JPS58500037A - インタ−フェロンの検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称　インターフェロンの検定法会÷六←梼餐−中十 技術分野 本発明は、免疫学的検定法の分野に関する。より詳しく言うと、本発明は、イン ターフェロンに対するモノクローナル抗体の使用を含む、インターフェロンの抗 体過剰免疫学的検定法に関する。

背景技術 インターフェロンとは、哺乳動物の体に存在する同類のタンパク質の一群である 。インターフェロンは。

１（ＮＡとタンパク質両方の合成を含む細胞の代謝過程を介して、少くとも同種 の細胞においてウィルス非特異的で抗ウイルス性の作用をするタンパク質因子で ある。インターフェロンは、抗原の特異性を基礎として型に分類され１名称はア ルファ、ベータ、ガンマ（これらは以前の名称である白血球、線維芽細胞、■型 （免疫性）インターフェロンにそれぞれ対応する）である。この抗ウィルス作用 に加えて、インターフェロンは、他の細胞現象の媒介物質又は免疫機能として深 い係わりがある。インターフェロンの研究は、今までその検定法における問題点 によって順調にはいがなかった。唯一の普及している検定法は、組織培養した細 胞を使い、インターフェロンがあ′る場合とない場合のウィルス生長の成る要因 （例えばウィルスのＲＮＡ合成又は宿主細胞の死）を比較することである。これ らの複雑な生物学的検定法は、敏感ではあるが、骨の折れるものであり、また本 質的な変動性によって大きく影響される。特に、検定試料中に存在するインター フェロン以外の要素は、ウィルスの増殖にしばしば影響を与える。そのため、簡 単で間接的なインターフェロン検定法がめられている。このような検定法は、イ ンターフェロン研究の少くとも３つの分野で次のように幅広く応用されるであろ う。

１）インターフェロンの研究用生産、大量生産そして精製のモニター。

２）研究と臨床的応用におけるインターフェロン投与の定量。

３）生物学的分泌液におけるインターフェロンの定量。

本発明の目的は、この要求を満たすインターフェロンの抗体過剰免疫学的検定法 を提供するものである。

人間の体は、抗原があると、リンパ球細胞から抗体分子を産生することによって 抗原に対して反応する。

抗体は、抗原上の決定基（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ　）として知られている成る 特殊な部位に選択的に結合して、抗原を無毒化する性質を持っている。抗原と抗 体との相互作用の性質は、全て分っているという訳ではないが、抗体は、抗原物 質の特定の決定基に対して物理的な親和力を持っているということは明らかであ る。抗体と抗体が特異性を持っている抗原上の決定基との反応により、一般に“ 免疫複合体”と呼ばれる付加物ができる。この種のものの形成により、抗原性物 質の非常に多様な検定がｂ］能となる。このよ５な検定法は、総称的に免疫学的 検定法として知られている。

免疫学的検定法は、大まかには次の２つに分類される。

（１）アナライト（ａｎａｌｙｔｅ　）過剰；ラベルした抗原（アナライトとい う用語は技術用語であり、この文中では゛分析されるもの′とい５意味である） 。このタイプの検定法では、アナライトに対して特異性を持っている抗体を、ア ナライトと既知量のラベルした抗原を含んでいる溶液と一緒に培養する。この方 法においては、拮抗的な平衡が成り立ち、未知量のアナライトが既知量のラベル した抗原と拮抗して抗体との免疫複合体ができる。ラベルした抗原と抗体との間 に生じた免疫複合体の数を計る方法により、アナライトの量を導き出すことがで きる。このタイプの検定法は、検定の究極的感度が生じた免疫複合体の相対的安 定度により限界があるという理由で欠点を有する。

（２）抗体過剰；ラベルした抗体。このタイプの検定法では、定量されるアナラ イトは過剰のラベルした抗体分子と一緒に培養する。従って、アナライトの定量 結果は同線状となり、その最大感度は、理論的には少くともアナライトの１分子 である。この方法を改良したものでは、抗体が過剰に固形培地に溶けないように して、アナライトがそこで免疫複合体を形成するようにする。その後、アナライ ト上の２番目の決定基に対して過剰のラベルした抗体を固形培地と一緒に培養す る。

一般に゛サンドイッチ検定法°°と呼ばれるこのタイプの検定法は、免疫学的検 定法に大きな効用をもたらしている。

本発明は、上述した検定法の第２のタイプ、即ち抗体過条１１免疫学的検定法に 特に関連があり、とりわけインターフェロンの検定に適用されるものである。

本発明によれば、インターフェロンの免疫学的検定を行うための試薬は、インタ ーフェロン、に対する２つの抗体、少くとも１つはモノクローナル抗体であり、 １つはラベルした抗体からなる。

インターフェロンに対して抗体を産生させるための従来の技術では、動物に抗体 産生な刺激するための免疫化用に得られる純粋なインターフェロンが極めて少量 であるという理由により問題があった。この低い抗原性と得られる僅かの量では 、並の純度の抗血清を・産生させることができるだけである。分子生物学の分野 における研究は、現在抗体の代替源を提供している。

哺乳動物（例えば、マウスとラット）から得たリンパ球細胞とミエローマ細胞間 の融合により、試験管内で複製能力を持った雑種細胞を作ることができることが わかっている（コーラとミルシュタイン、Ｎａｔｕｒｅ　２５６゜４９５−５９ ７　＞。このような雑種細胞は、予め決った特異性のある抗体を分泌するという 特質を持っている。この特異性というのは、融合に係わったリンパ球によって産 生された抗体の持っているものである。雑種細胞は、クローン化して安定した培 地で増殖させると、培養上清中に特定の決定基に対して抗体試料を産生させるこ とができる。この方法で産生された抗体は、当該技術分野においてモノクローナ ル抗体として知られている。

この技術の利点は、哺乳動物を免疫化した抗原上又は免疫物質にある抗原不純物 上のいずれかにある他の決定基に生長した抗体によっては汚染されていない特異 的な抗体の供給源を提供することである。この技術の他の利点は、スクリーニン グ検定用に純粋なかたちでは使用できない抗原、また例えばインターフェロンの ような免疫物質に低濃度で存在する抗原であっても使用することができることで ある。細胞融合技術が提供する、抗体の便利な供給源に加えて、モノクローナル 抗体の唯１つの決定基特異性は、免疫学的検定法の分野において様々に利用され ている。と−りわけ、モノクローナル抗体は、１つの決定基にだけ結合するので ある。一般にポリクローナル抗体として知られている、免疫学的検定法において 従来使用されていた抗体は、この特異性を持たず、またこのようなポリクローナ ル抗体を使用する検定法は、特異性がなかったため不正確になりがちであった。

本発明の１実施例では、インターフェロンに対する両抗体はモノクローナル抗体 である。

インターフェロンに対する特に好適なモノクローナル抗体は、ｌ−１ｕ−ＩＦＮ α特異的モノクローナル抗体ＮＫ２であり、その単離と特性は、Ｄ、Ｓ、セチャ ーとＤＣ，パークニよルＮａｔｕｒｅ　２８５　第４４６−４５０頁（１９８０ ）の論文健説明されている。

上述したように、インターフェロンに対する両抗体は、モノクローナル抗体とす ることができる。しがし、都合のいいことには、抗体のうちの１つは例えばＮＫ ２のようなモノクローナル抗体であり、他の１つは従来技術によって産生された 抗体である。このような従来の方法で産生された抗体は、ヒト、ヒツジ、ウマ、 マウス、ヤギ、モルモット、ニワトリ、ラット等から産生し得る。それらの抗体 は、通常精製できるだけ精製し、その後特異性を高めるために公知の方法で、例 えばブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ　）により修飾する。

検定は液相中で、又は固形支持体を使用して実施することができる。もし、液相 検定であれば、反応物の分離が必要でない同質の検定、又は反応物の分離をしな ければならない異質の検定となる。分離は、免疫沈降法、結合した抗原−抗体の 複合体ではなく、遊離の抗原と抗体を有する木炭による吸収又は溶解度のような 異る物理的性質に基づいた相分離により行うことがてきる。

本発明に係る検定は、好ましくは、ラベルされていない抗体が最初に付着する固 形支持体を使用して行うことである。この検定は、次の２，３の方法で行うこと ができる。即ち、（ａ）産生物がラベルした抗体と反応することになる、インタ ーフェロン抗原の過剰に固相に結合した抗体との反応、（ｂｌラベルした抗体と 固相に結合した抗体、両者の抗原との反応、（Ｃ１過剰の固相に結合した抗体と 反応することになる、ラベルした抗体の抗原との反応である。

固形支持体は、固定しておくことも、固定しないでおくこともできる。固定支持 体の例は、プレート、試験管、トレー、くぼみである。固定されていない支持体 の例は、ビーズ、粒子、粉末である。支持体を作り得る代表的な物質には、例え ばポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、ポリアクリルアミド、ナイロ ン、樹脂のような合成ポリマー、例えばセルロース、多糖類、セファロース、ア ガロース、デキストランのような天然ポリマー、シリカ、ガラス、コラーゲンス はポリヌクレオチドのような構造タンパク質、例えば赤血球のような細胞、スタ フィロコッカス・アウレウス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　 ）を含む。固形支持体への抗体の付着は、吸収、吸着又は共有結合によって直接 的に又は結合剤により行うことができる。

ラベルしたモノクローナル抗体は、同位元素でラベルしたものであっても、また 同位元素でないものでラベルしたものであってもよい。好ましくは同位元素でｌ ラベルしたものがよく、このためこの検定法は、免疫放射検定法（ＩＭＲＡ）と なる。ラベル化は直接的又は間接的（複合）に行うことができ、適当なラベルと して１２５．１　、１３１１　、３２ｐ　、　１４Ｃ、３Ｈがある。ラベル化技 術には、クロラミン−Ｔ酸化法、複合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ　）ラベル化法 （ポルトンとハンター、１９７３ｂ　、　Ｂｉｏ！ｌ：ｈｅｍ、　Ｊ　１３３゜ ５２９）、ラクトペルオキシグーゼとヨートゲ：ｙ　（ｉｏｄｏｇｅｎ　）操作 を含む。

本発明の検定で使用できる同位元素によらないラベルには、酵素があり、このた めこの検定は酵素免疫学的検定法（ＥＩＡ）又は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬ ＩＳＡ）となる。適当な酵素マーカには、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダ ーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ等がある。検定法は、 蛍光免疫学的検定法（ＦＩＡ）とすることもでき、マーカの例として、フルオロ セイン、ローダミン、キレート化した希土類元素のような蛍光体（ｆｌｕｏｒｏ ｐｈｏｒｅ　）がある。検定法は、生物ルミネセンス・マーカ又は例えばルミノ ールのような化学ルミネセンス・マーカを含むルミネセンス免疫学的検定法（Ｌ ＩＡ）とすることができる。

同位元素によらないラベル化の他の方法には、当該技忙分野においては全てよく 知られている重金属、補酵素、ラテックス、遊離基、粒子計測の使用による細胞 の標識操作かある。

検定操作は、４Ｃから３７Ｃの範囲の温度において、好ましくは室温で適切に行 う。２回連続して培養を行う場合、最初の培養は４時間位行い、第２回目は８時 間から１６時間、例えば−晩行うことになる。

図面の簡単な説明 第１図は、免疫学的検定法によりインターフェロンを定量した場合の標準曲線で ある。

第２図は、インターフェロンか低濃度の場合の標準曲線である。

第３図は、ヒトの血清を存在させた場合のインターフェロンの検定結果を表すグ ラフである。

発明を実施するための最良の形態 代表的な実施例の１つとして、免疫放射検定法（Ｉ　ＲＭＡ　）を説明する。こ れから説明するこの検定法では、ヒツジの抗インターフェロン抗体を固相である ポリスチレンに付着させ、そして試料中のインターフェロンを固相に固定させる ようにする。その後、この結合インターフェロンは　１２５１−　ＮＫ２　（モ ノクローナル抗Ｈｕ−ＩＦＮα）を添加し、そして固相に結合した総数を計測す ることによって検出する。

この抗体ＮＫ２は、Ｄ、Ｓ、セチャーとり、Ｃ，パーク（へａｔｕｒｅ　２８５ 第４４６〜４５０頁（１９８０）　）により説明されているように、また国際特 許出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＧＩ３８１１０００６７に記載されている通り調製した。

３種類の形のポリスチレンを固相として使用した。

（１）３ｍｌ試験管（ＬＰ３　、　Ｌｕｃｋｈａｍ　、　Ｌｔｄ、　、　Ｂｕｎ ｇｅｒｓ　Ｈｉ　ＩＩ　。

Ｕ、に、　） （２＋　”　９６個のくぼみを有するミクロ滴定用トレー（Ｍ２４１Ｇｉｂｃｏ 　Ｅｕｒｏｐｅ　、　Ｌｔｄ、　Ｕｘｂｒｉｄｇｅ　、　Ｕ、に、、　）（３１ ６，５ｔｎｒｎビーズ（ＮｏｒｔｈｕｍｂｒｉａＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　Ｌｉ ｄ、　。

Ｐｒａｍｌ　ｉｎｇｔｏｎ　、Ｕ、に、）第１のケースでは、試験管全体を結合 １２５■−ＮＫ２を測定するため罠計測した。トレーを使用したときは、各くぼ みの底を熱線で切除し、計測のためきれいな管に変形した。３番目のケースでは 、ビーズを２０個又は６０個のくぼみを有するトレー（９３−０４０２、Ａ、ｂ ｂｏｔｔＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　、　Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ　、　Ｕ、に 、　）で培養し、その後計測のため試験管に移し変えた。使用した培養容量は、 １ｍｌ又は０１ｍ１　（（ぼみ）と０．２ｍｌ　（ビーズ）であった。３つの支 持体は全て満足のゆくものであったが、多数の試料を検定するためには、便利さ の故にビーズの方が好適であった。

ＮＫ２抗体は、ＮＫ２胛瘍を持っているマウスの血清と腹水液から硫酸アンモニ ウム沈降とＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィで精製し、次にクロラミン＝Ｔ 法てラベルし、その後セファデクスＧ　−５０（ｌｉｎｅ）カラムにかけて脱塩 した。ラベルしたＩｇＧは約２０１／μモル、即ち１モルのＩｇＧ当り１２５■ 約１原子の比活性を持っていた。

それぞれの検定では、標準曲線をインターフェロン・レフアレメス標準品Ｍｆ（ Ｃ６９／１９又はラボラトリ標準品を使用して描いた。

このような検定の１つ（第１図参照）では、ＩｇＧをヒツジ抗Ｈｕ　−ＩＦＮα 抗皿清（４５０，０００中和単位／　ｍｌ　）から硫酸アンモニウム沈降とＤＥ ＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィにより精製し、その後ヒツジＩｇ Ｑ　（ＰＢＳ　（リン酸塩緩衝液）、５ｍＭ　ＥＤＴＡ、０１％へａＮ３中２０ μｇ／ｍｌ　）中に４０で１６時間培養することにヨッて、ポリスチレンピーズ に塗布した。数百例のビー　７：　Ｋ　ｆｌ　布Ｌ、ＰＢＳ、１０５’６ウマ皿 清、０．１５１６へａＮ３からなる培養液（ＪＩＳ培養液）に浸し、４Ｃで１− （Ｓ培養液中に保存した。検定用トレー（２０個又は６０個のくぼみのあるもの 、Ａｂｂｏｔｔ　）にＨ８培養液をいれて４Ｃで培フエロン試料はＨ８培養液で 希釈し、その後一対の試料（２００μＣ）を抗体が塗布されたビーズに添加する 。

４Ｃで４時間の後、ビーズをそれぞれディスペンサ／アスピレータが組み合わさ れたもの（Ｐｅｎｔａｗａｓｈ”。

Ａｂｏｔｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）を使用して［ｍｉのＨ８培養液で洗 った。残った培養液を除去した後、１２５Ｉ　−ＮＫ２　（精製１ｇＱ、４０， ０００　ｃｐｍ　）を添加し、４Ｃで１６時間培養した。ビーズは前述のように 洗い、その後ガンマ・カウンタへ運んだ。破線は、塗布されたビーズをインター フェロンの入っていないＨ８培養液で培養したときのバックグラウンドｃｐｍ境 界を示す。８，０００　Ｕ／ｍｌにおいて結合している総数が最大であり、イン ターフェロン濃度を１０６Ｕ／ｍｌまで上げてもそれ以上の増加は観察されなか った。低レベルの非特異的結合（く１％のインプットａ数）は、サンドインチ検 定法の重要な特徴である。

第２の実験において（第２図参照）、我々は、低いインターフェロン濃度では結 合総数はインターフェロン濃度に比例することを示した。インターフェロン試料 は、ｌ−１８培養液中のレファレンス・リサーチ標準品を希釈することにより調 製し、２３，０００　ｃｐｍ　１２５Ｉ　−ＮＫ２を各ビーズに添加したことだ けを除いて、第１図のために説明したように検定した。点線は、バックグラウン ドｃｐｍ境界を示し、８個の値（ｓ、ｅ、　＝±５ｃｐｍ）のヱ均であった。５ ０Ｕ／ｍＬ以上の濃度は、容易に定量できることがわかる。標準的な検定条件（ υＩＪち、第１図を描くときに使用したもの）を、インターフェロンの精製の際 得た試料を定量し易くするために調整した。

このような試料は、１０３−１０７Ｕ／ｍｇの値を持っている。

１０３Ｕ／ｍｌを含む溶液を、順次希釈してゆくと、得られた滴定曲線は標準曲 線に一致していた。同じ試料について、上述の免疫学的検定法による結果と公知 の抗ウイルス検定法による結果とを比較すると、実験上の誤差はあってもよく一 致している。

本発明の免疫学的検定法によれば、従来の生物学的検定法より検定が非常に有利 になる。抗体が塗布されたポリスチレンは４Ｃで使用することができるので、試 料をすぐに検定することができ、そして結果は検定の開始から２４時間以内に得 られる。標準曲線は、生物学的検定法の有する非常に大きな本質的な変動性と比 較して、検定毎には殆んど変動を示さない。インプットｃｐｍが、４７，０００ から５３，０００　ＣＩ）ｍにわたる別々の検定において、２，０ＯＯＵ／ｍＡ ’の溶液を４回測定したところ。

値は３０６３±３４５ｃｐｍであった。ポリスチレンに塗布するために使用する ＩｇＧ溶液は、検定の感度を見掛は上減少させることなしに再ひ使用することが できるため、ヒツジ抗体は少量だけあればよい。ヒツジ抗体の質は、検定の成功 の決定的な要因とはならず、上述したようにＨｕ−ＩＦＮαに対する他の抗体で も全く同様に代替しつる。この検定法は、モノクローナル抗体ＮＫ２の特異性を 利用するものであり、これは培養におけるハイブリッドミエローマ細胞系の産物 であるので、質に何等の変化もなく大量に産生させることができる。最後に、こ の検定法にかかる費用は安く（特に、ビーズを除く全てのプラスチック製品は再 使用が可能であるめで）、自動化に適しており、更に１人で１日に数百もの試料 を検定することもできる。

血清又は他の生物学的分泌液にあるインターフェロンの従来の検定法においては 限界があったため、ウィルス増殖に影響を与える他の非インターフェロン物質の 効果がインターフェロンの作用をマスクすることがなくなるまで試料を希釈する 必要があった。ＰＢＳ、１０９６ウマ皿清、ｏ、ｌ　、９６　ＮａＮ３又は未希 釈の正常なヒトの血清中ＮＫｚ−セファロースでアフィニティ・クロマトグラフ ィにより精製されたインターフェロンの試料を希釈すると、第３図に示す同じ滴 定曲線が得られ、この滴定曲線は本発明の免疫学的検定法がこの問題を解決して いることを示している。この実験でば、インター７二ロ／は（ａ）Ｈ８培養液中 に希釈されたもの、又は（ｂ）未希釈の正常なヒトの血清であり、ビーズではな く３ｍｌ試験管をポリスチレン支持体として使用したことを除いて、第１図に関 連して説明したように試料を検定した。実線は、ケース（ａ）ＶＣおける結合ｃ ｐｍを示し。

破線はケース（ｂ）における結果を示す。

生物学的検定法により血清インターフェロンを定量する際におけるよりも低い量 であっても、インターフェロンを投与した患者の血清中にあるインターフェロン を検出するのであれば充分である。しがし、この感度であっても、正常なヒトの 血清中にあるインターフェロン濃度（もしあれば）を定量するには不充分である 。

−条件を上述したようにインターフェロン濃度を定−Ｍするために調整すれば、 本発明の免疫学的検定法は確実に５０Ｕ／ｍＪぐらいは定量することができる。

本検定法の感度は、小型のＮＫ２−アフィニティ・カラムでインターフェロンを 予め濃縮し、精製して、おくことによって更に一層増大させることができる。

図面の浄書（内容に変更なし） ［イ＝ｙ−７ｚｏ＞］　（ＲＲＵ／ｍｌ　）ＦＩＧ、　１ ＦＩＧ、　３ 特許庁長官　若　杉　和　夫　駿　− １、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８１１００２３９ ２、発明の名称 インターフェロンの検定法 ３、補正なする雀 事件との関係　特許出願人 ４、代　理　人東京都新宿区画新宿１丁目８番１号（針量ビル）６、補正により 増加する発明の数 ２

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １．２つのうちの少くとも１つはモノクローナル抗体であり、１つはラベルした 抗体である、インターフェロンに対する２つの抗体からなるインターフェロンの ための免疫学的検定用試薬キット。 ２　両抗体はモノクローナル抗体であり、１つはラベルされたものである特許請 求の範囲第１項記載のキット。 ３　ラベルした抗体がヒトのα型インターフェロンに特異的なモノクローナル抗 体である特許請求の範囲第１項又は第２項記載のキット。 ４　上記モノクローナル抗体はＮＫ２である特許請求の範囲第３項記載のキット 。 ５、　上記モノクローナル抗体は放射性う、ベルされたＮＫ２である特許請求の 範囲第４項記載のキット。 ６　ラベルされていない抗体は、固形支持体に結合している特許請求の範囲第１ 項から第５項のいずれか１項に記載のキット。 ７、　検定される試料は、試料中のインターフェロンと固形支持体に結合したイ ンターフェロン抗体との間で免疫複合体を形成させる固形支持体と接触して置か れ、ラベルしたモノクローナル抗体は、固形支持体に結合したインターフェロン とラベルしたモノクローナル抗体との間で免疫複合体を形成させる固形支持体と 接触して置かれ、そして免疫複合体が定量されることになる、固形支持体に付着 したインターフェロン抗体とインターフェロンに対するラベルしたモノクローナ ル抗体とからなるインターフェロンのための免疫学的検定法。 ８　ラベルしたモノクローナル抗体が検定されることになる試料と反応し、反応 産物は過剰の固形支持体に結合した抗体と反応し、そして生じた免疫複合体が定 量されることになる、固形支持体に付着したインターフェロン抗体とインターフ ェロンに対スるラベルしたモノクローナル抗体とからなるインターフェロンのた めの免疫学的検定法。 ９、ラベルしたモノクローナル抗体と固形支持体に結合した抗体が検定されるこ とになる試料と反応し、そして生じた免疫複合体が定量されることになる、固形 支持体に付着したインターフェロン抗体とインターフェロンに対スるラベルした モノクローナル抗体とからなるインターフェロンのための免疫学的検定法。 １０、ラベルしたモノクローナル抗体は、放射性ラベルされたＮＫ２である％許 請求の範囲第７項から第９項のいずれか１項に記載の免疫学的検定法。