JPS58178258A - アレルギ−の存在の検出及びアレルギ−を誘導するアレルゲンの特異的検出の方法並びに白血球プロテア−ゼ - Google Patents
アレルギ−の存在の検出及びアレルギ−を誘導するアレルゲンの特異的検出の方法並びに白血球プロテア−ゼInfo
- Publication number
- JPS58178258A JPS58178258A JP58049043A JP4904383A JPS58178258A JP S58178258 A JPS58178258 A JP S58178258A JP 58049043 A JP58049043 A JP 58049043A JP 4904383 A JP4904383 A JP 4904383A JP S58178258 A JPS58178258 A JP S58178258A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- allergy
- allergen
- ige
- compound
- general formula
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はアレルギーの存在を検出しかつアレルギーを誘
導するアレルゲンを特異的に検出する方法並びに活性が
本発明方法で測定される新規プロテアーゼに関する。
導するアレルゲンを特異的に検出する方法並びに活性が
本発明方法で測定される新規プロテアーゼに関する。
アレルギー患者の場合、血中で高いＩｇＥ濃度が認めら
れる。更に、ＩｇＥはマスト細胞及び好塩基性球に結合
しているのが認められる。アレルギー反応はアレルゲン
がそれに特異性の、マスト細胞もしくは好塩基性球に結
合しているＩｇＥに結合することにより誘発される。刺
激を与えるアレルゲンが隣接するＩｇＥの所謂６架橋（
Ｖｅｒｂｒｕｃｋｕｎｇ ）を介して行なうＩｇＥへの
この結合か複雑な反応において好塩基性白血球の細胞崩
壊を惹起すると考えられている。周知のように、この細
胞崩壊はヒスタミン、カリクレイン様プロテアーゼ並び
に他の物質を遊離する。
れる。更に、ＩｇＥはマスト細胞及び好塩基性球に結合
しているのが認められる。アレルギー反応はアレルゲン
がそれに特異性の、マスト細胞もしくは好塩基性球に結
合しているＩｇＥに結合することにより誘発される。刺
激を与えるアレルゲンが隣接するＩｇＥの所謂６架橋（
Ｖｅｒｂｒｕｃｋｕｎｇ ）を介して行なうＩｇＥへの
この結合か複雑な反応において好塩基性白血球の細胞崩
壊を惹起すると考えられている。周知のように、この細
胞崩壊はヒスタミン、カリクレイン様プロテアーゼ並び
に他の物質を遊離する。
アレルギー性疾患の診断には、患者忙負担を与えかつ一
定の危険の伴う生体内試験と共に試験管内試験が次第に
重要になっている。
定の危険の伴う生体内試験と共に試験管内試験が次第に
重要になっている。
市場で得られる試験管内試験法は総ＩｇＥ （アレルギ
ーの存在を一般的に非特異的に検出）か又は特異性Ｉｇ
Ｅ（アレルギーを誘導する存在するＩｇＥの特異性の検
出）を検出する。前記の試験管内試験の利点は実施が比
較的迅速でありかつ患者の負担が低いことである。欠点
は、血清中のＩｇＥ濃度が必ずしもマスト細胞及び好塩
基性球の反応性に関する・ぞラメータではなく（種々の
媒介物質の遊離）かつ特異性ＩｇＥの検出が担体結合の
アレルゲンを必要とし、アレルゲンはその担体への結合
に基づいて変化していることである。それ故、文献は偽
陰性の結果について報告している。
ーの存在を一般的に非特異的に検出）か又は特異性Ｉｇ
Ｅ（アレルギーを誘導する存在するＩｇＥの特異性の検
出）を検出する。前記の試験管内試験の利点は実施が比
較的迅速でありかつ患者の負担が低いことである。欠点
は、血清中のＩｇＥ濃度が必ずしもマスト細胞及び好塩
基性球の反応性に関する・ぞラメータではなく（種々の
媒介物質の遊離）かつ特異性ＩｇＥの検出が担体結合の
アレルゲンを必要とし、アレルゲンはその担体への結合
に基づいて変化していることである。それ故、文献は偽
陰性の結果について報告している。
これらの欠点を、感受性細胞を試験管内でアレルゲンで
刺激しかつアレルゲンの刺激によるヒスタミン遊離を測
定する細胞試験により除（ことが既に試みられた。この
方法はアレルギー反応を前提とする固有の過程を包含す
る。しかしこの方法の欠点はヒスタミン分析が莫大な経
費でもって実施することができかつ妨害を受は易いこと
である。
刺激しかつアレルゲンの刺激によるヒスタミン遊離を測
定する細胞試験により除（ことが既に試みられた。この
方法はアレルギー反応を前提とする固有の過程を包含す
る。しかしこの方法の欠点はヒスタミン分析が莫大な経
費でもって実施することができかつ妨害を受は易いこと
である。
更に、アレルゲン特異性の、白血球からのカリクレイン
様プロテアーゼの遊離が既に記載された。このプロテア
ーゼは至適ｐＨ８，５を有し、アプロチニンによる特異
的阻害性Ｉ５０約５０μｇ／蛯及びＳＴＩ （大豆−ト
リプシン阻害剤００１モル／ｌによる阻害１１％を有し
ている。この酵素の測定は、極めて僅かの活性しか遊離
されないので放射性化学的に３Ｈ−ＴＡＭＥ （）シル
−アルギニル−メチルエステル）で行なう。このプロテ
アーゼの遊離は非特異的に抗ＩｇＥ又は特異的にアレル
ゲンでも行なえる。
様プロテアーゼの遊離が既に記載された。このプロテア
ーゼは至適ｐＨ８，５を有し、アプロチニンによる特異
的阻害性Ｉ５０約５０μｇ／蛯及びＳＴＩ （大豆−ト
リプシン阻害剤００１モル／ｌによる阻害１１％を有し
ている。この酵素の測定は、極めて僅かの活性しか遊離
されないので放射性化学的に３Ｈ−ＴＡＭＥ （）シル
−アルギニル−メチルエステル）で行なう。このプロテ
アーゼの遊離は非特異的に抗ＩｇＥ又は特異的にアレル
ゲンでも行なえる。
本発明は、細胞反応の特異性を比較的簡単な実施及び高
い感度と結び付ける方法を開示するという課題に基づい
ている。
い感度と結び付ける方法を開示するという課題に基づい
ている。
本発明によりこの課題は、試験すべき試料の白血球とア
レルゲン又は抗ＩｇＥのような細胞崩壊の他の刺激因子
とを水性媒体中で恒温保持し、その後で白血球を分離し
かつ残留する溶液を一般式： 〔式中Ｙはアミノ末端位に常用の保護基を有していてよ
いアミノ酸又はアミノ酸２個又は３個を有するペプチド
を表わし、Ｘはアルギニン又は溶解素を表わしかつＣは
色原体残基を表わす〕の化合物とｐＨ６，３〜８０で作
用性の緩衝剤の存在において恒温保持しかっ色原体残基
の遊離を測定することを特徴とする、細胞原理に基づイ
テアレルギーの存在を検出しかつアレルギーを誘導する
アレルゲンを特異的に検出する方法により解決される。
レルゲン又は抗ＩｇＥのような細胞崩壊の他の刺激因子
とを水性媒体中で恒温保持し、その後で白血球を分離し
かつ残留する溶液を一般式： 〔式中Ｙはアミノ末端位に常用の保護基を有していてよ
いアミノ酸又はアミノ酸２個又は３個を有するペプチド
を表わし、Ｘはアルギニン又は溶解素を表わしかつＣは
色原体残基を表わす〕の化合物とｐＨ６，３〜８０で作
用性の緩衝剤の存在において恒温保持しかっ色原体残基
の遊離を測定することを特徴とする、細胞原理に基づイ
テアレルギーの存在を検出しかつアレルギーを誘導する
アレルゲンを特異的に検出する方法により解決される。
本発明は、意外にも、アトピー患者、即ちアレルギー感
作された人の白血球の場合には、白血球から非特異的に
抗ＩｇＥで又は特異的にアレルゲンで遊離する新規プロ
テアーゼが見出されたことに基づいている。明らかに性
質が公知の白血球からのカリクレイン様プロテアーゼと
異なっているこの新規プロテアーゼは色原体残基な含有
するペプチドを良好な活性度で分解する。
作された人の白血球の場合には、白血球から非特異的に
抗ＩｇＥで又は特異的にアレルゲンで遊離する新規プロ
テアーゼが見出されたことに基づいている。明らかに性
質が公知の白血球からのカリクレイン様プロテアーゼと
異なっているこの新規プロテアーゼは色原体残基な含有
するペプチドを良好な活性度で分解する。
アトピー患者の白血球は健康な人の白血球と比べてこの
プロテアーゼ振出分を５〜１５倍で生ぜしめるので、こ
のプロテア−ぜの活性度を測定することにより一層高感
度で迅速な高い特異性のアレルギー試験が構成される。
プロテアーゼ振出分を５〜１５倍で生ぜしめるので、こ
のプロテア−ぜの活性度を測定することにより一層高感
度で迅速な高い特異性のアレルギー試験が構成される。
同様に本発明の目的である白血球からのこの新規プロテ
アーゼは、アプロチニンによる特Ａ的阻害性■５ｏ１〜
／ｍ５ ＳＴＩによる特異的阻害性００５ミリモル／ｌ
で５０〜１００％を特徴とする。このプロテアーゼは遊
離後約１００時間までは安定であり、それ故採血後長時
間測定することができ、細胞自体も比較的安定である。
アーゼは、アプロチニンによる特Ａ的阻害性■５ｏ１〜
／ｍ５ ＳＴＩによる特異的阻害性００５ミリモル／ｌ
で５０〜１００％を特徴とする。このプロテアーゼは遊
離後約１００時間までは安定であり、それ故採血後長時
間測定することができ、細胞自体も比較的安定である。
プロテア−ぜは広範な至適ｐＨ約６．８〜８．２を有し
、例１に記載の条件下に測定する。
、例１に記載の条件下に測定する。
一般式： Ｙ−Ｘ−Ｃを有する本発明による白血球プロ
テアーゼの基質はＣとして、新規の白血球プロテアーゼ
により脱離しかつ本発明方法で電歇測定される公知の色
原体残基の１つを含有する。Ｃがｐ−ニトラニリン基で
あると優れている。本発明範囲では色原体残基とは離脱
後、場合により他の化合物との反応により着色化合物に
変換することができるか又はそれ自体が着色している残
基である。残基ＹがＧｌｙ−Ｐｒｏ列を含有すると有オ
リである。
テアーゼの基質はＣとして、新規の白血球プロテアーゼ
により脱離しかつ本発明方法で電歇測定される公知の色
原体残基の１つを含有する。Ｃがｐ−ニトラニリン基で
あると優れている。本発明範囲では色原体残基とは離脱
後、場合により他の化合物との反応により着色化合物に
変換することができるか又はそれ自体が着色している残
基である。残基ＹがＧｌｙ−Ｐｒｏ列を含有すると有オ
リである。
一般式：Ｙ−Ｘ−Ｃの特に優れている化合物はトシル−
クリシル−プロリル−アルギニン−ｐ−ニトラニリドー
アセテート〔商品名クロモチム（Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ
） Ｔ Ｈで市販されている〕並びにアルギニンが溶解
素に代えられている相応する化合物である。化合物ｙ−
ｘ−ｃは担体結合形でも使用することができる。
クリシル−プロリル−アルギニン−ｐ−ニトラニリドー
アセテート〔商品名クロモチム（Ｃｈｒｏｍｏｚｙｍ
） Ｔ Ｈで市販されている〕並びにアルギニンが溶解
素に代えられている相応する化合物である。化合物ｙ−
ｘ−ｃは担体結合形でも使用することができる。
本発明方法の使用可能性は著しく広い。例えばそれを利
用してアンビチリンアレルギーを検出した。この所見を
従来公知のアレルギー反応の開始機構では説明すること
ができないので特に驚異的である。Ｎ１−もしくはクロ
ムイオンに対する金属アレルギーも同様に検出すること
ができた。
用してアンビチリンアレルギーを検出した。この所見を
従来公知のアレルギー反応の開始機構では説明すること
ができないので特に驚異的である。Ｎ１−もしくはクロ
ムイオンに対する金属アレルギーも同様に検出すること
ができた。
本発明によりアレルギーを検出し得るようにするには、
被検者の洗浄した白血球を調達、これを特異的アレルゲ
ン又は例えば抗ＩｇＥのような細胞崩壊による非特異的
な刺激因子と恒温保持し、恒温保持後日血球を上澄みか
ら分離し、基質と緩衝剤を添加しかつしばら（後に遊離
した色原体を測定するだけで十分である。この際に、恒
温保持に当り特異性アレルゲンを使用する場合、白血球
がこのアレルゲンに対して感作されていると本発明によ
る白血球プロテアーゼの高められた振出が達成される。
被検者の洗浄した白血球を調達、これを特異的アレルゲ
ン又は例えば抗ＩｇＥのような細胞崩壊による非特異的
な刺激因子と恒温保持し、恒温保持後日血球を上澄みか
ら分離し、基質と緩衝剤を添加しかつしばら（後に遊離
した色原体を測定するだけで十分である。この際に、恒
温保持に当り特異性アレルゲンを使用する場合、白血球
がこのアレルゲンに対して感作されていると本発明によ
る白血球プロテアーゼの高められた振出が達成される。
抗ＩｇＥ以外の細胞崩壊による非特異性刺激因子は既に
多数記載されている〔例えばＡ、Ｌ、ＤｅＷｅｃｋ著、
” Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ
Ｉｎｔｅｒｎ、Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｆ Ｃｈｅｍｏｔ
ｈｅｒａｐｙ”、（１９８１年）、フローレンス〕。
多数記載されている〔例えばＡ、Ｌ、ＤｅＷｅｃｋ著、
” Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ ｉｎ Ａｌｌｅｒｇｙ
Ｉｎｔｅｒｎ、Ｃｏｎｇｒｅｓｓｏｆ Ｃｈｅｍｏｔ
ｈｅｒａｐｙ”、（１９８１年）、フローレンス〕。
本発明方法で使用する精製白血球の製造は当業者に公知
の方法で行ない、ここで詳説する必要はない。デキスト
ラン法［Ｐｒｏｆ、Ｄｒ、Ｈ，Ｆｒｉｅｍｅｌ著、”
Ｉｒｒｍｕｎｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅ
ｔｈｏｄｅｎ”（１９８０年） 、 Ｇｕｓｔａｖ Ｆ
ｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ在〕
、フイコル法ＣＦｉｃｏｌｌｍｅｔｈｏｄｅ、Ｎ、Ｒ，
Ｒｏｓｅ及びＨ０Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ共著、 ” Ｍａ
ｎｕａｌ ｏｆ Ｃ１ｉｎｉｃａｌＣ１１ｎｉｃａｌＩ
ｒｒ ＡＳＭ”（１９８０年） 、 Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ。
の方法で行ない、ここで詳説する必要はない。デキスト
ラン法［Ｐｒｏｆ、Ｄｒ、Ｈ，Ｆｒｉｅｍｅｌ著、”
Ｉｒｒｍｕｎｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅ
ｔｈｏｄｅｎ”（１９８０年） 、 Ｇｕｓｔａｖ Ｆ
ｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ在〕
、フイコル法ＣＦｉｃｏｌｌｍｅｔｈｏｄｅ、Ｎ、Ｒ，
Ｒｏｓｅ及びＨ０Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ共著、 ” Ｍａ
ｎｕａｌ ｏｆ Ｃ１ｉｎｉｃａｌＣ１１ｎｉｃａｌＩ
ｒｒ ＡＳＭ”（１９８０年） 、 Ｗａｓｈｉｎｇｔ
ｏｎ。
Ｄ、Ｃ在〕を顆粒性白血球の富化に適用することができ
る。得られた細胞懸濁液に好適な緩衝剤を加えろと有利
であり、約３００〜８００ｙで遠心分離しかつ沈降物を
新しい緩衝剤中に懸濁させる。洗浄を場合により繰返し
実施することができろ。測定・ぐツチについては細胞懸
濁液は細胞数１０６〜１０８７ｍｅの範囲で存在すべき
である。本発明では白血球の代りにマスト細胞を使用す
ることもできる。
る。得られた細胞懸濁液に好適な緩衝剤を加えろと有利
であり、約３００〜８００ｙで遠心分離しかつ沈降物を
新しい緩衝剤中に懸濁させる。洗浄を場合により繰返し
実施することができろ。測定・ぐツチについては細胞懸
濁液は細胞数１０６〜１０８７ｍｅの範囲で存在すべき
である。本発明では白血球の代りにマスト細胞を使用す
ることもできる。
本発明範囲で緩衝剤として前記のｐＨ範囲で有効な緩衝
剤を使用することができる。トリス緩衝剤が有効である
ことが明らかとなった。
剤を使用することができる。トリス緩衝剤が有効である
ことが明らかとなった。
白血球を例えば抗ＩｇＥもしくはアレルゲンと反応させ
る第１恒温保持工程の時間は適用温度に左右される。３
７°Ｃでは約６０分間恒温保持すると有利である。恒温
保持の後、白血球の分離を公知方法で、例えば３０００
０ ｇで１０分間遠心分離する。その際に得られた遠心
分離上澄みに直接一般式： Ｙ−Ｘ−Ｃの基質を加えか
つ再度恒温保持する。測定に当り、抗ＩｇＥもしくはア
レルゲン溶液の代りに相当量の緩衝溶液を添加して得ら
れ比較試料を一緒に行なうと有利である。
る第１恒温保持工程の時間は適用温度に左右される。３
７°Ｃでは約６０分間恒温保持すると有利である。恒温
保持の後、白血球の分離を公知方法で、例えば３０００
０ ｇで１０分間遠心分離する。その際に得られた遠心
分離上澄みに直接一般式： Ｙ−Ｘ−Ｃの基質を加えか
つ再度恒温保持する。測定に当り、抗ＩｇＥもしくはア
レルゲン溶液の代りに相当量の緩衝溶液を添加して得ら
れ比較試料を一緒に行なうと有利である。
色原体の測定は当業者に公知の光学的方法で脱離して残
基の色に相応して可視範囲で又はＵＶ範囲で竹なう。
基の色に相応して可視範囲で又はＵＶ範囲で竹なう。
本発明方法の特別な実施形により初めて潜在的なアレル
ギーの危険性を測定することも可能となる。本方法のこ
の拡大展開された変形では初めに試験すべき細胞物質を
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）と共に恒温保持する。これ
により細胞物質の感作が惹起され、従って本発明方法の
条件のもとでアレルギーの存在の検出の場合と同様に結
果が得られる。同じ細胞物質を用いて予めＩｇＥと恒温
保持しない場合には非アレルギ一体質の７人と同じ結果
が得られる。それ故、この方法で、アレルギーの過誤、
潜在アレルギー及び急性アレルギーを区別することが可
能である。
ギーの危険性を測定することも可能となる。本方法のこ
の拡大展開された変形では初めに試験すべき細胞物質を
免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）と共に恒温保持する。これ
により細胞物質の感作が惹起され、従って本発明方法の
条件のもとでアレルギーの存在の検出の場合と同様に結
果が得られる。同じ細胞物質を用いて予めＩｇＥと恒温
保持しない場合には非アレルギ一体質の７人と同じ結果
が得られる。それ故、この方法で、アレルギーの過誤、
潜在アレルギー及び急性アレルギーを区別することが可
能である。
本発明方法により、生体内試験で配慮しなければならな
いように患者に負担をかけずに、一般的にアレルギーの
存在並びに特異的アレルゲンの検出を可能にする簡単で
迅速なかつ特異的な測定法が開示される。それ故、本発
明方法により公知の生体内試験の利点と試験管内試験の
利点が結合する。
いように患者に負担をかけずに、一般的にアレルギーの
存在並びに特異的アレルゲンの検出を可能にする簡単で
迅速なかつ特異的な測定法が開示される。それ故、本発
明方法により公知の生体内試験の利点と試験管内試験の
利点が結合する。
次に本発明を実施例により詳説する。
例 １
健康な給血者の試料
１１白血球の取得
健康な給血者の静脈血６０ｍ１をデキストラン混合物（
平均分子量７５０００のデキストラン２チ、ｄ−グルコ
ース２％、 ＥＤＴＡ ２０ミリモル／ｌ 、ゼラチン
０．０７％）３０ｍｌと注意深くポリエチレンビーカ中
で混合しかつシリコーン処理した分散漏斗中に移した。
平均分子量７５０００のデキストラン２チ、ｄ−グルコ
ース２％、 ＥＤＴＡ ２０ミリモル／ｌ 、ゼラチン
０．０７％）３０ｍｌと注意深くポリエチレンビーカ中
で混合しかつシリコーン処理した分散漏斗中に移した。
常温で６０〜９０分間放置した後で白血球を含有する上
澄み（約５０ｍｔ）を分離しかつトリス緩衝剤混合物（
ｐＨ７６、トリス２２ミリモル／ ｌ 、 ＮａＣｌ
０．１２モル／ｌ、ＫＣｌ５ミリモル／１１．ゼラチ
ン００５％、 ＥＤＴＡ １ミリモル／Ａ、Ｄ−グルコ
ースｏ１％）５ｏｍｅを加えかつ１５分間８００ｙで遠
心分離しまた。デカンテーション後、細胞を同じ緩衝剤
混合物（ｐＨ７，６）１回当り５０ｍ１で懸濁しかつ１
回当り１５分間８００ｇで遠心分離することにより２回
洗浄した。細胞を同じ緩衝剤混合物１０ｍ１中に懸濁さ
せた。
澄み（約５０ｍｔ）を分離しかつトリス緩衝剤混合物（
ｐＨ７６、トリス２２ミリモル／ ｌ 、 ＮａＣｌ
０．１２モル／ｌ、ＫＣｌ５ミリモル／１１．ゼラチ
ン００５％、 ＥＤＴＡ １ミリモル／Ａ、Ｄ−グルコ
ースｏ１％）５ｏｍｅを加えかつ１５分間８００ｙで遠
心分離しまた。デカンテーション後、細胞を同じ緩衝剤
混合物（ｐＨ７，６）１回当り５０ｍ１で懸濁しかつ１
回当り１５分間８００ｇで遠心分離することにより２回
洗浄した。細胞を同じ緩衝剤混合物１０ｍ１中に懸濁さ
せた。
１２ゾロテアーゼの遊離
細胞ＷＩＡ濁液それぞれ０．９ ｍｌをポリエチレン試
験管２本に移し、トリス緩衝剤混合物（ｐＨ７，６）０
、４ ｍｌと共に水浴中で３７℃にした。１方の試料中
に抗ＩｇＥ溶液（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｗｅｒｋｅ社製、７
ｇ６０ＴＮＰ ０４１０５ 、）リス緩衝剤（ｐＨ７，
６）でｌ二５００に稀釈）ｏ１ｍｌ加え、他方の試料（
対照）中にトリス緩衝剤混合物（ｐＨ７，６） ０．１
１／をピペット添加しかつ両方の試料にＣａＣｌ ２溶
液（等張ＮａＣＩ溶液中４ミリモル／ ｌ 、 ｐＨ７
，６） ０．１ ｍｌを加えた。両方の試料を６０分間
７０℃に保持し、その後氷冷ＥＤＴＡ溶液（等張ＮａＣ
ｌ中０．１モル／ １．ｐｎ７．６）それぞれ０．５
ｍｌを加えかつ４°Ｃで１０分間３００００９で遠心分
離しかつ遠心機の停止後直ちに上澄みをピペット分離し
た。
験管２本に移し、トリス緩衝剤混合物（ｐＨ７，６）０
、４ ｍｌと共に水浴中で３７℃にした。１方の試料中
に抗ＩｇＥ溶液（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｗｅｒｋｅ社製、７
ｇ６０ＴＮＰ ０４１０５ 、）リス緩衝剤（ｐＨ７，
６）でｌ二５００に稀釈）ｏ１ｍｌ加え、他方の試料（
対照）中にトリス緩衝剤混合物（ｐＨ７，６） ０．１
１／をピペット添加しかつ両方の試料にＣａＣｌ ２溶
液（等張ＮａＣＩ溶液中４ミリモル／ ｌ 、 ｐＨ７
，６） ０．１ ｍｌを加えた。両方の試料を６０分間
７０℃に保持し、その後氷冷ＥＤＴＡ溶液（等張ＮａＣ
ｌ中０．１モル／ １．ｐｎ７．６）それぞれ０．５
ｍｌを加えかつ４°Ｃで１０分間３００００９で遠心分
離しかつ遠心機の停止後直ちに上澄みをピペット分離し
た。
１３プロテアーゼ試験
上澄み０．５ ｍｌ：に１５ミリモル／ｌ−クロモチム
ＴＨ溶液（８Ｍ１９９６６４１ピンをＨ２Ｏ０，５１１
１中に溶解） ０．５ ｍｌを添加した。両方の試料の
吸光度差を４０５１７１１で１時間後、２時間後及び３
時間後に測定した。
ＴＨ溶液（８Ｍ１９９６６４１ピンをＨ２Ｏ０，５１１
１中に溶解） ０．５ ｍｌを添加した。両方の試料の
吸光度差を４０５１７１１で１時間後、２時間後及び３
時間後に測定した。
１４結果
３時間で未処理の試料において一定の吸光度上昇ΔＥ／
ｈ二〇〇２０が認められ、抗ＩｇＥで処理した試料では
ΔＥ／ｈ ０．０．６５であった。
ｈ二〇〇２０が認められ、抗ＩｇＥで処理した試料では
ΔＥ／ｈ ０．０．６５であった。
従って、細胞の抗ＩｇＥ処理により吸光度上昇ΔＥ４０
５ｎｍ”” ０．０４５が達成された。
５ｎｍ”” ０．０４５が達成された。
注：アレルギーではない提供者の血液中には本例による
方法では抗ＩｇＥを用いてΔＥ／ｈ＝０．１を上回る数
値は認められなかった。それぞれの場合に２０時間以上
一定の吸光度上昇が認められた。
方法では抗ＩｇＥを用いてΔＥ／ｈ＝０．１を上回る数
値は認められなかった。それぞれの場合に２０時間以上
一定の吸光度上昇が認められた。
例 ２
検出されたアンチピリンアレルギーを有する給血者の試
料 ２１アレルギーの存在を抗ＩｇＥ刺激により検出前記の
実施例の１１に相応して得られたアンチピリンアレルギ
ーの給血者の白血球懸濁液０．９ｍｌから１２に相応し
て抗ＩｇＥにより遊離したプロテアーゼ（測定値ΔＥ／
ｈ＝０．８０５ ）では、抗ＩｇＥで刺激を与えなかっ
た比較試料（測定値ΔＥ／ｈ ＝０．０８５ ）に比べ
て、クロモチムＴＨとの反応の開始後最初の３時間でΔ
Ｅ／ｈ＝０．７２０の付加的な吸光度変化が認められた
。
料 ２１アレルギーの存在を抗ＩｇＥ刺激により検出前記の
実施例の１１に相応して得られたアンチピリンアレルギ
ーの給血者の白血球懸濁液０．９ｍｌから１２に相応し
て抗ＩｇＥにより遊離したプロテアーゼ（測定値ΔＥ／
ｈ＝０．８０５ ）では、抗ＩｇＥで刺激を与えなかっ
た比較試料（測定値ΔＥ／ｈ ＝０．０８５ ）に比べ
て、クロモチムＴＨとの反応の開始後最初の３時間でΔ
Ｅ／ｈ＝０．７２０の付加的な吸光度変化が認められた
。
従って、血液１ ｍｌからクロモチムＴＨを加水分解す
る活性度的１．６ ミＩＪ Ｕが遊離した。
る活性度的１．６ ミＩＪ Ｕが遊離した。
２２アンピチリン刺激によるアンチピンアレルギーの存
在の検出 例１１に相応して得られた白血球懸濁液０．９ｍｌを１
２に相応して刺激するが、但し抗ＩｇＥ溶液０．１ ｍ
ｌの代りにアンチピン／血清アルブミン溶液（アンピチ
リン５〜／ｍｌ、ヒト血清アルブミ１５〜／ｍｅ ）
ｏｌｍｌをプロテアーゼの遊離に使用した。アンビチリ
ンにより遊離したプロテアーゼ（測定値ΔＥ／ｈ＝０．
８９３ ）ではアンビチリンで処理しなかった対照（測
定値ΔＥ／ｈ−０，３３５）に対して付加的な吸光度変
化ΔＥ／ｈ−〇５５８か得られた。
在の検出 例１１に相応して得られた白血球懸濁液０．９ｍｌを１
２に相応して刺激するが、但し抗ＩｇＥ溶液０．１ ｍ
ｌの代りにアンチピン／血清アルブミン溶液（アンピチ
リン５〜／ｍｌ、ヒト血清アルブミ１５〜／ｍｅ ）
ｏｌｍｌをプロテアーゼの遊離に使用した。アンビチリ
ンにより遊離したプロテアーゼ（測定値ΔＥ／ｈ＝０．
８９３ ）ではアンビチリンで処理しなかった対照（測
定値ΔＥ／ｈ−０，３３５）に対して付加的な吸光度変
化ΔＥ／ｈ−〇５５８か得られた。
α：血清アルブミンはアンチピンによるプロテアーゼの
遊離には必要ではない。
遊離には必要ではない。
例 ３
基質としてのＣＢＯ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡ
例１１に相応して得られた健康な給血者の血液からの２
つの白血球懸濁液者０．９ ｍｌ中で１２に相応して抗
ＩｇＥ刺激後にプロテアーゼが遠心分離の上澄みとして
得られた。プロテアーゼ試験は１３と同様に、但し試料
中でクロモチムＴＨの代りに等モル量のＣＢＯ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを使用して行なった。初め
の３時間で同じΔＥ／ｈ （ΔＥ／ｈ ＝０．０６７
）が測定された。
例１１に相応して得られた健康な給血者の血液からの２
つの白血球懸濁液者０．９ ｍｌ中で１２に相応して抗
ＩｇＥ刺激後にプロテアーゼが遠心分離の上澄みとして
得られた。プロテアーゼ試験は１３と同様に、但し試料
中でクロモチムＴＨの代りに等モル量のＣＢＯ−Ｇｌ
ｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐＮＡを使用して行なった。初め
の３時間で同じΔＥ／ｈ （ΔＥ／ｈ ＝０．０６７
）が測定された。
例 ４
基質としてのＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ
（クロモチムＰＬ） 例１に相応して平行に処理した２つの試料の活性度をク
ロモチムＴＨもしくは等モル量のクロモチムＰＬを用い
て測定した。クロモチムＰＬではΔＥ／ｈ−００５２、
クロモチムＴＨではΔＥ／ｈ ＝＝＝＝０．０４８が実
測された。
（クロモチムＰＬ） 例１に相応して平行に処理した２つの試料の活性度をク
ロモチムＴＨもしくは等モル量のクロモチムＰＬを用い
て測定した。クロモチムＰＬではΔＥ／ｈ−００５２、
クロモチムＴＨではΔＥ／ｈ ＝＝＝＝０．０４８が実
測された。
例 ５
基質としてのＰｈｅ−Ｐ ｉｐ−Ａｒｇ−ｐＮＡ例１に
相応して平行処理した２つの試料のプロテアーゼ活性度
をクロモチムＴＨもしくは等モル積の８２２３８を用い
て測定した。８２２３８ではΔＥ／ｈ＝０．０３７ 、
クロモチムＴＨではΔＥ／ ｈ ＝０．０４８が測定さ
れた。
相応して平行処理した２つの試料のプロテアーゼ活性度
をクロモチムＴＨもしくは等モル積の８２２３８を用い
て測定した。８２２３８ではΔＥ／ｈ＝０．０３７ 、
クロモチムＴＨではΔＥ／ ｈ ＝０．０４８が測定さ
れた。
例 ６
例１と同様に実施
被検者：
■、アレルギ一体質の人：馬小屋に入った際に又は発汗
している馬の 近（でアレルギー症状（ 涙、くシやみ等）。予想 されるアレルゲン：馬の ちり ■、非アレルギ一体質の人：アレルギー症状が認められ
ない 試験： 細胞濃度： アレルギ一体質の人：細胞数５・１０１／ｒｎｌ非アレ
ルギ一体質の人：細胞数４・１ ｏ７／ｍｌ細胞崩壊の
開始 ａ）抗ＩｇＥ権釈１：５００−＋試験０．１ｒ＋ｌ／１
．５ｍｌテストｂ） アレルゴファ／ｌ／、ＩＡ社（Ｆ
ａ、ＡＩ ｌｅｒｇｏｐｈａｒｍ）の馬上及稀釈１ ：
１００ 稀釈１：１００ １：１０００ １ ： １００００−＋０．１ｍ１７１．５ｍｌテスト
結果： 】 抗ＩｇＥＩＣよるアレルギー反応の非特異的開始、
つまりアレルギーの存在 アレルギ一体質の人：ΔＥ４ｏ５／ｈ −１，３４４非
アレルギ一体質の人：ΔＥ４ｏ５／ｈ −０，０３８２
アレルギ一体質の人で馬上皮アレルゲンによるアレルギ
ー反応の特異的開始 稀釈１ ： １００ ΔＥ４ｏ５／ｈ−１１２２
／／ １：ｌ０００ ΔＥ４ｏ５／ｈ −１，６
１１／／ １：１００００ ΔＥ４ｏ５／ｈ −１，
５９８例 ７ ７１白血球の取得 健康な給血者又はアトピ一体質の人の新鮮な静脈血６０
ｙｙｒｌ！を、デキストラン溶液（平均分子量７５００
０ ）１２．５ｍ１１Ｄ−グルコース溶液（６％）１２
５ｍｉ及びＥＤＴＡ溶１（１００ミリモル）６．０ｍｌ
並びにゼラチン溶液（２％） ２． ｓ ｙｎｔからの
混合物を予め装入した１００ｍ１−三角フラスコ（ポリ
エチレン）中に装入する。十分に混合した後で、１回当
り２０ｍ１ずつをポリプロピレン−血清／血しようフィ
ルター（Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅｎ、 Ｆａ。
している馬の 近（でアレルギー症状（ 涙、くシやみ等）。予想 されるアレルゲン：馬の ちり ■、非アレルギ一体質の人：アレルギー症状が認められ
ない 試験： 細胞濃度： アレルギ一体質の人：細胞数５・１０１／ｒｎｌ非アレ
ルギ一体質の人：細胞数４・１ ｏ７／ｍｌ細胞崩壊の
開始 ａ）抗ＩｇＥ権釈１：５００−＋試験０．１ｒ＋ｌ／１
．５ｍｌテストｂ） アレルゴファ／ｌ／、ＩＡ社（Ｆ
ａ、ＡＩ ｌｅｒｇｏｐｈａｒｍ）の馬上及稀釈１ ：
１００ 稀釈１：１００ １：１０００ １ ： １００００−＋０．１ｍ１７１．５ｍｌテスト
結果： 】 抗ＩｇＥＩＣよるアレルギー反応の非特異的開始、
つまりアレルギーの存在 アレルギ一体質の人：ΔＥ４ｏ５／ｈ −１，３４４非
アレルギ一体質の人：ΔＥ４ｏ５／ｈ −０，０３８２
アレルギ一体質の人で馬上皮アレルゲンによるアレルギ
ー反応の特異的開始 稀釈１ ： １００ ΔＥ４ｏ５／ｈ−１１２２
／／ １：ｌ０００ ΔＥ４ｏ５／ｈ −１，６
１１／／ １：１００００ ΔＥ４ｏ５／ｈ −１，
５９８例 ７ ７１白血球の取得 健康な給血者又はアトピ一体質の人の新鮮な静脈血６０
ｙｙｒｌ！を、デキストラン溶液（平均分子量７５００
０ ）１２．５ｍ１１Ｄ−グルコース溶液（６％）１２
５ｍｉ及びＥＤＴＡ溶１（１００ミリモル）６．０ｍｌ
並びにゼラチン溶液（２％） ２． ｓ ｙｎｔからの
混合物を予め装入した１００ｍ１−三角フラスコ（ポリ
エチレン）中に装入する。十分に混合した後で、１回当
り２０ｍ１ずつをポリプロピレン−血清／血しようフィ
ルター（Ｍｏｎｏｖｅｔｔｅｎ、 Ｆａ。
５ａｒｓｔｅｄｔ 社製、注文番号５３．４２２；２
５１１）に移し、次（・で約６０〜９０分間室温で放置
する。゛ その後、血しよう上澄み（合計的４５〜５０ｍ１ ）と
赤血球沈降物を分離する。上澄み１００μｌを採取して
細胞数を数える（白血球及び赤血球。
５１１）に移し、次（・で約６０〜９０分間室温で放置
する。゛ その後、血しよう上澄み（合計的４５〜５０ｍ１ ）と
赤血球沈降物を分離する。上澄み１００μｌを採取して
細胞数を数える（白血球及び赤血球。
” ｃｏｕｌｔｅｒ ｃｏｕｎｔｅｒ”）。次いで、上
澄みを氷冷トリス緩衝剤（ｐＨ７６，６ミリモル） 、
ＥＤＴＡ（１ミリモル）及びゼラチン（００５％）によ
り約１：２に稀釈し、１５分間ｓ ｏ ｏｚｇで遠心分
離し、再度同じ緩衝剤で洗浄し、その後トリス緩衝剤（
６ミリモル）及びグルコース添加物（０１％）を用いて
約４０ｍ１に再懸濁する。次いで再度計数するために細
胞懸濁液１００μｌを採取する。
澄みを氷冷トリス緩衝剤（ｐＨ７６，６ミリモル） 、
ＥＤＴＡ（１ミリモル）及びゼラチン（００５％）によ
り約１：２に稀釈し、１５分間ｓ ｏ ｏｚｇで遠心分
離し、再度同じ緩衝剤で洗浄し、その後トリス緩衝剤（
６ミリモル）及びグルコース添加物（０１％）を用いて
約４０ｍ１に再懸濁する。次いで再度計数するために細
胞懸濁液１００μｌを採取する。
７２反応の実施
それぞれ０．９ ｍｌの白血球細胞懸濁液をポリエチレ
ン試験管中に移し、グルコース添加物を含有するトリス
緩衝剤混合物（１）Ｈ７，６） ０．４ ｍ／７と共に
水浴中で３７℃にしかつそれぞれ０．１ ｍｌの抗１ｇ
Ｅ溶液（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｗｅｒｋｅ 、 ／１６０
ＴＮＰ Ｏ，４１０５、トリス緩衝剤混合物（ｐＨ７，
６）で１：５００に稀釈）又はそれぞれ０．１ ｍｌの
アレルゲン溶液（全・ζフチ中の最終濃度は］００，１
０及び１μｇ／ｍｌとする）を加え、次いでそれぞれ０
．１ ｍｌの塩化カルシウム溶液（等張ＮａＣＩ溶液中
４ミリモル、［）Ｈ７，６）を加える。
ン試験管中に移し、グルコース添加物を含有するトリス
緩衝剤混合物（１）Ｈ７，６） ０．４ ｍ／７と共に
水浴中で３７℃にしかつそれぞれ０．１ ｍｌの抗１ｇ
Ｅ溶液（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｗｅｒｋｅ 、 ／１６０
ＴＮＰ Ｏ，４１０５、トリス緩衝剤混合物（ｐＨ７，
６）で１：５００に稀釈）又はそれぞれ０．１ ｍｌの
アレルゲン溶液（全・ζフチ中の最終濃度は］００，１
０及び１μｇ／ｍｌとする）を加え、次いでそれぞれ０
．１ ｍｌの塩化カルシウム溶液（等張ＮａＣＩ溶液中
４ミリモル、［）Ｈ７，６）を加える。
抗ＩｇＥもしくはアレルゲン刺激物質を含まない対照試
料は相応してそれぞれ０．１ ｍｌのトリス緩衝剤混合
物（ｐＨ７，６）を添加して生成する。
料は相応してそれぞれ０．１ ｍｌのトリス緩衝剤混合
物（ｐＨ７，６）を添加して生成する。
試料を３７°Ｃで６０分間恒温保持し、その後それぞれ
０．５ ｍｌの氷冷ＥＤＴＡ溶液（等張ＮａＣ１溶Ｑ中
１ｏ ミ＋）モル／／Ｊ 、ｐＨ７，６）を加えかつ４
′Ｃで１０分間１５００Ｘｙで遠心分離する。上澄みを
遠心機の停止後ピペット分離する。
０．５ ｍｌの氷冷ＥＤＴＡ溶液（等張ＮａＣ１溶Ｑ中
１ｏ ミ＋）モル／／Ｊ 、ｐＨ７，６）を加えかつ４
′Ｃで１０分間１５００Ｘｙで遠心分離する。上澄みを
遠心機の停止後ピペット分離する。
７３分析
ゾロテイナーゼ
蛋白質分解活性を測定するために、細胞の分離後最高１
５分間／４℃貯蔵した細胞の上澄みそれぞれ０．５ ｍ
ｌをトリス緩衝剤（０σ７５モル。
５分間／４℃貯蔵した細胞の上澄みそれぞれ０．５ ｍ
ｌをトリス緩衝剤（０σ７５モル。
ｐＨ７，６） ０．７ ｍｌ及びクロモチムＴＨ溶液（
１，５ｘ １０−３モ／ｌ／ 、 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ 、注文番号１９９６６４．それ
ぞれ１ビンを水５ ｍｌ中に溶解） ０、３ ｍｌと
混合する。ａ）アレルゲン抽出液中もしくはｂ）抗Ｉｇ
Ｅ−抗血清中のゾロテイナーゼによるもしくはＣ）作業
緩衝剤による非特異的な基質分解を測定するに当り、ア
レルゲンもしくは抗ＩｇＥ種々の細胞試料に相応してア
リコートをアレルゲンもしくは抗ＩｇＥで評価する。
１，５ｘ １０−３モ／ｌ／ 、 Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅ
ｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ 、注文番号１９９６６４．それ
ぞれ１ビンを水５ ｍｌ中に溶解） ０、３ ｍｌと
混合する。ａ）アレルゲン抽出液中もしくはｂ）抗Ｉｇ
Ｅ−抗血清中のゾロテイナーゼによるもしくはＣ）作業
緩衝剤による非特異的な基質分解を測定するに当り、ア
レルゲンもしくは抗ＩｇＥ種々の細胞試料に相応してア
リコートをアレルゲンもしくは抗ＩｇＥで評価する。
その直後に試料の開始吸光度を４０５ｎｍ及び室温で測
定する。次いで試料を室温（２０〜２４’ｃ ）で−晩
装置し、約２０時間後に吸光度を再び４０５ｎｍで読み
取る。
定する。次いで試料を室温（２０〜２４’ｃ ）で−晩
装置し、約２０時間後に吸光度を再び４０５ｎｍで読み
取る。
特異的にアレルゲンもしくは抗ＩｇＥにより遊離可能な
プロテイナーゼの尺度としては補正吸光度な利用する。
プロテイナーゼの尺度としては補正吸光度な利用する。
これは
ａ）アレルゲンもしくは抗ＩｇＥ溶液による非特異的な
基質脱離に関する吸光度並びにｂ）アレルゲンもしくは
抗ＩｇＥ刺激物質を含まない対照試料の吸光度−クロモ
チムＴＨ−緩衝剤の試料の吸光度 に関する試料測定値である。
基質脱離に関する吸光度並びにｂ）アレルゲンもしくは
抗ＩｇＥ刺激物質を含まない対照試料の吸光度−クロモ
チムＴＨ−緩衝剤の試料の吸光度 に関する試料測定値である。
７４アトピ一体質の人
明瞭な枯草熱の症状を有する給血者の白血球を前記の７
１〜７３に記載したようにして取得し、反応させかつ分
析する。室温で２０時間恒温保持した後で、明らかに吸
光度は０．０３０（緩衛剤による自然な遊離）から０１
８５（アレルゲンＩにより誘発された遊離）に上昇した
。その結果はアレルゲンＩＩ （Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ
）ではな（アレルゲンＩ（は上皮： Ｒａｙｇｒａｓ
）が白血球からのプロテイナーゼの明瞭な遊離の原因と
なることを示す。
１〜７３に記載したようにして取得し、反応させかつ分
析する。室温で２０時間恒温保持した後で、明らかに吸
光度は０．０３０（緩衛剤による自然な遊離）から０１
８５（アレルゲンＩにより誘発された遊離）に上昇した
。その結果はアレルゲンＩＩ （Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ
）ではな（アレルゲンＩ（は上皮： Ｒａｙｇｒａｓ
）が白血球からのプロテイナーゼの明瞭な遊離の原因と
なることを示す。
ヒト抗ＩｇＥで刺激後も同様に明瞭な遊離（ΔＥ
：０．１９７）を確認することができた。
：０．１９７）を確認することができた。
０５
例 ８
潜在アレルギーの検出
９１ｊ １による試験系を適用する。検査する試験細胞
懸濁液（細胞３×１０７個／ ｍｌ ）は給血者として
の潜在アレルギー患者から得た。この細胞懸濁液を用い
て例１の方法を繰返した。第２ノ々ノチにおいて他の量
の試験細胞懸濁液を３０分間３７’Ｃ；でＩｇＥで富化
したヒト血清と共に予め恒温保持した。その後、細胞を
２回トリス緩衝剤で洗浄し、その後側１に記載したよう
に処理した。結果を次表に記載する。
懸濁液（細胞３×１０７個／ ｍｌ ）は給血者として
の潜在アレルギー患者から得た。この細胞懸濁液を用い
て例１の方法を繰返した。第２ノ々ノチにおいて他の量
の試験細胞懸濁液を３０分間３７’Ｃ；でＩｇＥで富化
したヒト血清と共に予め恒温保持した。その後、細胞を
２回トリス緩衝剤で洗浄し、その後側１に記載したよう
に処理した。結果を次表に記載する。
これらの結果は、ＩｇＥと恒温保持する際にアレルギー
の存在に相応する吸光度差が得られ、ＩｇＥの不存在で
は吸光度差はアレルギーを示さな（・。
の存在に相応する吸光度差が得られ、ＩｇＥの不存在で
は吸光度差はアレルギーを示さな（・。
第１頁の続き
０発 明 者 ベーター・ヴンダーヴアルトドイツ連邦
共和国バウンスホー フェン・シュールシュトラーセ
共和国バウンスホー フェン・シュールシュトラーセ
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 細胞原理に基づいてアｌｚ／Ｌ４？−の存在の検出
及びアレ材−を誘導するアレルゲンの特異的検出の方法
において、試験すべき試料の白血球とアレルゲン又は細
胞崩壊による他の刺激因子とを水性媒体中で恒温保持し
、その後で白血球を分離しかつ残留する溶液を一般式：
〔式中Ｙはアミノ末端位に常用の保護基を有していてよ
いアミノ酸又はアミノ酸２個又は３個を有するペゾチド
を表わし、Ｘはアルギニン又は溶解素を表わしかつＣは
色原体残基を表わす］の化合物とｐＨ６，３〜８０で作
用性の緩衝剤の存在において恒温保持しかっ色原体残基
の遊離を測定することを特徴とするアレルギーの存在の
検出及びア固イーを８導するアレルゲンの特異的検出の
方法。 ２ Ｃがｐ−ニトロアニリン基である前記一般式の化合
物を使用する特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ ＹがＧｌｙ−Ｐｒｏを含有する前記一般式の化合物
を特徴とする特許請求の範囲第１項又は第２項記載の方
法。 ４ 前記一般式の化合物としてトシル−グリシル−プロ
リル−アルギニン−ｐ−ニトラニリドーアセテート又は
アルギニンの代りに溶解素を含有する相応する化合物を
使用する特許請求の範囲第１項〜第３項のいずれか１項
に記載の方法。 ５一般式：Ｙ−Ｘ−Ｃの化合物を担体結合の形で使用す
る特許請求の範囲第１項〜第４項のいずれか１項に記載
の方法。 ６ アノロチニンの存在において恒温保持する特許請求
の範囲第１項〜第５項のいずれか１項に記載の方法。 ７ 潜在アレルギーの存在を検出しかつ潜在アレルギー
を誘導するアレルゲンを特異的検出するに当り、予め試
験すべき試料の白血球をＩｇＥと恒温保持して行なう特
許請求の範囲第１項〜第６項のいずれか１項に記載の方
法。 ８ アプロチニンによる特異的阻害性Ｉ５ｏが１ｑ ／
ｍｌでありかつ大豆−トリプシン阻害剤による特異的
阻害性が０． Ｑ ５４１７モル／ｄで５０〜１００％
であることを特徴とする白血球プロテアーゼ。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE32112548 | 1982-03-26 | ||
| DE19823211254 DE3211254A1 (de) | 1982-03-26 | 1982-03-26 | Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58178258A true JPS58178258A (ja) | 1983-10-19 |
Family
ID=6159433
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58049043A Pending JPS58178258A (ja) | 1982-03-26 | 1983-03-25 | アレルギ−の存在の検出及びアレルギ−を誘導するアレルゲンの特異的検出の方法並びに白血球プロテア−ゼ |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4592997A (ja) |
| EP (1) | EP0090359B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58178258A (ja) |
| AT (1) | ATE39364T1 (ja) |
| AU (1) | AU537514B2 (ja) |
| CA (1) | CA1197778A (ja) |
| DE (2) | DE3211254A1 (ja) |
| IL (1) | IL68167A (ja) |
| ZA (1) | ZA832134B (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3446713A1 (de) * | 1984-12-21 | 1986-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | N-substituierte aziridin-2-carbonsaeurederivate, verfahren zu deren herstellung sowie diese substanzen enthaltende arzneimittel |
| DE3446714A1 (de) * | 1984-12-21 | 1986-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens |
| FI854634A0 (fi) * | 1985-11-22 | 1985-11-22 | Labsystems Oy | Foerfarande foer bestaemning av proteolytisk aktivitet. |
| US5480779A (en) * | 1988-09-07 | 1996-01-02 | Arzneimittelwerk Dresden Gmbh | Cyclosporine assay |
| US6632622B2 (en) * | 1989-10-25 | 2003-10-14 | Russell Jaffe | Assay for evaluation of cellular response to allergens |
| NZ235778A (en) * | 1989-10-25 | 1992-11-25 | Russell M Jaffe | Enzyme assay and assay kit to measure cellular activation |
| GB2246627B (en) * | 1990-08-01 | 1994-11-30 | Patricia Mary Becket Robertson | Allergy test kit and apparatus |
| SE467498B (sv) * | 1990-11-20 | 1992-07-27 | Vera Stejskal | Foerfarande foer in vitro analys av kvicksilverallergier |
| CN112205512A (zh) * | 2019-07-11 | 2021-01-12 | 江南大学 | 一种低致敏性植物蛋白肉的制备方法 |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE128691C (ja) * | ||||
| DE2527932C2 (de) * | 1974-07-02 | 1983-04-21 | Pentapharm AG, 4052 Basel | Säureadditionssalze von Tripeptidderivaten und deren Verwendung als Substrate zur Bestimmung von Plasmakallikrein |
| SE407058B (sv) * | 1974-12-05 | 1979-03-12 | Kabi Ab | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| CH622286A5 (ja) * | 1975-06-23 | 1981-03-31 | Pentapharm Ag | |
| SE407405B (sv) * | 1975-07-11 | 1979-03-26 | Kabi Ab | Nya kromogena trombinsubstrat |
| SE437153B (sv) * | 1976-12-01 | 1985-02-11 | Kabi Ab | Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| SE7801373L (sv) * | 1978-02-07 | 1979-08-08 | Kabi Ab | Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser |
| DE2905531A1 (de) * | 1979-02-14 | 1981-01-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Diagnostisches mittel zum nachweis von leukozyten in koerperfluessigkeiten |
| DE3147763A1 (de) * | 1981-12-02 | 1983-06-09 | Stickl, Helmut, Prof.Dr.Med., 8033 Krailling | Nachweisverfahren zur in vitro-bestimmung des bei einer allergie korrespondierenden allergens |
-
1982
- 1982-03-26 DE DE19823211254 patent/DE3211254A1/de not_active Ceased
-
1983
- 1983-03-17 US US06/476,452 patent/US4592997A/en not_active Expired - Lifetime
- 1983-03-17 IL IL68167A patent/IL68167A/xx not_active IP Right Cessation
- 1983-03-21 AU AU12620/83A patent/AU537514B2/en not_active Ceased
- 1983-03-24 AT AT83102949T patent/ATE39364T1/de not_active IP Right Cessation
- 1983-03-24 EP EP83102949A patent/EP0090359B1/de not_active Expired
- 1983-03-24 DE DE8383102949T patent/DE3378732D1/de not_active Expired
- 1983-03-25 CA CA000424570A patent/CA1197778A/en not_active Expired
- 1983-03-25 JP JP58049043A patent/JPS58178258A/ja active Pending
- 1983-03-25 ZA ZA832134A patent/ZA832134B/xx unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU537514B2 (en) | 1984-06-28 |
| IL68167A0 (en) | 1983-06-15 |
| CA1197778A (en) | 1985-12-10 |
| DE3378732D1 (en) | 1989-01-26 |
| EP0090359A3 (en) | 1985-04-10 |
| DE3211254A1 (de) | 1983-09-29 |
| IL68167A (en) | 1986-10-31 |
| ATE39364T1 (de) | 1989-01-15 |
| ZA832134B (en) | 1983-12-28 |
| EP0090359A2 (de) | 1983-10-05 |
| AU1262083A (en) | 1983-09-29 |
| US4592997A (en) | 1986-06-03 |
| EP0090359B1 (de) | 1988-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cuatrecasas | Perturbation of the insulin receptor of isolated fat cells with proteolytic enzymes: Direct measurement of insulin-receptor interactions | |
| Blands et al. | Flour allergy in bakers: I. Identification of allergenic fractions in flour and comparison of diagnostic methods | |
| Donaldson et al. | Action of complement in hereditary angioneurotic edema: the role of C′ 1-esterase | |
| Ungar et al. | Activation of profibrinolysin by antigen-antibody reaction and by anaphylactoid agents; its relation to complement | |
| EP0064274B1 (en) | Method for assaying antigen-antibody reactions and reagent therefor | |
| JPS60230066A (ja) | プロトロンビン時間測定用試薬 | |
| Dwenger et al. | Bronchoalveolar lavage fluid and plasma proteins, chemiluminescence response and protein contents of polymorphonuclear leukocytes from blood and lavage fluid in traumatized patients | |
| JP3451091B2 (ja) | 全血試料中に存在する分析対象成分の定量に用いる分析用キュベット、定量方法及び診断検査キット | |
| JPS58178258A (ja) | アレルギ−の存在の検出及びアレルギ−を誘導するアレルゲンの特異的検出の方法並びに白血球プロテア−ゼ | |
| US5073487A (en) | Rapid assay for functional human α1 -proteinase inhibitor | |
| Banks et al. | Measurement of the ‘fast’or complexed form of α2 macroglobulin in biological fluids using a sandwich enzyme immunoassay | |
| US6242197B1 (en) | Use of urinary trypsin inhibitor for the diagnosis of the onset of AIDS | |
| US5116731A (en) | Process for the detection of an allergy or an anti-allergic substance | |
| US3900558A (en) | Method of measuring histamine release from mast cells | |
| KR20190016446A (ko) | 호염기구 활성화 검사 방법 | |
| Chargelegue et al. | A longitudinal study of the IgG antibody response to HIV-1 pl7 gag protein in HIV-1+ patients with haemophilia: titre and avidity | |
| CN103995112A (zh) | 用于特异性动物毛皮屑过敏原IgE筛查的试纸条及其制备方法 | |
| RU2426130C2 (ru) | Экспресс-тест для диагностирования болезни альцгеймера | |
| AU625355B2 (en) | Reagent for the detection of the presence of an allergy and for the specific detection of the allergen responsible for the allergy | |
| Janssen et al. | Immunochemical determination of human tear lysozyme (muramidase) in keratoconjunctivitis sicca | |
| RU2164026C2 (ru) | Способ определения состояний шока и контроля за ходом лечения пациентов в состоянии шока | |
| Heistø et al. | Studies on trypsin treatment of red cells with special reference to differences between trypsin preparations | |
| CA1275041A (en) | Device for the detection of the presence of an allergy and for the specific detection of the allergen responsible for the allergy | |
| Berrens | Levels of lysyl-and arginyl-naphthylamidase in sera of normal and allergic subjects | |
| CA1038737A (en) | Method for detecting hepatitis associated antigen |