JPS58201982A - ビンブラスチン高生産能を有する植物組織培養物およびその生産方法 - Google Patents
ビンブラスチン高生産能を有する植物組織培養物およびその生産方法Info
- Publication number
- JPS58201982A JPS58201982A JP57085228A JP8522882A JPS58201982A JP S58201982 A JPS58201982 A JP S58201982A JP 57085228 A JP57085228 A JP 57085228A JP 8522882 A JP8522882 A JP 8522882A JP S58201982 A JPS58201982 A JP S58201982A
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- callus
- acid
- tissue
- vinblastine
- combination
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ビンブラスチン高生産能を有する植物組織培
養物およびその生産方法に関し、更に詳しくは、南アフ
リカ産ニチニチソウ（Ｃａ ｔ ｈａｒａｎｔｈｕｓｒ
ｏｓｅｕｓ ）から誘導されたカルス２よびその生産方
法に関する。
養物およびその生産方法に関し、更に詳しくは、南アフ
リカ産ニチニチソウ（Ｃａ ｔ ｈａｒａｎｔｈｕｓｒ
ｏｓｅｕｓ ）から誘導されたカルス２よびその生産方
法に関する。
植物の二次代謝物質として生産される化合物の種類は膨
大な数にのぼるが、その中の多くは古くから医薬、香辛
料、染料およびその他の化学工業原料などとして用いら
れている。そして、これらの化合物は、現在なお不可欠
な有用物質であり、特定の植物の栽培に依存して生産さ
れている。
大な数にのぼるが、その中の多くは古くから医薬、香辛
料、染料およびその他の化学工業原料などとして用いら
れている。そして、これらの化合物は、現在なお不可欠
な有用物質であり、特定の植物の栽培に依存して生産さ
れている。
一方、植物組織培養技術は、俊雑に分化した品等植物を
あたかも微生物のように培養することを１１能にした為
、植物細胞自体が醗酵生産的な感覚で有用物質生産の手
段に利用されるようになっている。この様な植物組織培
養による有用代謝産物の生産が可能となったことにより
、土壌、気候などの自然条件に左右されずに、これら有
用代謝産物を工業的規模で効率よく生産することが可能
となる。
あたかも微生物のように培養することを１１能にした為
、植物細胞自体が醗酵生産的な感覚で有用物質生産の手
段に利用されるようになっている。この様な植物組織培
養による有用代謝産物の生産が可能となったことにより
、土壌、気候などの自然条件に左右されずに、これら有
用代謝産物を工業的規模で効率よく生産することが可能
となる。
ところで、ビングラスチンは、ニチニチソウニ含有され
る抗腫瘍性アルカロイドであって、ホジキン氏病および
急性白血病の治療薬として使用さｎている。ビンブラス
チンは、式： で示される極めて複雑な構造を有し、その全合成は非常
に困難であるといわれている（相見則部「生物活性天然
物質」、柴田承二編、医歯薬出版、４０１頁（１９７８
年）参照）。従って現在、ビン７− ラスチンの供給は
専らニチニチソウかうの抽出に依存している。しかしな
がら、この植物中に含まれるビンブラスチンの含量は極
めて低く、産地によっては全く含まれていないこともめ
る。このような貴重で高価なビングラスチンを、大Ｊｌ
ｓつ安定に供給することが強く望まれていた。
る抗腫瘍性アルカロイドであって、ホジキン氏病および
急性白血病の治療薬として使用さｎている。ビンブラス
チンは、式： で示される極めて複雑な構造を有し、その全合成は非常
に困難であるといわれている（相見則部「生物活性天然
物質」、柴田承二編、医歯薬出版、４０１頁（１９７８
年）参照）。従って現在、ビン７− ラスチンの供給は
専らニチニチソウかうの抽出に依存している。しかしな
がら、この植物中に含まれるビンブラスチンの含量は極
めて低く、産地によっては全く含まれていないこともめ
る。このような貴重で高価なビングラスチンを、大Ｊｌ
ｓつ安定に供給することが強く望まれていた。
本発明者らは、ニチニチソウη・らのビンブラスチンの
生産について研究を重ねた結果、南アフリカ産のニチニ
チソウを組織培養することによりピンブラフチンを効率
よく生産できることを見い出し、本発明を完成するに至
った。
生産について研究を重ねた結果、南アフリカ産のニチニ
チソウを組織培養することによりピンブラフチンを効率
よく生産できることを見い出し、本発明を完成するに至
った。
すなわち、本発明の一要旨は、南アフリカ産ニチニチソ
ウの組織から誘導されたビンブラスチン高生産能を有す
るカルスに存する。
ウの組織から誘導されたビンブラスチン高生産能を有す
るカルスに存する。
また、本発明の他の要旨は、南アフリカ産ニチニチソウ
の組織を、サイトカイニンとオーキシンの組み合わせに
よジカルス化することを特徴とするビンブラスチン高生
産能を有するカルスの生産方法に存する。
の組織を、サイトカイニンとオーキシンの組み合わせに
よジカルス化することを特徴とするビンブラスチン高生
産能を有するカルスの生産方法に存する。
ニチニチソウは、南アフリカ産のものを用いる。
南アフリカ産ニチニチソウは、自体ビンブラスチンの含
量が高く、カルス化した場合のビンブラスチン生産能も
高い為である。ニチニチソウの組織の中でも、葉が最も
高含量でビンブラスチンを含んでいるので、以下の説明
は、葉を用いて行なうが、本発明はこれに限定されるも
のではなく、他の部位の組織を用いることも可能である
。
量が高く、カルス化した場合のビンブラスチン生産能も
高い為である。ニチニチソウの組織の中でも、葉が最も
高含量でビンブラスチンを含んでいるので、以下の説明
は、葉を用いて行なうが、本発明はこれに限定されるも
のではなく、他の部位の組織を用いることも可能である
。
組織のカルス化は、適当な培地、たとえばＭｕｒａｓｈ
ｉｇｅ−５ｋｏｏｇ （Ｍ Ｓ ）培地に各種植物ホル
モンを添加し、これに植物組織を培養して行なう。
ｉｇｅ−５ｋｏｏｇ （Ｍ Ｓ ）培地に各種植物ホル
モンを添加し、これに植物組織を培養して行なう。
植物ホルモンとしては、サイトカイニン、たとえばカイ
ネチンお工びベンジルアミノプリン（以下、ＢＡＰとい
う。）、ならびにオーキシン、たとえば２．４−ジクロ
ルフェノキシ酢酸（以下、２゜４−Ｄという。］、イン
ドール酢酸（以下、ＩＡＡという。）およびナフタレン
酢酸（以下、ＮＡＡという。）を組み合わせて用いるの
が好ましい。
ネチンお工びベンジルアミノプリン（以下、ＢＡＰとい
う。）、ならびにオーキシン、たとえば２．４−ジクロ
ルフェノキシ酢酸（以下、２゜４−Ｄという。］、イン
ドール酢酸（以下、ＩＡＡという。）およびナフタレン
酢酸（以下、ＮＡＡという。）を組み合わせて用いるの
が好ましい。
就中、ＢＡＰとＩＡＡ、ＢＡＰと２．４−Ｄ、カイネチ
ンとＮＡＡの３種の組み合わせが特に好ましい。さらに
、継代培養の場合には、ＢＡＰとＮＡＡの組み合わせも
好ましい。
ンとＮＡＡの３種の組み合わせが特に好ましい。さらに
、継代培養の場合には、ＢＡＰとＮＡＡの組み合わせも
好ましい。
これらホルモンの濃度は、種類に応じて適宜定められる
が、通常、０．０５〜−２０μｆ／、ｎｔ、好ましくは
０１〜１０μｆ／−である。
が、通常、０．０５〜−２０μｆ／、ｎｔ、好ましくは
０１〜１０μｆ／−である。
培養温度は、通常、１５〜３５°Ｃ１好１しくは２０〜
３０°Ｃ１特に２５°Ｃである。
３０°Ｃ１特に２５°Ｃである。
カルスは、少なくとも１〜２週間の培養により誘導され
る。
る。
誘導されたカルスは、１伏目で丁でにピンブラフチン含
量の高いものが多いが、１伏目のビンプスチンの含量が
低い場合は、継代培養を行なってビンブラスチン高生産
株を選抜するとよい。
量の高いものが多いが、１伏目のビンプスチンの含量が
低い場合は、継代培養を行なってビンブラスチン高生産
株を選抜するとよい。
継体培養は、表面継体培養および液体培養のいずれでも
行なえ、表面培養はＭＳ寒天培地を用い２０〜３０°Ｃ
で静置培養により約２０〜３０日毎に継代し、液体培養
は回転培養によＶ約２週間毎に継代する。
行なえ、表面培養はＭＳ寒天培地を用い２０〜３０°Ｃ
で静置培養により約２０〜３０日毎に継代し、液体培養
は回転培養によＶ約２週間毎に継代する。
得られたカルスは、ビンブラスチン’ｋ ０．５〜１５
μｆ／ｆ−ｄｒｙ ｗｔ、の割合で含んでいる。
μｆ／ｆ−ｄｒｙ ｗｔ、の割合で含んでいる。
この様な微量のビングラスチンの定量は、本発明者らに
より開発された生物学的分析法によＶ行なわれる。すな
わち、ビンブラスチンがガン帷；抱の有糸分裂中期に紡
錘体の生成全阻害する点に着目し、ビンブラスチン濃度
と有糸分裂指数との足拭的相関関係を利用して定量する
方法である。この定量法の具体的手順は、次に述べる実
施例において詳述する。
より開発された生物学的分析法によＶ行なわれる。すな
わち、ビンブラスチンがガン帷；抱の有糸分裂中期に紡
錘体の生成全阻害する点に着目し、ビンブラスチン濃度
と有糸分裂指数との足拭的相関関係を利用して定量する
方法である。この定量法の具体的手順は、次に述べる実
施例において詳述する。
実施例１
南アフリカ顔ニチニチソウの葉を水洗し、３％サラシ粉
氷水溶液中２０分間殺菌した後、無菌水で４回洗浄した
。次いで、葉ｉ ０．５ ＣＭに切断し１ζ。
氷水溶液中２０分間殺菌した後、無菌水で４回洗浄した
。次いで、葉ｉ ０．５ ＣＭに切断し１ζ。
一方、ＩＶｉ Ｓ培地に第１表に示す各種植物ホ／レモ
ンの組み合わ一＋！：ｋ ｍ’ｓ加した寒天培地（０，
８％ａｇａ ｒ）を調製し、こ扛に切断した葉勿のせ、
２５°Ｃでカルス化した。カルス化は２週間で完了した
。
ンの組み合わ一＋！：ｋ ｍ’ｓ加した寒天培地（０，
８％ａｇａ ｒ）を調製し、こ扛に切断した葉勿のせ、
２５°Ｃでカルス化した。カルス化は２週間で完了した
。
カルスのピンプヲヌチン含量は、次の様にして定量する
： （１］ 培養した細胞を凍結融解熱地し、メタノール
で抽出した後、減圧下で蒸発乾固する。残５＆ヲアンモ
ニアア゛ルカリ性でベンゼンにより抽出し、塩酸酸性に
して水層に移し、ビンブラスチンを含ｔｒ粗アルカロイ
ド画分會得る。
： （１］ 培養した細胞を凍結融解熱地し、メタノール
で抽出した後、減圧下で蒸発乾固する。残５＆ヲアンモ
ニアア゛ルカリ性でベンゼンにより抽出し、塩酸酸性に
して水層に移し、ビンブラスチンを含ｔｒ粗アルカロイ
ド画分會得る。
（２）粗アルカロイド画分を、水酸化ナトリウムまたは
塩酸で中性とし、後に測定する有糸分裂指数（Ｍｉｔｏ
ｔｉｃ １ｎｄｅｘ ）が１５％以下となる様に、すな
わちビンフ”ラスチン含量がｌ ｎｇ／−〜２０ ｎｇ
／−となる様にＰＢＳ←）で希釈して試料とする。
塩酸で中性とし、後に測定する有糸分裂指数（Ｍｉｔｏ
ｔｉｃ １ｎｄｅｘ ）が１５％以下となる様に、すな
わちビンフ”ラスチン含量がｌ ｎｇ／−〜２０ ｎｇ
／−となる様にＰＢＳ←）で希釈して試料とする。
（３） 一方、牛血清１０容量％、グルタミン３００
μｆ／、ｌ、ペニシリン５ＱＵ、／ｍ／、カナマイシン
５０μ９／、ｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／−およ
びファンギゾン０．０５μ’；！／、ｌｋ添加したイー
グル（Ｆ、ａｇｌ ｅ ） Ｍ Ｆ、 Ｍ培地を用い、
と ？５−３Ｍ胞（２Ｘ １０”ｃｅｌｌｓ／ｍ／ ）
を５日毎に植えかえて継代培養する。
μｆ／、ｌ、ペニシリン５ＱＵ、／ｍ／、カナマイシン
５０μ９／、ｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／−およ
びファンギゾン０．０５μ’；！／、ｌｋ添加したイー
グル（Ｆ、ａｇｌ ｅ ） Ｍ Ｆ、 Ｍ培地を用い、
と ？５−３Ｍ胞（２Ｘ １０”ｃｅｌｌｓ／ｍ／ ）
を５日毎に植えかえて継代培養する。
（４） ヒーラｓ−３稲胞培養物を１−ずつがイアル
ピンに小分けし、１日培養する。これに（２）で得た試
料の一定量（５０μりを添加して６時間培養する。
ピンに小分けし、１日培養する。これに（２）で得た試
料の一定量（５０μりを添加して６時間培養する。
（５）６時間培養後、培地をすて、細胞’ｉＰ、Ｂｓ（
＠で洗浄し、０．０２５％トリズシン溶液を加え、細胞
をビンの壁から剥離する。次いで、１００ｒＰｍで２分
間遠沈し、ＰＢＳ←）で１回洗浄し、再び遠沈した後、
０．０７５Ｍ７５Ｍ塩化カリシラム、５−を加え、低張
溶液処理を３７°Ｃで１５分間行なう。
＠で洗浄し、０．０２５％トリズシン溶液を加え、細胞
をビンの壁から剥離する。次いで、１００ｒＰｍで２分
間遠沈し、ＰＢＳ←）で１回洗浄し、再び遠沈した後、
０．０７５Ｍ７５Ｍ塩化カリシラム、５−を加え、低張
溶液処理を３７°Ｃで１５分間行なう。
これを遠沈し、上清會０．１４残した状態で４°Ｃにお
いてカルノア液１滴を加え、４°Ｃで静置する。
いてカルノア液１滴を加え、４°Ｃで静置する。
５〜１０分後、カルノア液１−を重層し、再び４°Ｃで
１０〜１５分間静置した後、カルノア液で３回洗浄し、
こｎｔ−スライドグラス上に゛火炎固定する。
１０〜１５分間静置した後、カルノア液で３回洗浄し、
こｎｔ−スライドグラス上に゛火炎固定する。
（６） ヌライドクラヌに固定した細胞をギザム液（
ギザム液２滴／リン酸緩＃液１−）に浸して静置するこ
とにより染色でる。１５分後、ギザム液を水で洗い流す
。
ギザム液２滴／リン酸緩＃液１−）に浸して静置するこ
とにより染色でる。１５分後、ギザム液を水で洗い流す
。
（７） 染色後、細胞勿顕１！ｉ！鏡（１５０倍〕で
観察る。一視野内に見える約２００個の細胞のうち、分
裂中期の細胞数ケカウントする。こｔ’ｌ−５同繰り返
してその平均鎮（％）を求め、その値を有糸分裂指数と
する。
観察る。一視野内に見える約２００個の細胞のうち、分
裂中期の細胞数ケカウントする。こｔ’ｌ−５同繰り返
してその平均鎮（％）を求め、その値を有糸分裂指数と
する。
（５） 得られた有糸分裂指数から、第１図に示す検
量線を用いてビンブラスチン濃度を決定する。
量線を用いてビンブラスチン濃度を決定する。
この様にして定量したカルスのピンツーラスチン含量を
第１表に示す。
第１表に示す。
注１）カイネチン
実施例２
実施例１と同様にしてカルヌ化した細胞ヲ２５℃で表面
培養により２５日毎に植えついで継代培養した。各世代
のカルスのビンブラスチン含量全実施例１と同様に定量
した。結果を第２表に示す。
培養により２５日毎に植えついで継代培養した。各世代
のカルスのビンブラスチン含量全実施例１と同様に定量
した。結果を第２表に示す。
第２表
注１） Ｎｏｔ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ実施例３
同−卸ｉ胞集団中のビングラスチン生産能のばらつきを
調べるため、ＶＡ３−１株を約２ｍ角の細胞塊に小分け
し、それぞれＭＳ寒天培地（ＮＡＡｌ ０ ／１ｇ／、
ｔ、 Ｂ Ａ Ｐ １，０μｇ／−含有）に植え、５℃
で２５日間表面培養した。さらに２５℃で２５日間培養
により、もう１伏線代培養した。各カルを スのビングラスチン含量実施例１と同様に定量し△ た。結果を第３表に示す。株名の下の（）内にビンブラ
スチン含量（μｆ／ ｆ −ｄｒｙ ｗりが示されてい
る。
調べるため、ＶＡ３−１株を約２ｍ角の細胞塊に小分け
し、それぞれＭＳ寒天培地（ＮＡＡｌ ０ ／１ｇ／、
ｔ、 Ｂ Ａ Ｐ １，０μｇ／−含有）に植え、５℃
で２５日間表面培養した。さらに２５℃で２５日間培養
により、もう１伏線代培養した。各カルを スのビングラスチン含量実施例１と同様に定量し△ た。結果を第３表に示す。株名の下の（）内にビンブラ
スチン含量（μｆ／ ｆ −ｄｒｙ ｗりが示されてい
る。
第１図は、ビンプクヌチン濃度と有糸分裂指数との相関
を示すグラフ（検量線）でおる。 特許出願人 三 浦 喜 温
を示すグラフ（検量線）でおる。 特許出願人 三 浦 喜 温
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、南アフリカ産ニチニチソウの組織から誘導されたビ
ングラスチン高生産能を有するカルス。 ２、組織が葉の組織である第１項記載のカルス。 ３、南アフリカ産ニチニチソウの組織を、サイトカイニ
ンとオーキシンの組み合わせによりカルス化することを
特徴とするビングラスチン高生産能を有するカルスの生
産方法。 ４、 サイトカイニンとしてカイネチンまタハペンジル
アミノプリンを用い、オーキシンとして２゜４−ジクロ
ルフェノキシ酢酸、インドール酢酸またはナフタレン酢
酸を用いる第３項記載の方法。 ５、 ペンシルアミノプリンとインドール＃酸の組み合
わせ、ベンジルアミノプリンと２．４−ジクロルフェノ
キシ酢酸の組み合わせまたはカイネチンとナフタレン＃
酸の組み合わせを用いる第４項記載の方法。 ６、 ベンジルアミノプリンとナフタレン酢酸ヲ用いて
カルスを誘導し、誘導細胞をランタムに植え継ぎ、ピン
フヲヌチン高生産株を選抜する第３項記載の方法。 ７、組織が葉の組織である第３〜６項のいずれかに記載
の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57085228A JPS58201982A (ja) | 1982-05-19 | 1982-05-19 | ビンブラスチン高生産能を有する植物組織培養物およびその生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP57085228A JPS58201982A (ja) | 1982-05-19 | 1982-05-19 | ビンブラスチン高生産能を有する植物組織培養物およびその生産方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58201982A true JPS58201982A (ja) | 1983-11-25 |
Family
ID=13852704
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP57085228A Pending JPS58201982A (ja) | 1982-05-19 | 1982-05-19 | ビンブラスチン高生産能を有する植物組織培養物およびその生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS58201982A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990012102A1 (en) * | 1989-03-30 | 1990-10-18 | Novalal Plc | A process for preparing alkaloids |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5799191A (en) * | 1980-10-22 | 1982-06-19 | Synthelabo | Culturing of plant cell in vitro |
-
1982
- 1982-05-19 JP JP57085228A patent/JPS58201982A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5799191A (en) * | 1980-10-22 | 1982-06-19 | Synthelabo | Culturing of plant cell in vitro |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1990012102A1 (en) * | 1989-03-30 | 1990-10-18 | Novalal Plc | A process for preparing alkaloids |
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