JPS5843790A - アグロマイセス属細菌由来の免疫賦活剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 属する菌を培養して得られる免疫賦活物質，その製造法
．当該免疫賦活物質を有効成分とする免疫賦活剤および
アグロマイセス属に属する新規の免疫賦活物質生産菌株
に関する。

本発明で提供する免疫賦活物質は，アグロマイセス属に
属する免疫賦活物質生産菌株を培地に培養し．得られる
菌体あるいはその破砕細胞片を殺菌，水洗，凍結乾燥す
ることにょ−り得られる。

従来より．細菌から免疫賦活物質を採取する研究が行な
われており，免疫賦活物質を採取する菌としてストレプ
トコツカス属（　Ｓ　ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｅｕ８　）細
菌（特公昭μ３−１．１．９０他）、コリネバクテリウ
ム属（　Ｃ　ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）細菌（
特開昭．３；１．−３’ｌｌ，タグ他）、プロビオニパ
クテＯウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）
細菌（特開昭３；２−／（Ｈθφ１ｌ他）、マイコバク
テ：′１．．・。

リウム属（　ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉＩＩｍ）細菌（特
公昭’Ｉｔ−’ｌ　３Ｆ’／−２他）などが用いられて
きた。しかし、本発明使用のアグロマイセス属細菌由来
の免疫賦活物質は，未だ知られていない。

本発明者らは，後述のように，土壌から分離した下記ア
グロマイセス属菌株から免疫賦活物質が得られることを
発見し，本発明を完成した。

アグロマイセス属細菌は非病原性菌であるので。

ストレプトコツカス属細菌等の病原性菌を用いた場合と
は異なり感染症を引きおこす危険性がなく。

免疫賦活物質あるいは免疫賦活剤の製造過程，保存過程
などにおいて菌体の取り扱いが容易である。

さらには、本発明において得られる免疫賦活物質は．種
々の溶媒に対して安定であり．熱に対しても高い安定性
を有している。

本発明におけるプグロマイセス属に属する免疫賦活物質
生産菌株は，アグロマイナス・ラモスス（　Ａｇｒｍｙ
ｙａｅ８’　ｒａｍｏｓｕｓ）　ＡＴＣＣ２！；　／７
３ならびにアグロマイセス・オ鼻ナワイ（　ＡｇｒｏＩ
ｖｃｅｓ　ｏｋｉｎａｗａｉ）Ｇｐ　２！；９　、　Ｉ
Ｉ！；ｒ　、　３’３ｊ　、　Ａ２０　、２Ａ３２　、
２９／９　。

：１ ２９ｌ９および３７乙ざである。、アグロマイセス・ラ
モススｋＴｃｃ２３／７３は，唯一の既知アグロマイナ
ス属菌で７９乙タ年に同定されたＣ　Ｇｂ＋ｄｈｉｌｌ
Ｗ，　Ｅ，　、　Ｌ．Ｅ，　Ｃａｓｉｄａ　：　Ａｐｐ
ｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、　／７　＋　３’ｌθ一３
ｑ９　（／？ｇｙ　）　〕。アグロマイ士ス・オキナワ
イＧｐ２ｊ９，グｊざ，！；３３．乙コ０，２乙３２．
２ワｌワ．２９ざ９。

３７乙ざのざ菌株は，本発明者らが今回沖縄地方の土壌
試料から分離した新種であり，その標準株は茨城県筑波
郡谷田部町の微生物工業技術研究所に昭和！６年♂月３
ー日から寄託しである。それぞれの菌寄孔番号（ＦＥＲ
Ｍ−Ｐ）を以下に示す。

次にアグロマイセス・オキナワイの上記！株の菌学的性
状を示す。記述については，特記しない限り全株共通で
ある。

（Ｉ）形態学的性状 （、）画形：細い桿状菌。培養条件によってはフィラメ
Ｉント状．分枝状を呈することもある。大きさはθ３〜
ｏｑ×ｉｘ〜２θμ。培養初期に特にフィラメント状．
分枝状を生じる傾向がある。

（ｂ）鞭毛：認められない。

運動性も認められない。

（ｃ）莢膜：認められない。

（ｄ）内生胞子：認められない。

（Ｉ［）染−色性 ダラム染色　　　陽性 抗酸染色　　　　陰性 異染顆粒染色　　なし くＩＩＩ）増殖時外観 （２ｌｒ’ｃ．グリセロール添加培地で培養）（ａ）寒
天培地上のコロニー：ｊ日日に肉眼で観察すると円型（
径０３〜／．ＯＩＩＩＩＩＩ）、周辺完全である，表面
は平滑で光沢は無い。不透明な灰白色を呈し．柔らかい
。さらに培養を続けると，黄色味を帯び死滅する。また
ｌｊ〜３θ時間目に３６θ倍で検鏡すると、アクチンマ
イセス属菌でみられるスパイグー型のコロニー像を呈し
ている。

（ｂ）寒天斜面上の生育：２〜３日目日日眼で観察する
と線状であり９表面は平滑で鈍い光沢がある。不透明な
灰白色を呈し柔らかく、さらに培養を続けると黄色味を
増して死滅する。

（ｃ）液体培地での生育：静置培養７日で弱い均一の成
長を遂げる。さらに培養を７日日まで続けても著しい増
殖はないが、攪拌下に培養すれば良好な増殖を示す。

（ＩＶ）各種培地上での生育 （ａ）生育良好な培地： グリセロール寒天培地、澱粉・栄養寒天培地。

スクロース・酵母エキ子寒天培地、フラクトー３°酵母
″キ７寒岑培：１地 争）生育不良な培地ニ ゲルコース・栄養寒天培地 （Ｖ）生理学的性質 （１）硝酸塩還元能　　　　　　　　　　陽性（２）イ
ンドールの生成　　　　　　　　陰性（８）硫化水素の
生成　　　　　　　陰性または微弱（４）澱粉の氷解能
　　　　　　　　　　陽性（５）ゲラチンの液化能　　
　　　　　　陰性（６）カゼインの分解能　　　　　　
　　陰性（７）エスクリン水解能　　　　　　　　東隣
性（８）ミルク反応 ペプトン化　　　　　　　　認められず凝固　　　　　
　　　　　　　　〃 酸形成　　　　　　　　　　　　　〃 （９）卵黄反応　　　　　　　　　　　　陰性顛カタラ
ーゼ　　　　　　　　　　　陰性αＤコバツクオキシダ
ーゼ　　　　　　陰性０チトクロームオキシダーゼ　　
　　陰性α９ウレアーゼ　　　　　　　　　　　　陰性
（１４チロシナーゼ　　ｉ、、、　　　　　　　　陰性
へ９フエニルアラニンデアミナーゼ　　陰性ＤＩ酸素要
求性 （ｉ）ガスバック嫌気系（グリセロール添加培地２ざ°
Ｃ，／〜７日） 全く成育しない。

（ｉｉ）高層培地（θＯざ％寒天含有グリセロール添加
培地） 表層より／〜２１ＩＨ下の部分に帯状の成育がみられる
。

（鴎０−Ｆテスト 好気的条件下の試験管内のみで生育。

＜ｉＸｉ心（ｉｉ）全て好気性菌であることを示してい
る・Ｑ７１生育温度（グリセロール添加培地）／ｒ”ｃ
　　　　　増殖するが遅い ２７〜３２°Ｃ至適温度 ３７℃　　　　極端に生育が悪くなる ａ呻生育ｐＨ値（グリセロール添加培地、、２ｔ”Ｃ）
ｊ　　　　生育しなし功）または生育してもごくわずか
７〜９　至適ｐＨ ／θ　　　生育は悪い ０呻増殖影響物質 必須要求物質（オキナワイＧｐ２ｊ９　”）　：ビオチ
ン、ビタミンＢ＋ 増殖促進物質（オキナワ（Ｇｐ２！；９　）　：イソロ
イシンカロイシン、プロリン。

アスパラギン酸、グルタミン酸 生育阻害物質： リソゾーム、アジド、亜テルル酸塩 食塩（グ％以上）耐性：無 翰へモリシス（溶血反応）（ウサギ血液寒天培地上） 弱いａ−へモリシスは認められるがβ−へモリシスは認
められない。

０１）７オーゲス・プロスカラエル（Ｖｏｇｅｓ−Ｐｒ
ｏｓｋａｕｅｒ）反応 （財）各種抗生物質に対する感受性 感受性： エリスロマイシン、ペニシリンＧ、バンコマイシン、セ
ファロチン 非感受性： トブラマイシン、ケンタマイシン、ストレフトマイシン
その他のアミノグリコシド系抗生物質 （ハ）過酸化水素の蓄積 通常認められる。

リジン、アラニンも多く含む。

（ホ）細胞壁糖組成 ラムノースを最も多く含み、その他、マンノース、グル
コース、ガラクトース、グルコサミン、ムラミン酸を含
むが、ガラクトサミンは含まない。

（イ）全菌体中のミコール酸分析 約７０　％（アグロマイセス・オキナワイＧｐ２３９は
７２．７％） 翰チトクローム系分析 可視部吸収スペクトルにおいて３３３”ｆｉにチトクロ
ームＣ，、！；ｔ２’μにチトクロームＢ。

乙θＱｌｌｆｉに弱いチトクローム・オキシダーゼの吸
収がそれぞれ認められる。

（至）実験感染症 マウスに本発明使用のアグロマイセス属菌を７　　　　
　　　　７ ｇＸ／θ　、／、２×／θ　、２．グ×／θ６および仏
！×／θ５個の各数量を静脈注射し３週間飼育後。

生存率０体重変化、内臓所見を調べたが、全てに異常は
認められず実験感染症は成立しない。

上記の様な性質を有するアグロマイセス・オキアグロマ
イナス・ラモススと次の様な主たる共通した特徴を有し
ている。

ｉ）ダラム陽性菌。細い桿状菌。

ｉ）カタラーゼ陰性菌であるにもかかわらす好気的条件
下でのみ増殖する。

伍）　細胞壁の構成ジアミノ酸とｊ７てジアミノ酪酸を
含む。

ｉｖ）　　マウスへの静脈投与による実験的感染症はみ
られない。

■）血液寒天培地上で弱いα−へモリシスがみられる。

ｖｒ）２０〜３２℃で生育最良。３７℃では生育不良と
なる。

ｖｉ）生育時に過酸化水素を生じ３〜！日で黄色化に伴
ない死滅する。

一方、アグロマイセス・オキナヮイは、主に次の２点に
関してアグロマイナス・ラモススと明ら・□。

かにその性質を異にする。

（１）硝酸塩還元能を有する。

（２）細胞壁中にキシロースを含まない。

以上の知見から、アグロマイセス・オキナヮイはアグロ
マイセス属に属する新種と判定して今回命名した。

本発明に於ては、アグロマイセス・ラモススおよびアグ
ロマイセス・オキナワイの天然および人工変異株は勿論
のこと、アグロマイセス属に属する免疫賦活物質生産菌
株は全て使用でき１本発明に包含する。

次に本発明で提供する免疫賦活物質の製造方法を示す。

上記アグロマイセス属に属する免疫賦活物質生産菌株を
栄養培地に好気的条件下に培養し。

培養終了後菌体を採取し、殺菌、水洗後、凍結乾燥する
と非砕細胞標品を得る。または、採取した菌体を細菌後
超音波処理して得られる破砕細胞片を水洗後凍結乾燥す
ると破砕細胞片標品を得る。

培地組成は９通常の細菌用天然栄養培地を用いればよい
。培地は炭：電源、窒素源、無機塩などを、： 含む。炭素源としては１例えば、グルコース、スクロー
ス、グリセロール、澱粉、ガラクトース。

ラムノース、糖蜜などが単独で、あるいは混合物として
用いられる。窒素源としては９例えば、コーンスチープ
リカー、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、ペプトンなど
が単独で、あるいは混合物として用いられる。無機塩と
しては２例えば、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、塩
化カリウム、各種リン酸塩などが挙げられ必要に応じて
加えられる。

培養も通常用いられる方法に準じて行なえばよく、好気
的条件下で１通気攪拌あるシ夷は振盪しなか’）　行す
、ｔ　Ｉｆよい。培養時間は種培養においては７〜２８
０本培養においては２日〜！日が好ましく、培養温度は
、２θ〜３０″Ｃ９好ましくは２３〜２♂″Ｃがよい。

培養終了後、菌体を採取するには、遠心分離。

濾過などの方法を用いればよい。また、殺菌は。

採取した菌体を水溶液、７０〜７！°ｃで２θ〜３０分
熱処理すること導より行なう。あるいは、ポルマリン、
クロロホルム、メタノール、トルエン。

サリチル酸などで処理してもよい。超音波処理は。

２θＫＣで３分間程度が望ましく、３０分間では失活す
る。

上記の様にして得られる本発明の免疫賦活物質標品は、
アセトン、メタノール等の溶媒に不溶でかつ動電であり
、また熱にも安定で６０〜／／θ’０　、２０〜３０分
間の熱処理にも耐える。さらには、−２０〜θ℃で／年
間以上、室温で／ケ月以上安定である。

以下に免疫賦活物質標品の成分分析結果を示す。

（、）細胞壁アミノ酸組成 ジアミノ酪酸を最も多く含み、グルタミン酸。

グリシン、アラニンも多く含む。

（ｂ）細胞壁糖組成 ラムノースを最も多く含み、その他、マンノース、グル
コース、ガラクトース、グルコサミン。

ムラミン酸を含むが、ガラクトサミンは含まない。

本発明の免疫賦活物質は／）制癌活性、２）抗ウィルス
活性、３）インターフェロン誘導活性。

リ　免疫応答増強活性を有している。

ハ　制癌活性 〔活性測定法〕 腫瘍細胞を／群７〜／θ匹のＤＳ系マウスの背部皮下に
移植し、その翌日からＩＯ日間毎日被検物質を腹腔内投
与Ｌ　、　／　ｊ８目に腫瘍を摘出して秤量し、対照群
と比較する。腫瘍細胞の種類とそれぞれの移植量は次の
とおりである。

判定は次式で示される唾瘍指数により行なった。

〔結　果〕

次表に本発明の免疫賦活物質の非砕細胞標品に関する各
条件下での睡−＊数を示す。

（以下余白） 上表に示される様に、アグロマイセス・ラモススＡＴＣ
Ｃ２ｊ／７３ならびにアグロマイセス・オキナワイＧｐ
２３９およびその近縁７株から採取した免疫賦活物質は
、互に同程度の制癌活性を有しており、抗癌薬として有
用な物質である。

また破砕細胞標品についても同様にして制癌活性を検討
したところ、活性にはほとんど変化がなかった。また非
砕細胞標品連続投与時に時としてみられた腹水、内臓癒
着等の副作用は、まったくみられなかった。

２）゛抗ウィルス活性 〔活性測定法〕 ＣＪ？ＢＬ／４系マウスに本発明のアグロマイセス・オ
キナワイＧＰ２！；９から採取した免疫賦活物質の非砕
細胞標品を００６〜１０ＯＱ／に９の濃度範囲で腹腔内
投与しておく。／週間後ヘルペスウィルス（Ｕｗ−Ｊ＃
、’Ｑｐθ２）を３０　ＭＬＤ、。

（マウス３０％致死量の５６倍）腹腔内投与し。

２週間後の生死を判定基準とする。

次表には、アグロマイセス・オキナワイＧｐｇ９由来の
標品に関する各用量における平均生存日数と一週間後生
存率を示す。

（ｊθ％有効濃度＝０２ｆｌｆｌｋＱ）上表からも明ら
かな様に１本発明の免疫賦活物質は、ヘルペスウィルス
の感染予防効果を有している。　　　　　　　　゛ ３）インターフェロン誘導活性 〔活性測定法〕 Ｃ，ＢＬ／乙系マウスに本発明のアグロマイセス・オキ
ナワイＧｐ２！；９から採取した免疫賦活物質の非砕細
胞標品をｊθ〜／ｋＱ腹腔内投与する。その後／、７．
１０．２０．３０８目に牌臓を摘出ｔ、　テｉ。

％牛胎児血清添加ＲＰＭＩ／乙ｑＯ培地で／×ＩＯ個の
単細胞浮遊液を調製し、再び上記標品を／θθμ９７ｍ
１加え、３７°Ｃ，ｔ％炭酸ガス中で２グ時間培養する
。培地中のインターフェロン力価は水泡性口内炎ウィル
スに感染させたマウス胎児細胞に対する細胞変性効果を
抑制する最高箱釈濃度を基準として国際標準単位に換算
する。

〔結　果〕

標品投与後７〜／θ日目に最も高いインターフェロン誘
導活性が見られた。ここで誘導されるインターフェロン
はｐＨ２０の酸性処理によう完全に失活し、免疫型イン
ターフェロンの抗血清により中和されるので免疫型イン
ターフェロンである。

また血液についても検討したところ、血清中においても
インターフェロン誘導活性が認められた。

ゲ）免疫応答増強活性 加熱細菌した。アグロマイセス・オキナワイＧｐ２ｊ９
由来の非砕細胞標品／　ＩＲＱを腹腔内投与しく標品処
置）、ＤＳマウスの抗ヒツジ赤血球免疫応答に及ぼす影
響を検定した。

（ｉ）血清抗体産生増強活性 〔活性測定法〕 マウスに上述の如く標品処置を施し、同日または／週間
後にヒツジ赤血球（／×／θ２個）を静脈注射し感作を
行なう。感作後１尾静脈から／〜μ週にわたり経時的に
採血し血清凝集抗体価を求め。

対照群（標品非処置群）と比較する。血清凝集抗体価（
ＩｇＧ抗体価）は、Ｏ／Ｍ２−メルカプトエタノールを
含む燐酸緩衝液添加生理食塩水（ｐＨπ）により血清の
２倍段階希釈系列をつくり、／％ヒツジ赤血球を添加し
、ミクロタイター法で求める。

〔結　果〕

次表に各群（／ｇ￥は５頭）の凝集価を、（平均上標準
偏差）の形で示す。感作の／週間前ζこ標品処置を施し
１３群では、感作後２〜３週にて凝集価の有意な上昇が
見られた。感作当日に標品処置を施した群では、感作後
３〜１週にて凝集価の著明な上昇が認められた。

ｒｉｉ）遅延型過敏症増強活性 マウスに前述の如く標品処置を施し、／週間後にヒツジ
赤血球（／ｘ１０個）を静脈注射し感作を行なう。感作
後７〜４週にわたって／方の後肢足鵬皮内にヒツジ赤血
球Ｃ２×７０’個、００２！；ｗｌ’）を注射し遅延型
過敏症を誘発する。２ｊ時間後の：′、、：：： 腫張をカリバー・ゲージで測定し、ヒツジ赤血球を注射
していない足踏の厚さとの差（足踏腫張）をもって遅延
型過敏症の強さを表わす。

次表に各群（７群は５頭）の足踏腫張を（平均上標準偏
差）の形で示す。感作後／−１週のどの時点においても
、対照群（標品非処置群）を大きく上まわる著明な遅延
型過敏症が認められた。

以上の諸活性を有する本免疫賦活物質は、医薬。

動物薬として有効であり１次の様な用途に供することが
できる。

ｌ免疫賦活物質としての制癌剤及びその原料ユインター
フエロレ誘導型の抗つィルス剤及びその原料 ３、畜産動物の細菌、ウィルス等の感染症の予防及び治
療薬 弘動物用ワクチンのアジュバント。

本発明の免疫賦活物質は、汎用される賦形剤。

保存剤、安定化剤、界面活性剤、懸濁化剤などを添加し
て注射剤、坐剤、較膏剤、リニメント剤な０／〜３θｌ
である。

次に本発明の免疫賦活物質の製造例を示すが。

下記実施例はなんら本発明を限定するものではない。

実施例 （、）発酵工程 グリセロールエＭ＠地： グリセロール　　　θｊ　％ ポリペプトン　　　９２５％ 牛肉エキス　゛　　　９２５％ 酵母エキス　　　　９２５％ ソイトーン　　　　０２Ｓ％ 塩化ナトリウム　　０３　％ （ｐＩ（６，ざ） 種培養： グリセロールーＩＭ培地７００　ｍｌを含む！Ｏθｌ１
ｌｌ容フラスコにアグロマイセス・オキナワイＧｐ２ｊ
９を２白金耳植菌し、２ざＣでｌｊ日間振盪培養する。

（回転数／ざＯｒｐｍ）。

木培養： ｐ）−＋）　−＠　ｏ　−Ｊｌ／−ＩＮ培地１ｒ　００
ｍｌヲ含ｂ２　Ｉ！容フラスコに得られた種培養を３％
の濃度になる様に接種する。回転数／ざＱ　ｒｐｍで、
２ｒ”Ｃ，３日間振盪培養し、菌濃度が２　ＷＩｇ、／
　ｔｘｔ以上であれば培養をΦ止し９本培養液を得る。

（ｂ）分離工程 本坊養液ｊ１分を遠心分離し、粗標品として沈澱Ａを得
る・ 沈澱Ａを／ｌの水に溶解し、７！；’Ｃ，３θ分間の熱
処理によって殺菌する。これを０°Ｃまで冷却し、０℃
で３θ分間攪拌し、遠心分離により沈澱Ｂを得る。沈澱
Ｂを１回水洗し凍結乾燥すると非砕細胞標品を得る。収
率：　／３；９０また。沈澱Ａを２ｊ；０ｙｎｌの水に
溶解し、殺菌後θ℃で超音波処理しく２θＫＣ，ｊ分間
）、水で約／ｌに希釈し、２θ０θｇの遠心分離で得ら
れる上清を♂θＯθｇの遠心分離にかけ沈＃Ｃを得る。

沈澱Ｃを／回水洗後凍結乾燥すると破砕細胞片標品を得
る。収率：菌体／ｇから１７θ■。

特許出願人　　塩野義製薬株式会社

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）アグロマイセス属に属する免疫賦活物質生産菌株
   を培地に培養して得られる免疫賦活物質。
2. （２）アグロマイセス属に属する免疫賦活物質生産菌株
   がアグロマイセス・ラモススＡＴＣＣ２！；／７３なら
   びにアグロマイセス・オキナワイＧｐ２！；９゜グｊ♂
   、　！；３Ｋ　、乙２θ、２１．３２．ノ９／９．２５
   リワおよび３７乙ざより選ばれた菌株であることを特徴
   とする特許請求の範囲／記載の免疫賦活物質。
3. （３）アグロマイセス属に属する免疫賦活物質生産菌株
   を培地に培養し、培養細胞を採取することを特徴とする
   免疫賦活物質の製造法。
4. （４）アグロマイセス属に属する免疫賦活物質生産菌株
   を培地に培養し、得られる菌体あるいはその破砕細胞片
   を殺菌、水洗、凍結乾燥することを特徴とする特許請求
   の範囲（３）記載の製造法。
5. （５）アグロマイセス属に属する免疫賦活物質生産免疫
   賦活剤。
6. （６）免疫賦活物質を生産するアグロマイセス・オキナ
   ワイ。
7. （７）アグロマイナス・オキナワイＧｐ２！；９である
   特許請求の範囲（６）記載の細菌。
8. （８）アグロマイセス・オキナワイＧｐ４’＃’である
   特許請求の範囲（６）記載の細菌。
9. （９）アグロマイナス・オキナワイＧＰ３３ｊである特
   許請求の範囲（６）記載の細菌。 αＯアグロマイセス・オキナワイＧＰ１．２θである特
   許請求の範囲（６）記載の細菌。 α◇アグロマイセス・オキナワイＧｐ２ｔ３２　である
   特許請求の範囲（６）記載の細菌。 αのアグロマイセス・オキナワイＧｐ２９／９である特
   許請求の範囲（６）記載の細菌。 α３アグロマイセス・オキナワイＧｐ２％フである特許
   請求の範囲（６）記載の細菌。 α４アグロマイセス・オキナワイＧＰ３７１．ｆ　であ
   る特許請求の範囲（６）記載の細菌。