JPS5847255A

JPS5847255A - 液体クロマトグラフ装置

Info

Publication number: JPS5847255A
Application number: JP14596381A
Authority: JP
Inventors: Shingo Hirose; 廣瀬　信吾
Original assignee: NISSHIN DENKI SEISAKUSHO KK
Current assignee: NISSHIN DENKI SEISAKUSHO KK
Priority date: 1981-09-14
Filing date: 1981-09-14
Publication date: 1983-03-18

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は分析に用いられる液体クロマトグラフの改良に
関する。％に１液体クロマトグラフの分離カラ人出口に
現われる分離された物質に酵素を反応させて螢光物質を
得て、これに光線を照射して検出を行う装置に関する。

医薬品が体内で代謝および吸収または排泄される状態を
調べることにより、医薬品の作用および副作用を観察す
ることが、医薬品の開発には不可欠である。ことに近年
医薬品の作用および副作用についてきわめて詳しく調べ
ることが求められるようになり、血液・尿その他の排泄
物や分泌物または組織中に含まれる極〈微量の物質を定
量する技術が必要になった。このための手段と１−て、
液体クロマトグラフは優れた装置として知られている。

液体クロマトグラフは、試料を展開剤とともに分離カラ
ムの中に通過させると、試料中の成分が、その物理的お
よび化学的性質に応じて分離されて出口に現われるよう
に構成された装置である。この液体クロマトグラフのカ
ラム出口に現われた物質に微量に含まれる物質を検出す
るために、出口に現われた物質に光線を照射し、この照
射に励起されて化学物質が発する螢光を検出する技術が
、特に微量な成分を検出する優れた方法として知られて
いる。

従来この方法によれば、一般に１　ｍｌ中に１０−６ｇ
ｒ程度に存在する化学物質を検知することのできる感度
があるが、前述のような最近の医学における分析の要求
をみたすにはこれでは不十分であって、さらに高い検出
能力のある処理能力の優れた分析装置の開発が望まれて
いる。また、従来の液体クロマトグラフは、分離カラム
の中に試料を通過させる時間が長く、分析の能率が悪い
欠点がある。

本発明はこのような背景に行われたもので、検出能力を
高くするとともに、分析に要する時間を短くすることの
できる液体クロマトグラフ装置を提供することを目的と
する。

さらに、検出対象となる物質が光線を照射しても螢光を
発しないために、この種の従来装置では検出することの
でき々かった物質に対しても、検出を可能とする液体ク
ロマトグラフ装置を提供することを目的とする。

本発明は、液体クロマトグラフ装置に酵素反応を組合せ
るものであって、分離カラムによる分離と酵素の特異性
を利用する分離との二段階の分離を組合せて行うことを
特徴とする。

このように二段階の分離を行うと、第一段階の分離カラ
ムによる分離は、粗い分離を行えばよいことになり、分
離カラムを短くかつ簡単化して、分離に要する時間を短
縮することができる。

また、検出能力を高めるために、照射する光線−パルス
状の光源を用い、さらにこれにより励起される螢光をこ
のパルスに同期して作動する検出器により検出すること
を特徴とする。

この構成により、小形の装置で瞬時エネルギの大きい光
線で検出物質全照射することができるとともに、励起さ
れた螢光を検出するための光雑音を排除することができ
るので、検出能力をきわめて高くすることができる。

すなわち本発明は、分離カラムの出口と光線を照射する
手段との間に、分離カラムの出口に現われる物質に酵素
を共存させて反応させる手段を備え、光線を照射する手
段がパルス状に発光する励起用光源装置を含み、検出す
る手段がこの励起用光源装置の発光するパルスに同期し
て作動する検出器を含むことを特徴とする。

上記酵素を共存させて反応させる手段には、あらかじめ
固定化された酵素が充填された酵素カラムを含むものが
望ましい。

この酵素（例えば酸化還元型の酵素系のもの）には、そ
の反応に関与する補助物質（例えば過酸化水素、ＮＡＤ
Ｈなど）を共存させて、試料から螢光を発する物質を直
接得ることができなくと゛も、分離された物質と上記補
助物質とが酵素により反応することによって、螢光を発
する物質を得て、これを観測することができる。

実施例図面により詳しく説明する。

第１図は本発明実施例装置の構成図である。溶離液１は
送液ポンプ２を介して管路３に送出される。分析の対象
となる試料５はサンプルパルプ６からこの管路３に注入
される。管路３の液体は送液ポンプ２の作用により、カ
ラム７に高圧で送られる。カラム７は公知の充填剤と溶
離液を含むクロマトグラフィ用分離カラムであって、通
過した物質の物理的および化学的性質に応じて分離が行
われ、その出口８には分離された物質が時系列的に現わ
れる。

カラム７の出口には混合管９が連結され、カラム７の出
口８に送出された物質を次の酵素カラム１０に導くとと
もに、溶液１１から送液ポンプ１２により送られる酵素
および補助物質がここで混合される。酵素等が混合され
た物質は、酵素カラム１０で反応する。この反応につい
て後に詳しく述べるが、酵素の種類と反応の条件によっ
ては、酵素カラムＩＯの中にあらかじめ一部の酵素を固
定化しておくことがよい方法である。酵素カラム１０に
は電熱ヒータが備えられ、端子３２から電流を通じて酵
素による反応の最適な温度条件を作る。

酵素カラム１０の出口１３１Ｃ送出される物質は照射板
１４の表面を伝って流下しドレイン１５に流れる。

この板１４の表面には、励起用光源装置１７からレンズ
１８を介してレーザ光線が照射される。この光線の進路
には光トラップ１９が配置されて、光線はここに吸収さ
れる。励起用電源装置１７は電源２０により駆動される
。

この照射板１４の表面でレーザ光線により照射された物
質から発せられる螢光は、フィルタ２２、レンズ２３お
よびスリットを通過して電子増倍管２４に入り、電気信
号に変換されて、検出器２５に入る。

電子増倍管は電源２６により駆動される。図に一点鎖線
２８で示す部分は暗箱である。検出器２５の別の入力に
は、レーザ光線をスプリッタ２９で分岐し、これを光電
変換器３０で電気信号に変換した信号が与えられる。検
出出力は端子３１に送出される。

ここで、励起用光源装置１７は窒素レーザ（波長３３７
．１ｎｍ）を用いることが最適である。しかも、励起用
光源装置１７はパルス状に駆動される。検出器５はボッ
クスカー積分器またはゲート形のホトカウンタ等が適し
ていて、励起用光源装置１７の発光パルスに応じて積分
またはゲート動作を行い、雑音を排除して高感度の検出
を行う。

このように、本発明の特徴とするところは、カラム７の
出口に酵素を混合し反応させるための手段を連結して、
この反応により生じた物質に光線を照射して検出を行う
ことにあるが、この酵素の反応について次に実施例を用
いて詳しく説明する。

発明者が実施した第一の実施例は、検出対象である基質
がｔ−アミノ酸の場合である。ｔ−アミノ酸を定量する
操作は医薬の研究試験等においてきわめて必要性が大き
い。従来から液体クロマトグラフがこのために利用され
ている。第１図に示す装置を用いて、カラム７の出口８
にｔ−アミノ酸が連続して単離される。これは混合管９
に送られる。

一方溶液１１は、ｐＨ調節用の０．１モル燐酸緩衝液お
よび１０　　モルｐ−ハイドロキシフェニール酢酸混液
であって、ポンプ１２から混合管９に送られ、上記アミ
ノ酸とともに酵素カラムｌＯに流し込まれる。酵１カラ
ム１０の中には、ｔ−アミノ酸オキシダーゼ（ＫＯｌ・
４・３・２）とペルオキシダーゼ（ＫＯｌ・１１・１・
７）が固定化されている。第２図にその反応過程を示す
。すなわち、基質がｔ−アミノ酸であるとき、第一の酵
素としてｔ−アミノ酸オキシダーゼ（ＢＯｌ・４・３・
２）を用いる。この酵素の作用により基質ｔ−アミノ酸
は酸化され２−オキソ酸とガる。その反応を例示すると
、Ｈ２＋ＲＣ！（！ＯＯＨ＋Ｈ２Ｏ２＋ＮＨ３１である。

上記のようＫこの反応には、空気中の酸素（０２）が利
用され、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を生成する性質がある
。

この第一の酵素は、第１図で示した混合管９から混入し
てもよいが、発明者が実験した結果では、あらかじめ酵
素カラムｌＯに固定化して入れておく方が簡便であり有
効である。

このようにして生成された過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は、
第二の酵素である過酸化水素分解酵素（ペルオキシダー
ゼ（Ｅｃ、１・１１・１・７））の作用により分解され
る。

この第二の酵素の作用により、過酸化水素が分解する過
程で、補助物質を酸化する。この補助物質としては、酸
化の前には非螢光物質であって、酸化されると螢光物質
となる性質のものを選び、これを第１図に示す溶液１１
から送り、混合管９で混入する。

酸化の前に非螢光物質であり酸化により螢光物質となる
物質は利用する酵素に応じて適宜選ぶことがよい。発明
者が実施している例はフェノール類および芳香族アミン
から選ばれるが、特にその−例を挙げると、ｐ・ハイドロキシフェニール酢酸であるが、これに限るもので彦い。

この第二の酵素についても、溶液■１から送出し混合し
てもよいが、酵素カラム１０にあらかじめ固定酵素とし
て入れておくことができる。補助物質については、原則
として溶液１１から送出混入することがよい。

このように酵素を用いて検出対象となる基質を反応させ
、これにより生成される物質を観測することにより、基
質が螢光性を持たないものについて、観測する対象を拡
大することができる。特に、本発明を実施してクロマト
グラフィ用分離カラムに連結して酵素を作用させると、
分離カラムにおける分離を従来装置はど厳しく行わなく
とも、対象とする基質を反応させる酵素により選択する
ことができるので、カラムの構成が簡単でよいことにな
り、液体クロマトグラフ装置を安価にすることができる
。

この方法により芳香核を有するアミノ酸を５　Ｘ　１０
−’　　ｇｒ／ｍｌの濃度まで定量できることが確められた。また、分離カ
ラム７を短縮することができるので、測定に要する時間
を著しく短縮することができることがわかった。したが
って、一台の装置で一人の作業者が多数の試料について
測定することができるので、今後の医薬の効果測定にき
わめて有用であると考えられる。

次に発明者が実施した第二の例として、血液中の尿酸の
定量について、数値を含む実施例を示す。

血清１　ｍＡを取り、これにメタノール１０ｍｔを加え
て加温後メタノール液層を分取する。これを減圧下で乾
固する。残渣を８０チメタノ一ル溶液１ｍＡに溶解する
。その１０μｔを第１図に示す液体クロマトグラフ装置
にて分離定量する。

カラム７は、ＲＰ−０，８を充填し、その長さが３．１
ｍｍφＸ２５０ｍｍであって、溶離液に０．１Ｍ燐酸１−カリウム塩を用い
０．８　ｍ４／Ｉｎ１ｎの流速で溶離させる。

カラム７の出口に連結された混合管９から、１０−４Ｍ
のｐ・ハイドロキシフェニル酢酸の溶液を０．３３　Ｌ
／’ｍｉ　ｎの割合で混合させる。

酵素カラムｌＯにはガラスピーズに固定化したウリカー
ゼ（ｕ、ｃ、１・７・６・３）およびペルオキシダーゼ
（ＢＯＩ・１１・１・７）を充填する。酵素カラムｌＯ
の大きさは２．０ｍｍφ×１００ｍｍであり、酵素カラムの温度を約３５℃に保つ。

励起用光源装置１７は窒素レーザであって、フィルタ２
２は４２５ｎｍの螢光を透過し、３３７．１ｎｍの励起
光の散乱光を除去する。この反応を第３図に示す。

これにより血中の１　ｍＡ中に含まれる５Ｘ１０　　ｇ
、ｒの尿酸を定量することができた。

発明者が実施した酵素を用いる反応についての第三の実
施例は、第４図に示す反応系のものである。これは酵素
として、オキシドリダクターゼ類を用い、補助物質とし
てＮＡＤにコチンアミドアデニンジヌクレオチド）−！
たはＮＡＤＰにコチンアミドアデニンジヌクレオチドホ
スへイト）を用いる。

オキシドリダクターゼ類の酵素の中には、共通の補助物
質ＮＡＤまたはＮＡＤＰの作用を必要とするものが多い
。またこの酵素は基質を生成物に変化させる際に、ＮＡ
ＤまたはＮＡＤＰをそれぞれＭＡＤＥまたはＮＡＤＰＨ
に変化させる。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨは５４０ｎｍ
の波長を吸収して、４６０　ｎｍの強い螢光を発する。

このため励起光源として窒素レーザ（３３７，１ｎｍ　
）を用いることはきわめて有効である。励起光をパルス
状とし、これに同期して螢光を測定すると、ＮＡＤＨま
たはＮＡＤＰＨの微量の測定が可能に々る。

このようにＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの定量を行うこと
により、化学量論的に測定の目的物である基質を比例し
て定量することができる。オキシドリダクターゼ類の中
には、ＮＡＤまたはＮＡＤＰを補酵素とするものが多く
、したがって測定できる基質の種類が多く、利用範囲が
広い。

次にこの具体的々実施例として、血液中の微量の乳酸の
測定について述べる。ここで用いる酵素は、乳酸デヒド
ロゲナーゼ（ＥＣ，１・１・１・２７）である。この酵
素は補酵素としてＮＡＤを必要とし、下式のように反応
する。

Ｌ−乳酸子ＮＡＤ？ピルビン酸十ＮＡＤＨこの反応は可逆的であって、生成したピルビン酸にヒド
ラジンを添加して、ピルビン酸のヒドラシーンとして可
逆反応の進行を防止する。この操作により生成するＮＡ
ＤＨは乳酸の量に比例することになる。ＮＡＤＨを窒素
レーザ（３３７，１ｎｍ　）で励起し、その発生する螢
光（４６０ｎｍ）をレーザと同期した電子倍増管で測定
する。

上記乳酸デヒドロゲナーゼ（ｒ；ｃ、１・１・１・２７
）は基質に対する特異性が大きいので、迅速な操作によ
る短い時間の分析や、十分な精度を必要としない分析の
場合には、第１図の分離カラムをきわめて短くして、極
端な場合にはカラム７を取除いても、測定することがで
きる。

血清を１０倍に希釈し、その１０μｔをサンプルパルプ
６より注入する。このとき溶離液】としてはｐｌ（８，
５の０．１Ｍ燐酸緩衝液に、０．２　ｍＭのＮＡＤ。

５０ｍＭのヒドラジン、および少量のＥＤＴＡを含む溶
液を用いる。ポンプ２は毎分０．３　ｍＡ程度とする。

酵素カラム１０は２５℃に保温する。　励起用光源１７
としては、窒素レーザ（３３１，７ｎｍ　）を用いた。

この結果血清１　ｍＡ中に存在する乳酸ｌＸ１０　　ｇ
ｒ　　　以下を測定することができた。

このように、基質がアミノ酸以外の場合にも、また基質
に螢光性がなくとも検出を行うことができる。酵素、補
助物質、アクセプタ等については、さまざま々組合せで
基質に対応させて選ぶことができる。

以上説明したように、本発明によれば、きわめて微量の
物質も、酵素を用いることＫより生物化学的に反応させ
て検出できる状態に修飾することができる。これをパル
ス状に発光する励起用光源　−で照射し７、これに同期
した検出を行うことにより、従来得られなかったきわめ
て高感度の測定を行うことができる。

さらに、検出の対象となる基質が螢光を発しない場合に
も、上述のような酵素反応により螢光を発する物質に置
き換えて定量することができるので、液体クロマトグラ
フの適用領域が広くなる。

さらに、酵素反応を組合せることによる顕著な効果は、
従来の分離カラムによる分離の程度を粗くしても、十分
に高感度の測定を行うことができる点にある。このため
測定の作業能率が向上し、従来測定できなかった程の多
数のテークを採ることができ、医薬品の性質の調査には
きわめて有効である。

さらに、酵素を酵素カラムに固定化すると、酵素を取扱
うための特別な知識や技術を必要とせずに、この種の装
置の操作ができるようになる。従来液体クロマトグラフ
は、いくつもの部分に分けられ、これらを巧みに連結し
て取扱う必要のある装置であったものが、１台のまとま
った取扱いの　゛簡単な装置として提供できるようＫな
る。しかも酵素カラムを消耗品として提供すれば、本発
明が分析技術に貢献するところは大である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明実施例装置の構成図。第２図は酵素による反応系の一例を示す図。第３図は酵素による反応系の別の一例を示す図。第４図は酵素による反応系のさらに別の一例を示す図。１・・・溶離液、２・・・送液ポンプ、３・・・管路、
５・・・試料、６・・・バルブ、７・・・カラム、８・
・・出口、９・・・混合管、ｌＯ・・・酵素カラム、１
１・・・溶液、１２・・・送液ポンプ、１３・・・出口
、１４・・・照射板、１５・・・ドレイン、１７・・・
励起用光源装置、１８・・・レンズ、１９・・・光トラ
ップ、２０・・・電源、２２・・・フィルタ、２３・・
・レンズ、２４・・・電子増倍管、２５・・・検出装置
、２６・・・電源、２８・・・暗箱、２９・・・スプリ
ッタ、３０・・・光電変換器、３２・・・端子。特許出願人　株式会社日辰電機製作所代理人　　弁理士　井　出　血　孝

Claims

【特許請求の範囲】

（１）試料を通過させる分離カラムと、この分離カラム
により分離された物質に光線を照射する手段と、この光
線により励起される螢光を電気信号に変換して検出する
手段とを備えた液体クロマトグラフ装置において、前記
分離カラムの出口と前記光線を照射する手段との間に、
前記分離カラムの出口に現われる物質に酵素を共存させ
て反応させる手段を備え、前記照射する手段がパルス状
に発光する励起用光源装置を含み、前記検出する手段が
前記電気信号を入力とし前記励起用光源装置の発光する
パルスに同期して作動する検出器を含むことを特徴とす
る液体クロマトグラフ装置。
（２）酵素を共存させて反応させる手段に、あらかじめ
固定化された酵素が充填された酵素カラムを含む特許請
求の範囲第（１）項に記載の液体クロマトグラフ装置。
（３）酵素を共存させて反応させる手段に、この酵素の
反応に関連する１種または複数種の補助物質をこの酵素
と共存させる手段を含む特許請求の範囲第（１）項また
は第（２）項に記載の液体クロマトグラフ装置。
（４）酵素が、分離された物質および補助物質を反応さ
せる第一の酵素と、この第一の酵素が関与する反応によ
り生成された物質をさらに上記補助物質とは別の種類の
補助物質と反応させて螢光物質を得るための第二の酵素
とを含む特許請求の範囲第（３）項に記載の液体クロマ
トグラフ装置。
（５）酵素を共存させて反応させる手段に、加温手段を
含む特許請求の範囲第（１）項ないし第（４）項のいず
れかに記載の液体クロマトグラフ装置。