JPS5831988A - 新規なクロ−ニングビヒクル - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物量での組換Ｔ）ＮＡ遺伝学に有用なプラスミドベ
クターの発展は良く知られている。サイエンス１９６巻
、１９７７年４月の論説はＤＮＡ研究を良くまとめてい
る。この論説はサイエンスの同号の幾つかの支持論文を
伴っている。

同様なりＮＡ研究がストレプトミセス属の工業的重要ガ
微生物に対！、てなされている。ビップス。

エム　ショッテル、シエー　エル、及ヒコーエン。

ニス　エン１９１号Ｏ，ネイチャー里５２ｆｉ　−５３
１抗生物質牛産ストレヅトミセス中の種間遺伝子変換の
だめのＤＮＡクローン化系；ショッテルジエーアール、
ビップス　エム、及ヒコーエンエス　エヌ１９８１　、
　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１４旦　３６０−３（ｉ８
　、大腸菌から由来する抗生物質抵抗性遺伝子のストレ
プトミセス　リビダンス中のクローン化及び表現：スア
レスシエーイニ及びチャーターケーエフ１９８０゜ネイ
チャー、　　２Ｒ６、５２７−５２９、ストレプトミセ
ス中のＤＮＡクローニング：ストレプトミセス　ファー
ジ中に挿入された１）ＢＲ３２２からなる二官能性レプ
リコン；及びｌ・ンヅソン　シージエー、ワーＰジエー
エムルヒホツプウッドディーエ−１９８０゜ネイチャー
２Ｒｆｉ　　５２５−５２７　、スルブトミセスのＤＮ
Ａクローン化：抗牛物質牛産打かＣ）の４１（抗性遺伝
子，を参照。

プラスミドｐＵｃｆｉ　　けスＩ・レプトミ（イス　エ
スビノザ．Ｘ　（　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｅｓｐ
ｊｎｏｓｕθ）バイオタイプ２３７２４　ａ，　ＮＲＲ
Ｌ　１１４３９　　から単ぬ１出来る。米国特．ｉ／１
′−第４２７３Ｆｔ７５けｐＩ］ｃ　６　　を開示し特
許パ＋’（求している。

本発明に於てプラスミドｐ［］ＪＣから〜２．（）キロ
ベース（Ｋｂ）のＤＮＡを削除することによって予期せ
ぬ高いコピー数のプラスミドを構成することが出来た。

この高いコピー数のプラスミドはｐ＋Ｉｃ　１０ｆｉｌ
と基金される７′］；、任意の生物からのＤＮＡ配列の
クローン化に便用出来又は使用出来る、Ｌうに適合由来
るただ１個のｘｈｏ　Ｔ位Ｉ〆（゛を有１〜でもいるの
でイｆ利である。

プラスミドｐ［ＪＣ　ｌｔｌｆｉｌけプラスミドｐＵｃ
１ｉから〜２、ＯＫｂのＤＮＡを試験管内（インビトロ
）で削除することにより構成される。この構成け」：り
小さな方のｐＵＣ　（ｉ　Ｘｈｏ　Ｉ制限エンドヌクレ
アーゼ断片を削除することからなる。ｘｈｏ■及びＳａ
ｌ　Ｎ　　エンドヌクレアーゼはＤＮＡ断片上に適合可
能な一重鎖末端を生じるからｐＵＣ　１０６１Ｘｈｏ　
Ｔ位置けｘｈｏ■及びＳａｌ　ｌ　消化ＤＮＡを受ける
こと一／に出来る。そのうえ他の制限位置を含むＤＮＡ
配列けｐＵＣ　］Ｏｆｉｌ　Ｘｈｏ　■位置にクローン
化され得、他のエンドヌクレアーゼにより生じたＤＮＡ
配列をクローン化するのに適し満たしていって線」二の
プラント末端（二本が末端最？ａ　ｔで対になってい々
いにぷい切端の末端）の二重鎖Ｔ）ＵＣ　１０６１ＤＮ
Ａを与えることが出来る。この形のｐｕｃ　１０Ｆｉ１
．　ＤＮＡは任意の出所のプラント末端ＤＮＡ断片にプ
ラント末端連結することが出来る（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄ
　ｌｉｇａｔｉｏｎ　）。

ｐＵＣ　１０６１のそれ以外の有用性はエンドヌクレア
ーゼＢ＋，（ＩＩＩとＢＯ１’ｉ　　の他の単一制限位
置に古来するものである。これらの位置もＤＮＡ断片を
クローン化するのに利用出来る。

　５　− 予想外にもそして有益にもｐｔ］Ｃ］０６１けｐＬ］ｃ
　６のコピー数よりも高いコピー数を有する。ｐＴ］Ｔ
：１０６１のコピー数はｐＵｏ　６の２０〜加のコピー
数に較ベストレプトミセテのゲノム”＋を当たり〜２　
（１　（１〜５００である。この高いｐＵＣ１０６１の
コピー１りげものすごい遺伝子投与効果を利用ｌ〜でク
ローン化された遺伝子の非常に低い水準の表現の検出を
可能にする。

プラスミドｐＵＣ　６は新規な微生物のストレゾトミセ
スエスビノザスパイオタイプ２３７２４　ａ　、　ＮＲ
ＲＩＩＪ１４．３−ｉｌ １１４　３　９から得られる。このプラスミドけＮ　Ｒ
Ｉ３　ＴＪｖｌＪｈら、培養基を適当な培ｆ１１．−１
＝で生育させ、適当な時間の後培養基を収穫し、菌糸体
を断裂させ、次に菌糸体を溶菌させることによってイｌ
↓ることか出来る。

この溶菌物から本質的に純粋なｐ［］ｃ　ｆｉを単離す
ることが可能である。ｐＴ］Ｃ　６は分子量およそ６．
０メガダルトン、制限エンドヌクレアーゼに対する感受
性及びストレプトミセスニスピノサスＮＲＦｔＬ１１４
３９細胞当たり２０〜４０コピー数での存在を含む標準
の特性化試験により特性化される。

図面は約７．２キロベースの分子量を有するプラ　６　
− ｙ、ミドｐＵＣ１０６１に基づいて構成される。制限エ
ンドヌクレアーゼ略称は次の通りである。（１１ＢｇＩ
ＴＩけバシルス　　グロビジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｇ
ｌｏｂｌｇｉｉ　）からの酵”Ｐ、（２１Ｂｃｌ　ｒは
パシルス　カルトリティカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａ
ｌｄｏｌｙｔｉｃｕｓ　）からの酵素、（３）Ｐｖｕｌ
ｒ　ｋｌニブロチウス　プルがりｙ、　（Ｐｒｏｔｅｕ
ｓ　ｖｕｌ　−ｇａｒｉｓ　）からの酵素、そして（４
＞　ＸｈＯＩけキサントモナス　ホリコラ（Ｘａｎｔｈ
ｏｍｏｎａｓ　ｈｏｌｉｃｏｌａ　）からの酵素である
。

ｐｌ］Ｃ１０６１は形質転換で宿主微生物に導入出来る
組替プラスミドを造るのに使用出来る。組替プラスミド
を造る方法は技術分野で良く知られている。

このツノ法七ｌ単離されたベクター　プラスミドを特宇
位置で制限エンドヌクレアーゼ例えばＢｇｌ　ｆｌ、Ｘ
ｈ、Ｏｌ　などによって開裂させることを含む。環状り
罷分子であるプラスミドは、こうして二重のＤＮＡ鎖を
喘定位置に於て切断する酵素によって線状ＤＮＡ分子に
変換される。他の非ベクトルＤＮＡも同様に同じ酵素で
開裂される。線状ベクター又はその一部及び非ベクター
ＤＮＡを混合するとこれら一重鎖又はプラント（二本そ
ろって切ｉ１ない鈍い切端）１）ｈｌ八 末端１互いに対になってボーリーヌ−り一し−オーｆ−
１〆　リガーセとして知られる第２の酵素のＹＩｌ′ｌ
：、下で１１有結合で連結さｔｌもず、単一環状ｉ）Ｎ
　Ａン・１１ネ成する。

微生物とプラスミド 次の微生物はアメリカ合衆国イリノイ州ビオリ−ｙ’　
合衆１−＋１　農務省ノーザン　リージョハル　リーリ
一チ　ラホラトリーの永久収集かＣ）入手１１しｌｌ；
ｒ）。

ｔ　℃ ベ　　ベ 　９− これらの寄託物は、とわらを明らかにした鍵受入のアッ
プジョン・ノ７ンノ？ニーのｌ涛ＩＦ　ＩＩＶ　Ｖ４ｉ
により一般に人手できる。゛また本出願の対応又に［そ
の関連特許が出願される国々の米国以１１の１１”、１
ｄ′１法で必要とされるとおりに人手できＺ）。ｊ、か
し保イＴ−株か人手できるからといって、１−１政行為
によって１７λらねた特許権を侵害（−てｉで本発明の
牛１許実１ｔＩｉ　４；ｉｉを行使してよいということ
でけ力い。

プラスミドｐｔｌｃ６とｐ［ＪｃＩ０６１に姐するＨＲ
］、ＩＴ　　　　　　　　　１　　　　　　　　１ＰＶ
ｕＩＩ　　　　　　　　　４　　　　　　　　　：（Ｂ
ｃｌ）　　　　　　　　　３　　　　　　　　１ＸｈＯ
）　　　　　　　　　２　　　　　　　　１Ｐ日Ｔ；　
Ｉ　　　　　　　　　　　　　　　（１１２１”　　　
　　　　　　　　　＋１＋２１”ｓａｔ　Ｉ　　　　　
　　　　２　　　　　　　　２ＢａｍＨ（（１（１ ）（：Ｌｎ（ｉｌｌｌ　　　　　　　　Ｏ０Ｋ−ｐｎ　
Ｉ　　　　　　　　　ｒｌ　　　　　　　　　ｆ＋Ｈｐ
ａ■　　　　　　　　　　　Ｑ　　　　　　　　　　　
　Ｏｌｌ：ｃｏＲｌ　　　　　　　　　　　　００Ｘｂ
ａ）　　　　　　　　　　　　Ｏ０８ａｌ　Ｔ　　　　
　　　　　　　（−ｉ−７５−６中、ストレプトミセス
　エスピノザスパイオタイプ２３７２４　ａから単離さ
れたシラスミドｐＵＣ６ＤＮＡｉＩ　Ｐｏｔ　ｌ　エン
ドヌクレアーセにより開裂され々い。

しかしｐＵｃｆｉが大腸菌に−１２の中にクローン化さ
Ｊすると２つのＰＢｉニア位置が現われる。これに対応
してシラスミドｐＵＣ１０６１け２つのＰｅｔ　ｉ位置
を有するかストレプトミセス　ニスピノサスから単Ｍし
／：、　１）Ｎ　Ａ中ではマスクされている。

プラスミドｐＵｃ　６とｐＵＣ１０６１についての宿主
ゲノムえｈ量あたりのコピー数の対比プラスミド　　　
プラスミドＤＮＡのチ　　　コピー数１ｐＩＪＣ６３，
０３３ Ｔｌ［ＩＣＨ）６１　　　　　　　　４５．０　　　　
　　　　　　　４７３ａ、プラスミドＤＮＡ　＋７）％
はＤＮＡを〔３）１−メチル〕チミジンでラベル［７、
染料−密度勾配平衡物中でのラベルされた細胞の未精製
溶菌物を遠心することによって測ガ−する。これＣ１シ
ラスミ１°と染ｒ！′＋５体ＤＮＡを２つの区別出来る
バンドに分割する。これらの密度勾配物を１０滴分画と
して集め、放射能水準を測定する。勾配物中の介ｎ１）
〃ｑ［イｊｌ−，に対するプラスミドバンドの放射能の
一１ｆｔが存在−４゛るプラスミドＤＮＡのパーセント
を表わす。

ｂ、われわわはこれらのコピー数削１９で５．２×１０
９の分子１１をストレプトミセスの染（Ｑ　（イの大き
さを表わしているものとじでイψ月１した。

以下の秋！施例日、本発明の方法及び生成物を例示する
ものであるが、限５ｉ的に二４えらｔｌてけならない。

他にｆ−１−童がなければ、自分率はすべて重１臥溶媒
混合物の割合ｄすべて容置による。

実施例１　　生物学的に純粋なストレプトミセスｆｆ−
スビノザス（ＩＪｌ；ｒθｐｔｏｍｙｃθ８θθｐｉ、
−ｎｏｅｕｅ　）バイオタイプ２ニー１７２４　ａ　、
　Ｎ）（１１１４３９の培養基か１つのプラスミドｐＵ
ｃｆ；の単離 ストレプトミセス　ニスピノサス（１３ｔ、ｒθ■、＋
１：０ｍ７Ｑθｌ１ｅｅｐｉｎｏｅｕｓ　）バイオタイ
プ２３７２４ａ　、　ＮＲＲＬ　１１４３９の生物学的
に純粋な培養基からの胞子をディフコ抗生物質培地Ｎ［
１３ブロス１０薄ｅ中に接種する（　Ｄｉｆｃ。

Ｌａｂｓ、デトロイト、ミシガン）二ビーフェキス０．
１５係；酵母エキス０．１５％；ベゾトン０．５係；グ
ルコース（１，１％　；　ＮａＣ／−０，３５％　；　
Ｋ２ＨＰ０．０．３６８　％　；及びＫＨ２ＰＯ４０、
１３２係。

培［１ヲ５０　ｍｌのエレンマイヤーフラスコで予め滅
菌しておく。接種後フラスコを３７゛Ｃで約３６〜４８
時１１１’ｌ　１００〜２５０　ｒＴ）ｍで作動するガ
ンプ又はニューブランズウィック回転振とり機上で培養
する。培養完了稜フラスコ中の菌糸体とブロスの懸濁液
を滅１’４￥φ件下で均一にし、次に上記培地１０ｍ１
及び有利には６８チ（Ｗｌｖ）のショ糖と１％（Ｗｌｖ
）のグリシンナ含んでいる１２５ｍ１′の滅菌エレンマ
イヤーフラスコ中で７１も合する。ショ糖とグリシンの
添加は稜で細胞溶菌を促進する。培地のショ糖及びグリ
シン釦は、目標を以後の細胞溶菌を促進することにおき
慣用の調整法で変化させるととが出来る。

フラスコを次に更に３６〜４８時間３７°Ｃで上の様に
ガンプ回転振とり機」二で培養する。この培養の彼、＝
１３− 菌糸体を低速遠心例えば（’＋（Ｉ１１０×ｇ、１５分
、／Ｉ　’Ｃでプロスから分離し、そし−Ｃ菌糸体イｌ
／ントから」二層を傾斜で除く。

十澄を捨て、ベレットをエザレンジアミノデトう酢酸（
ＥＤＴＡ　）及び蔗糖を含む′、１に張緩衝液、例えば
ａ＋−ｇ（ｗ７ｖ）蔗糖を含有−シーるＴ’ＫＳ緩イｆ
ｉｉ　Ｍｓ：　Ｃ０，０３Ｍトリス（ヒドロキシメチル
）アミンメタン（トリス）、０　、　（＋０５　）Ａ　
Ｄ２ＤＴＡ及びｎ、ｎ５ＭＮＡＣ：ｔ　；　ＴＩＨ＝８
．（＋　）１．５ｍｌに内懸淘する。次に同緩伸工液中
の１．５ｒｎｅの５■／ｍ／′リゾチーム溶液台加λ混
合物を、４７°Ｃで１３０多）時々混合しながら培養す
る。次に１．５１Ｗ／４の（１，２５ＭＥＤＴＡ　（ｐ
Ｈ＝８．０　）を加えこの４Ｉ、合物を：３７“Ｃで１
５分培養する。

次に菌体懸濁液を溶菌混合物２．５＋＋＋ｅの添加、例
えば［１，０％　（Ｗｌｖ）Ｂｒｉ、１−５８（イリノ
イ州ロックフォード、ピアース　ケミカル　カン／ミニ
−により販売されている洗剤）、０．４　％　（Ｗｌｖ
）デオキシコール酸、０．０５Ｍトリス（１）Ｈ＝　８
．０　）及び（１，０６ＭＦｉＤＴＡ　）、及びこのｎ
７２合物を１３７°Ｃに於て加分培養することによって
溶菌する。溶菌物を次にｌ（Ｉ　ｍｅのピ１４− イツトに５〜１０回通過させるととＫよって剪断する。

剪断した溶菌物を次にリボヌクレアーゼ（１４゜ｔｒｇ
／ｍｅ　）とプロナーゼ（３０（ｌ　ｔｔｇ／　ｍｌｉ
　）で更に３７°Ｃ−Ｃ２（１３）消化する。別の方法
として、菌体−リゾチーム−Ｈ：ＤＴＡ混合物を、水中
の２％ドデシル硫酸すトリウムカとの溶昭剤で溶菌させ
る前にリボヌク１７アーセ及びプロナーゼで消化させる
ことが出来る。

この粗ルシ浴菌物質を次に塩例えば塩化セシウム＜Ｉｒ
−４しい）、硫酸セシウム及びインターカレーション（
割込み）染料の臭化エチジウムと混合してρ−Ｌ５５０
の密度の溶液を力える。この溶液を連心分ｔｉｌｌ　し
て１４５．［ＨｌＯｘｇで平衡させる（密度勾配置１１
ｒｌ！、＋遠心法）。そうすると共有結合で閉鎖された
環状のプラスミドＤＮＡは遠心・θ中で長波長紫外（３
２゜１）ｍ）照射］゛で糾ｊ状の染色体及びプラスミド
ＤＮＡのｌ１ｉｌｉい０い光帯のドのうすいけい光イｆ
Ｙとして見えてく、イ〕。

共有結合で閉じられた環状のプラスミドＤＮＡは密度勾
配・ｒ・衡物から取り除き、イソプロピルアルコールの
％容で２回グ１理す２）ことにより臭化エチジウムを抽
出し、次に水ＩＣ？）を適当′ｆｒ緩倚Ｓ液、例えば”
　Ｘ５ＳＣ＆　衝液（（１，（Ｎ　Ｆｉ　Ｍ　１４ａ、
Ｃ／、（１，０旧５Ｍり丁ン酸す）・リウノ、　；　Ｔ
）Ｈ＝　７．４　）　ｉ／Ｃ力１１．て透４１ｉ　１．
、て本質的に純粋なｐＵｃ６を生成すｚｌことにょ−）
てｌｒ：ｒ性決定のために調製さｆする。

実施例２　　プラスミドｐｔｌＣ１ｆ１６１の１１．１
．１　’Ｊｙ実施実施例証載のとおりにつ＜　１’）わ
るプラスミＦ　Ｔ）ＩＪｃ　６は、次のように！ｔｉｌ
ｌ　Ｋ艮丁ンドヌクｌ／アーゼｘｈｏ■　て゛の消化に
よって線状にざｆする。

ＴＵＢ緩ｍ＋沿（ｆｔ、（１１Ｍ　ト　リスＨＣ１，、
（１，ｆｌｌ　Ｍ　ＩＩ］）ｉ’Ａ、　Ｔｌ＋４８．０
　）　２Ｆｇｔｌ−中のｐ（ＩＣ（１ＤＮＡ約＋’１．
５／Ｉｇを等容ｈ１の２ＸＸｈＯＩ制限酵素緩衝液（０
，：うＭ　ＮａＣ／、、　１２１ｏＭ　トリｙ、　ＨＣ
Ｉ　［ｐＨ７，４］、１２　ｍＭ　ＩＡにＣ１２，１２
ｍＭ　２−　メ／ｌ　カプトエタノール）人びＸｈｏ　
（制限酵メ・ご２申イ１７と混合する。この試料を３７
°Ｃで１時間消化させる。

生ずる消化物を（１，８％訓和製１１１低融アガロース
／７’　ルヘカｋｊ、５０ホルト、４°Ｃテ〜３１＋、
′Ｎ　１ｌｆｌ　’）Ｉｆｆｆｆ側させる。分割をれた
用４Ａ断片は臭化エチジウム染色及び長波長紫外光照射
によって）、１．乏るようにされる。ＤＮＡを含有する
ゲル領域はゲ゛ルから切除し１．５ｍｅのＴＩＣ緩衝液
の存在下に６５°Ｃに加熱し、ゲルを溶ＦＡ’ｌｔさせ
、ゲルマトリックスからＤＮＡを放出させＺ）。との懸
濁液を冷却し、：’１７　、０００　Ｘ　ｇで遠心分肉
１１させてアがロースをベレット化させる。上澄を何１
斜させとっておく。アガロースベレットは２回Ｌ１の抽
出をｑ’ｇ緩衝液と６５°Ｃに加熱１７て行う。２つの
に澄をため、０．１容のＮａアセテート及び２容の１）
５噛エタノールを−２（ビＣで添加させることによりエ
タノール沈殿さぜる。ＤＮＡ沈殿は８５．０００Ｘｇ’
ｔｌ’４°Ｃで６（１９）遠心することによって集める
。沈殿を１（Ｈ１／ｌ／のＴＢ糸′Ｇ価液中に凹溶解さ
せる。生じるＴ）ＵＣ６１）ＮＡ沈殿の最大断片を次の
様に連結させる。

、Ｉｌ（結（リゲーション）にはδμｔのＤＮＡ試料を
５ＢＬ（／”）　２　Ｘ連結用緩価液［１３２ｍＭ＋−
リスＨＣｔ、１３．２＋ｎＭ　ＭＩ７Ｃ７２，２０ｍＭ
　　ジチオスレイトール（ＤＴＴ　）　ｐＨ７、（ｉ〕
、】ｔｔ！、の８ｍＭＡＴＰ　　及びｌｌ４ｉ位のＴ４
　ＤＮＡリガーセと混合する。この混合物を１〜２時間
Ｚ２°Ｃで培養（〜、次にＮＲＲＬ　１１４３９培養基
から調製したストレフ゛トミセス　ニスピノサスの原形
質（プロ１７− トラスト）を形質転換するのに使用する。

原形質を次のやり方で成艮形菌糸イ、（かＣ）〜、ｌＪ
　ＩＪする。胞子をＳ−培地〔オツノニシ　ｔＡ、スズ
キ　Ｋ、ウメサ７　　Ｈ，］！１７／１．　Ｊ、Ｇｅｎ
、ＭｉＣｒＯＩＪｉｏｌ　＠ｉｌ　３）（ｔｌ　−、／
ＩＯｎ。

ストレプトミセテの原形質の形１）ｋ及びフチ転：　」
ｔ’ｆ　＊Ｗ基条件とフ１〉席学的イυ（弗〕に接神ｌ
７３７°Ｃで２・１〜４ＨＩＳ間生育させる。この培養
基を均仙化さ−１）、０．５係グリシン全含イｆする新
た々Ｓ−ｊ合地の培地−児に接細するのに使用する。ク
リシン袖−１６培￥ｒ基を９（（ｌζ２４〜４８　Ｑ間
３７’Ｃテ生有させ、３０００　Ｘ　ｇで涼心さ−Ｕて
収穫し、１１猛（１，３Ｍショ糖でどＮ、い、（１，３
Ｍショ糖に再懸濁する。この懸洞治をプランノンモデル
２２０超廿波水浴中でｂ〜：ＪＪ＋ｒ分音波処」」叫７
．３ｏ　（１（ＩＸｇでベレット化させ、Ｋｌ／ツ）　
ｆ、’−５７ｑ　／　１）（ｌのリソチームを＠　’Ａ
’　−ｒ　ルＰ−Ｊ＋ｌ　ｕｌ＋、中Ｖ（１１）ｖｌ蜀
すル〔オカニシ　Ｍ、スズキ　Ｋ、及びウメザヮ　月、
　Ｈ１７ＣＪ。

Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂ」、ｏｌ、　Ｈ（１３Ｂ９−４（
Ｈｌ、ストレプトミセテ原形質の形成及び逆転：培養基
φ件とＪし独学的研究〕。菌糸体及びリゾチームを３７
°Ｃで原プ１イ質力；放出さｔしる筐で培養する。菌糸
体の残骸は滅閲綿栓を通してろ過することにより原形質
懸濁液から除く。残留するリゾチームは２回原形質をペ
レット化しＰ−培地でそれらを洗浄することにより除く
。最後に原形質をＰ−培地に再懸濁する。

原形質形質転換は０．５ｍＪの原形質懸濁液をＰ−培ｊ
ｌｌＩｉ＋　ノ０．０５ｍ／　（１）　ＤＮＡ　試料及
び０．５　ｍｌ：（７）　２ｆｌ　％ポリエチレングリ
コール（ＰＢＧ−ｆｉＯｏｏ　）と混合し、そｊ７て混
合物を１時間室温で放置することによって達成する。次
に５　ｍｌのＰ−培地を加え、原形質をにレッド化する
。ベレットを食客（例えば０．５罰）をり十げこの混合
物をＲ２再生培地〔オカニシ　Ｍ。

スズキ　Ｋ７ウメザ’７　　Ｈ，１９７４、Ｊ、　（）
ｅｎ、　Ｍｉ、ｃｒＯ−ｂｉＯ］、　Ｈ（１：（＋（９
−４００、ストレプトミセテ原形質の形成及び逆転：培
養基条件と形態学的研究〕土で軟質寒天覆いとしてのＲ
２培地中で０．７５　％寒天を使用１１．て平板培養す
る。３７°Ｃで培養して７〜１０日後形目抜換体をあば
たの生成により検出する〔ビツブス　Ｍ、Ｂ、、ワード
　Ｊ、Ｍ、、ポツプウッド　Ｄ、Ａ、　１９７８、イ、
イチャー２７４３９８−４００、トランスフォーメーシ
ョンオプゾラスミドＤＮＡ　イントウストレプトミセス
アット　ハイ　フレクエンシー〕。

上記の手１＋ｌｉ　ｒ、Ｊ’　ｐＵｃ　１０６１を宿−
ジ′るクローンをｌ−７える。こレラのクローンのスト
レフトミセス　エスビノザス（ｐＨｃ　ｌ０ｆｉｌ　）
　、Ｎ１（ＲＴ、　１２４１（Ｆ（と品名される。

シラスミドＴ’ＵＣ１０６］けストレプトミセス　ニス
ピノサス宿主かＩ−）良く知られた手１１に１、例えば
十記未精製溶閑物−密度勾配平衡手＋１１１’ｉを使Ｉ
ＩＩ　Ｌ−ｃ単離出来る。Ｔ）ＵＣＩＯｆｉｌを含有す
る形質転換体が同定されたなら、これらは純粋な培誉基
中で純粋なものとして分１１ｉｆされる。

このシラスミドはその独特の制限パターンによって別個
のものとし、て区別出来る。

制限エンドヌクレアーゼは市販調製物としてミルズラホ
ラトリー及びニュー　イングランド　パイオラボズから
得られた。酵素消化物目少なくとも２培過剰のエンドヌ
クレアーセを１史１１して１１（給者により特定された
条件に従い醍１製ｌまた。

消化１．た試料は０．７〜１％アガ゛ｒ）−ス　ゲルに
かけ、ゲル旨さｍ当り１００Ｖの一定付加電圧で３時間
電気泳動を行った〔シャープ　ビーニー（ＦＪｈａｒｐ
・Ｐ、Ａ、　）、ザグデン　ジエ−（臼ｕｇｄｅｎ　、
　Ｊ　）及びサンプルツク　ジェ−（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
　、　Ｊ　）　１９７３、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍ
ｏｐｈｉｌｕｓ　ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ　）中
の２つの制限エンドヌクレアーゼ活性の、分析用アガロ
ースーエチジウムブロマ゛イド電気泳動を使用−Ｃる検
出。バイオケミストリー１２巻３０５５−３０６３　）
。

制限断片の分子＋ｔｔけ酵素Ｔ（１！Ｍｌｌ［で消化し
たバクテリオファージラムダＤＮＡの標準移動パターン
と比較１２て、〔ムーレー　Ｋ、及びムーレー　Ｎ、　
Ｅ、、ＩＱ７５　　ＤＮＡ断片に対するファージラムダ
　レセプター染色体をインフルエンザ菌の制限エンドヌ
クレアーセｏｒ及び大腸菌の制限エンドヌクレアーゼＩ
でつくった。ＪｏＭｏｌ、Ｂｉｏｌ　ｇＢ、５５１．−
５６４　〕寸だ同エンドヌクレアーゼで消化したｐＴＪ
Ｃ６ＤＮＡとの比較で決定ｌ〜だ。

ベクターのだめの他の宿主例は他のストレプトミセス、
大腸菌に一１２誘導体〔バクテリオロジカル　レビュー
ズ１９７２年１２月５２５−４１５７頁〕（これらはＮ
　Ｉ　Ｈガイドラインで誌められた）、及び酵母、他の
フンジ（菌類）、又は他の細菌である。これ２１　− らの後者の宿主が同じ（Ｎ：ｒＨガイドラインで認めら
れるべきであろうことが認識される。

本明δ：＋ｌＩ　涯に記載のイ１）１究は旧Ｉ（ガイド
ラインに４＆定のりをｌ理的及び生物学的か１じ］へめ
快求に応じてすべて７′ｌ（行庁わわた。

【図面の簡単な説明】

；４’ｙ　１　図はＩ）ＵＣ］　Ｏｆｉ＋　”４−　Ｔ
１１’ＣＯ／ｒらつくる／ｒめの４１ノｆ成図式を示す
。 ：’ｅ　２　Ｌ−ノ、けｐＵｃ　１ｆＨ）ｌの卸１限エ
ンドヌクレアー−１と開裂地１図を示−Ｊ′つ １１１Ｑｆｆ　人　　　ジ　アラ１ジヨン　カンパニー
・′　　１ 代理人　弁理土佐々　ル彌太部　　□ （ほか１名）、、１− （ｊ）：・１．、− ｂ′／Ｉ　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、寄託所からの入手番号ＮＲＲＬ　１２４ＢＰｌを有
   するス）　ｌ／ブトミセス　エスビノザス（Ｔ）ＩＪＣ
   １０６１）。 ２、図面の第２図中の制限地図により示されることを特
   をとするシラスミドｐｌ）Ｃ１０６１゜３　、　（ａ、
   ）　ｐＤｃ　６ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼμ賃ユ
   で消化して断片化線状プラスミドＤＮＡを得、（ｌ・）
   上記プラスミドＤＮＡの最大断片を連結させてプラスミ
   ドＴ）ＩＪＣＩＱ＋’；１を得ることからなるプラスミ
   ドｐ【Ｊ　Ｃ１ｆ）６］の製造方法。 ４　、　（ａｌ　１）ＵＣ（’＋　ＤＮＡを制限エンド
   ヌクレアーセプラスミドｒｌｌＪｃ　１０６　］を得、
   （ＣＩ　Ｊ−記プラスミドを適当方宿主に形質転換させ
   ることからなる、 プラスミドＴ）Ｕ（：　１０６１を適当な宿主中でクロ
   ーン化する方法。 　１− ５、上記適当な宿主がストレプトミセスである特許請求
   の範囲第４項による方法。 ６、上記ストレプトミセスがストｌ／ブトミセスニスピ
   ノサスバイオタイプ２３７２／Ｉ１１である・Ｐ４ｊπ
   ＦＲ青求の範囲第５項の方法。 ７、外来ＤＮＡをＩ）［］Ｃ］　Ｏｆｉ　１に挿入し７
   、牛じるシラスミドを適当な宿主に導入することがＣ−
   ）なる方法。