JPS5831989A - 正常二倍体細胞の培養方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は動物に由来する１１常二倍体細胞の培養方法に
関するものである。 動物細胞を培養することｅ」牛物科を的実験研究および
ホルモン、ワクカフ１Ｍ素などの」−箔的牛産の両面に
おいて寸す−ます重要に乙「りつ１）ある、ｌこれらの
細胞の培養においては、血清の培地中への添加がほとん
どの場合必イ１−（：あること←１．　＋ｈ　＜知られ
ティろｎ　Ｌ　カｌ−，／ｃ　カ１’：１面／１１ｔｒ
Ｌ−ｆ′ｑ）供給が不安定であり２品質の一定したもの
が１１１１れに＜＜。 液体であるノζめに保存・ｔＩＶ、４１いが困ｍ＋＋で
、＋／Ｃル常に高価であるという欠点を持っていく）。 その／（め生物科学的実験（１１１究やホルモンな、＋
′のＴｌ’　：Ｚヴｙ・戸ト産における細胞培養の発展
が〕（へ＜　ｌｕｌ＋害さＪｔ、−ＴＥＡだ。とのよう
な欠点を解決するｆ（、Ｍ）これ土で各種のホルモンや
クンバク實を添加することＶ（１，四′で培養に必要ｔ
、［血清（１を低減１−、　、につと才る団介←１数多
く知られている。しかしｔ「が〔−）、これＣ）〆勺４
１Ｙ’東の無血清または低血清培地に関する研究＆：１
．　ｌ’ｒとんんどすべて樹立細胞株や異数体細胞に関
するものであった。このような細胞は無限に増殖する能
力を持つことが多いが、多くは肚鼾訪起能を持ったり、
その性４１が容易に変化することｔｒ：どから工業的応
用し。１、困酢である。とれに対（２て正常二倍体細胞
＆、Ｊ：　、動物の正常な組織に由来し、その染色体数
が２１１本（プことえげヒトの場合であれば４６本）で
あり、有限の分裂回数を持ち、吸着する固体表面を必要
とすることを’ｒ、ｙ徴とする細胞である。このような
正常二倍体細胞ｉｔ腫瘍誘起能を持たず。 七の性ｌａが容易に変化しないことからホルモン。 ワクチン、酵素などの工業的生産に適した安全な細胞４
１１ｆとして期待さ１ｔでいる。しかしながら、正常二
倍体細胞は樹立細胞株や異数体細胞と比較して栄養要求
性が複雑であるだめにこれら正常二倍体細胞に適し、た
無面清捷たは低面ｆｆｆ培地はい１だに確立されていな
い。 本発明者らは、との問題を解決すべく、正常二倍体細胞
を無血清寸たは低血清培地で培養する方法について鋭意
研究を車ねた結果、培地中に動物を全く含１ｔ［いか捷
たは極めて低濃度の血清しか含１ない培地でとＪシＩＬ
、の細胞の増剤ｉイｃ名１−＜向−１−することができ
ることを見い出し、この知（−５に基づいて本発明をな
−（置ｆ（至つ／ｒ１、本発明は培養培地中に動物肉酵
素分解ペプトンを添加することを’ｌ￥　６’ｌとする
「曲物（・（二山米する正常二倍体細胞の培養方法であ
る。。 本発明において月１いられる動′向肉酵素分解ベプ（・
ンは一般（ｌこ細菌の培′＋１培ｌ也（・（用いｌ′）
江るものでアリ＋　通’／Ｆ＋　フローｊ′十−スベゴ
トン、グ１１デオーゼペブトン、獣肉ペゾトソと１１・
ＰげれるものＣある１゜この動物肉酵素分解ペプトンの
調製法は公知であり、たとえば「細閑培地学講１′１＜
第二ｔｋｊｌ　（坂崎刊−著・納谷Ｉ１１°店・１９６
７年刊）６１１戦・つ′）方法に従えばよい。すなわち
動物肉とｌ、　ＣＩｉ、Ｊ：　’ｌ　、　ＩＩ釆、廻ノ
１す、羊、クジラｔ

【どの肉廿ブｔ　Ｉ／、Ｉ−、内臓
が用いＣ）れるが、このうち牛肉が最もふつ゛うに用い
られ・′）。分解用の酵素とし２て＋：ｉ：　ｌリブメ
ン、ババｒン、ペプシン、パンクレアチンｌｃとがある
。これｒ〕の動物肉の、純性され、水と混合され、炭酸
ナトリウム・Ｉａ虫酸などで酵素分解に適したＰ　Ｈに
調整される。 これに酵素を加え２０〜４０ｔＺ’で１〜２０日間９通
常は３７Ｃで２〜３日間酵素分解を行なう。消化後ｄ、
分解酵素を不活性化するためと、未消化のタンパクを熱
凝固させるだめに１００′Ｃ以上に加熱し。 ■１過によってとれを除去したのち、濃縮・乾燥・細末
化する。濃縮・乾燥の方法には煮つめて粉末にするのと
、Ｘ空装置を用いて低温で濃縮後細末化するのがある。 市販品としてはディフコ（］）ｉｆｃｏ　）社のフ゛ロ
チオースペプトン（Ｐｒｏ＋ｅｏｓｃ　Ｐｅｐｔｏｎｅ
　）　、プロテオースベプトン＆２．プロテオースペブ
トン高３、チオペプトン（ＴＩ＋１ｏｐｅｐｌｏｎｅ）
　、オギソイド（Ｏｘｏｉｄ）社のプロテオースペプト
ンＬ４６．ペプトンＰＬ４６　、　ＩＩＬ社のチオトン
（Ｔ＋＋１ｏｌｏｎｅ）　、大五栄養化学社のプロテオ
ースペプトンなどがある。 細胞の培養のためには通常炭素曽、窒素源および無機塩
類などから成る基本培地が必要である。 本発明においてもこの基本培地は必要である。基本培ｔ
ｌｌ＋ＫＨ、ミニマムエツセンシャルミティアム　５− （Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｂｓｓ＋ｑ山ａ１〜ｔｅｄｉｕｍ）
　、　１９９培地、ダルベコ改ゆイーグルミディアム（
ｒ）ｕｌｈｅｃｃｏ’ｓ　ＩＶｌｎｄｉｆｉｃ＋ｌ　１
ｉ’＋ａｇｌｅ　ＭＣ＋ｌｉ＋ｕｎ）。 ハム（１１ａ＋ｎ）のＦ−１０培地、ハムのｌｉ”　−
１２，（３’４地。 ＩＬＰＭ１１６４０培地など数多くの種類がある。これ
らの基本培地の組成はたとぐ−ば「組織培養」（中井準
之助他編集、朝倉Ｖ：店、１９７（ｉ年）に記載されて
いる。本発明者らけｎ？ｉにこの基本培」１１１にエビ
ダーマルグロースファクターとトランスソ下すンヲ添加
することで１面７１ｔを全く含寸ないか５！は（孕めて
低濃度の面ｒｆｒ　Ｌか含捷ない培１１１目４１で、細
胞を効率よく培養できることを見い出している（Ｉ庁願
昭５６−８４２７３号）。該発明ではエビダーマルグロ
ースファクターとトランスフェリンを同１１！１に添加
することで血清を完全に又は大部分代替することかでき
るのであるが１本発明によると動物肉酵素分解ペプトン
をさらに添加することア動１肉に由来する正常二倍体細
胞の増殖を著シ、＜向上することができる。動物肉酵素
分解ペプトンの好ｔ　１．いＭ’ｉ　加ｄＮ度は細胞の
種類によってゲ＆ｆｃるが、０．５〜５ｍ夕／ｍｌの範
囲内である。 ＝　６− 本発明に用いられる細胞は動物に由来する正常二（ｉ′
１体細１１１ルであれば何でもよく、このようなものと
してｔｌ、プＣとえはアフリカミドリザル腎細胞、カニ
クイザル腎細胞、ウシ胎児腎細胞、ウザギ腎細胞、ウシ
胎児肺細胞、ヒト胎児皮膚紐１胞、ヒト胎児肺細＋Ｅ　
＋　＋＝　ト胎児旬皮細胞、ヒト胎児牌細胞。 ヒト胎児１１１７ｉ下匍体細胞、ヒト胎児甲状腺細胞な
ど数多（＋Ｌ′）、ａ　ｏこの中でも特にヒト胎児肺細
胞はインター−ノー「ロン生産に、ヒト胎児腎細胞は１
ノロキナーゼ生産に、アフリカミドリザル腎細胞はワク
チン生産に用いるととができるためその工業的応用１価
値は高い。 その他の培養条件、方法は通常の細胞培養で用いられる
方法、たとえば前に挙げだ「組織培養」記載の方？、ｌ
を適用することができる。すなわち培地の１）１］や培
養温度は［１的の細胞増殖に通常用いられる条件でよく
、１泪は６〜８．培養高度は２５〜４０Ｃが一般的であ
る。 培養容器も通常の培養用ディシュ、培養フラスコ、［１
−ラーボトル、プラスチックバッグ、う線状フィルム、
ポローファイバー、ギヤピラリ−。 マイクロキャリアー、ガラスピーズ、多層平板などいず
れも本発明の方法に適ｌ１ｌ−Ｊろととが−Ｃきる。 動物に由来するＩＦ常二倍体細胞を培′ＩＹする際。 多量の血清を用いることに、１つ°Ｃ斗じる抽々の障害
を本発明によって除くことができる。−ＪｌＣわらｔｆ
ｎ清と比較して動物肉酵素分解ペプトン（・」１．安価
であり、粉末であり陛期保存可能で７ｂるン’ｆｆｌめ
、保存・取扱いが簡Ｉ％ｔで、常に一定の品’ｔ′Ｊσ
）ものを安定して入手することができる。さらに動物肉
酵素分解ペプトンに、Ｙつで細胞の増殖がＭ　ｌ−、＜
向ト［７たことにより、培養＋１１ＪＩ間が短縮され、
ホルモンや酵素などの４１−産性が高まることからｉＦ
常二倍休体１胞の工業的Ｌト創１１への寄−りが大へい
。 次に実施例によって本発明を・さらＫＨＩ′細に説明す
る。 実施例］ よく純性１〜だ牛肉５００ｇを精製水１１１００　ｍ／
′中に入れ、濃塩酸］２．５ｍ／！１（−１１１１えた
のち、ペプシン６ｇを加えで３７ｉＪで２１１間、とへ
どき楊りながら消化した。この消化液を１０００に５分
間加熱し９口過接水酸化ナトリウムを用いてｐＨをほぼ
中性とした。 この液を４５Ｃに保ちながらロータリーエバポレーター
で濃縮、乾燥１７て淡黄かつ色の牛肉ベブクン分解ペプ
トンを１１５ｇ得だ。 次にアフリカミドリザルの腎臓に由来する正常二倍体細
胞（フロー・ラボラトリ−社）に対する牛肉ベブノン分
解ペプトンの添加効果を調べた。 基本培地にミニマムエツセンシャルミティアムを月］い
、これにエビダーマルグロースファクターを１５　＋１
ｇ　／ｍｅ　、　ｌ・うｙ　スフ　：ｒ−リンを１　）
ｒ　ｇ　／　ｍｌを加え。 さらに各濃度の牛肉ペプシン分解ペプトンを加えブこ培
地を準備した。これらの培地にアフリカミドリザル腎細
胞を懸濁し１組織培養用ディシュに６ＸＨＩ’個／ｉの
細胞数になるように植え付けた。３７Ｃで４日間培養し
たのち、０．０５％Ｗ／Ｖのトリプシンを含むリン酸緩
衡生理食塩水で処理して細胞を再懸濁１７だ。細胞数は
コールタ−・カウンター（コールタ−・エレクトロニク
ス社の登録商標）でｊ１数した。 　９− 結呆な、牛肉ペプシン分解ペプトンを含まない対照に対
する細胞数の比（増殖１０′）で第１図に図示した。同
ペプトンを１〜５　ｍ９　／　ｍｌ含１１・培地では対
照に＜　１）へ約２倍の増前ＩＱ：を示１１．アフリカ
ミドリザル腎卸１胞の増殖が著しく向−１−４−るこ、
とが認められた。 実施例２ 本実施例では種類の異なる動物肉酵素分解ペプトンのア
フリカミドリザル腎細胞の増殖に及＃１゛す効果を調べ
た。 クジラ肉ペプシン分解ペプトン乞１．実施例１と同様の
方法で、　５０（ｌ　ｇのクジラ肉かＣ）　８４　ｇの
同ヘプトンを作製した。 牛肉パンクレアチン分解ペプトンは、純性した牛肉５０
０ｇを精製水］　０００　ＭＩ　Ｉ’ｌｌ　Ｋ入れ、炭
酸ナトリウムでｐｌＴを約８としたのち、バンク１／ア
１−ン１５ｇを加えて３７Ｃで２０間消化して作製り、
た。消化後の処理は実施例１と同じ方法で、同ペプトン
１１０ｇを得た。 市販の動物肉酵素分解ペプトンであるプロプオー　　Ｉ
（１− −スペプトンはディフッ社より購入した。 これらのペプトンをそれぞれ５ｍｇ　／　ｍｅ金含有る
実施例１と同様の培地を準備した。対照として牛乳カゼ
イン酵素分解ペプトン（ポリペプトン、大五栄養化学社
）、ラクトアルブミン加水分解物（ディフコ社）をそれ
ぞれ５　ｒｎｑ　／　ｍｌｉずつ含有する培地、これら
を全く加えない培地を準備した。 培養、測定は実施例１と同様に行ない、結果を表１に添
加物なしの対照に対する相対的増殖度で示した。この結
果から、動物肉を原料としないタンパク分解物である牛
乳カゼイン酵素分解ペプトンやラクトアルブミン加水分
解物の添加ではアフリカミドリザル腎細胞の増殖は促進
されないが。 動物肉を原料としだ酵素分解ペプトンである牛肉ペプシ
ン分解ペプトン、クジラ肉ペプシン分解ペプ）・ン、牛
肉パンクレアチンを添加すると同細胞の増殖は著しく向
上した。 実施例３ 本実施例で０．ヒト胎児の肺臓に由来する１１−常一倍
体細胞であるＭ口１０５細ｊ１；・】（）「１−・ラボ
ラトリ−社）の増殖に対する牛肉ペプシン分解ペプトン
の効果を調べ−ｋ。 方法は各項」１１１にウシ胎児血清をｆｌ、４％Ｗ　／
　Ｗ　Ｊｎ＋えることを除けば実施例１と同様である。 第２図に結果を示１．た。１：うに、ヒト胎シフ１．肺
細川１；においでも牛肉ペブンン分解ペブトンヲ０．５
〜２■／　ｍｌ加えることによって増殖ｅ、」著り、　
＜向ト（７た。 実施例４ 本実施例ではヒト胎児の腎臓に由来する正常二倍体細胞
（マイクロバイオロジカル・アソシエイツ社）の増７１
ｉ＋’ｔに対する牛肉ペプシン分解ペプトンの効果を調
べた。 方法り、各培地にウシ胎児血清を０．４％Ｗ／Ｗ加える
ことを除けば実施例１と同様である。 第３図に結果を示したように、ヒト胎児腎細胞において
も牛肉ペプシン分解ペプトンを０．５〜５＋ｎｒ７　／
　ｍｅ加え、ることによって増殖は著しく向上した。 実施例６ 本実施例では種類の異なる動物肉酵素分解ペプトンのヒ
ト胎児腎細胞の増殖に及はす効果を調ベノこ。 方法は、各培地にウシ胎児血清を０．４％Ｗ／Ｗ加え、
各添加物の濃度が１　ｍ９　／　ｍｌであること除けば
実施例２と同様である。 第２表に結果を調したように、動物肉を原料としないタ
ンパク分解物である牛乳ツノゼイン酵素分解ペプトンや
ラクトアルブミン加水分解物の添加　１３− でけヒト胎児腎細胞の増％ｌは促進されないが、動物肉
を原料どＬ７た酵素分解ペプトンである牛肉ペプシン分
解ペプトン、クジラ肉ペブ７ン分解ペプトン、牛肉パン
クレアチンを添１１１１寸ろと同細胞の増η（１は著［
−７く向トした。 第　　２　　表

【図面の簡単な説明】

第１図はアフリカミドリザル腎細１１ＦＩ！の増殖に対
する動物肉酵素分解ベプトシの効＋１．　ヲ示＋３、第
２図はヒト胎児肺細ボ・ｊの増殖に７１する動物肉酵素
分解ペプトンの効果を示１゛。 　１４− 第３図＆ｌＪ、ヒト胎児１１イ細胞の増殖に対する動物
肉酵素分解ペプトンの効果を示す。 特ｄ′１−出願人　　旭化成工業株式会社＝　１５− （ Ｌ　　　禦　鷹　郵 （ Ｌ　　　禦　１蝦　餌 動物肉酊票分解公ブトン　（ｍ９／ｒｒｌＩり手続補正
書（自発） 昭和５６年９月１ｚ日 ’ｌ”ｌ’ｉ？’ｌ庁艮官ハノ　１）春　樹　　殿１　
“１１件の表示　　　１１ｉ’ｆｆ１ｌ　５６年′１．
７訂願第１２５８８１　冒゛２　発明の名、称 正常二項体細胞の培養方法 ａ　補止、をする渚 ｌｊｒ件との関係　　特￥１°出願人 大阪府大阪市北区堂島浜１丁目２番６号４　補正のズ・
１象 明細書の「発明の詳細な説明」の欄。図面。 ｈ　補正の内容

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）培養培地中に動物肉酵素分解ペプトンを添加する
   ととを特徴とする動物に由来する正常二倍体ａｍ　＋＋
   ；＝ｔの培養方法 （２）　　動物に由来する正常二倍体細胞が腎臓に由来
   するＩＩ−常三倍体細ＩＫ；！である時Ｗ１・Ｓ請求の
   範囲第１項ｉ）１中νの培１１辷方ｚ人 （１）　　ＩＰＦ　ｌ岡が１ニド胎児の腎臓である特許
   請求の範囲第２項記載の培養方法 （４）　　動物に由来する正常二倍体細胞がヒト胎児の
   肺に由来する正常二倍体細胞である特、ｒ′Ｆ請求の範
   囲第１項記載の培養方法 （５）　　動物肉酵素分解ペプトンの添加ａ１１１１１
   が０．５〜５ｍｙ　／　ｍｌである特許請求の範囲第１
   項記載の培養方７ノ、 （６）　　培ｄ培ｊ１１１がエビダーマルグロースファ
   クターとトランス−７Ｊ′−ｌ）ンを含む培養培地であ
   る特許請求の範囲第１項の培養方法