JPS5844210B2 - 血中アセト酢酸の高感度簡易比色定量法 - Google Patents
血中アセト酢酸の高感度簡易比色定量法Info
- Publication number
- JPS5844210B2 JPS5844210B2 JP8680378A JP8680378A JPS5844210B2 JP S5844210 B2 JPS5844210 B2 JP S5844210B2 JP 8680378 A JP8680378 A JP 8680378A JP 8680378 A JP8680378 A JP 8680378A JP S5844210 B2 JPS5844210 B2 JP S5844210B2
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- Japan
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- absorbance
- acetoacetic acid
- solution
- blood
- serum
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は血中ケトン体、殊に血清中のアセト酢酸の簡易
分別定量法に係る。
分別定量法に係る。
糖尿病患者の臨床診断に際して血清中のケトン体量を測
定することが極めて重要であることは従来より知られて
いる。
定することが極めて重要であることは従来より知られて
いる。
しかしながら、この目的に於て現在一般に使用されてい
るのはニトロプルジッド法と酵素法とであるが、前者は
半定量法であって不正確であり、後者はその操作手段が
極めて煩雑であると謂う欠陥を有している。
るのはニトロプルジッド法と酵素法とであるが、前者は
半定量法であって不正確であり、後者はその操作手段が
極めて煩雑であると謂う欠陥を有している。
斯くて本発明の基本的目的は、感度及び正確度に優れた
ジアゾニウム塩とのカップリング反応を利用して血清中
のアセト酢酸を比色定量する方法を提供することにある
。
ジアゾニウム塩とのカップリング反応を利用して血清中
のアセト酢酸を比色定量する方法を提供することにある
。
この目的に供し得るものとして従来知られているジアゾ
ニウム塩としては２．５−ジクロロベンゼンジアゾニウ
ムクロライドが存するがこれは液状であり且つ不安定で
あるので血清中のアセト酢酸測定の当日に新たに調製し
なければならないと謂う煩られしさがあり、しかも発色
生成物が不安定であるので測定値がバラツクと言う欠点
を有している。
ニウム塩としては２．５−ジクロロベンゼンジアゾニウ
ムクロライドが存するがこれは液状であり且つ不安定で
あるので血清中のアセト酢酸測定の当日に新たに調製し
なければならないと謂う煩られしさがあり、しかも発色
生成物が不安定であるので測定値がバラツクと言う欠点
を有している。
従って、本発明の主たる目的は結晶性粉末状ジアゾニウ
ム塩であって、冷暗所保存により数ケ月に亘って安定で
ありしかも蒸留水中に易溶であり、アセト酢酸との反応
性が高く発色生成物が安定である、ｐ−ニトロフェニル
ジアゾニウムフルオポレートを使用する血中アゼト酵酸
の高感度簡易比色定量法を提供することである。
ム塩であって、冷暗所保存により数ケ月に亘って安定で
ありしかも蒸留水中に易溶であり、アセト酢酸との反応
性が高く発色生成物が安定である、ｐ−ニトロフェニル
ジアゾニウムフルオポレートを使用する血中アゼト酵酸
の高感度簡易比色定量法を提供することである。
本発明によれば、上記目的並びに本発明を理解すること
により自から判明する他の諸目的は、ａ）検体血清を除
蛋白し、クエン酸緩衝液中でｐニトロフェニルジアゾニ
ウムフルオポレートと反応せしめて血清中のアセト酢酸
をアゾ化合物に変じ、次いで次亜燐酸溶液を添加して残
存する上記ジアゾニウム塩を分解すると共に上記アゾ化
合物をヒドラゾ化合物に変じて溶液の吸光度（４）を３
９０ ｎｍの波長で測定する工程と、ｂ）検体血清の代
りに６％アルブミン溶液を用いリチウムアセト酢酸の０
、０．２５ 、０．５ 、１．０及び２．０ ｍＭ浴
溶液作成し、これを除蛋白し、次いで上記工程ａ）と同
様の処理を行なった後３９０ｎｍの波長で吸光度を測定
し、各吸光度値から上記ＯｍＭの吸光度を（Ｂニブラン
ク値）を減じた値をプロットとして標準検量線を作製す
る工程とを具備しており、式 ％式％） 〔式中Ｆは標準定量直線の吸光度が１．０のときのりチ
ウムアセト酢酸の濃度（ｍＭ／ｌ）を意味する〕に従っ
て定量するにより遠戚される。
により自から判明する他の諸目的は、ａ）検体血清を除
蛋白し、クエン酸緩衝液中でｐニトロフェニルジアゾニ
ウムフルオポレートと反応せしめて血清中のアセト酢酸
をアゾ化合物に変じ、次いで次亜燐酸溶液を添加して残
存する上記ジアゾニウム塩を分解すると共に上記アゾ化
合物をヒドラゾ化合物に変じて溶液の吸光度（４）を３
９０ ｎｍの波長で測定する工程と、ｂ）検体血清の代
りに６％アルブミン溶液を用いリチウムアセト酢酸の０
、０．２５ 、０．５ 、１．０及び２．０ ｍＭ浴
溶液作成し、これを除蛋白し、次いで上記工程ａ）と同
様の処理を行なった後３９０ｎｍの波長で吸光度を測定
し、各吸光度値から上記ＯｍＭの吸光度を（Ｂニブラン
ク値）を減じた値をプロットとして標準検量線を作製す
る工程とを具備しており、式 ％式％） 〔式中Ｆは標準定量直線の吸光度が１．０のときのりチ
ウムアセト酢酸の濃度（ｍＭ／ｌ）を意味する〕に従っ
て定量するにより遠戚される。
尚、本発明方法に際して生起する反応工程を示せば下記
の通りである。
の通りである。
次に、本発明方法に使用される試薬及び本発明方法を実
施する操作等に関連して更に説明する。
施する操作等に関連して更に説明する。
試薬
１、クエン酸緩衝液
０．２３Ｍのクエン酸溶液と０．２３Ｍのクエン酸ナト
リウム溶液とを混合してｐＨ４，５に調整する。
リウム溶液とを混合してｐＨ４，５に調整する。
２、ジアゾニウム塩試薬
１）合成
ｐ−Ｎｏ２０６Ｈ４ＮＨ，、＋ＨＮＯ２＋ＨＢＦ４→ｐ
−ＮＯ□Ｃ６Ｈ４Ｎ２ＢＦ４＋２Ｈ２０ｐ−ニトロアニ
リン３．４ｇを４２％硼弗化水素酸１１ｍ１中に充分に
攪拌し乍ら添加し、これに氷冷亜硝酸すｔ−ＩＪウム溶
液（１，７ｇ／３．４ｍ／？）を滴加する。
−ＮＯ□Ｃ６Ｈ４Ｎ２ＢＦ４＋２Ｈ２０ｐ−ニトロアニ
リン３．４ｇを４２％硼弗化水素酸１１ｍ１中に充分に
攪拌し乍ら添加し、これに氷冷亜硝酸すｔ−ＩＪウム溶
液（１，７ｇ／３．４ｍ／？）を滴加する。
数分間攪拌し、ガラスフィルタで吸引濾過し、氷冷硼弗
化水素酸３７７１１で１回、９５％メタノールで２回、
エチルエーテルで数回洗浄した後に五酸化燐を入れた真
空デシケータ中で乾燥せしめれば、黄色結晶状粉末であ
る所望のｐ−ニトロフェニルジアゾニウムフルオポレー
ト５．６ｇ（収率９５．９％）が得られる。
化水素酸３７７１１で１回、９５％メタノールで２回、
エチルエーテルで数回洗浄した後に五酸化燐を入れた真
空デシケータ中で乾燥せしめれば、黄色結晶状粉末であ
る所望のｐ−ニトロフェニルジアゾニウムフルオポレー
ト５．６ｇ（収率９５．９％）が得られる。
１１）使用態様
１”Ｌ’ｍの濃度となるように蒸留水に溶解する。
１１１）保存態様
粉末体は比較的安定であり冷暗所保存により数ケ月に亘
り安定、溶液化したものは直ちに使用が原則であるが、
遮光下に水冷しておくことにより少なくとも４〜５時間
程度安定に保存しておくことができる。
り安定、溶液化したものは直ちに使用が原則であるが、
遮光下に水冷しておくことにより少なくとも４〜５時間
程度安定に保存しておくことができる。
３６ 次亜燐酸溶液
２０％溶液を使用
測定手技
１、除蛋白
試験管に血清０．２ｍｌを採取し、２％過塩素酸溶液２
．０ｍｌを混和し３００ ’０．９で１５分間遠心した
後の上澄液を検体溶液として使用する。
．０ｍｌを混和し３００ ’０．９で１５分間遠心した
後の上澄液を検体溶液として使用する。
２、検体溶液の発色と吸光度測定
検体溶液０．５−中にクエン酸緩衝液０．５ ｍ１．及
びジアゾニウム塩試薬０．５ｍｌを加えて３０℃の恒温
槽内で２０分間反応させる。
びジアゾニウム塩試薬０．５ｍｌを加えて３０℃の恒温
槽内で２０分間反応させる。
次いで次亜燐酸溶液０．５ｍｌを添加して残存ジアゾニ
ウム塩を分解すると共に、生成していたアブ化合物をヒ
ドラゾ化合物に変じた後に溶液の吸光度（４）を３９０
ｎｍの波長で測定する。
ウム塩を分解すると共に、生成していたアブ化合物をヒ
ドラゾ化合物に変じた後に溶液の吸光度（４）を３９０
ｎｍの波長で測定する。
３、標準検量源の作製
６％アルブミン溶液を用いてリチウムアセト酢酸の０
、０．２５ 、０．５ 、１．０及び２．０ｍＭ溶液を
調製し、これを２％過塩素酸溶液で除蛋白した後に上記
２）項と同様の操作を行ない３９０ｎｍでの吸光度を測
定し、各吸光度値から上記ＯｍＭの吸光度（Ｂニブラン
ク値）を減じこの値をプロットして標準定量直線を作製
する。
、０．２５ 、０．５ 、１．０及び２．０ｍＭ溶液を
調製し、これを２％過塩素酸溶液で除蛋白した後に上記
２）項と同様の操作を行ない３９０ｎｍでの吸光度を測
定し、各吸光度値から上記ＯｍＭの吸光度（Ｂニブラン
ク値）を減じこの値をプロットして標準定量直線を作製
する。
４、定量計算
（Ａ−Ｂ）ＸＦ＝ｍＭ／Ｊ
〔式中Ｆは標準定量直線の吸光度が１．０のときのりチ
ウムアセト酢酸の濃度（ｍＭ／Ｊ）を意味する〕。
ウムアセト酢酸の濃度（ｍＭ／Ｊ）を意味する〕。
測定結果
（１）第１図はアセト酢酸とジアゾニウム塩とのカップ
リング反応の最適温度について検討した結果であり、３
０℃での反応が、反応終了後の生成アゾ化合物も安定で
しかも反応終了時間も短かった。
リング反応の最適温度について検討した結果であり、３
０℃での反応が、反応終了後の生成アゾ化合物も安定で
しかも反応終了時間も短かった。
（２）第２図はアスト酢酸の濃度によるジアゾニウム塩
との反応時間（分）の険討結果である。
との反応時間（分）の険討結果である。
いずれの濃度においても２０分で完全に反応は最大に達
した。
した。
（３）第３図はアセト酢酸の濃度による反応生成ヒドラ
ゾ化合物の吸収スペクトルを表わしたものであり、いず
れの濃度でも３９０ ｎｍで吸収のピークがあった。
ゾ化合物の吸収スペクトルを表わしたものであり、いず
れの濃度でも３９０ ｎｍで吸収のピークがあった。
（４）第４図はアセト酢酸の生成ヒドラゾ化合物の安定
性を示した結果であり、いずれの濃度でも経時的にほと
んど変化がなく安定であった。
性を示した結果であり、いずれの濃度でも経時的にほと
んど変化がなく安定であった。
（５）第５図はアセト酢酸の標準検量線を表わしたもの
であり、明確な直線性があった。
であり、明確な直線性があった。
（６）第６図は血清、６％アルブミン溶液、蒸溜水のそ
れぞれにリチウムアセト酢酸を溶解して標準検量線を作
成した結果である。
れぞれにリチウムアセト酢酸を溶解して標準検量線を作
成した結果である。
いずれにおいても直線の傾きが同じであり、血清中での
りカバリ−も９８％であった。
りカバリ−も９８％であった。
添付図面中、第１及び２図はアセト酢酸とジアゾニウム
塩とのカップリング反応と温度との及び反応時間との関
係をそれぞれ示すグラフ、第３図は生成ヒドラゾ化合物
の吸収スペクトルを示すグラフ、第４図はアセト酢酸濃
度が異なる場合の生成ヒドラゾ化合物の経時的変化を示
すグラフ、第５図はアセト酢酸標準定量直線を示すグラ
フ、第６図は蒸溜水を使用した場合と６％アリブミン溶
液を使用した場合とのアセト酢酸標準定量直線を比較し
て示すグラフである。
塩とのカップリング反応と温度との及び反応時間との関
係をそれぞれ示すグラフ、第３図は生成ヒドラゾ化合物
の吸収スペクトルを示すグラフ、第４図はアセト酢酸濃
度が異なる場合の生成ヒドラゾ化合物の経時的変化を示
すグラフ、第５図はアセト酢酸標準定量直線を示すグラ
フ、第６図は蒸溜水を使用した場合と６％アリブミン溶
液を使用した場合とのアセト酢酸標準定量直線を比較し
て示すグラフである。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ａ）検体血清を除蛋白し、クエン酸緩衝液中でｐ
−ニトロフェニルジアゾニウムフルオポレートと反応せ
しめて血清中のアセト酢酸をアゾ化合物に変じ、次いで
次亜燐酸溶液を添加して残存する上記ジアゾニウム塩を
分解すると共に上記アゾ化合物をヒドラゾ化合物に変じ
て溶液の吸光度（４）３９０ｎｍの波長で測定する工程
と、ｂ）検体血清の代りに６％アルブミン溶液を用いり
チウムアセト酢酸の０ 、０．２５ 、０．５ 、１．
０及び２．０ｍＭ溶液を作製し、これを除蛋白し、次い
で上記工程ａ）と同様の処理を行なった後３９０ｎｍの
波長で吸光度を測定し、各吸光度値から上記ＯｍＭの吸
光度（Ｂニブランク値）を減じた値をプロットして標準
検量線を作製する工程とを具備しており、式 ％式％） 〔式中Ｆは標準定量直線の吸光度が１．０のときのりチ
ウムアセト酢酸の濃度（ｍＭ／ｌりを意味する〕に従っ
て定量することを特徴とする血中アセト酢酸の高感度簡
易比色定量法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8680378A JPS5844210B2 (ja) | 1978-07-18 | 1978-07-18 | 血中アセト酢酸の高感度簡易比色定量法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8680378A JPS5844210B2 (ja) | 1978-07-18 | 1978-07-18 | 血中アセト酢酸の高感度簡易比色定量法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5515004A JPS5515004A (en) | 1980-02-01 |
| JPS5844210B2 true JPS5844210B2 (ja) | 1983-10-01 |
Family
ID=13896949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8680378A Expired JPS5844210B2 (ja) | 1978-07-18 | 1978-07-18 | 血中アセト酢酸の高感度簡易比色定量法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5844210B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6452905U (ja) * | 1987-09-30 | 1989-03-31 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2804267B2 (ja) * | 1988-05-02 | 1998-09-24 | オリンパス光学工業株式会社 | 内視鏡対物レンズ |
| US6618205B2 (en) | 2001-05-14 | 2003-09-09 | Pentax Corporation | Endoscope objective optical system |
-
1978
- 1978-07-18 JP JP8680378A patent/JPS5844210B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6452905U (ja) * | 1987-09-30 | 1989-03-31 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5515004A (en) | 1980-02-01 |
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