JPS58201979A - ヒトインタ−ロイキン２遺伝子が組込まれているエシエリヒア・コリおよびその育種方法 - Google Patents
ヒトインタ−ロイキン２遺伝子が組込まれているエシエリヒア・コリおよびその育種方法Info
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- JPS58201979A JPS58201979A JP57082509A JP8250982A JPS58201979A JP S58201979 A JPS58201979 A JP S58201979A JP 57082509 A JP57082509 A JP 57082509A JP 8250982 A JP8250982 A JP 8250982A JP S58201979 A JPS58201979 A JP S58201979A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトインターロイキン２遺伝子が組込まれてい
るエシェリヒア・コリおよびその育種方法ＫＩＩＩＬ、
詳しくは遺伝子組換え技術によって創製したエシェリヒ
ア・コリおよびその育種方法に関Ｊる。
るエシェリヒア・コリおよびその育種方法ＫＩＩＩＬ、
詳しくは遺伝子組換え技術によって創製したエシェリヒ
ア・コリおよびその育種方法に関Ｊる。
エシェリヒア・コリは組換えＤＮＡ （デオキシリポ核
酸〕実験の材料として良く用いられており、ヒトインタ
ーフェロンなどの有用物質の生産に関しても提案がなさ
れている。
酸〕実験の材料として良く用いられており、ヒトインタ
ーフェロンなどの有用物質の生産に関しても提案がなさ
れている。
リンパ球が産生する生物活性、薬理活性のある可溶性の
蛋白性因子であるリンホカイｙは生体内において微量で
生体の免疫応答機構を調節する作用を有している。リン
ホカインは、その免疫活性物質としての性格より汎く抗
腫瘍剤、抗ウィルス剤、抗菌剤、免疫不全症治療剤、自
己免疫疾患治療剤としての有用性が期待されている（ム
ｄｖ、ｉｎＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ、ｅ ５０７．１９
８Ｇ ）。とりわけ、インターロイキン２はその特異な
免疫応答作用から医薬への応用が注目されている。
蛋白性因子であるリンホカイｙは生体内において微量で
生体の免疫応答機構を調節する作用を有している。リン
ホカインは、その免疫活性物質としての性格より汎く抗
腫瘍剤、抗ウィルス剤、抗菌剤、免疫不全症治療剤、自
己免疫疾患治療剤としての有用性が期待されている（ム
ｄｖ、ｉｎＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ、ｅ ５０７．１９
８Ｇ ）。とりわけ、インターロイキン２はその特異な
免疫応答作用から医薬への応用が注目されている。
ヒトインターロイキン２を産生するヒトＴ白点病細胞株
が１株見出されたことが報告されている（ギリスら、Ｊ
、１）Ｃ１）、 Ｍｅｄ、、 １５２巻、１７０９頁。
が１株見出されたことが報告されている（ギリスら、Ｊ
、１）Ｃ１）、 Ｍｅｄ、、 １５２巻、１７０９頁。
１９８０年）。しかし、このヒト！白血病細胞株による
ヒトインターロイキン２の生産量は極めて微量であり、
しかもその生産手段は大量細胞培養技術を含み非常ＫＩ
Ｆ維である。
ヒトインターロイキン２の生産量は極めて微量であり、
しかもその生産手段は大量細胞培養技術を含み非常ＫＩ
Ｆ維である。
ヒトインターロイキン２を製造するための他の方法とし
ては、ヒトインターロイキン２に対応するＤＮＡを微生
物のベクターに組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻
訳せしめて微生物により生産させることが考えられる。
ては、ヒトインターロイキン２に対応するＤＮＡを微生
物のベクターに組込んで微生物細胞内で複製、転写、翻
訳せしめて微生物により生産させることが考えられる。
しかしながら、ヒトインターロイキン２に対応するＤＮ
Ａはクローンされていないので、この方法を実施するこ
とはできな〜・。
Ａはクローンされていないので、この方法を実施するこ
とはできな〜・。
本発明者らは、ヒトインターロイキン２の生物学的作用
、生産方法などについて研究を重ねてきたが、その過程
にお（・てヒトリンパ球由来細胞からヒトインターロイ
キン２に対応するメッセンジャーＲＮＡ（リボ核酸）（
以下、ｍＲＮＡと略称する。）を抽出することに成功し
、このｍＲＮＡからこれに対応するＤＮＡを調製するこ
とに成功した。さらに、このようにして得たＤＮＡを微
生物細胞内で発現することＫよって目的とするヒトイン
ターロイキン２を製造できることを見出した。
、生産方法などについて研究を重ねてきたが、その過程
にお（・てヒトリンパ球由来細胞からヒトインターロイ
キン２に対応するメッセンジャーＲＮＡ（リボ核酸）（
以下、ｍＲＮＡと略称する。）を抽出することに成功し
、このｍＲＮＡからこれに対応するＤＮＡを調製するこ
とに成功した。さらに、このようにして得たＤＮＡを微
生物細胞内で発現することＫよって目的とするヒトイン
ターロイキン２を製造できることを見出した。
本発明はヒトインターロイキン２遺伝子を有するエシェ
リヒア・コリおよびその育種方法を提供するものである
。
リヒア・コリおよびその育種方法を提供するものである
。
本発明のエシェリヒア・コリは以下に示す遺伝子組換え
技術によって創製することができる。すなわち、ヒトイ
ンターロイキン２に対応し、ショ糖密度勾配遠心法（以
下、８ＤＧ遠心法と略称する。）による分画により１１
〜１２８１ｉ分として得られるｍＲＮＡをヒトリンパ球
由来細胞より分離し、このｍＲＮＡに相補的なりＮＡを
調製し、該ＤＮＡをプラスミドベクターに組込み、こり
ノ・イブリッド・プラスミドをエシェリヒア・コリの細
胞に導入することを特徴とするヒトインターロイキン２
遺伝子が組込まれて〜・るエシェリヒア・コリの育種方
法である。
技術によって創製することができる。すなわち、ヒトイ
ンターロイキン２に対応し、ショ糖密度勾配遠心法（以
下、８ＤＧ遠心法と略称する。）による分画により１１
〜１２８１ｉ分として得られるｍＲＮＡをヒトリンパ球
由来細胞より分離し、このｍＲＮＡに相補的なりＮＡを
調製し、該ＤＮＡをプラスミドベクターに組込み、こり
ノ・イブリッド・プラスミドをエシェリヒア・コリの細
胞に導入することを特徴とするヒトインターロイキン２
遺伝子が組込まれて〜・るエシェリヒア・コリの育種方
法である。
本発明に用いられるｍＲＮＡは、上記したように、ヒト
インターロイキン２に対応し、８ＤＧ達心法やゲルト過
法等による分画ならびにアガロースゲル電気泳動法によ
り１１〜１２８画分として得られるものであり、このｎ
ｎＲＮムはヒトリンノく球由来細胞より抽出１分離する
ことによって製造できる。
インターロイキン２に対応し、８ＤＧ達心法やゲルト過
法等による分画ならびにアガロースゲル電気泳動法によ
り１１〜１２８画分として得られるものであり、このｎ
ｎＲＮムはヒトリンノく球由来細胞より抽出１分離する
ことによって製造できる。
本発明に用いるヒトインターロイキン２産生能を有する
ヒトリンパ球由来細胞としてヒト末梢能、扁桃朦、牌臓
等より得られるリンパ球そのものも含まれる。また、こ
れらのリンパ球をナイロンカラム処理、抗血清−補体処
理、密度勾配分画および酵素（ノイラミニダーゼ、ガラ
クトース酸化酵素等）処理などの前処理をしたもの並び
ＥＸ線等による変異処理およびトリプシン等の酵素処理
等によりインターロイキン２の産生能が付与されたもの
も本発明のヒトリンパ球由来細胞に含まれる。
ヒトリンパ球由来細胞としてヒト末梢能、扁桃朦、牌臓
等より得られるリンパ球そのものも含まれる。また、こ
れらのリンパ球をナイロンカラム処理、抗血清−補体処
理、密度勾配分画および酵素（ノイラミニダーゼ、ガラ
クトース酸化酵素等）処理などの前処理をしたもの並び
ＥＸ線等による変異処理およびトリプシン等の酵素処理
等によりインターロイキン２の産生能が付与されたもの
も本発明のヒトリンパ球由来細胞に含まれる。
さらに、これらヒトリンパ球由来細胞を、たとえばＴ
ＩＪンバ球をＴ リンパ球成長因子等の存在下にクロー
ン化したように、クロ゛−ン化したものも好ましいヒト
リンパ球由来細胞である。
ＩＪンバ球をＴ リンパ球成長因子等の存在下にクロー
ン化したように、クロ゛−ン化したものも好ましいヒト
リンパ球由来細胞である。
また、ヒト白面病細胞およびＴ ＩＪンノ（腫細胞のよ
うなヒトリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性
化細胞を上記のような前処理もしくは変異処理したもの
または悪性化細胞をクローン化したものがより好ましい
ヒトリンパ球由来細胞として用いることができる。特に
クローン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通
常多い。
うなヒトリンパ球悪性化細胞やこれらヒトリンパ球悪性
化細胞を上記のような前処理もしくは変異処理したもの
または悪性化細胞をクローン化したものがより好ましい
ヒトリンパ球由来細胞として用いることができる。特に
クローン化細胞株は親株に比べ抽出されるｍＲＮＡが通
常多い。
さらに、上記のヒトリンパ球由来細胞とＯＥＭ。
Ｍｏ１１４Ｆ等のヒト腫瘍細胞とを細胞融合せしめて得
られる。いわゆるハイプリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
られる。いわゆるハイプリドーマも好適なヒトリンパ球
由来細胞として使用できる。
これらヒトリンパ球由来細ＵＫは（１）自発的にインタ
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生ずるものがある。
ーロイキン２を産生ずるもの、（２）他の細胞の存在下
または非存在下にマイトゲンと接触せしめて刺激するこ
とによりインターロイキン２を産生ずるものがある。
ヒトリンパ球由来細胞にｍＲＮＡを生成せしめるにあた
り、インターロイキン２自発産生株を用いる場合には、
これら細胞を通常の方法で培養すればよい。マイトゲン
刺激によりインターロイキン２を産生する細胞を用いる
場合には、細胞を十分に洗浄後、ローズウェル・パーク
・メモリアル・インスチチュート１６４０ （以下、
ＲＰＭ１１６４０と略記する。）培地、ダルベツコのイ
ーグルス変形（ＤｕｌｂρｃＣｃ＋’Ｓｍｎｄｉｆｊｐ
ｄ Ｅ／］４１ｅｓ ）培地、クリック培地などの通常
の細胞用培地（血清や血清成分は含有しても含有Ｌ７な
くてもよい）や合成無血清培地に０．５〜４メ１０６個
、／ ｍｌの細胞密度で懸濁ｌ、ここにマイトゲン；ノ
イラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；噛化亜鉛等の
亜鉛化合物ｉプロティンＡ、ストレプトリジン−０等の
菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後、細胞を洗浄
、刺激剤を除去する。
り、インターロイキン２自発産生株を用いる場合には、
これら細胞を通常の方法で培養すればよい。マイトゲン
刺激によりインターロイキン２を産生する細胞を用いる
場合には、細胞を十分に洗浄後、ローズウェル・パーク
・メモリアル・インスチチュート１６４０ （以下、
ＲＰＭ１１６４０と略記する。）培地、ダルベツコのイ
ーグルス変形（ＤｕｌｂρｃＣｃ＋’Ｓｍｎｄｉｆｊｐ
ｄ Ｅ／］４１ｅｓ ）培地、クリック培地などの通常
の細胞用培地（血清や血清成分は含有しても含有Ｌ７な
くてもよい）や合成無血清培地に０．５〜４メ１０６個
、／ ｍｌの細胞密度で懸濁ｌ、ここにマイトゲン；ノ
イラミニダーゼ、ガラクトース酸化酵素；噛化亜鉛等の
亜鉛化合物ｉプロティンＡ、ストレプトリジン−０等の
菌体由来リンパ球活性化成分を添加した後、細胞を洗浄
、刺激剤を除去する。
マイトゲン刺激の際にマクロファージやプントリティッ
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
細胞やＢ Ｉ）ンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ
、 Ｄａｕｄｉ 、 Ｋ５６２ 、 ＴＩＡＬＬ−
１細胞を共存させると同様にインターロイキン２の産生
能がみられるような細胞があり、これらの細胞を用℃・
てｍＲＮＡを生成せしめる場合には、これらの細胞の存
在下にマイトゲン刺激を行なう。このようＫすると、ｒ
ｒ：ＲＮＡの収量は上昇することがある。
ク細胞を共存させるとインターロイキン２を産生しうる
細胞やＢ Ｉ）ンパ球やＢリンパ球由来細胞株Ｒａｊｉ
、 Ｄａｕｄｉ 、 Ｋ５６２ 、 ＴＩＡＬＬ−
１細胞を共存させると同様にインターロイキン２の産生
能がみられるような細胞があり、これらの細胞を用℃・
てｍＲＮＡを生成せしめる場合には、これらの細胞の存
在下にマイトゲン刺激を行なう。このようＫすると、ｒ
ｒ：ＲＮＡの収量は上昇することがある。
ヒトリンパ球由来細胞は、通常の条件で試験管内もしく
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行な５ことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
は動物種中で継代、増殖させる。試験管内での培養継代
は通常の細胞培養用培地を用いて行な５ことが可能であ
り、哺乳動物由来の血清。
ｎ’ｈｍ成分もしくは血清アＡ・ブミンが含有されて（
・石培池でも向ｒ＾′アルブミン１ら含まない合成前血
清培地でも、これらの細胞株は培養、増殖させることが
可能で、かつ本発明の細胞材料として用いることができ
ることが判った。
・石培池でも向ｒ＾′アルブミン１ら含まない合成前血
清培地でも、これらの細胞株は培養、増殖させることが
可能で、かつ本発明の細胞材料として用いることができ
ることが判った。
リンパ球由来細胞の培養時間は、リンパ球が活性化され
、 ｍＲＮＡが生成される時間であり、この時間は細胞
の培養上溝にインターロイキン２が産生され始めた頃に
相当する。具体的には通常、刺激剤添加後３〜１２時間
である。徒らに培養時間を延ばすと、生成したｍＲＮＡ
が分解されてしまう。
、 ｍＲＮＡが生成される時間であり、この時間は細胞
の培養上溝にインターロイキン２が産生され始めた頃に
相当する。具体的には通常、刺激剤添加後３〜１２時間
である。徒らに培養時間を延ばすと、生成したｍＲＮＡ
が分解されてしまう。
また、リンパ球活性化に際し、ＰＭムやＴＰＡなどのホ
ルボールエステル類を１０〜５０ ｎ９７ｍ１添加する
こともある。培養温度は３２〜３７℃の範囲が望ましい
。
ルボールエステル類を１０〜５０ ｎ９７ｍ１添加する
こともある。培養温度は３２〜３７℃の範囲が望ましい
。
以下にインターロイキン２を産生ずる能力を有するヒト
リンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明する
。
リンパ球由来細胞の培養方法をさらに具体的に説明する
。
０） リンホカイン自発産生株の取得
ヒ）７９７７球由来白血病細胞であるジュルカット細胞
（７レツド・ハツチンソン・癌研究所シアトル／アメリ
カ、ソーク研究所／サンジ１ゴ／アメリカ、西ドイツ国
立癌センター／）・イデルペルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）を１×１０６個／ｄの細胞密度でクリック
培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度で
合計ｓ、ｏｏ。
（７レツド・ハツチンソン・癌研究所シアトル／アメリ
カ、ソーク研究所／サンジ１ゴ／アメリカ、西ドイツ国
立癌センター／）・イデルペルヒ／西ドイツ等で自由に
手に入る。）を１×１０６個／ｄの細胞密度でクリック
培地中に懸濁させ、１５０レントゲン／分の照射速度で
合計ｓ、ｏｏ。
レントゲンのＸ線照射を行なう。この後、本細胞をＯ１
細胞／２００μｌの細胞密度で９６穴の平底マイクロタ
イタープレート（［ファルコン３０７２−１）Ｋ添加し
、５％牛脂児血清を含むクリック培地中で３週間３７°
ＣＫて５％ＣＯｅインキュベーター中にて培養する（限
界希釈法によるクローニング）。
細胞／２００μｌの細胞密度で９６穴の平底マイクロタ
イタープレート（［ファルコン３０７２−１）Ｋ添加し
、５％牛脂児血清を含むクリック培地中で３週間３７°
ＣＫて５％ＣＯｅインキュベーター中にて培養する（限
界希釈法によるクローニング）。
細胞の生育が認められた培養ウェル中の細胞は、細胞が
底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社
製培養プレートに移し、２ｄのクリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。十分量の細胞が得もねた場合には
、本細胞を２ Ｘ １０’個／ｍｅの細胞密度にて血清
も血清由来アルブミンも含まない無血清合成培地２１に
懸濁して２日間培養し、本培養上清を３０００ｒｐｒｎ
、 ５分間の遠心分離操作で分離し、次いで０，２２
μのミリポアフィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行
なう。
底面全体をおおう密度に到達する前に２４穴のヌンク社
製培養プレートに移し、２ｄのクリック培地中にて５日
間細胞を増殖させる。十分量の細胞が得もねた場合には
、本細胞を２ Ｘ １０’個／ｍｅの細胞密度にて血清
も血清由来アルブミンも含まない無血清合成培地２１に
懸濁して２日間培養し、本培養上清を３０００ｒｐｒｎ
、 ５分間の遠心分離操作で分離し、次いで０，２２
μのミリポアフィルタ−にてデブリス除去と無菌化を行
なう。
こうして得られるクローン化細胞よりインターロイキン
２産生株が得られる。
２産生株が得られる。
（ロ） ヒト末梢血１９７７球よりインターロイキン２
産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をＩ Ｘ １０’個／ｍｌの細胞密度でクリック
培地に懸濁し、各２１宛２４穴のヌンクの培養プレート
に接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ（キプコ
社製）を５μり／ａｔの終末濃度になるように１００μ
ｌ添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで細胞
を培養液で洗浄し、再びＩ Ｘ １０６個／ＩＰＬｌの
細胞密度で元のヌンクの培養プレートに１ｄ宛まく。各
ウェルにラットの牌臓細胞をコンカナバリンＡ２．５μ
９７ｍ１で４８ｆＩｎＪ５刺激して得たコンディショニ
ングした培養液を１ｄ添加し、３日間同様の培養を繰り
返し、ヒト末梢血より得た７＋ １Ｊ ７ｌ球を長期継
代培養する。
産生株の取得 ヒトの末梢血を採血し、フィコール・ハイバークの密度
勾配遠心法により末梢血リンパ球を採取する。本末梢リ
ンパ球をＩ Ｘ １０’個／ｍｌの細胞密度でクリック
培地に懸濁し、各２１宛２４穴のヌンクの培養プレート
に接種する。ここにフィトヘマグルチニン−Ｍ（キプコ
社製）を５μり／ａｔの終末濃度になるように１００μ
ｌ添加し、上述の条件下に４８時間培養し、次いで細胞
を培養液で洗浄し、再びＩ Ｘ １０６個／ＩＰＬｌの
細胞密度で元のヌンクの培養プレートに１ｄ宛まく。各
ウェルにラットの牌臓細胞をコンカナバリンＡ２．５μ
９７ｍ１で４８ｆＩｎＪ５刺激して得たコンディショニ
ングした培養液を１ｄ添加し、３日間同様の培養を繰り
返し、ヒト末梢血より得た７＋ １Ｊ ７ｌ球を長期継
代培養する。
このように長期継代培養して得たＴ ＩＪンパ球を。
前述と同様の限界希釈法でクローニングおよび細胞増殖
を行なう。、こうして得られたクローン化１９７７球を
Ｉ×１０″′個／′ｍｌの細胞密度にＲＰＭ１１６４０
培地Ｋｌ濁し、ここに１０ ｐ９７７ｍｌの終末濃度に
なるようにフィトヘマグルチニン（ＰＩＩＡ）を添加し
、２４時間、３７℃で７５％ＣＯ，インキュベーター中
にて培＠ｌ、本培養上清を３．００Ｏｒｐｍ、５分間の
遠心分離操作で分離し、次〜・で０２２μのミリポアフ
ィルタ−で無菌化４行なう。
を行なう。、こうして得られたクローン化１９７７球を
Ｉ×１０″′個／′ｍｌの細胞密度にＲＰＭ１１６４０
培地Ｋｌ濁し、ここに１０ ｐ９７７ｍｌの終末濃度に
なるようにフィトヘマグルチニン（ＰＩＩＡ）を添加し
、２４時間、３７℃で７５％ＣＯ，インキュベーター中
にて培＠ｌ、本培養上清を３．００Ｏｒｐｍ、５分間の
遠心分離操作で分離し、次〜・で０２２μのミリポアフ
ィルタ−で無菌化４行なう。
こうし−て得られるクローン化細胞よりインターロイキ
ン２産−住棟が得られる。
ン２産−住棟が得られる。
（ハ） マイトゲン刺激でインターロイキン２を生産す
るヒ） ９７７球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカ
ット細胞や前記した限界希釈法によりクローン化された
Ｊ−１１１株は、前記の無血清培地や面清１〜２％を含
むＲＰＭＩ １６４０培地中にてコンカナバリンＡ（以
下、ＣθｎＡと略称する− ）１０μりｙ’、、ｌｌ
′やＰＩＩＡ ２５ｔｔり／ｂＩｉの存在下（で２４時
間培養すると、ｌ０＝４，０００単能ろｌでのインター
ロイキン２を産生することが判明し、た。また、鳩化亜
鉛、プロティンＡ、ピシバニール存在下に培養して本、
インターロイキン２を産生ずる。
るヒ） ９７７球由来悪性化細胞の取得前述のジュルカ
ット細胞や前記した限界希釈法によりクローン化された
Ｊ−１１１株は、前記の無血清培地や面清１〜２％を含
むＲＰＭＩ １６４０培地中にてコンカナバリンＡ（以
下、ＣθｎＡと略称する− ）１０μりｙ’、、ｌｌ
′やＰＩＩＡ ２５ｔｔり／ｂＩｉの存在下（で２４時
間培養すると、ｌ０＝４，０００単能ろｌでのインター
ロイキン２を産生することが判明し、た。また、鳩化亜
鉛、プロティンＡ、ピシバニール存在下に培養して本、
インターロイキン２を産生ずる。
（ロ） 他の細胞もしくはその細胞の産生づる因子の存
在下にマイトゲンで刺激することＫよりインターロイキ
ン２を産生する細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ
１ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュル
ヵット細胞の１つのクローンジェルカット９９株は、上
述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加え
て２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生
じない。ところが、この間モノ力インの１種であるイン
ターロイキン１を５〜１０μ／ａｔ ｆたはに５６２
やラージ（Ｒａｊｔ）細胞をｌＸｌ０″細胞／ｄ当り０
．５Ｘ１０’個１ｒｒｒｌ相当共存させてクリック培地
中にて３７’Ｃ，２４時間培養すると、インターロイキ
ン２を１０〜１００μ／ゴ産生する。
在下にマイトゲンで刺激することＫよりインターロイキ
ン２を産生する細胞の取得ヒトリンパ球悪性化細胞Ｍｏ
１ｔ４Ｆや前述の限界希釈法でクローン化されたジュル
ヵット細胞の１つのクローンジェルカット９９株は、上
述のごときレクチンやマイトゲンを広い濃度範囲で加え
て２４〜７２時間培養してもインターロイキン２を産生
じない。ところが、この間モノ力インの１種であるイン
ターロイキン１を５〜１０μ／ａｔ ｆたはに５６２
やラージ（Ｒａｊｔ）細胞をｌＸｌ０″細胞／ｄ当り０
．５Ｘ１０’個１ｒｒｒｌ相当共存させてクリック培地
中にて３７’Ｃ，２４時間培養すると、インターロイキ
ン２を１０〜１００μ／ゴ産生する。
このようにし、て得られた細胞よりインターロイキン２
に対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わ
ず常法岐よって行なえはよい。たとえば、ＮＰ−４０，
ＳＤ８． ＴｒｉｔｏｎＸ １００デオキシコール酸な
どの界面活性剤を使用するが、ホモゲナイザーや凍結融
解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完
全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際ＫＲＮａ
ｓｅｋよるＲＮＡの分解を防りタめに、抽出液中ＫＲＮ
ａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニル硫
酸、ベントナイト。
に対応するｍＲＮＡを抽出するには、細胞の種類を問わ
ず常法岐よって行なえはよい。たとえば、ＮＰ−４０，
ＳＤ８． ＴｒｉｔｏｎＸ １００デオキシコール酸な
どの界面活性剤を使用するが、ホモゲナイザーや凍結融
解などの物理的方法を用いて、細胞を部分的あるいは完
全に破壊、可溶化する方法を行なう。抽出の際ＫＲＮａ
ｓｅｋよるＲＮＡの分解を防りタめに、抽出液中ＫＲＮ
ａｓｅインヒビター、たとえばヘパリン、ポリビニル硫
酸、ベントナイト。
ツカロイド。ジエチルピロカーボネイト、バナジウム複
合体などを添加して槌くのが好ましい。また、場合に応
じては、インターロイキン２に対応する抗体を用いてイ
ンターロイキン２合成逮上のポリゾームを沈降せしめ、
これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行
なうことができる。
合体などを添加して槌くのが好ましい。また、場合に応
じては、インターロイキン２に対応する抗体を用いてイ
ンターロイキン２合成逮上のポリゾームを沈降せしめ、
これよりｍＲＮＡを界面活性剤などで抽出する方法も行
なうことができる。
また、本発明に用いるｍ’ＲＮＡの精製についてはオリ
ゴｄＴ−セルロース、ポリＵ−セファロース。
ゴｄＴ−セルロース、ポリＵ−セファロース。
セファロース２Ｂなどの吸着カラムあるいはバッチ法に
よる精製法、 ８ＤＧ遠心法による分画等によって行な
うことができる。このような精製操作によりｍＲＮＡは
１ｌ−１２８１ｉＩｉｉ分として得られる。
よる精製法、 ８ＤＧ遠心法による分画等によって行な
うことができる。このような精製操作によりｍＲＮＡは
１ｌ−１２８１ｉＩｉｉ分として得られる。
上記の如くして得られたｍＲＮＡが目的とするインター
ロイキン２に対応するものであることを確ｇするためＫ
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるが
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえはｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用
いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｃｎｏｐｕｓ
１ａｅｖｉｓ ）の卵母細胞にｍ１ＬＮＡを注入して
翻訳させる、あるいはＲムｔ ｉｒ ｕｌｏ−ｃｙｔＱ
−コｙｚａｔｅ 、網状赤血球ライゼート、 Ｗｈｅａ
ｔｇｅｒｍ などの無細胞系で蛋白Ｋ１１訳させるこ
とが行なわれている。
ロイキン２に対応するものであることを確ｇするためＫ
は、ｍＲＮＡを蛋白に翻訳させその生理活性を調べるが
、抗体等を用いてその蛋白を同定する等の方法を行なえ
ばよい。たとえはｍＲＮＡを蛋白に翻訳するのによく用
いられる系であるアフリカッメガエル（Ｘｃｎｏｐｕｓ
１ａｅｖｉｓ ）の卵母細胞にｍ１ＬＮＡを注入して
翻訳させる、あるいはＲムｔ ｉｒ ｕｌｏ−ｃｙｔＱ
−コｙｚａｔｅ 、網状赤血球ライゼート、 Ｗｈｅａ
ｔｇｅｒｍ などの無細胞系で蛋白Ｋ１１訳させるこ
とが行なわれている。
ここに用いたインターロイキン２の活性検定法は次の通
りである。即ち、検体１９０ ｔｒｌを９６穴マイクロ
タイタープｌ／−トの１列目に添加し、２％の牛胎児血
清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地に２倍希釈を繰り
返して、９６六マイクロプレート上において各１００μ
ｌの希釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒ
ｅ 、 ２６８巻、１５４頁、 （１９７７））によっ
て教示された方法に従って作成した活性化Ｔ ＩＪ ７
パ球株を、４ ×１０３個／１００ｔｔｌの細胞密度と
して１００μｌ宛各くぼみに添加する。３７°Ｃ２５％
炭酸ガスインキコベーター中２０時間＃置培養後、トリ
チウム化チミジン０５μｃ１を加え、４時間パルスを行
なった後、この分野で良く知られた方法に従って細胞を
採取し、細胞内にとり込まれた放射線量を測定する。イ
ンターロイキン２活性の高い培養上清はど活性化１゛リ
ンパ球内にとり込まれるトリチウムチミジン量が多いこ
とから、検体中に含有されるインターロイキン２量を容
易に知ることができる。
りである。即ち、検体１９０ ｔｒｌを９６穴マイクロ
タイタープｌ／−トの１列目に添加し、２％の牛胎児血
清を含有するＲＰＭＩ １６４０培地に２倍希釈を繰り
返して、９６六マイクロプレート上において各１００μ
ｌの希釈系列を作成する。そこにギリスら（Ｎａｔｕｒ
ｅ 、 ２６８巻、１５４頁、 （１９７７））によっ
て教示された方法に従って作成した活性化Ｔ ＩＪ ７
パ球株を、４ ×１０３個／１００ｔｔｌの細胞密度と
して１００μｌ宛各くぼみに添加する。３７°Ｃ２５％
炭酸ガスインキコベーター中２０時間＃置培養後、トリ
チウム化チミジン０５μｃ１を加え、４時間パルスを行
なった後、この分野で良く知られた方法に従って細胞を
採取し、細胞内にとり込まれた放射線量を測定する。イ
ンターロイキン２活性の高い培養上清はど活性化１゛リ
ンパ球内にとり込まれるトリチウムチミジン量が多いこ
とから、検体中に含有されるインターロイキン２量を容
易に知ることができる。
かくして得られたインターロイキン２ ｍＲＮＡよりイ
ンヒドロで相補的なりＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、微生
物のベクターなどに組込んで微生物等でインターロイキ
ン２を生産することを可能ならしめる。
ンヒドロで相補的なりＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成し、微生
物のベクターなどに組込んで微生物等でインターロイキ
ン２を生産することを可能ならしめる。
このようなＣＤＮＡの合成は、通常試験管内で次のｒう
な方法で行なうことができる。
な方法で行なうことができる。
！ＴｌＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴをプライマーとし
て、ｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＴ
’ｌ’Ｐの存在下で逆転写薄紫によりｍＲＮＡと相補的
な単鎖ｃＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡ
を分解、除去１−だ後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にし
て、逆転耳障１ｇあるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて
二重値ｒ：ＩＩＮＡを合成する。
て、ｄＡＴＰ 、 ｄＧＴＰ 、 ｄＣＴＰ 、 ｄＴ
’ｌ’Ｐの存在下で逆転写薄紫によりｍＲＮＡと相補的
な単鎖ｃＤＮＡを合成し、アルカリ処理で鋳型ｍＲＮＡ
を分解、除去１−だ後、今度は単鎖ｃＤＮＡを鋳型にし
て、逆転耳障１ｇあるいはＤＮＡポリメラーゼを用いて
二重値ｒ：ＩＩＮＡを合成する。
次いで、得られたＤＮＡ両端を必１）Ｋよりエキソヌク
レエースで処理し、それぞれに適当なＩ）ＮＡを接続し
、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を複数個重
合せしめる。しかる後、これを微生物ベクターに組込む
。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し、
必要により適当なリンカ−またはアニーリング可能な組
合せの塩基を複数個重合せしめる。このように加工した
二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リガーゼを用
いて接続せしめる。
レエースで処理し、それぞれに適当なＩ）ＮＡを接続し
、あるいはアニーリング可能な組合せの塩基を複数個重
合せしめる。しかる後、これを微生物ベクターに組込む
。組込む方法は、ベクターを適当な制限酵素で切断し、
必要により適当なリンカ−またはアニーリング可能な組
合せの塩基を複数個重合せしめる。このように加工した
二重鎖ＤＮＡとベクターＤＮＡを混合し、リガーゼを用
いて接続せしめる。
得られた組換えＤＮＡはベクターの宿主微生物に導入す
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用する。エシェリヒア・コリに使用されるベクターを
以下に例示する。（蛋白質核酸酵素２６巻４号（１９８
１）参照） ＢＫ糸プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｏ １０１． ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６． ｐ
ＲＫ２４８ 。
る。宿主微生物として本発明ではエシェリヒア・コリを
使用する。エシェリヒア・コリに使用されるベクターを
以下に例示する。（蛋白質核酸酵素２６巻４号（１９８
１）参照） ＢＫ糸プラスミドベクター（ストリンジェント型）のｐ
ｓｏ １０１． ｐＲＫ３５３． ｐＲＫ６４６． ｐ
ＲＫ２４８ 。
ｐＤＦ４１等、 ＥＸＸフグ２スミドベクターリラック
スト型） ノ０ａｌＥ １． ｐＶＨ５１，ｐＡｃ１０
５． Ｒ８Ｆ ２１２４、 ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９．
ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，Ｔ１ＥＲ３２４、ｐＢＲ
３２５，ｐＢＲ３２７、ｐＨ１Ｒ３２８，ｐＫＹ２２８
９゜ｐＫＹ２７００．ｐＫＮ８０．ｐＫＣ７，ｐＫＢ１
５８．ｐＭＫ２００４、ｐＡｃＹｃｌ、ｐＡｃＹｃ１８
４．λｄｕ１等、λｇｔＪファージベクターのλｇｔ・
λＣ９λｇｔ・λＢ、λＷＥＢ・λＣ１λＷ１８−λｎ
／、λＺＪｖｉｒ・λＢ′、λＡＬＯ・λＢ、λＷＥＳ
・〒５６２２ 、λＤａｍ等。
スト型） ノ０ａｌＥ １． ｐＶＨ５１，ｐＡｃ１０
５． Ｒ８Ｆ ２１２４、 ｐｃＲｌ、 ｐＭＢ９．
ｐＢＲ３１３，ｐＢＲ３２２，Ｔ１ＥＲ３２４、ｐＢＲ
３２５，ｐＢＲ３２７、ｐＨ１Ｒ３２８，ｐＫＹ２２８
９゜ｐＫＹ２７００．ｐＫＮ８０．ｐＫＣ７，ｐＫＢ１
５８．ｐＭＫ２００４、ｐＡｃＹｃｌ、ｐＡｃＹｃ１８
４．λｄｕ１等、λｇｔＪファージベクターのλｇｔ・
λＣ９λｇｔ・λＢ、λＷＥＢ・λＣ１λＷ１８−λｎ
／、λＺＪｖｉｒ・λＢ′、λＡＬＯ・λＢ、λＷＥＳ
・〒５６２２ 、λＤａｍ等。
これらのベクターのうち円シェリヒア・コリに対しては
一般にＴ）ＢＲ３２２が良く用いられている。
一般にＴ）ＢＲ３２２が良く用いられている。
１）ＢＲ３２２の場合にはＣＤＮＡの組込み場所はＰｓ
ｔｌサイ） 、 ＥｃｏＲ）サイトがよく利用されて
いる。
ｔｌサイ） 、 ＥｃｏＲ）サイトがよく利用されて
いる。
プラスミドベクターにｃＤＮＡを組込んだプラスミドを
用いてエシェリヒア・コリへ形質転換をする方法として
は主として対数増殖期にある細胞を集めて０ａＣＩＩ処
理して自然ＫＤＮムを取込みゃすい秋１１Ｋしてプラス
ミドを取込ませる方法が採用されており、Ｍｇ０ｊ、あ
るいはＲｂｃｌをさらに共存させることＫよりトランス
ホームの効率が一層増すことも知られている。また、他
の微生物の場合には、細胞をスフェロプラストあるいは
プロトプラスト化してからトランスホームさせることが
多い。
用いてエシェリヒア・コリへ形質転換をする方法として
は主として対数増殖期にある細胞を集めて０ａＣＩＩ処
理して自然ＫＤＮムを取込みゃすい秋１１Ｋしてプラス
ミドを取込ませる方法が採用されており、Ｍｇ０ｊ、あ
るいはＲｂｃｌをさらに共存させることＫよりトランス
ホームの効率が一層増すことも知られている。また、他
の微生物の場合には、細胞をスフェロプラストあるいは
プロトプラスト化してからトランスホームさせることが
多い。
形質転換株からインターロイキン２遺伝子が組込まれて
いる株を選別するＫは、すでにインターフェロンｌ伝子
のクローニングに用（・もれた方法（Ｔａｎｉｇｕｃｈ
ｉ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｊｐｎ、Ａｃａｄｏ、
ｖｏｌ、５５Ｂ＋４６４〜４６９（１９７９））を用い
ればよい。
いる株を選別するＫは、すでにインターフェロンｌ伝子
のクローニングに用（・もれた方法（Ｔａｎｉｇｕｃｈ
ｉ ｅｔ ａｌ、 Ｐｒｏｃ、Ｊｐｎ、Ａｃａｄｏ、
ｖｏｌ、５５Ｂ＋４６４〜４６９（１９７９））を用い
ればよい。
このようにして得られたインターロイキン２遺伝子が組
込まれているエシェリヒア・コ！ＪはＮ法によって培養
すればよい。
込まれているエシェリヒア・コ！ＪはＮ法によって培養
すればよい。
かくしてインターロイキン２の遺伝子を有スる：Ｌ シ
１１Ｊヒア・コリ菌体内にインターロイキン２の遺伝子
が増巾、生産され、インターロイキン２遺伝子を大量に
調製することができる。
１１Ｊヒア・コリ菌体内にインターロイキン２の遺伝子
が増巾、生産され、インターロイキン２遺伝子を大量に
調製することができる。
次Ｋ、本発明のエシェリヒア・コリの育種方法について
実施例により詳しく説明する。
実施例により詳しく説明する。
実施例１
０） １０容量／容量％の牛胎児血清を含有するＲＰＭ
Ｉ １６４０培地で、当分野□で良（知られた方法で培
養したヒ）Ｔ白血病細胞ジュルカット細胞（日本、アメ
リカ、西ドイツ等で自由に人手てきる）を上記の培地に
懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置１１ＦＸ
８１５０／３００−４型を用いて１．０００レントゲン
の総照射線量を照射した。次（・で、この照射された細
胞な１〉、Ｉ Ｏ！１個／ｍｔの細胞密度で上述の培地
中で５％炭酸ガス中３７℃で５日間培養した。次に、９
６穴マイクロプレ一ト１０枚に０．２個／ｗｅｌｌ （
＜はみ）になるように本変異細胞を接種し、５％炭酸ガ
ス中３７゛Ｃにて２１Ｆ１間培養した。細胞増殖の観察
されたクローンを順次継代増殖させ、次いでＩ Ｘ １
０’個／ ｍｅの細胞密度でＣ１）■＋Ａ５０μ’ｊ／
′ｍｔ存在下に２４時間培養し、培養上清に放出される
インターロイキン２の産生量を前出の方法で測定し、原
ジュルカット細胞に比し産生量が４０倍以上に改善され
た変異化クローン細胞ジュルカツ）１１１株（ＡＴＣＣ
ＣＲＩ、８１２９ ）を得た。本枕は通常の培養方法で
増殖１−１その増殖速度はジュルカット細胞と同程度で
あった。
Ｉ １６４０培地で、当分野□で良（知られた方法で培
養したヒ）Ｔ白血病細胞ジュルカット細胞（日本、アメ
リカ、西ドイツ等で自由に人手てきる）を上記の培地に
懸濁し、室温下５０秒間、東芝製Ｘ線照射装置１１ＦＸ
８１５０／３００−４型を用いて１．０００レントゲン
の総照射線量を照射した。次（・で、この照射された細
胞な１〉、Ｉ Ｏ！１個／ｍｔの細胞密度で上述の培地
中で５％炭酸ガス中３７℃で５日間培養した。次に、９
６穴マイクロプレ一ト１０枚に０．２個／ｗｅｌｌ （
＜はみ）になるように本変異細胞を接種し、５％炭酸ガ
ス中３７゛Ｃにて２１Ｆ１間培養した。細胞増殖の観察
されたクローンを順次継代増殖させ、次いでＩ Ｘ １
０’個／ ｍｅの細胞密度でＣ１）■＋Ａ５０μ’ｊ／
′ｍｔ存在下に２４時間培養し、培養上清に放出される
インターロイキン２の産生量を前出の方法で測定し、原
ジュルカット細胞に比し産生量が４０倍以上に改善され
た変異化クローン細胞ジュルカツ）１１１株（ＡＴＣＣ
ＣＲＩ、８１２９ ）を得た。本枕は通常の培養方法で
増殖１−１その増殖速度はジュルカット細胞と同程度で
あった。
（２） 本ジュルカット１１１細胞株を１ｘｌＯ５ｆｌ
ｉ’ｆｌ／＃ノの細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴＣ！
５５−９１．００（１４Ｋｊ９濁し、７アルコ社製回
転培養瓶に入れ、３７°Ｃで４日間培養し、遠沈操作に
より細胞を集めた。この細胞を４ Ｘ １０’個／ｄの
細胞密度にて上述の培地中に懸濁し、ここにｃ＋＋ｎ
Ａ １０μｇ／ｄを添加し、上記ファルコン社製回転培
１１瓶に３．ＱＱＱａＪで張り込み６時間回転培養した
。
ｉ’ｆｌ／＃ノの細胞密度で無血清合成培地ＲＩＴＣ！
５５−９１．００（１４Ｋｊ９濁し、７アルコ社製回
転培養瓶に入れ、３７°Ｃで４日間培養し、遠沈操作に
より細胞を集めた。この細胞を４ Ｘ １０’個／ｄの
細胞密度にて上述の培地中に懸濁し、ここにｃ＋＋ｎ
Ａ １０μｇ／ｄを添加し、上記ファルコン社製回転培
１１瓶に３．ＱＱＱａＪで張り込み６時間回転培養した
。
（３） このようにして得たＣｏｎ人１０μｇ７’ｍ
ｌで６時間誘導したジュルカット細胞（３Ｘ１０’細胞
）を１’ＢＳ溶液２００１に懸濁し、細胞を遠心によっ
て２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるＲｌｂ
ｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎ、ｑｄｇｌ Ｃｏ
ｍｐｌｅｘ （ｌ ＯｍＭ ） を含んだＲ８
Ｂ溶液（］ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｊ 、 ｐＨ７
，５。
ｌで６時間誘導したジュルカット細胞（３Ｘ１０’細胞
）を１’ＢＳ溶液２００１に懸濁し、細胞を遠心によっ
て２度洗浄してから、ヌクレアーゼ阻害剤であるＲｌｂ
ｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ−Ｖａｎ、ｑｄｇｌ Ｃｏ
ｍｐｌｅｘ （ｌ ＯｍＭ ） を含んだＲ８
Ｂ溶液（］ ＯｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｊ 、 ｐＨ７
，５。
１０ ｍＭ Ｍａｉｌ、 １．５ ｍＭ ＭｇＯ／＊
） ２００Ｍ７Ｋｌｌ！ｆ＠Ｌ。
） ２００Ｍ７Ｋｌｌ！ｆ＠Ｌ。
た。次に、ＮＰ−４０を０．０５％になるように加えた
後、ゆるやかに攪拌後３．００ Ｏｒｐｍで５分遠心し
て核酸を除去し、その上清液に８Ｄ８ （０，５％）と
ＥＤＴＡ （５ｍＭ ）を加えた後、ただちにフェノー
ルを等量加え細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３仲１フエ
ノール抽出を繰返してから２容エタノールで１（、ＮＡ
を沈澱し、遠心でこの沈澱を集め］ ｌ） ［ＴＬＭＴ
ｒｌ：＝−１１０／ 、 ｒ＋Ｈ７，５で溶解した。
後、ゆるやかに攪拌後３．００ Ｏｒｐｍで５分遠心し
て核酸を除去し、その上清液に８Ｄ８ （０，５％）と
ＥＤＴＡ （５ｍＭ ）を加えた後、ただちにフェノー
ルを等量加え細胞質ＲＮＡを抽出した。合計３仲１フエ
ノール抽出を繰返してから２容エタノールで１（、ＮＡ
を沈澱し、遠心でこの沈澱を集め］ ｌ） ［ＴＬＭＴ
ｒｌ：＝−１１０／ 、 ｒ＋Ｈ７，５で溶解した。
このようＫ［てジュルカット細胞から得られたＲＮＡ量
は３３〜であった。
は３３〜であった。
次Ｋ、このＲＮＡからｍＲＮＡを取得するためにオリゴ
（ａＴ ）−セルロース（Ｐ、Ｔ、、 Ｂｊｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ 。
（ａＴ ）−セルロース（Ｐ、Ｔ、、 Ｂｊｏｃｈｅｍ
ｉｃａｌｓ 。
Ｔｙｐｅ ７ ）を用い、カラムクロマトグラフィーを
行なった。吸着は２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（７４、ｐ
Ｈ７，５、０，５Ｍ ＮｎＣｊｌ 、 １ ｍＭ Ｆ
ＤＴＡ溶液Ｋ ＲＮＡを溶解して行ない、溶出は上記緩
衝液で洗浄後、水と１０ｍＭＴｒｉｓ−ｆ（０！（Ｔ）
’８７．５ ）で交互にｍＲＮＡを溶出することにより
行なった。この結果、溶出されたｍＲＮＡ ｔをま８６
０μすであった。
行なった。吸着は２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（７４、ｐ
Ｈ７，５、０，５Ｍ ＮｎＣｊｌ 、 １ ｍＭ Ｆ
ＤＴＡ溶液Ｋ ＲＮＡを溶解して行ない、溶出は上記緩
衝液で洗浄後、水と１０ｍＭＴｒｉｓ−ｆ（０！（Ｔ）
’８７．５ ）で交互にｍＲＮＡを溶出することにより
行なった。この結果、溶出されたｍＲＮＡ ｔをま８６
０μすであった。
さらに、このｍＲＮＡの一部（６９０μｇ）をＳＤＧ！
！！、ｔ＞ （５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ 、
ｐＨ７，５，１ｍＭＥ］）ＴＡ。
！！、ｔ＞ （５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ 、
ｐＨ７，５，１ｍＭＥ］）ＴＡ。
（１，２Ｍ Ｎｐ＋Ｃ１を含む５〜２５％シヨ糖密度勾
配。
配。
Ｈｔ ｔｎｃｈ ｉ ＰＨ１４０ローターで３５．００
Ｏｒｐｍ。
Ｏｒｐｍ。
１６時間、４℃）して分画し、１１−１２８のｍＲＮＡ
画分を分画番号１１．１２．１３として４７μり得た。
画分を分画番号１１．１２．１３として４７μり得た。
ｆｉｌ ここに得られた分画番号１１，１２．１３の
ｎ１ＲＮＡを前出の検定法に従い、アフリカッメガエル
の卵母細胞に１個当り５０ ｎ９をマイクロインジェク
ション法により注入して得られた卵母細胞抽出物をイン
ターロイキン２の活性検定に供したところ、次表に示す
トリチウム化チミジンの取り込みがみられ、これら分画
のｍ ＲＮＡは本発明のヒトインターロイキン２ ｍＲ
ＮＡを含有することが証明された。
ｎ１ＲＮＡを前出の検定法に従い、アフリカッメガエル
の卵母細胞に１個当り５０ ｎ９をマイクロインジェク
ション法により注入して得られた卵母細胞抽出物をイン
ターロイキン２の活性検定に供したところ、次表に示す
トリチウム化チミジンの取り込みがみられ、これら分画
のｍ ＲＮＡは本発明のヒトインターロイキン２ ｍＲ
ＮＡを含有することが証明された。
＊各希釈度のトリチウム化チ□ミジンの取り込へ縁（Ｌ
ｃｐｍ）のグロビット・グロットナ棚準インターロイキ
ン２（１０４０位１’ｌＲ１）と比較し−（求めた。
ｃｐｍ）のグロビット・グロットナ棚準インターロイキ
ン２（１０４０位１’ｌＲ１）と比較し−（求めた。
（５）次に、ここで得られたインターロイキ／ｎｌＲＮ
Ａを含む１１〜１２ Ｓ ｍＲＮＡよりｒｌ’ｌＮＡ
をインヒドロで合成し、プラスミドベクターＰＢＲ：（
２２と絹換え体ＤＮＡｆＩｒ作り、これをエシェリヒア
・コリにトランスホームしてインターロイキン２ ｃＤ
ＮＡクローンを持つ菌体を以ドの方法で選択１．た。
Ａを含む１１〜１２ Ｓ ｍＲＮＡよりｒｌ’ｌＮＡ
をインヒドロで合成し、プラスミドベクターＰＢＲ：（
２２と絹換え体ＤＮＡｆＩｒ作り、これをエシェリヒア
・コリにトランスホームしてインターロイキン２ ｃＤ
ＮＡクローンを持つ菌体を以ドの方法で選択１．た。
（５−１） ５０ ＋ｎＭ ’Ｉ’ｒ１ｓ−ＨＯ１ｇ
ｐｉ液（ｐＨ７，５） 、 ３０１Ｍ ＮＡ（’、／
、 ６ｍＭ ＭｑＣ１嘗、 ５ ｍＭジチオスレイ
トール（ｎＴＴ）、 ０．５ ｍＭの各ｔｌＡＴＰ 、
ｄＧＴＰ 、 ｄｃＴＰ 。
ｐｉ液（ｐＨ７，５） 、 ３０１Ｍ ＮＡ（’、／
、 ６ｍＭ ＭｑＣ１嘗、 ５ ｍＭジチオスレイ
トール（ｎＴＴ）、 ０．５ ｍＭの各ｔｌＡＴＰ 、
ｄＧＴＰ 、 ｄｃＴＰ 。
（ＩＴＴＰ （ｄＣＴｐはＩｍｐラベルしたものを含む
）。
）。
０７５μクオリゴ（ｄＴＬｌｌ 、 ７．２μりｍＲＮ
Ａおよび１５ユ＝ットＡＭＶ逆転写酵謔（Ｊ、 Ｗ、
Ｂｑａｒｄ ）を１、 、）ｊ、４１°Ｃに９０分間保
った。これにより約１８μりの１重鎖ｃＤＮＡが合成さ
ｆｔだ。反応液からｍ１ＬＮＡを除くために、反応液に
Ｎａ０ＪＩ溶液を加えて（１，３３Ｎ Ｎ５ＯＨとし
室温にて１５時間置き、次い（：ｍＷを中和し［セファ
デックスＧ −５０Ｊ力ラムド通した。これＫより１．
３’ ｐ９のｃ ＤＮＡを回収し、た。
Ａおよび１５ユ＝ットＡＭＶ逆転写酵謔（Ｊ、 Ｗ、
Ｂｑａｒｄ ）を１、 、）ｊ、４１°Ｃに９０分間保
った。これにより約１８μりの１重鎖ｃＤＮＡが合成さ
ｆｔだ。反応液からｍ１ＬＮＡを除くために、反応液に
Ｎａ０ＪＩ溶液を加えて（１，３３Ｎ Ｎ５ＯＨとし
室温にて１５時間置き、次い（：ｍＷを中和し［セファ
デックスＧ −５０Ｊ力ラムド通した。これＫより１．
３’ ｐ９のｃ ＤＮＡを回収し、た。
（’！１−２） ５０ ｍＭリン酸緩衝ｆｅｉ、 （ｐ
Ｈ７，５） 、 １０ ｍｈＩＭｙＣ／ｐ 、 １
０ ｎ１Ｍ ＤＴＴ 、 ０．７５ ｍＭの各１１Ａ
ＴＰ 。
Ｈ７，５） 、 １０ ｍｈＩＭｙＣ／ｐ 、 １
０ ｎ１Ｍ ＤＴＴ 、 ０．７５ ｍＭの各１１Ａ
ＴＰ 。
ｄＯＴＰ、 ｃｌＣＴＰ、 ｄＴＴＰ （ｄＯＴＰは３
ＩＩでラベルされたものを含む）、１３μｇ１本鎖ｃＤ
ＮＡ、８ユニットポリメレース（Ｐｏｌｙｍｅｒｎｓｅ
） Ｉ （米国Ｂ Ｒ，Ｉ、製）を混ぜ、１５°Ｃで
１５時間反応を行なった１、この反応により０．８２μ
りの二重鎖ｃＤＮＡを得た。
ＩＩでラベルされたものを含む）、１３μｇ１本鎖ｃＤ
ＮＡ、８ユニットポリメレース（Ｐｏｌｙｍｅｒｎｓｅ
） Ｉ （米国Ｂ Ｒ，Ｉ、製）を混ぜ、１５°Ｃで
１５時間反応を行なった１、この反応により０．８２μ
りの二重鎖ｃＤＮＡを得た。
次いで、５０ ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５） 。
０、２ Ｍ ＮａＣｊ！ 、 １ ｍＭ ＺｎＯ／９
．０．８２μクニ１に鎖（・ＤＮＡを混ぜて３７℃で２
０分間インキュベートした後、０．２５ユニツトのヌク
レアーゼＳ＋（三共（株）製）を加え、さらに１５分間
インキュペ・−トした。しかる後、０．４３μ９の二重
鎖ＣＤＮＡを回収した。
．０．８２μクニ１に鎖（・ＤＮＡを混ぜて３７℃で２
０分間インキュベートした後、０．２５ユニツトのヌク
レアーゼＳ＋（三共（株）製）を加え、さらに１５分間
インキュペ・−トした。しかる後、０．４３μ９の二重
鎖ＣＤＮＡを回収した。
（５−３） ｏ、 １４ Ｍカコジル酸カリウム、３０
ｍＭ）リス塩基、 ０．１ ｍＭＤＴＴ、 １ ｒｎＭ
ｃｏｏｌ、、 ０．６４ ｍＭ’”Ｐ−ｒｌｃＴＰ （
”８ｐｃ、ａｃｔ、２．７ Ｘ １０ ｃｐ＋ｎ／ｎｍ
ｏ／ ）’。
ｍＭ）リス塩基、 ０．１ ｍＭＤＴＴ、 １ ｒｎＭ
ｃｏｏｌ、、 ０．６４ ｍＭ’”Ｐ−ｒｌｃＴＰ （
”８ｐｃ、ａｃｔ、２．７ Ｘ １０ ｃｐ＋ｎ／ｎｍ
ｏ／ ）’。
０４３μクニ重鎖ｃ ｆ）Ｎ Ａおよび５ユニツトのタ
ーミナルトランスフェラーゼ（ＵＲＬ）を混ぜ３７℃で
７分間インキュベートしたところ約５０個の＋ＩＣＭＰ
が両３′末端に付加された。
ーミナルトランスフェラーゼ（ＵＲＬ）を混ぜ３７℃で
７分間インキュベートしたところ約５０個の＋ＩＣＭＰ
が両３′末端に付加された。
ＰＢＲ３２２ＤＮＡ １０ ｔｔりを制限酵素ＰｓｔＩ
で切断１７たのち、前述の二重鎖ｒ： ＤＮＡ Ｋ ｄ
ＣＭＰ鎖を付加【またのと全く同じ条件でｄｃ！ＴＰ
の代りＩｃ ｄＧＴＰを用いて両３′末端Ｋ ｄＧＭＦ
鎖を付加した。かくして゛ 約５０個の（ＩＱＭＰが両
３′末端に付加された。
で切断１７たのち、前述の二重鎖ｒ： ＤＮＡ Ｋ ｄ
ＣＭＰ鎖を付加【またのと全く同じ条件でｄｃ！ＴＰ
の代りＩｃ ｄＧＴＰを用いて両３′末端Ｋ ｄＧＭＦ
鎖を付加した。かくして゛ 約５０個の（ＩＱＭＰが両
３′末端に付加された。
（５−４） ５０ ｍＭＴｒｌｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，
５）、 ０．１ ＭＮＡＣ７、５ｍＭ ＢＭｋ 、
０．０５μりの（Ｉ ＧＭＰが付加されたＰＢＲ３２
２，０，０１１１９のｄｃＭＦが付加されたｒＤＮＡを
まず６５℃で２分間、次いで４６℃で１２０分間、さら
に３７°Ｃで６０分間、そ１．て室温で６０分間保持し
た。
５）、 ０．１ ＭＮＡＣ７、５ｍＭ ＢＭｋ 、
０．０５μりの（Ｉ ＧＭＰが付加されたＰＢＲ３２
２，０，０１１１９のｄｃＭＦが付加されたｒＤＮＡを
まず６５℃で２分間、次いで４６℃で１２０分間、さら
に３７°Ｃで６０分間、そ１．て室温で６０分間保持し
た。
エシェリヒア・コリＸ１７７６を５０＋１／のＬ培地（
１００μ９ ／ｙｓｌのジアミノピメリン酸と５０μり
／ｍｆのチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エキ
プ、０５％ＮｈＣ１および０１％グルコースを含む）に
接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそ０
３になるまで３７℃で振とう培養した。培養Ｐｒ後、菌
体を遠心分離により集め、５ｍＭＴｒ１＝、−ＨＣｌ
（Ｔ）Ｅ７．６ ）−０，１ＭＮａ０ｊ、 ５ ｍＭ
％４ｔｔ（’、１． 、 １０ ＋ｎＭ ＲｈＣｌの溶
液二２５＃１７で２回洗浄し得られた菌体を５ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐＨ７−６） 。
１００μ９ ／ｙｓｌのジアミノピメリン酸と５０μり
／ｍｆのチミジン、１％トリプトン、０．５％酵母エキ
プ、０５％ＮｈＣ１および０１％グルコースを含む）に
接種し、培養液の５６２ｍμにおける吸光度がおよそ０
３になるまで３７℃で振とう培養した。培養Ｐｒ後、菌
体を遠心分離により集め、５ｍＭＴｒ１＝、−ＨＣｌ
（Ｔ）Ｅ７．６ ）−０，１ＭＮａ０ｊ、 ５ ｍＭ
％４ｔｔ（’、１． 、 １０ ＋ｎＭ ＲｈＣｌの溶
液二２５＃１７で２回洗浄し得られた菌体を５ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ（ｐＨ７−６） 。
０．２５ Ｍ ＬＣＩ 、 ５ ｍＭ ＭＦｒＣ１堂
、０．１ Ｍ ０ｂＯ１＊および１０ ｍｂｌ ＲｂＣ
ｊを含む溶液２０ＩＩＬεに墾濁し、（箇Ｃにて２５分
間静置後、遠心分離忙より菌体を集めた。上記と同じ溶
液”’ｌ ｍｌ Ｋ ｉｌｉ体を再び懸濁し、得られた
菌体懸濁液の０．２ ｍｌに上記組換えＪ）Ｎλを入れ
、０℃で４０分間静置した。さらに、３７″Ｃで２分間
保ったのち、再び０°Ｃで６０分間静置した。
、０．１ Ｍ ０ｂＯ１＊および１０ ｍｂｌ ＲｂＣ
ｊを含む溶液２０ＩＩＬεに墾濁し、（箇Ｃにて２５分
間静置後、遠心分離忙より菌体を集めた。上記と同じ溶
液”’ｌ ｍｌ Ｋ ｉｌｉ体を再び懸濁し、得られた
菌体懸濁液の０．２ ｍｌに上記組換えＪ）Ｎλを入れ
、０℃で４０分間静置した。さらに、３７″Ｃで２分間
保ったのち、再び０°Ｃで６０分間静置した。
次に、これ１；前記■、培地０．７Ｒ１！を加七て３７
℃で３０分間振とう培養した。この培養液０１肩／を１
００μ７．／αシナしピメリン酸、５０μ９／′１チミ
ジンと１５μｑ／ａｔブトラ号イクリンを含むＬ培地の
１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７℃にて２Ｌ（
間インキュベートした。
℃で３０分間振とう培養した。この培養液０１肩／を１
００μ７．／αシナしピメリン酸、５０μ９／′１チミ
ジンと１５μｑ／ａｔブトラ号イクリンを含むＬ培地の
１．５％寒天培地上に一面に塗抹し、３７℃にて２Ｌ（
間インキュベートした。
（５−５）上記において出現したコロニー３０ （１０
個を、 １００１ｉ９／１ｒｒｌのジアミノピメリン
酸、５０μ翰のチミジンと１５μｑ ／ｍｅのテトラサ
イクリンを含ｔｖＬ培地の１，５％塞天培地−１・Ｋミ
リポアフィルタ−ＨＡＷＧを置（・たもσ・の土に一面
に塗抹した（同一・のものを２枚作る。）３．これを３
７ ”Ｃ−Ｃ２晩イノキユベートした後、コロニーが出
現したものＫついてフィルターを剥がし、このフィルタ
ーを０、５ Ｎ ＮＦＩＯＨに１０分間浸した。
個を、 １００１ｉ９／１ｒｒｌのジアミノピメリン
酸、５０μ翰のチミジンと１５μｑ ／ｍｅのテトラサ
イクリンを含ｔｖＬ培地の１，５％塞天培地−１・Ｋミ
リポアフィルタ−ＨＡＷＧを置（・たもσ・の土に一面
に塗抹した（同一・のものを２枚作る。）３．これを３
７ ”Ｃ−Ｃ２晩イノキユベートした後、コロニーが出
現したものＫついてフィルターを剥がし、このフィルタ
ーを０、５ Ｎ ＮＦＩＯＨに１０分間浸した。
次に、０．５ Ｍ Ｔｒ１８−Ｈｃｌ １９ 補液（ｐ
Ｈ７，５）Ｋ５分間浸し、さらに１．５ Ｍ ＮｔｑＯ
ｌｌｏ、 ５ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ（！ｊ緩衝液（ｐＩ（
’７．５ ） Ｋ ｓ分間浸した。次〜蔦で５ＳＣ（０
，１５Ｍ ＮａＣ１１０，０１５Ｍクエン酸ナトｌノウ
ム。
Ｈ７，５）Ｋ５分間浸し、さらに１．５ Ｍ ＮｔｑＯ
ｌｌｏ、 ５ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ（！ｊ緩衝液（ｐＩ（
’７．５ ） Ｋ ｓ分間浸した。次〜蔦で５ＳＣ（０
，１５Ｍ ＮａＣ１１０，０１５Ｍクエン酸ナトｌノウ
ム。
ｐＨ７，５）の２倍希釈液に５分間浸漬した。
しかる後、ティッシュペーノく一上にフィルターを移し
、風乾後８０℃で３時間加熱した。これによりフィルタ
ー上に組換えＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡが固定され
る・・ フィルター上のＤＮＡにインターロイキン２に対応する
ｃ ＤＮＡプローブをノ・イブリダイスさせズインター
ロイキン２生産能を有するコロニーを以下のよ５ｋして
選別した。
、風乾後８０℃で３時間加熱した。これによりフィルタ
ー上に組換えＤＮＡを含むプラスミドＤＮＡが固定され
る・・ フィルター上のＤＮＡにインターロイキン２に対応する
ｃ ＤＮＡプローブをノ・イブリダイスさせズインター
ロイキン２生産能を有するコロニーを以下のよ５ｋして
選別した。
この選別方法はプラス・マイナス法と称さね、るもので
、次のようにして行なった。まず０ｏｎＡによって刺激
したジュルカット細胞よりｍ ＲＮ Ａを抽出１．．８
Ｉ）Ｇ遠心法によってインターロイキン２ｍＲＮムを部
分精製したのち（はぼ１１〜１２８ｍＲＮＡ ） 、こ
のｍＲＮＡを用いて前述の如（１１ｐラベルしたｃＤＮ
ムを合成した。ｍＲＮＡをアルカリ処理によって除いた
後、Ｃｏｎムで誘導していな（・ジュルカット細胞より
抽出した１１〜１２８の部分精製ｍＲＮＡの過剰と〕・
イブリダイズさせた。
、次のようにして行なった。まず０ｏｎＡによって刺激
したジュルカット細胞よりｍ ＲＮ Ａを抽出１．．８
Ｉ）Ｇ遠心法によってインターロイキン２ｍＲＮムを部
分精製したのち（はぼ１１〜１２８ｍＲＮＡ ） 、こ
のｍＲＮＡを用いて前述の如（１１ｐラベルしたｃＤＮ
ムを合成した。ｍＲＮＡをアルカリ処理によって除いた
後、Ｃｏｎムで誘導していな（・ジュルカット細胞より
抽出した１１〜１２８の部分精製ｍＲＮＡの過剰と〕・
イブリダイズさせた。
次に、このｍＲＮＡにハイブリダイズしなかったｃＤＮ
ムと、このｍＲＮＡとノ・イブリッドを形成したｃＤＮ
ムをヒドロキシブパタイトカラムクロマトグラフイーに
よって分離し、それぞれプローブＡおよびプローブＢと
した。
ムと、このｍＲＮＡとノ・イブリッドを形成したｃＤＮ
ムをヒドロキシブパタイトカラムクロマトグラフイーに
よって分離し、それぞれプローブＡおよびプローブＢと
した。
先に指摘した如く、全く同じフィルターを２枚用意しで
あるので、１枚はグローブＡと他の１枚はプローブＢと
別個にノ・イブリダイズさせたのちオートラジオグラソ
イ−を行ない、グローブＡ Ｋはポジティブに反応する
（プラス）がプローブＢには弱く、もしくは全く反応し
な（・（マイナス）コロニーを検索した。
あるので、１枚はグローブＡと他の１枚はプローブＢと
別個にノ・イブリダイズさせたのちオートラジオグラソ
イ−を行ない、グローブＡ Ｋはポジティブに反応する
（プラス）がプローブＢには弱く、もしくは全く反応し
な（・（マイナス）コロニーを検索した。
このよ５Ｋして３０００個のコロニー９８個のインター
ロイキン２産生能を有するコロニーを選別したっことで
のノ・イブリダイゼーションの条件はフィルターを８８
０の３倍希釈液で６５℃、３０分間浸し７、さらに、ｓ
ｓｏの３倍希釈とＤｅｎｈａｒｔ原液（０，２％Ｆｉｃ
ｏｌｌ ４００ 、 ０．２％ポリビニルピロリドン、
０．２％ウシ血清アルブミン）に６０分間浸し、次にバ
イブリドバッファー（ＩＭＮＰｌｏＶ、５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊ、 ｐＨ５３−０，１０ｍＭ ＩＤＴＡ、
０．１％８Ｄ８ ）とＤｅｎｈａｒｔ ｒＩｉ、液お
よびエシェリヒア・コリＤＮＡ適当量（このとき１０μ
りぐらい）でもって６５℃で１夜予備的ノ・イブリダイ
ゼーションを行なった。さもにノ・イブリドバッファー
、 Ｄｅｎｈａｒｔ原液、エシェリヒア・コリＤＮＡ、
ラベルされたプロープムまたはＢ中に６５℃、２晩浸し
ノ・イブリグイブする。次いでフィルターを８８０の２
倍、希釈液でよく洗いさらに８８Ｃ１７）１０倍濃縮液
と０，１％ｓｎｓで６５℃３０分間浸し１、これを２回
繰返した後、ＳＳＣの２倍希釈液で洗い、風乾後オート
ラジオグラフィーする。
ロイキン２産生能を有するコロニーを選別したっことで
のノ・イブリダイゼーションの条件はフィルターを８８
０の３倍希釈液で６５℃、３０分間浸し７、さらに、ｓ
ｓｏの３倍希釈とＤｅｎｈａｒｔ原液（０，２％Ｆｉｃ
ｏｌｌ ４００ 、 ０．２％ポリビニルピロリドン、
０．２％ウシ血清アルブミン）に６０分間浸し、次にバ
イブリドバッファー（ＩＭＮＰｌｏＶ、５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｊ、 ｐＨ５３−０，１０ｍＭ ＩＤＴＡ、
０．１％８Ｄ８ ）とＤｅｎｈａｒｔ ｒＩｉ、液お
よびエシェリヒア・コリＤＮＡ適当量（このとき１０μ
りぐらい）でもって６５℃で１夜予備的ノ・イブリダイ
ゼーションを行なった。さもにノ・イブリドバッファー
、 Ｄｅｎｈａｒｔ原液、エシェリヒア・コリＤＮＡ、
ラベルされたプロープムまたはＢ中に６５℃、２晩浸し
ノ・イブリグイブする。次いでフィルターを８８０の２
倍、希釈液でよく洗いさらに８８Ｃ１７）１０倍濃縮液
と０，１％ｓｎｓで６５℃３０分間浸し１、これを２回
繰返した後、ＳＳＣの２倍希釈液で洗い、風乾後オート
ラジオグラフィーする。
上記８個のコロニーからそれぞれＤＮＡを単＃ｌ２、そ
れぞれ熱変性させておいてから、部分精製したインター
ロイキン２ ｍＲＮＡとハイブリダイズさせた。ハイブ
リダイズの条件は８０％ホルムアミド。
れぞれ熱変性させておいてから、部分精製したインター
ロイキン２ ｍＲＮＡとハイブリダイズさせた。ハイブ
リダイズの条件は８０％ホルムアミド。
２０ ｍＭパイブス（ｐＨ６，５） 、 ０．４ Ｍ
ＮＬｉＣ１，５ｍＭｇＤＴ人、５３℃でインキュベート
させた。次にＤＮＡにハイブリダイズしたｍＲＮＡをニ
トロセルロース膜を通すことによって特異的にフィルタ
ー上に保留させ（他の＋ｒ、ＲＮＡは通過する）、その
後フィルターからｍＲＮＡを抽出し、アフリカッメガエ
ル（Ｘｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓ ）の卵母細胞で翻
訳させた。
ＮＬｉＣ１，５ｍＭｇＤＴ人、５３℃でインキュベート
させた。次にＤＮＡにハイブリダイズしたｍＲＮＡをニ
トロセルロース膜を通すことによって特異的にフィルタ
ー上に保留させ（他の＋ｒ、ＲＮＡは通過する）、その
後フィルターからｍＲＮＡを抽出し、アフリカッメガエ
ル（Ｘｅｎｏｐｕｓ １ａｅｖｉｓ ）の卵母細胞で翻
訳させた。
そしてこの卵母細胞の抽出物を前述の方法で活性検定し
、インターロイキン２活性の検出された轟２０株（ＡＴ
ＯＯ３６０６４）をインターロイキン２遺伝子コードを
もつクローンとして選んだ。ウサギ網状赤面球うイゼー
・トな用いた無細胞蛋白合成系を翻訳させ、ヒトインタ
ーロイキン２に対応する蛋白の合成が認められた。
、インターロイキン２活性の検出された轟２０株（ＡＴ
ＯＯ３６０６４）をインターロイキン２遺伝子コードを
もつクローンとして選んだ。ウサギ網状赤面球うイゼー
・トな用いた無細胞蛋白合成系を翻訳させ、ヒトインタ
ーロイキン２に対応する蛋白の合成が認められた。
この実験結果より、クローン＆２０株のＤＮＡはインタ
ーロイキン２ ｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成
するＤＮＡ （インターロイキン２遺伝子）シもつこと
が鉦明された。
ーロイキン２ ｍＲＮＡと特異的にハイブリッドを形成
するＤＮＡ （インターロイキン２遺伝子）シもつこと
が鉦明された。
実施例２
実施例１と同様の方法で変異クローン化［２て得られた
インターロイキン２自発産生株Ｊ−Ａ１８８６（ＡＴｃ
ｃ ＯＲＬ ８１３０）を同様に回転培養瓶にて大量に
Ｎ養増殖させＩ Ｘ １０’個／ｍｌの細胞密度で新鮮
なＲＩＴＣ−５５〜９培地に再懸濁し８時間後の細胞を
集め、本絹Ｕ３ｘ１０ｅ個より実施例１同様に１１〜ｌ
ｚｓｗ分のインターロイキン２に対応するｍＲＮＡが得
られる。以下、実施例１と同様の方法によりインターロ
イキン２；ｌｌｌ壬子組込まれて（・るエシェリヒア・
コリが得られる。
インターロイキン２自発産生株Ｊ−Ａ１８８６（ＡＴｃ
ｃ ＯＲＬ ８１３０）を同様に回転培養瓶にて大量に
Ｎ養増殖させＩ Ｘ １０’個／ｍｌの細胞密度で新鮮
なＲＩＴＣ−５５〜９培地に再懸濁し８時間後の細胞を
集め、本絹Ｕ３ｘ１０ｅ個より実施例１同様に１１〜ｌ
ｚｓｗ分のインターロイキン２に対応するｍＲＮＡが得
られる。以下、実施例１と同様の方法によりインターロ
イキン２；ｌｌｌ壬子組込まれて（・るエシェリヒア・
コリが得られる。
実施例３
Ｘ線照射をし、ないジュルカット細胞を実施例１と同様
に限界希釈法でクローニングし、インターロイキン２産
生能が全くないクローン死細胞Ｊ−９９細胞株（ＡＴＯ
Ｃ！ ＯＲＬ ８１３１）を得た。本細胞株を実施例１
と同様に回転培養瓶にて大量に増殖さゼＩ Ｘ Ｉ Ｏ
’個／’ｓｌの細胞密度で新鮮なりＩＴ６７〜５５−９
培地に再懸濁し、ここにＣａｎム１０μり／ｍｌ。
に限界希釈法でクローニングし、インターロイキン２産
生能が全くないクローン死細胞Ｊ−９９細胞株（ＡＴＯ
Ｃ！ ＯＲＬ ８１３１）を得た。本細胞株を実施例１
と同様に回転培養瓶にて大量に増殖さゼＩ Ｘ Ｉ Ｏ
’個／’ｓｌの細胞密度で新鮮なりＩＴ６７〜５５−９
培地に再懸濁し、ここにＣａｎム１０μり／ｍｌ。
ラージ細胞０．５：ｘｌＯ’個７ｄ３．ホルボールミリ
ステートアセテ−）１０■／ｄを添加し、回転培養瓶中
にてｌ、ＱＱＱａｕの容量で６時間培養した。本細胞３
Ｘ１０′１個より実施例１と同様Ｋ１ｌ−１２Ｓ画分の
インターロイキン２に対応するｍＲＮＡが得られる。以
下、実施例１と同様の方法によりインターロイキン２遺
伝子が組込まれているエシェリヒア・コリが得られる。
ステートアセテ−）１０■／ｄを添加し、回転培養瓶中
にてｌ、ＱＱＱａｕの容量で６時間培養した。本細胞３
Ｘ１０′１個より実施例１と同様Ｋ１ｌ−１２Ｓ画分の
インターロイキン２に対応するｍＲＮＡが得られる。以
下、実施例１と同様の方法によりインターロイキン２遺
伝子が組込まれているエシェリヒア・コリが得られる。
特許出願人 財団性人癌研究会
味の素株式会社
代 理 人 弁理士 久保１）藤 部第１頁の続き
■出 願 人 味の素株式会社
東京都中央区京橋１丁目５番８
号
手続補正書（自発）
昭和５７年８月１１日
特許庁長官 若杉和夫 殿
１、 事件の表示
特願昭５７−８２５ｏ９
２、 発明の名称
ヒトインターロイキン２遺伝子が組込まれているエシェ
リヒア・コリおよびその育種方法五 補正をする者 事件との関係 特許出願人 財団法人 癌研究会 味の素株式会社 ４、代理人 〒１０４ 東京都中央区京橋１丁目１杏１０号 ５、 補正の対象 、。
リヒア・コリおよびその育種方法五 補正をする者 事件との関係 特許出願人 財団法人 癌研究会 味の素株式会社 ４、代理人 〒１０４ 東京都中央区京橋１丁目１杏１０号 ５、 補正の対象 、。
明細杏の発明の詳細な説明の欄
６ 補正の内等
明糾１書第５１Ｃｆ下から９行と・（の［ＡＴ！’！ｎ
！ｉ６［１６４１を［ＡＴｃｏ ５９０６４Ｊに、ｔ
ｉ正する。
！ｉ６［１６４１を［ＡＴｃｏ ５９０６４Ｊに、ｔ
ｉ正する。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、ヒトインターロイキン２に対応し、ショ糖密度勾配
遠心法による分画により１１〜１２８画分として得られ
、ヒトリンパ球由来細胞より分離されるメッセンジャー
ＲＮＡより調製されたＤＮＡが組込まれているプラスミ
ドベクターを有するエシェリヒア・コリ。 ２、ヒトインターロイキン２に対応し、ショ糖密度勾配
遠心法による分画により１１〜１２８画分として得られ
るメッセンジャーＲＮＡをヒトリンパ球由来細胞より分
離し、このメッセンジャーＲＮＡに相補的なりＮＡを調
製し、該ＤＮＡをプラスミドベクターに組込み、このハ
イブリッド・プラスミドをエシェリヒア・コリの細胞に
導入すること各特徴とするヒトインターロイキン２の遺
伝子が組込まれているエシェリヒア・コリの育種方法。 ３、ヒ） ＩＪンパ球由来細胞がヒトインターロイキン
２自発意生株である特許請求の範囲第２項記載の育種方
法。 ４、ヒトリンパ球由来細胞がマイトゲンにより刺激され
るととＫよりヒトインターロイキン２を産生ずる細胞で
ある特許請求の範囲第２項記載の育種方法。 ５、ヒトリンパ球由来細胞が他の細胞の存在下にマイト
ゲンにより刺激されることによってヒトインターロイキ
ン２を産生する細胞である特許請求の範囲第２項記載の
育種方法。
Priority Applications (9)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57082509A JPS58201979A (ja) | 1982-05-18 | 1982-05-18 | ヒトインタ−ロイキン２遺伝子が組込まれているエシエリヒア・コリおよびその育種方法 |
| EP83101035A EP0091539B2 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying said gene, cell lines possessing the recombinant DNA,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| DE8383101035T DE3377363D1 (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells |
| US06/463,496 US4738927A (en) | 1982-03-31 | 1983-02-03 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US07/814,049 US5620868A (en) | 1982-03-31 | 1991-12-26 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US08/096,842 US5399669A (en) | 1982-03-31 | 1993-07-26 | Interleukin-2 polypeptides |
| US08/516,563 US5795769A (en) | 1982-03-31 | 1995-08-18 | Gene encoding interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the gene, a living cell line possessing the recombinant DNA and method for producing interleukin-2 using the cell |
| US08/621,097 US5795777A (en) | 1982-03-31 | 1996-03-22 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
| US09/769,396 US20010041362A1 (en) | 1982-03-31 | 2001-01-26 | Gene coded for interleukin-2 polypeptide, recombinant DNA carrying the said gene, a living cell line possessing the recombinant DNA, and method for producing interleukin-2 using the said cell |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57082509A JPS58201979A (ja) | 1982-05-18 | 1982-05-18 | ヒトインタ−ロイキン２遺伝子が組込まれているエシエリヒア・コリおよびその育種方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58201979A true JPS58201979A (ja) | 1983-11-25 |
Family
ID=13776477
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57082509A Pending JPS58201979A (ja) | 1982-03-31 | 1982-05-18 | ヒトインタ−ロイキン２遺伝子が組込まれているエシエリヒア・コリおよびその育種方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58201979A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| JPS60248198A (ja) * | 1984-05-24 | 1985-12-07 | Ajinomoto Co Inc | バチルス属細菌によるインタ−ロイキン−２の製造法 |
-
1982
- 1982-05-18 JP JP57082509A patent/JPS58201979A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60115528A (ja) * | 1983-11-28 | 1985-06-22 | Takeda Chem Ind Ltd | ヒトインタ―ロイキン―２蛋白質を含有する抗腫瘍用または免疫機能低下疾患治療用組成物 |
| JPS60248198A (ja) * | 1984-05-24 | 1985-12-07 | Ajinomoto Co Inc | バチルス属細菌によるインタ−ロイキン−２の製造法 |
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