JPS5849821B2 - 酵素電極 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、集電体上に酵素を架橋法で固定化した酵素電
極に関する。

さらに、詳しくは、酵素を架橋試薬、例えばグルタルア
ルデヒドで固定化する際に、架橋試薬と反応してそれ自
体が不溶化すると同時に酵素固定化の担体ともなる高分
子化合物を用いることを特徴とする。

従来、酵素をカーボン、白金などの集電体上もしくはそ
の近傍に固定化した分析などの目的に用いられるいわゆ
る酵素電極は、酵素の固定化法としてグルタルアルデヒ
ドによる架橋法がしばしば用いられていた。

しかし、この種架橋試薬単独で酵素分子自体を直接架橋
固定化した場合には、十分な活性や強度を有する酵素電
極を得るのは困難であった。

本発明は、酵素を集重体上に架橋固定化する際に、架橋
試薬で架橋不溶化する高分子化合物を担体として用いる
ことにより、酵素の集電体上への固定化を容易にすると
ともに、゛固定化酵素を物理的に強固にし、さらに酵素
電極の活性を向上するものである。

以下本発明をその実施例により詳細に説明する。

実施例 １ 担体の高分子化合物として下記の一般式で表されるポリ
エチレンイミン、＋ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨｘ＋−ｎＸ＝
１ ｔ ２ 酵素としてグルコースオキシダーゼ、集電体としてカー
ボン、架橋試薬としてグルタルアルデヒドを用いる。

まず、炭素粉末をプレス或型して円板状電極を作ル。

一方、ポリエチレンイミンとグルコースオキシダーゼと
ＰＨ５．６のリン酸緩衝液とを重量化で１：１０：３の
割合で混合する。

この混合物を前記電極上に塗布し、乾燥した後、グルタ
ルアルデヒドの５重量俤水溶液につけ、架橋反応を行な
わせる。

こうして酵素を集電体上に直接固定した酵素電極が得ら
れる。

この際ポリエチレンイミンはグルタルアルデヒドによっ
てそれ自体不溶化されるが、グルコースオキシダーゼと
の間でも架橋反応を行ない、グルコースオキシダーゼの
固定化担体として作用する。

図面は酵素電極を用いた電気化学測定系を示す。

１は酵素電極、２は参照極の飽和カロメル電極、３はリ
ン酸緩衝液、４は対極、５はセパレータである。

６は酸素導入管で、電極１側のリン酸緩衝液中には酸素
ガスを飽和させてある。

ポテンショスタットを用いて、作用極である電極１を参
照極２に対して−〇．６Ｖの定電位に保つと、電極１に
は約２ ０ ０ ｌｔＡの酸素の還元反応に基づくカソ
ード定常電流が得られる。

ここで作用極側の緩衝液中にグルコースを５ Ｘ １
０−’モル／ｌの濃度となるように注入すると、電流値
は急激に減少して約１６０μＡの定常値が得られた。

この酸素の還元電流の減少分約４０μＡは、次のような
グルコースオキシダーゼの触媒反応によって酸素が消費
されるために生じている。

グルコース濃度を種々変えて同様の測定を行なうと、還
元電流の減少分とグルコース濃度との間に相関性が認め
られ、上記の酵素電極によってグルコース濃度を電気化
学的に測定することが可能なことがわかる。

ポリエチレンイミンを用いないでグルコースオキシダー
ゼのみを同様の方法で固定化した酵素電極を用いて同様
の測定を行なった場合の酸素の還元電流の減少分は、グ
ルコース濃度５Ｘ１０’モル／ｌに対して約１５μＡで
あった。

上記のように、ポリエチ゛レンイミシを用いてグルコー
スオキシダーゼを固定化した電極の方が、同一濃度のグ
ルコースに対して電流変化が大であり、従って感度が高
い。

これらはポリエチレンイミン自体が酵素固定化の担体と
なるため、酵素の固定化収率が向上しているためと考え
られる。

実施例 ２ 酸素としてＤ−アミノ酸オキシダーゼ、集電体としてＳ
ｎ０２ネサガラス、架橋試薬としてグルタルアルデヒ
ドを用いる。

Ｓ ｎ ０ ２ネサガラスを十分洗浄し、表面を親水化
する。

一方ポリオルニチンとＤ−アミノ酸オキシダーゼとＰＨ
５．６のリン酸緩衝液とを重量比で、２：１０：３の割
合で混合する。

この混合物を上記ＳｎＯ２ネサガラス表面に塗布、乾燥
した後、グルタルアルデヒドの２．５重量φ水溶液で処
理して架橋反応を行なわせる。

このようにして酵素を集電体上に直接固定化した酵素電
極が作製できる。

この際ポリオルニチンはグルタルアルデヒドによってそ
れ自体が不溶化されているがグルコースオキシダーゼと
の間にも架橋反応を行なっている。

この酵素電極を実施例１と同様の電気化学測定系に組み
込れる。

この場合実施例１とはちがい、作用極側電解液中にはＰ
−ペンゾキノンが１０−２モル／ｌの濃度で溶解されて
いる。

ポテンショスタットを用い作用極（酵素電極）を参照極
に対して＋０．４ｖの定電位に保つと、この時ブランク
定常電流は０．０５μＡであった。

ここで作用極側にＤ−アラニンを５ Ｘ １ ０−’モ
ル／ｌの濃度になるように注入すると、電流値は急速に
上昇して約２０μＡの酸化電流の定常値が得られた。

この酸化電流の増加は、以下の酵素触媒反応によって生
成するヒドロキノンのＳ ｎ ０ ２上での酸化反応に
基づくものである。

種々のＤ−アラニンの濃度で酸化電流の増加分との関係
を調べると、酸化電流の増加とＤ−アラニンの濃度との
間には相関性が認められ、ここに用いた酵素電極によっ
てＤ−アミノ酸（ここではＤ−アラニン）の濃度を電気
化学的に測定可能なことがわかる。

Ｄ−アミノ酸オキシダーゼはポリオルニチンを用いない
でグルタルアルデヒドによる架橋反応のみを行なわせた
場合はＳｎＯ２上に固定することができなかった。

ポリオルニチンは架橋法による酵素固定を容易ならしめ
る効果を有することがわかる。

酸素としてグルタミン酸脱水素酵素、集電体として実施
例１と同様にして作製した炭素粉末の成型電極を用いた
。

まず、ポリリジンとグルタミン酸脱水素酵素とニコチン
アミドアデニンジヌクレオチドとリン酸緩衝液とを重量
比で１：５：３：４の割合で混合し、この混合物を炭素
電極表面に塗布、乾燥した後、実施例１と同様にグルタ
ルアルデヒド処理をする。

このようにしてグルタミン酸脱水素酵素ならびにその補
酵素であるニコチンアミドアデニンジヌクレオチドがポ
リリジシを担体として集電体上に固定化することができ
る。

ポリリジシを用いないで前記酵素および補酵素を固定化
すると、集電体表面に形成された酵素一補酵素からなる
膜は、はがれ易く、強度の非常に弱いものであった。

上記のようにして作製した電極は、下記のような酵素触
媒反応によって生じる還元型のニコチンアミドアデニン
ジヌクレオチド（ＮＡＤ）の酸化電流を実施例２と同様
の方法で電気化学的に測定することにより、グルタミン
酸の濃度測定が可能であった。

高分子担体として天然のタンパク質であり、アミノ基や
イミノ基を有していると考えられるアルブミンとともに
同様にグルタミン酸脱水素酵素とＮＡＤを固定した場合
も物理的に強固でしかも活性の高い電極を得ることがで
きた。

以上の実施例では、いずれも成型したカーボンや、Ｓｎ
Ｏ２ネサガラスに膜状に酵素を架橋固定したが、成型す
る以前の集電体粉末上に酵素を架橋固定し、その架橋酵
素膜でおおわれた粉末を戒型して酵素電極にすることも
可能である。

以上の実施例から明らかなように、架橋試薬で架橋不溶
化する高分子化合物、すなわちポリエチレンイミン、ポ
リオルニチン、ポリリジン等のアミノ基あるいはイミノ
基を有する各種高分子化合物は、酵素を架橋試薬で集電
体上に固定化する際に用いると、酵素の固定化を容易に
し、また固定化酵素を物理的に強固なものとし、さらに
作製した酵素電極の活性を上昇させることができる。

また、酵素と集重体との接触筒積４大きくでき、応答感
度、応答速度の増大が可能となる。

担体となる高分子化合物としては実施例にあげた以外に
ポリアルギニンや天然のタンパク質であるアルブミン等
を用いることもできる。

また、架橋試薬としてはグルタルアルデヒド以外に、ヘ
キサメチレンジイソシアナート、ヘキサメチレンジチオ
イソシアナート、Ｎ，Ｎ’一エチレンビスマレインイミ
ドなどを用いることも可能である。

さらに実施例３にあげたように酸化還元酵素の電子伝達
体（補酵素）を集電体に酵素とともに固定して用いるこ
とも可能である。

この場合には実施例１あるいは２のごとく電子伝達体（
酸素やＰ−ペンゾキノン）を液中に溶解させる必要はな
く、酵素とともに電子伝達体も再使用が可能となる。

【図面の簡単な説明】

図面は本発明の酵素電極を組み込んだ電気化学測定系の
構戒を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 架橋試薬で架橋不溶化する高分子化合物とともに、
   酸化還元酵素を集電体上に架橋固定化したことを特徴と
   する酵素電極。 ２ 架橋試薬が、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレン
   ジイソシアナート、ヘキサメチレンジチオイソシアナー
   トおよびＮ，Ｎ’一エチレンビスマレインイミドである
   特許請求の範囲第１項記載の酵素電極。 ３ 高分子化合物が、アミン基もしくはイミノ基を有す
   る化合物である特許請求の範囲第１項記載の酵素電極。 ４ 高分子化合物が、ポリエチレンイミン、ポリオルニ
   チン、ポリリジン、ポリアルギニンおよびアルブミンよ
   りなる群から選択したものである特許請求の範囲第３項
   記載の酵素電極。