JPS58183089A - 酵素活性測定方法 - Google Patents

酵素活性測定方法

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JPS58183089A
JPS58183089A JP57065509A JP6550982A JPS58183089A JP S58183089 A JPS58183089 A JP S58183089A JP 57065509 A JP57065509 A JP 57065509A JP 6550982 A JP6550982 A JP 6550982A JP S58183089 A JPS58183089 A JP S58183089A
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reaction
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electrode
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JP57065509A
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Masako Notsuke
野附 正子
Masao Koyama
小山 昌夫
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Toshiba Corp
Tokyo Shibaura Electric Co Ltd
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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の技術分野〕 本発明は電、気化学的測足手法を用いたal!に累活性
測足装置に関する。
〔発明の技術的背景とその問題点」 従来、酵素活性の測定は、あるWI31Kを含む試料液
とその#素の基質を含む液と更に他の酵素、補酵素1発
色試薬等を添加して成ろ反応系において。
酵素作用により酵素基質に化学反応を行なわせ。
そのときの反応系のg&光度を測足するという方法で行
なわれている。
例えば、グルタミン酸ピルビン酸トランスアでナーゼ(
GPT)の酵素活性の場合、GPTをその基質と接触さ
せて該GPTの酵素作用によりピルビンSを生成し、そ
のピルビン酸をラクテートデヒドロナー−II’(LD
H)の酵素作用で還元する。このとき、この反応系に所
定濃度のニコチン酸ア(ドアデニンヌクレオチド(NA
DH)を共存させておくと時間の経過とともに該NAD
Hが減少してそのf11度が低下する。その濃度変化は
波長340mmにおけるNADHの吸+f渕足から知る
ことができる。したがって1間接的にGPro酵素活性
が摺足できることになる。
しかしながら、とO吸尤度測足法にあっては。
NADH,LDH又は各種O発色試桑などの高価な試薬
を用いかつそれらは側足後廃棄せざるを得ないため劇足
は極めてコスト高となる。また、懸濁物を含む反応系に
対しては吸光度創建が不可能となるため、それら試料に
あっては測定に先立って懸濁物の除去など前処理を必要
とする。
このような吸jt、11:測定の欠点を解決するために
、電気化学的測定法を適用した装置が提案されている(
特開昭56−97864号参照)にれは、試料中の酵素
が関与して生成する物質(検知物質)に作用する。ある
酵素を固足し九膜を添着して成る酵素電極を2本相互に
離して配設したフローシステムであって、試料中に当初
から含まれていた検知物質の与える電気信号をベース値
とし、更に試料中OII嵩の作用により該酵素の活性に
対応して生成した智質(検知物質)の与える電気信号を
[足し、両省の差から試料中のep票の活性を測定する
ものである。
しかしながらこの装置にあって#′i、2本の酵素電極
を用いるため両者の出力調整をすることが容易ではなく
その操作が極めて煩雑かつ多大な労力を要するものとな
る。
すなわち、感度、応答速度、ゲイン弊01IiIIIi
性が全く同じでかつその特性の経時変fヒも同一である
酵素電極t−製造するとと拡極めて困難である。
そのため、側足時にあっては各電極の出力Of!II整
が必要となるが、その場合でも、得られた検t*の直線
性、直線領域にそれぞれの電極では相違があり、そのた
め測定に誤差が生じる結果を招く。
また、フローシステムの液流路にあって2本の電極を相
互に離して配設した場合、液流路内で試料の拡散に基づ
く希釈現象が発生し下流OIEI位置では検知物質の濃
度が低下して、2本の電極間の出力差調整、差動増幅時
にあってはその調整が極めて困難となる。とくに、低活
性の酵素を含む徽皺の試料の劇足にあっては着るしく困
難である。
また、液流路内に酵素基質含有緩衝液を一足0流速で流
し、ここに試料液を注入し、Ijf路内を概れる間KI
I票七基質とを接触させて、酵素作用により減多若しく
に増加した検知物質の与える電気信号を下流に配設した
電極で検出して酵素活性を−j足するという方法も提案
されている(特公昭56−92445.92446号参
照)。
しかしながら、この方法にあっては、拭#=#注入口と
電極間の液流路はIl素と基質の反応の場であるため、
長い反応時間の低活性酵素の場合F′i液流路が長くな
る。また、流路が長くなればなるほどそれは注入した試
料OR路内での希釈が進み、十〇*+、[料注入1を増
すか、より流路を長くして反応時間を長くしなければな
らないという不都合が生ずる。
〔発明の目的〕
本発明は、電気化学的手法を甲いた従来装置におけみ上
記し九開題点を解決した新規な構造の酵素活性劇足装置
の提供を目的とする。
〔発明の概要〕
本発明装置は、電気化学的#1足手法を適用したフロー
システムによるwI素素性性測定装置あって。
検知物質の濃度を検知する電極が1本であること及び反
応系から電極までの液流路の途中に緩衝液供給部を*え
ていることを特徴とする。
すなわち1本発BA装置は、試料液供給部及び酵lE基
質含有液供給部から供給される試料液及び酵素基質含有
液を反応6せる反応部;該反応液の電気化学的信号変化
を検知する1本の電極を備え。
かつ、該反応部と激流路を介して接続する70−セル;
及び、鉄液流路に付設された緩衝液供給部;とから構成
されることを特徴とする。
本発明装置を絡1図に示した模式図に基づいて更に畦し
く観明する。図において、lは反応部。
2は70−セルで両者ttg流路3で接続されている。
反応Mlには、酵素を含む試料液の供給s4及び酵素基
質を含む酵素基質含有液の供給i!5がそれぞれ独立し
て配管6,6′  を介して接続されていて、それぞれ
からは注入用?tポンプ7.7′によって試料液及びl
1lP素基質含有液が反応部lに所定を供給され、ここ
で両者は例えばマグネチククスターラーによって混合自
接触される。このとき1反応系は、酵素と基質の反応に
適正な−に調整される。具体的に拡、酵素基質含有液に
適宜な緩衝物質t−金含有せることによって行なわれる
フローセル2には、酵素と基質の反L5糸における#工
作用により消費又は生成して経時的な濃度変化をする検
知物質に感応しその濃度変化を電気化学的信号(例えば
電流値)の変化に変換する1本の電極8が内置されてい
る。亀f8としては。
検知−質の濃度変化を検知し得る11L極であれば伺で
あってもよい。−えげ、p)l用ガラス電極、ア/モニ
タムイオン電極、アンモニアガス電極、グルコース、ピ
ルビン酸など有機物検卸用各種の#素電極【あけること
ができるe電極8からの信号は#Fsms9に導かれ、
ここで処理され演算されて酵素活性値が表示される。
10Fi緩衝猷の供給部であって、配管6N  を介し
て装着しくは電磁弁である流路切換パルプ11によp液
流路3に接続されている。該供給部には、飼えば′f#
素基質含有液から基質を除外した緩@液等の緩衝液が貯
留されている。
71は反応sS1の反応液及び緩衝液供給@100緩衝
液並びに両者の混合液を一定流速で所定量フローセル2
に導入するためのポンプである。ボングア 、 7’、
 71としてはプランジャータイプ、ペリスタタイプな
どのものをあげることができる。
側足終了後の液は排液[112に流入する。
本発明装置は次のようにして操作される。
まず、流路切換パルプ11を操作して緩衝液供給液10
−70−セル2の流路を形成し、ボングアIを作動して
フローセル2に所定の緩衝液を導入し電極8によってベ
ース信号を得る。ついで、パルプ11t−切換えて反応
部1−70−セル2の流路を形成し、ポンプ7.7′を
作動して試料液供給部4から標準酵素溶液を、基質含有
液供給部5からは上記緩衝液に基質を含有させた基質含
有液をそれぞれ所足蓋反応部1に注入し所定の時間両者
を接触5反応させ、得られた反応液をポンプ71によっ
て70−セル2に導入して電気信号を得る。
このときの電気信号とペース信号との差は標準酵素に対
応する検知物質の#I駄傷信号なる。したがりて、検知
物質のa&と電気信号との関係を検量線として作成して
おけば、この電気信号から検知物質011度、ひいては
酵素活性がm足できるととになる。飼えば、酵素がGP
T%したがって#素基質がL−アツユンとα−ケトグル
タル酸の場合。
GPTO@素作用に工作用ルビン酸が生成し、しかもそ
O生成量はGPTの活性に比ガする。この場合ピルビン
酸が検知物質となる。ピルビン酸はピルビン酸オキシダ
ー(によって酸素を消費し過酸化水嵩を生成して濃度変
化する。したがって。
酸素電極又は過酸化水素電極によりピルビン酸濃度は測
置される。ゆえに、ピルビン#!111!度と電極0電
気信号とから予め検量線を作成しておけば、電極からの
信号でピルビン酸のIIk度が、更にGPTのW!P素
活性が測足できることになる。11例えばLDHの酵素
活性については、ピルビン#濃度ことを利用して11足
することができる。
以上0被正操作を終了した後、試料液供給部4から酵l
L(活性未知)含有の試料液t−%lII票基質含有液
供給部5からは酵素基質含有液をそれぞれ所定量反応s
lに注入し、所定時間反応させ曳Oち反応液を70−竜
ル2に導入して検知物質O初期s度を電気信号として得
る。
つづいて、更に反応を進めその反応液170−セル2に
導入して検知物質O濃ft知る。ζ0ときの濃度変化に
対応する電気信号の変化生上記校正値とを比較すること
によって酵素活性が測足される。なお、各測足操作のた
びごとにパルプ11を切換えてフローセル2、電極8t
−緩衝液で洗浄してもよい。
〔発明の実施例〕
実[PlI  GPTPlI[[)If定コラーゲン繊
維を用いてピルビン酸オキシダーゼの包括固足化膜(膜
厚60 Ass *酵素活性40iυ/−)を作成し、
これを過酸化水素電極の電極感応部に、汚染防止用のセ
ルロース膜(膜厚40s111)とともに0−リyグで
装着して本発明にかかる電極とした。
緩衝液は、7ラビンアデンジヌクレオチド(FAD)0
.01 wag、塩化マノガン0−2mM、チアミンピ
ロリンl!(lカルメ命シラーゼ) 0.01p+M 
を含む0.05 Mリン酸緩衝[(p)17.4) で
あった。これ會緩at供給1610KjF?留し友。酵
素基質含有液は、上記緩衝液にα−ケトグルタル酸2m
M、L−アラニン50aM  を更に加えIN水酸化ナ
トリウムで−7,4に調整し九ものであった。これを供
給115に貯留しり、yNy17 、7’、 7#  
Fi、イfi4ベリスタボ/プ、配管系統は全て内径0
.5鵬のタイゴy?スープで形成し流路全体Vi37C
とした。
まず、パルプlit操作して供給部10−70−セル2
C)tlll&を形成し、ポンプ7〃により流速0.8
 d/mで緩衝液を送液してここに各#度のピルピノ酸
を注入して電@Oピルビン酸の検を線を作成した。結果
は第2mのとおりであった。
つfに、パルプ11を切換え1反応部−フロー竜ルの流
路を形成しえ0反応W61にはGPT含有O試料[10
0μ!、基質官有@900μlを注入しマグネチッタス
ターラーで混合した。反応液は上記流速でブローセルに
導入させ、電極からの信号を測定した。その結果を信号
値(電R)とGPT活性の関係として1/g3図に示し
た。
第3図は、従来法の吸光度ll1j足の結果とよく一致
し次。
実施例2  LDH酵素活性011J足酵素基質含有液
として実施例1の緩衝液に50mMの乳酸% 15mM
のニコチン酸ア省ドアデニンジヌタレオチド(NAD)
t−加え、IN水酸化ナトリウムで−8,4に調整した
溶液を用い友こと、試料液がLDHを含有する試料液で
あることを除いては実施例1と同様にしてLDHO酵素
活性t−測定した。
その結果を第4図に示した。図の結果線吸党[11足の
結果とよく一致した。
〔発明の効果J 以上の説明で明らかなように1本発明装置は用いる電極
が1本であシ従米のような煩雑か□つ労力のいる電極の
出力調整の作業が不要となり、その取扱いが極めて簡便
となるので極めて有用である。
【図面の簡単な説明】
@imlは本発v4羨置を説明するための模式図、11
12図は実施例1で用い皮電極のピルビン酸の検量1.
111311.11114riAuソt1.ツレGPT
、LDH(D酵素活性K1mする検量線である。 l・・・反応部、2・・・ブローセル、3・・・液流路
、4・・・試料液供給部、S・−・酵素基質含有液供給
部。 6 、 @’、 II#・・・配管、7.7’、71・
・ポンプ、8・・・電極、9・・・針橢部、10・・・
緩衝敵供給部、11・・・流路切換えパルプ、12・・
・排液タンク。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1、 試料液供給部及び酵素基質含有液供給部から供給
    される試料液及び酵素基質含有液を反応させる反応部; 皺反応畝の電気化学的信号変化を検知する1本O電極を
    備え−かつ、該反応部と液流路を介して接続する70−
    セル;及び #411111路に付設された緩衝液供給部;とから成
    ることを特徴とするI#素素性性測定装置Z  gra
    mがピルビン酸センサである特許精求O範l!第1項記
    載Or#嵩活性劇足装置。 λ #酵素がグルタミン駿ピルビン酸トラyxアミナー
    ゼ若しくはラクテートデヒドロナーゼである特許請求の
    範8第1項記載の酵素活性軸足装置。
JP57065509A 1982-04-21 1982-04-21 酵素活性測定方法 Granted JPS58183089A (ja)

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JPS6258717B2 JPS6258717B2 (ja) 1987-12-07

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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5558461A (en) * 1978-10-25 1980-05-01 Hitachi Ltd Oxygen utilizing analysis device

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5558461A (en) * 1978-10-25 1980-05-01 Hitachi Ltd Oxygen utilizing analysis device

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