸を定量することができる
。

この場合、目的のアミノ酸のみに作用する脱アミノ酸素
活性を有する微生物を用いることによって、その他のア
ミノ酸にはほとんど応答しない選択性の良い微生物電極
を得ることが可能である。

また、アミノ酸の脱アミノ酵素活性を有する微生物がグ
ルコースなどの有機物質を資化して酸素を消費する場合
は、有機物質にも応答を生じる。

このような不都合は、微生物菌体を有機溶剤または／お
よび界面活性剤で処理することによって呼吸作用を止め
ることができる。

なお、この有機溶剤または／および界面活性剤処理は微
生物茎体へのアミノ酸の拡散を容易にして脱アミン反応
を起きやすくする効果も与える。

一方、微生物膜が一般の有機物質を資化する細菌類に汚
染されると、有機物質に応答するようになる。

これを防止するには、被検液中に抗生物質、また制菌作
用のあるクロランフェニコール等の薬剤を加えて汚染菌
の生育を押えることができる。

本発明に使用する微生物は、脱アミン酵素活性の強い微
生物、たとえばＬ−フェニルアラニンを定量する場合に
はロドトルラ・グラシリス（Ｒｏｄｏ−ｔｏｒｕｌａ
ｇｒａｃｉｌｉｓ） ＩＦＯＯ３８９、Ｌ−アルギニン
を定量する場合にはストレプトコッカス・フェカリス（
Ｓ ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）
ＡＴＣＣ９７９０またはシュードモナス・プティダ（Ｐ
３ｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｉｄａ）ＡＴＣＣ４３５９
，Ｌ−アスパラギン酸を定量する場合にはニジエリシャ
・コリ（Ｅ ５ｃｈｅｒ １ｃｈｉａｃｏｌｉ）ＡＴＣ
Ｃ１１３０３またはバクテリウム・キャダベリス（Ｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｄａｖｅｒｉｓ）ＡＴＣＣ９７６
０゜Ｌ−ヒスチジンを定量する場合にはアクロモバクタ
−°リフイブイウム（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｏｒ Ｉ
ｉｑｕｉｄｉｕｍ）ＩＡＭ １６６７などをそれぞれ用
いられる。

これらの活性菌体の調整は、それぞれの菌株に応じた通
常の栄養培地で培養し、純水で２〜３回洗滌した後、そ
のままつかえるが、場合によっては次のような処理を行
うこともできる。

例えばアセトン、エタノール、メタノール、イソプ０／
々ノール、ｎ−プロパツール、トルエン、エーテル等（
７）有機溶媒および／またはセチルトリメチルアンモニ
ウム・フ０ロマイド（Ｃｅｔｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａ
ｍｍｏｎｉｕｍｂｒｏｍｉｄｅ例えば「Ｌｉｓｓｏｌａ
ｍｉｎｅ ＡＪ （ＩＣＩ商標））、セチルピリジニウ
ム・ブロマイド（Ｃｅｔｙｌｐｙｔｒｉｄｉｎｉｕｍｂ
ｒｏｍｉｄｅ）例えば［Ｆｉｘａｎｏｌ ＣＪ （ＩＣ
Ｉ商標商標上チルピリジニウム・クロライド（Ｃｅｔｙ
ｌｐｙｒｉｄｉ−ｎｉｕｍ ｃｈ ｌｏｒ １ｄｅ）等
の陽イオン界面活性剤、ナトリウム−高級アルコール・
サルフォート、例えば「シルビット５Ｐｊ（一方社油脂
工業ＫＫ商標）等の陰イオン界面活性剤、ポリオキシエ
チレン・アルキル°エーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｅｔｈｙ
ｌｅｎｅ−ａｌｋｙｌ・ｅｔｈｅｒ）例えば「サンモリ
ン１１」（三洋油脂工業ＫＫ商標）、ポリオキシエチレ
ン・アルキル・フェノール・エーテル（ｐｏｌｙｏｘｙ
ｅｔｈｙｌｅｎｅ°ａ］ｋｙｌ°ｐｈｅｎｏｌ ”’
ｅｔｈｅｒ）例えば「スコアロール」（花王石鹸ＫＫ商
標）等の非イオン界面活性剤ならびに、例えばアルキル
・ベタイン（ａｌｋｙｌ ｂｅｔａｉｎｅ）等の両性界
面活性剤等の浸透性の強い界面活性剤でＬ−アミノ酸脱
炭酸酵素活性を阻害しない界面活性剤を用いｉて浸漬処
理した後、低温にて乾燥粉末とする。

一方、脱アミノ酸反応によって生成したアンモニアを資
化して酸素を消費する微生物として、たトエハニトロソ
モナス・ヨーロパエ（Ｎｉｔｒｏｓｏ−ｍｏｎａｓ ｅ
ｕｒｏｐａｅａ） ＡＴＣＣ１９７１８、ニトロバクタ
ノー・アギリス（Ｎｉｔｒｏｂａｃｔｏｒ ａｇｉｌｉ
ｓ）ＡＴＣＣ１４１２３等がある。

これらは硫安およびりん酸などの栄養塩を含む培地で培
養したものを使用する。

本発明に使用される酸素電極は、ポーラ口型またはガル
バニック型のいずれでも良く、一般的に５市販されてい
るものを使用することができる。

本発明で用いる微生物電極の１例を第１図に示す。

第１図はガルバニック・タイプの酸素電極を用いた微生
物電極の正面断面図である。

定量しようとするアミノ酸の脱アミノ酵素活性フを有す
る微生物および硝化細菌を上述の方法でそれぞれ培養し
て集菌して得た菌体ペーストを十分に混合し薄層として
要すればこれをナイロン網で支持し、これを後述する微
細孔を有する薄膜で固定し輪ゴム等で固定することによ
って第１図の微５生物電極１１が得られる。

図中１は微生物の菌体層、２はこれを掩い、支持する支
持体、例えばナイロン網、３は多孔質膜、透析膜、また
はガス透過膜等の微細孔を有する薄膜、４は酸素電極の
隔膜、５は白金カソード、６はアルミニウム・アノ０−
ド、７は塩化カリウム電解液、３及び８′は固定のため
の輪ゴムである。

ここに微生物の菌体層１を掩い支持する微細孔を有する
薄膜としては、本発明で用いる微生物の菌体を通過せず
、アミノ酸、酸素等を自由に通過させる薄膜であれば伺
でも良く、例えばミ’）ボアフィルター等の多孔性膜、
例えば、セロファン、動物性半透膜等の透析膜、例えば
、テフロン膜、シリコーン膜等のガス透過膜等の上記の
条件を満足するものであればすべて使用することができ
る。

第１図中の１の微生物層の代りに固定化微生物膜を用い
てもよく、微生物をコラーゲンまたはポリアクリル・ア
ミドゲル等で通常の酵素の包括固定化法に準じて固定化
して固定化微生物膜をつくりこれを適当な大きさに切断
して封入する等、適当な方法で電極に取りつけて用いる
こともできる。

活性微生物菌体を用いても、固定化微生物膜を用いても
活性や機能は殆んど変らないので、特に固定化微生物膜
を用いて行なう必要はない。

本発明の微生物電極を用いて特定のアミノ酸を定量する
には、微生物電極１１をこのアミノ酸を含有する被検液
に浸漬、接触せしめると被検液のアミノ酸その他の成分
および酸素が微細孔を有する多孔質膜３を透して微生物
層１に拡散してくる。

これらの成分のうち目的のアミノ酸のみが脱ア。

ミノされてアンモニアが発生し、このアンモニアは硝化
細菌によって酸化されて酸素が消費される。

その結果、酸素電極隔膜４に近い部分の溶存酸素が減少
し、その結果、該微生物電極の出力電流が減少する。

微生物のアミノ酸の脱アミン能力およ。ひ生成したアン
モニアの酸化能力が多孔質膜３を通してのアミノ酸拡散
量に比べて十分大きく、すなわち拡散律速条件のときは
、微生物電極の出力電流の減少値あるいはその減少速度
と、微生物電極に接触する被検液のアミノ酸濃度との間
には比。

例関係が成立する。

従って、出力電流の減少量又は減少速度を測定すること
により、被検液中のアミノ酸濃度を求めることが出来る
。

このような比例関係を得るためには微生物量を十分に塗
布すると共に、その活性を保持するために被検液のｐＨ
。

を７〜９に保持することが望ましく、例えば炭酸ソーダ
およびりん酸第−カリウムをそれぞれ０．Ｏ５Ｍｏ ｌ
／１３程度添加すればよい。

本発明のアミノ酸測定を連続操作として実施するには、
例えば第２図のシステム組立図に示すような装置を用い
ればよい。

図中１１は本発明の微生物電極、１２はゴムバッキング
、１３はフローセル（内容積２〜１０ｍ１）、１４はマ
グネチック・スターラー、１５は攪拌器、１６はレコー
ダー、１７は空気流入口、１８は緩衝液（キャリヤー液
）注入口、１９はサンプル注入口をそれぞれ示す。

第２図によって本発明の方法を連続的に行なう場合を説
明する。

まず、酸素で飽和した緩衝液（キャリヤー液）１８をポ
ンプで測定セル（フローセル）１３内を通して置き、被
検液をサンプラーで２〜１５分間ずつ、一定間隔（例え
ば１０〜３０分間）で注入口１９から注入すると、被検
液はキャリヤー液で適度に希釈され（アミノ酸濃度とし
て数＋ｍ９／ｌ）て、フローセル１３内に入り、微生物
電極１１と接触すると、被検液内のアミノ酸が微生物層
によって脱アミノされ、生成したアンモニアがさらに酸
化され、それに応じて酸素が消費され、酸素電極膜に近
い部分の溶存酸素濃度が減少し、酸素電極の出力電流が
減少し、レコーダー１６に記録される。

被検液のアミノ酸濃度と電流の減少値（記録紙上のピー
クの高さに相当）との関係を既知標準アミノ酸濃度液に
ついて求めて置けば、ピークの高さから被検液中のアミ
ノ酸濃度を簡単に求めることができる。

バッチ式でアミノ酸濃度を定量する場合には、微生物電
極を被検液に浸漬、接触させ、−・定時間例えば１〜１
０分間の範囲内の一定時間における出力電流の減少量を
求めるか、あるいは測定中に被検液に通気することによ
って被検液の溶存酸素濃度を一定に保つと、定量時間が
長くなると出力電流値は一定になり平衡状態に達する。

この平衡時の出力電流値または出力電流の減少速度を求
めると、これらの値は被検液中のアミノ酸濃度に比例す
るので、その濃度を求めることができる。

定量の場合の条件は、使用する微生物の菌種は応じて活
性の強い範囲の条件で行なうことが望ましく、通常温度
は２５〜３５℃で、ｐＨは７〜９の範囲が好ましい。

微生物電極と被検液の接触時間は微生物の反応が早いた
め２〜１５分間で十分である。

このように被検液と微生物電極との接触時間が短かいこ
とは定量時間を短縮できるのみならず、微生物電極の汚
染程度も少なくて済むので本装置の長期間の使用を可能
ならしめる。

なお、微生物層には、アミノ酸の脱アミン活性のみを有
する菌および硝化細菌以外に、有機化合物を資化、酸化
する微生物が、わずかに混入し、それらが次第に増殖し
ていくにつれて、被検液中に含まれる有機化合物にも僅
かに応答することになるが、先に述べたようにバッファ
液に制菌剤あるいは抗性物質を添加することによってこ
れを押えることができる。

また、本性では微生物膜の交換が容易であるので、有機
化合物に応答するようになった時は微生物膜を交換して
もよい。

以上に述べたように、本発明によるアミノ酸の定量法に
より他の有機物質の存在している食品などの中の特定の
アミノ酸の簡便、迅速に定量することができ、実用上極
めて有用である。

以下、実施例にて詳細に説明する。

実施例 Ｉ Ｌ−フェニルアラニン１０ｇ／１１グルコース１０ｇ／
ｌ、酵母エキス５ ｇ／ｌ！１麦芽エキス５ｇ／１３
、ＫＨ２Ｐｏ、 ２ｇ＃、に２ＨＰＯ４１ｇｎ。

Ｍｇ５Ｏ，−７Ｈ２０１９／１１を含む培地４０ｍ１！
を５００ｍ１容のフラスコに移し０．５ＮＫＯＨでｐＨ
７に調整後１２０℃で１５分間殺菌した。

この培地にＲｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ（
ＩＦＯ０３８９）を接種して３０℃で３日間振とう培養
した後遠心分離して集菌した。

得られた菌体は生理食塩水で２回洗じょうしだ後、等重
量のアセトンを加えたのち真空デシケータ中で乾燥した
。

一方、容積５１の曝気槽に第１表の培地Ａを２．５１張
込み粉末炭酸カルシウム１５ｇを加えたのち、ＩＮの炭
酸ソーダでｐＨを８，０に調整しこれにＮｉｔｒｏｓｏ
ｍｏｎａｓ ｅｕｒｏｐａｅａ ＡＴＣＣ１９７］ ８
の培養液５００１１Ｌｌを接種し、散気管を挿入し、１
／３〜１／２■■で空気を吹込、表１の培地Ｂを２００
ｍＡ？／日で連続的に供給し、室温（２０〜３０℃）で
培養した。

なお、曝気槽中の培養液は常に２．５１ｉｔｒｅになる
ようオーバフローロを設けた。

３ケ月培養後、上記Ｎｉ ｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｅｕ
ｒｏｐａｅａの培養液５ｍｌに上記の方法によって調製
したＲｏｄｏ−ｉｏｒｕｌａ ｇｒａｃｉｌｉｓ の乾
燥菌体６０ｍ９を加えて十分混合したのちに径４７ｍｍ
のミリポアフィルタ−で濾過して、その表面に微生物を
付着させた。

この膜をガルバニック・タイプの酸素電極の隔膜上に微
生物層が内側に挾まれるように貼り、その上をナイロン
ネットで覆って輪ゴムで酸素電極本体に固定して微生物
電極を作製し、この微生物電極を用いて第２図に示す連
続測定システムを組立て以下の実験を行なった。

まず、キャリヤー液として０．０１Ｍ／ｌのほう酸ソー
ダと２０ｍＩ？＃のクロラムフェニコールの等景況合液
（ｐＨ９）を調製し、これに空気を吹込んで溶存酸素を
飽和させたのちに、フローセルに流量３．９ ｍｌ！／
ｍｉｎで連続的に供給し、別に空気を流量３．９ ｍ
ｌ／ｍｉｎで送り込んだ。

なお、このとき測定セルは保温ジャケット（第２図には
示されていない）内に設置し温度を３０℃に保った。

こうしておいて微生物電極の出力電流をレコーダーに記
録させ（ベースライン）その値が安定したのちにＬ−フ
ェニルアラニンを含む被検液を流量０．８ｍｌ／ｍｉｎ
でフローセルに送り微生物電極の出力電流の変化を記録
した。

出力電流が平衡に達したとき被検液の供給を中止し出力
電流が始めの値に回復するのを確認した。

このような試験を、Ｌ−フェニルアラニンを１００．２
００．３００１１Ｔ９をそれぞれイオン交換水に溶かし
１ｌｉｔｒｅとした被検液？（ｍ−’ｉ）Ｔ行なった。

その結果を第３図に、縦軸は出力電流をμＡで示し、横
軸に時間を分単位で示す。

図中カーブ１．２及び３はそれぞれ、Ｌ−フェニルアラ
ニン１００゜２００及び３００ｍ９を１１のイオン交換
処理水に溶解した液の出力電流の経時変化を示し、４は
イオン交換処理水の出力電流値を示す。

また、微生物電極の平衡電流値を被検液のＬ−フェニル
アラニン濃度に対してプロットして第４図を作成した。

縦軸を出力電流（μＡ）、横軸をＬ−フェニルアラニン
濃度（■／ｌ）で示す。

第３図中、１，２，３はそれぞれ上記の順のＬ−フェニ
ルアラニン溶液の出力電流のプロットであり、４はイオ
ン交換水の電流プロットである。

第３図から解るように、本微生物電極は１２分間以内の
短時間に平衡電流が得られ、また、第４図に示されるよ
うに平衡電流値はＬ−フェニルアラニン濃度に対して良
好な直線関係を示すことが判つた。

なお、被検液はキャリヤー液によって５倍程度希しやく
されるので測定セル内のし一フェニルアラニン濃度は１
７ないし５０１ｎ９／ｌとなり本微生物電極が極めて高
い感度を有することが示された。

次に有機物の影響を調べるためにグルコース１０００〜
／ｌ含有する被検液を測定したところ、その応答はＬ−
フェニルアラニン１００ｍ９／ｌの被検液の応答の１／
３０であった。

すなわち、この微生物電極は同一濃度で比較してグルコ
ースはＬ−フェニルアラニンに対して１／３００程度の
出力電流変化しか示さず、実用上十分な選択性が得られ
た。

次に各種のアミノ酸溶液（濃度１０１０００Ｉ）ｐを順
に注入して本微生物電極の応答を調べたところ、第２表
に示すようにＬ−フェニルアラニン以外のアミノ酸に対
してあまり応答せず（出力電流変化が小さい）、実用上
要求される選択性を示すことが判った。

実施例 ２ 濾紙で濾過したトマトジュース１００ ｍｌ、スキムミ
ルク１００ｇ、酵母エキス５ｇにイオン交換水を加え、
ＩＮ ＮａｏＨでｐＨを７０に調節後全容を１１として
た。

この培地４９ｍＡ！を５００ｍ１のフラスコに移し１２
０°Ｃで１５分間殺菌後５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｆａｅｃａｌｉｓ（ＡＴＣＣ９７９０）を接種し３７℃
で４８時間振とう培養し、遠心分離して集菌した、得ら
れた菌体を生理食塩水で２回洗じょうした後、等重量の
アセトンを加えたのち真空デシケータ−で乾燥した。

このようにした得られた乾燥菌体６０１′ｒ１９に実施
例１と同様な方法によって得たＮｉｔｒｏｓｏｍｏｎａ
ｓｅｕｒｏｐａｅａ （ＡＴＣＣ１９７１８）の培養液
５ｍｌを加え、同様な方法で酸素電極の表面に上記２株
の混合菌を固定化して微生物電極を作製した。

このようにして得た微生物電極を第２図に示す連続測定
システムに組込み、実施例１と同様な条件で作動させた
。

微生物電極の出力電流が安定したのち；こＬ−アスパラ
ギン酸を含む被験液を流量０、８ ｍｌ／ ｍ１ｙｒで
フローセルに送りこむと微生物電極の出力電流は次第に
減少し１０分以内に平衡値に達した。

そこで被験液の注入を中止すると微生物電極の出力電流
は増加していき、１２分後には注入前の値に戻った。

このような試験をＬ−アスパラギン酸（８０，１６０お
よび２４０■をイオン交換水に溶かし１１ｉｔｒｅとし
た）被検液についても行なった。

第５図は横軸に被検液中のし一アスパラギン酸濃度、縦
軸に被験液を注入したときの微生物電極の出力電流の減
少値をとってプロットしたものである。

第５図から両者間には良好な直線関係が成立することが
示され、この関係（検量線）を用いて濃度未知の被験液
中のＬ−アスパラギン酸の量を知ることができる。

次に有機物の影響を調べるためにグルコース１０００〜
／ｌを含有する被験液を測定したところ、その応答は８
０〜／ｌのＬ−アスパラギン酸［の１／２０であった。

すなわちこの微生物電極は同一濃度で比較して１／２５
０程度の出力電流しか示さず、実用上十分な選択性が得
られた。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の微生物電極の正面断面図であ１す、第
２図は微生物電極を用いるＬ−アミノ酸の連続測定シス
テムである。 第３図は各濃度のし一フェニルアラニンを連続的に測定
した時の微生物電極の出力電流を経時的に示すチャート
である。 第４図第５図は夫々Ｌ−フェニルアラニン及び）Ｌ−ア
スパラギン酸の濃度と出力電流の関係を示すグラフであ
る。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ 溶存酸素電極の隔膜と、これを覆う微細孔を有する
   薄膜の間に、定量せんとするＬ−アミノ酸に対して脱ア
   ミノ活性を有する微生物菌体及びアンモニアを資化して
   酸素を消費する硝化細菌菌体を封入した微生物電極をＬ
   −アミノ酸を含有する被験液と接触させ、該電極の出力
   電流の減少量又は減少速度を求めることを特徴とするＬ
   −アミノ酸の定量法。