JPS5843372B2 - ＩｇＡの精製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はＩｇＡ（人血清免疫グロブリンＡ）を工業的規
模で収率よく精製する方法に関するものである。

ＩｇＡは血液中に存在する免疫グロブリンであって■ｍ
ｌと同様に各種の抗体活性をもっており、生体内におい
て感染防漿上重要な役割を果たし、植種の疾病の予防並
に治療に広く臨床使用されている。

又ＩｇＡはＩｇＧに次いで血清中に多量に存在し、正常
人血清中の濃度は６０〜４９０■／ｄｉである。

この故にＩｇＡは人血清や人血漿又はこれらの副産物か
ら分離精製されている。

ＩｇＡの精製法にはすでに多くの報告があり、例えば 第１の方法、イオン交換体吸着法と免疫吸着体吸着法を
用いたりットマン（Ｇ、Ｗ、 Ｌｉｔｍａｎ）らの方法
（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、 ２６
３ 、８９ 。

１９７２） 第２の方法、カプリル酸沈澱法とＤＥＡＥセルロース吸
着法を用いたベジアウデル（Ｌ、 Ｐｅｊａｕｄｉｅｒ
）らの方法（ＶｏｘＳａｎｇ、２３，１６５，１９７２
）第３の方法、硫安塩析法とりパノール沈澱法を用いた
シビツク（Ｈ，Ｇ、 Ｓｃｈｗｉ ｃｋ）の方法（Ｖｏ
ｘＳａｎｇ、２３，１９７２） 第４の方法、酢酸亜鉛沈澱法とポリエチレングリコール
分画法を用いた方法（米国特許第３．８０８，１８９号
明細書）等がある。

このうち第１の方法は高純度のＩｇＡを実験室的規模で
得るには有効であるが、工業的製法としては不適であり
、他の３つの方法はいずれも人血清や人血漿又はこれら
の副産物から工業的規模でＩｇＡを製するには適してい
るが、純度と収量の面では改善が望まれる。

発明者らはＩｇＡの製法について長年研究を続け、工業
的規模で経済的に効率よ＜ＩｇＡを精製する方法を完成
した。

本発明はコーン画分■のペーストから蒸留水でＩｇＡを
抽出し、抽出液にアルカリ性条件下で硫酸ナトリウムを
１４〜１５％Ｗ／Ｖ飽和濃度に添加し、生じた不溶物を
除去して上清のｐＨを５．５〜６．５に調整したのち、
硫酸アンモニウムを９〜１２％Ｗ／Ｖ飽和濃度に添加し
て生じた沈澱を回収し、この沈澱から塩を除去したのち
ｐＨを５．２〜５．３に調整し、生じた沈澱を除去して
ＩｇＡを回収するのである。

本発明の詳細な説明する。ＩｇＡの出発原料としては人
血清又は人血漿を使用してもよいが、これらからフィブ
リノゲン、アルブミン又はグロブリン等の有効成分を分
画し、従来は廃棄されていた残りの画分を出発原料とす
れば安価である。

血漿分画の廃棄画分としては、コーンの冷アルコール分
画法で得られたコーン画分■のペースト（Ｊ、Ａｍ、
ｃｈｅｍ、 Ｓｏｃ、 ６８ 。

４５９．１９４６）がＩｇＡの混入量が多い点で有利で
ある。

しかしこのペーストにはリポプロティン、マクログロブ
リンやある種の変性蛋白等が多量に混入しており、これ
がＩｇＡの抽出や精製を困難にし、特に工業的規模での
ＩｇＡの精製を困難にしていた。

コーン画分■からリポプロティンやマクログロブリン等
を除くにはＩｇＡを抽出したのち酢酸亜鉛で除去する方
法（前記米国特許明細書）もあるが、最も簡単で確実な
方法は始めの工程でＩｇＡのみを特異的に抽出すること
である。

ＩｇＡの抽出効果の良否は一元免疫拡散法を用いてＩｇ
Ａを定量することで行い、変性蛋白やリポプロティン等
の不都合な物質が除去されているかどうかは、得られた
抽出液が澄明であるか白濁しているかを肉眼的に観察す
ることによって簡単に見分けることができる。

コーン画分■のペースト１００ｇを生理条件の溶媒又は
蒸留水で懸濁し、遠心分離を行って不溶物を除去し、得
られた上清の白濁の強さを観測してＩｇＡの抽出量との
関係をまとめたところ第１表の結果を得た。

こ＼に白濁の強さは任意に＋５から＋１の５段階に分け
、数値の小さいほど澄明に近いものとした。

この結果塩化す） ＩＪウム溶液、グリシン溶液、リン
酸緩衝液ではＩｇＡの抽出は良好であるが、得られた上
清は白濁しており、蒸留水で抽出したものはＩｇＡの抽
出量は幾分減少するが、澄明な上清が得られるから後工
程の精製処理を行いやすい。

コーン画分■はＩｇＡを多量に含有しているが、血液中
での存在比率と同様に■ｍｌも多量に含有しており、抽
出液中にはＩｇＡの約３倍の■ｍｌが混入している。

従ってこの抽出液からＩｇＡを損失することなく Ｉｇ
Ｇを除去することが、ＩｇＡの純度を高めるために必要
となってくる。

ＩｇＡと混入しているＩｇＧを分離する方法としては、
ペジアウデイル（前記） はＤＥＡＥ−セルロース吸着
法を用いているが、この方法ではＤＥＡＥ−セルロース
の予備洗滌や平衡化等の予備操作が加わるので、工業的
規模で行うには煩雑すぎて好ましくない。

発明者らは工業的規模に適した簡単な方法として塩析法
を選び、種々の塩析剤について検討した結果、硫酸ナト
リウムが最も効果的に■ｍｌを除去できることを見出し
た。

次にその最適条件を見出すための実験を詳しく説明する
。

最も一般的に用いられる塩析剤は硫酸アンモニウムであ
り、これと本発明で採用した硫酸ナトリウムをＩｇＡ抽
出液に添加して塩析し、生じた不溶物を除去して上清中
に残存する■ｍｌの量とＩｇＡの量を一元免疫拡散法で
定量した。

その結果をまとめると第２表の通りである。第１図は塩
析剤の添加量を横軸にとり、ＩｇＡと■ｍｌの残存量を
縦軸にとって第２表の結果を図示したもので、硫酸ナト
リウムを添加した場合のＩｇＡの残存量を実線Ａにて結
び、■ｍｌの残存量を実線Ｂにて結んでおり、硫酸アン
モニウムを添加した場合のＩｇＡの残存量と■〆わ残存
量をそれぞれ点線Ｃ，Ｄにて結んでいる。

この第１図から判るように硫酸ナトリウム１４ｑｂの添
加ではＩｇＡ２０係しか塩析されないが、ＩｇＧは約６
２係も塩析されて除去できるし、硫酸ナトリウムの添加
量を１５係に増すと約９０係の■ｍｌが除去されてＩｇ
Ａの存在量が相対的に優位となる。

この反面硫酸アンモニウムでは添加量が増すに従って■
ｍｌは塩析されるが、ＩｇＡも平行して塩析され、■ｍ
ｌの塩析剤としては特異性のないことが判る。

以上の結果■ρの塩析剤として硫酸ナトリウム１４〜１
５係Ｗ／■飽和濃度で添加するのが最も効果的であるこ
とを見いだした。

次に発明者らは硫酸ナトリウムで塩析する際のｐＨ条件
を調べるためＩｇＡ抽出液に硫酸ナトリウムを１５係飽
和濃度に加え、抽出液のｐＨを変えて上清中に残存する
ＩｇＡと■〆わ量を定量した。

第２図は横軸にｐＨをとり、縦軸にＩｇＡと１ｍｌの残
存量（ｒｒｕ？／ｄｉ！ ）をとったもので、ｐＨ４，
６，７゜９．１０におけるＩｇＡの残存量を実線Ｅにて
結び、■ｍｌの残存量を点線Ｆにて結んだ。

この第２図から判るように、酸性側ではＩｇＧとともに
目的とするＩｇＡも同時に塩析さへ中性付近ではＩｇＡ
は塩析されにくいが、■ｍｌの除去も少なくて効果的な
条件ではなく、アルカリ性になると■ｍｌが特異的に塩
析されるから、塩析時のｐＨはアルカリ側が良いことが
判る。

硫酸アンモニウムはこのようにアルカリ側でＩｇＧを特
異的に塩析するにしても、アルカリ側では分解してアン
モニアガスを発生するから実用的ではない。

第１図に示していないが、塩化ナトリウムによる塩析も
硫酸アンモニウムと同様に効果的でなかった。

以上の結果塩析剤としては硫酸す） ＩＪウムが特異的
であり、塩析時のｐＨはアルカリ側が好ましく、ｐＨ８
〜１０が最も効果的であることを見いだした。

ＩｇＡが豊富になった上清のｐＨを中性に戻し、ＩｇＡ
の濃縮と共存するアルブミン等の除去を兼ねて、硫酸ア
ンモニウムを添加する。

この際の最も好ましい条件は、発明者らの研究の結果、
ｐＨ５，５〜６．５で硫酸アンモニウム９〜１２係飽和
濃度であった。

この工程で殆んどすべてのＩｇＡが沈澱となり、アルブ
ミンやα２グロブリン等が上清中に残ってＩｇＡの純度
が向上する。

遠心分離又は濾過を行ってＩｇＡの沈澱を回収し、これ
を冷水に懸濁し、冷水に対して４℃で１６時間透析を行
う。

ここで得られた透析液中のＩｇＡの純度は４０〜５０係
であり、このま＼でも医薬として十分に使用できるが、
マクログロブリンやリポプロティン等が未だ混入してい
るため長期安定性に乏しい。

この工程で混入しているマクログロブリンやリポプロテ
ィンはＩｇＡと分子量がかなり相違しているので、実験
室的にゲル沢過でこれらの夾雑物を分離できるが、工業
的規模で行うにはゲル沢過は１回の処理能力が小さくか
つ長時間で要するという欠点がある。

発明者らは夾雑物の除去について研究を続け、単にｐＨ
を調整するだけで、短時間にしかも工業的規模で夾雑物
を除去できる条件を見いだした。

冷水透析を行ったＩｇＡ画分にＩＮの塩酸又は水酸化す
） ＩＪウムを少量加えてｐＨを変化させ、約３０分間
静置したのち遠心分離を行って上清を得、ＩｇＡの量と
蛋白量とからＩｇＡの純度を計算して巾との関係を求め
た。

第３図は横軸にｐＨをとり、縦軸に純度輪をとったもの
で、この第３図から判るように透析液のｐＨを５，２〜
５．３に調整するだけでＩｇＡの純度は著るしく高まり
、ｐＨ５，２でＩｇＡの純度は７５係にも達するのであ
る。

このようにして得たＩｇＡ濃厚液に塩化ナトリウム又は
グリシンを加えて除菌濾過を行うことにより、医薬とし
て安全に使用できるＩｇＡ液が工業的規模で製され、Ｉ
ｇＡ液を凍結乾燥するとＩｇＡの粉末が製される。

ＩｇＡの収量、純度及び安定性について本発明と従来法
（前記第２〜第４の方法）を比較し、その結果を第３表
にまとめて本発明の優位性を明らかにする。

本発明によるＩｇＡの収量は第２の方法よりも多く、純
度は第３、第４の方法よりも明らかに高く、長期安定性
も極めて良い。

本発明はこのように収量、純度及び安定性の優れている
ことに加えて、処理が簡単であるから工業的規模に適し
ており、ＩｇＡの工業的精製法として極めて有益である
。

実施例 正常人血漿からコーンの冷アルコール分画法で得た画分
■のペースト５０に９に冷蒸留水５００１を加え、ミキ
サーを用いて均一な懸濁液とする。

次にシャープレス型遠心機を用いて懸濁液中の不溶物を
除去し、澄明な抽出液５００１を得る。

この抽出液にＩＮの水酸化ナトリウム溶液を加えて、ｐ
Ｈを９．０に調整したのち、無水硫酸ナトリウムを１４
．５４Ｗ／Ｖ飽和濃度に加えて液温を２０°Ｃ前後に保
つ。

析出した沈澱をシャープレス型遠心機又はｒ過器を用い
て除去し、澄明な上清を回収してＩＮの塩酸でそのｐＨ
を６．０に調整したのち、硫酸アンモニウムを７６ｇ／
ｌの割合に添加する。

この処理で大部分のＩｇＡは塩析されるのでシャープレ
ス型遠心機又は沢過器を用いて上清を除き、回収した沈
澱を冷蒸留水に溶解させ、ＩｇＡを冷蒸留水に対して一
夜透析を行う。

この段階でのＩｇＡの純度は４１係であった。

次にこの透析液に０．５Ｎの塩酸又は０．５ Ｎの水酸
化ナトリウムを加えてｐＨを５．３±０．０５に調整し
、析出してきた不純蛋白をシャープレス型遠心機で除去
し、澄明なＩｇＡ溶液を得る。

このＩｇＡ溶液に蛋白当り１０係の割合となるようにグ
リシンを加えて、除菌ｆ過を行って無菌のＩｇＡ溶液を
得る。

ＩｇＡの純度は７６係で、収量は１０係濃度の溶液とし
て４８０１ｒＬｌである。

【図面の簡単な説明】

第１図は塩析剤の濃度と抽出液中のＩｇＡ 、 ＩｇＧ
の残存量の関係を示す線図、第２図は硫酸す） ＩＪウ
ム１５係飽和溶液のｐＨとＩｇＡ、ＩｇＧの残存量の関
係を示す線図、第３図は透析液のｐＨとＩｇＡの純度の
関係を示す線図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ コーン画分■のペーストから蒸留水でＩｇＡを抽出
   し、抽出液にアルカリ性条件下で硫酸す） ＩＪウムを
   １４〜１５４Ｗ／Ｖ飽和濃度に添加し、生じた不溶物を
   除去して上清のｐＨを５．５〜６．５に調整したのち、
   硫酸アンモニウムを９〜１２係Ｗ／Ｖ飽和濃度に添加し
   て沈澱を回収し、この沈澱から塩を除去したのちｐＨを
   ５．２〜５．３に調整し、生じた沈澱を除去してＩｇＡ
   を回収することを特徴とするＩｇＡの精製法。