JPS58501573A - 煙草の高温菌脱窒法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 煙草の高温菌脱窒法 本発明異化的代謝（ｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｏｒｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　）に よる煙草材料の脱窒法に関する。特に本発明は煙草材料中に存在するある種の窒 素含有化合物の濃度を減少させる方法において有用な高温微生物および高温法に 関する。本発明の高温法および高温微生物は嫌気性異化代謝経路によって煙草材 料中の硝酸塩および他の窒素含有化合物の濃度を減少させる。

背　景　技　術 一般に煙草製品の煙中の窒素の酸化物の排出量が少なくなっているのが望ましい ことが認められている。従って喫煙製品中の硝酸塩の如き窒素酸化物プリカーサ −の濃度を減少させるための多くの方法が開発されている。これらの従来技術の 方法は三つの主たる種類、即ちイオン交換法、結晶化法および微生物学法である 。

煙草材料の硝酸塩の濃度を減少させるためのイオン交換を基にした方法は例えば 米国特許第３６１６８０１号、第３８４７１６４号および第４．２５３９２９号 に記載されている。これらの方法、例えばイオン交換、イオン遅延、彰よび電気 透析は、小規模では実施可能であるかもしれぬが、大規模で実施するには費用が 掛ると共１こ、実際的でない。更にこの方法の費用には必要な樹脂および膜の再 生、窒素含有副生成物の分離および廃棄、および廃樹脂および膜の廃（２） 棄と費用が加えられる。

煙草材料中の硝酸塩濃度を減少させるための結晶化を基にした方法は、例えば米 国特許＠４１３１１１Ｂ号に記載されている。これらの方法は大規模法に有用で あり、窒素含有副生成物の迅速分離を可能にする。しかしながらこれらの方法は 副生成物の廃棄を必要とすることによって制限を受けるばかりでなく、それらは その方法で得ることのできる硝酸塩−窒素減少の程度によって制限を受ける。例 えばこれらの方法で処理した後の煙草抽出物は通常約０．４〜０．４５％（４０ ００〜４５０ＯＦＦｌ）の硝酸塩−窒素を含有する。これらの抽出物の硝酸塩− 窒素濃度のそれ以上の減少が、費用的に有効な方法で得られるならば率直に、」 つで有利である。

これらの方法において有用な各種の微生物法および微生物が煙草材料中のある種 の窒素含有化合物の濃度を減少させるため提案されている。好気性または嫌気性 であることのできるこれらの方法および微生物が、窒素含有化合物を代謝させる ため異化および同化経路を使用させている。これらの方法１′よび微生物には例 えば米国特許第３７４７６０８号、英国特許第１５５７２５３号（１９７８年３ 月６日出願の米国特許出願第８８３４４９号に基いていることを述べている）、 英国特許出願第２０１４０３１Ａ号（１９７８年２月９日出願のルクセンブルグ 特゛許市、願第７９０３９号に基づいている）、同第２０２３９９５Ａ号（１９ ７８年６月１５日出願の米国特許出願第９１６３２２号に基づい（３） ていると述べている）、および同第２０２８６２８Ａ号（１９７８年６月１５日 出願の米国特許出願第９１６３２３号に基づいていると述べている）、カナダ特 許＠１０８１０７６号（１９７７年５月６日出願のルクセンブルグ特許出願第７ ７２７２号および１９７７年７月２９日出願のルクセンブルグ特許出願第７７８ ７２号に基づいている）、ヨーロッパ特許出願第０００５０８２号（１９７８年 ４月２５日出願の米国特許出願第９０００４４号に基づいている）および西ドイ ツ特許出願第Ｐ３１００７１５．５号（１９８１年１月１３日出願）の方法およ び微生物を含む。

これらの方法の幾つかは煙草の自らのミクロフロラに属する細菌の使用をしてい るか、それぞれ活性微生物剤として非高温微生物のみを使用している。それらは また低温発酵条件・・・・・５〜４０℃のみを使用している。例えば英国特許第 １５５７２５３号は５〜３５℃を使用し、カナダ特許第１０８１０７６号は２５ 〜３５℃、英国特許出願第２０１４０３１Ａ号は２５〜３５℃、英国特許出願第 ２０２３９９５Ａ号は２０〜４０°Ｃ１英国特許出願第２０２８６２８Ａ号は５ 〜３７℃、ヨーロッパ特許出願第０００５０８２号は３０〜４０℃、西ドイツ特 許出願第Ｐ３１００７１５．５号は３０℃、および米国特許第３７４７６０８号 は２４〜４０℃を使用している。

これらの方法の大部分はまた、煙草材、料を微生物と接触させる前に最終的に滅 菌（例えばｌ　５　ｐｓｉｇで１５分間１２１℃で）すること、および醗酵を実 質的に無菌状態て行なう（４） ことも必要としている。各種嫌気性方法はまた酸素濃度を制限するため不活性ガ スまたは他の処理で醗酵ブイヨンのスパーンングを必要とし、ている。

これらの多くの方法はまた醗酵ブイヨン中に混入すべきまたは醗酵後これらのブ イヨンから分離した煙草材料を補充するための種々な添加剤を必要としている。

例えば英国特許第１５５７２５３号では煙草材料に加えるべき各種の有機化合物 を必要とし、カナダ特許第１０８１０７６号および英国特許出願第２０１４０３ １Ａ号はＤ−グルコースおよび他の添加剤を必要とし、西ドイツ特許出願第Ｐ３ １００７１５．５号はブイヨンに砂糖を加えることを要求している。率直に言っ て、かかる添加剤の要求はかかる方法の原価を高騰させ、煙草材料中に非煙草化 合物の混入を生せしめる。

煙草を処理するための他の微生物的方法も当業者に知られている。例えば米国特 許第２０００８５５号、第３７４７６０８号および第４０３７６０９号は煙草中 に存在するニー】チンを少なくするための微生物的方法および微生物を記載して いる。これらの方法も、煙草の自ら有しているミクロフロラに属する細菌の使用 をしていると考えらえば２４〜４０℃（米国特許第３７４７６０８号）、２０〜 ４５℃（米国特許第４０３７６０９号・）および３０〜４０℃（米国特許第２０ ００８５５号）を使用している。

更に日本特許第７３／４９９９９号（ケミカル・アブストラクツ７９　：１２３ ９４２Ｘ）、トバコ・サイエンス１９７６年第８０頁〜第８２頁のニス・ニー・ ガーブリアルの「スタデイズ・オン・ザ・マイクロフロラ・オン・エアキュアー ド−バーレー暑トバコ」、Ｋｙ、Ａｇｒ、Ｅｘｐ、　Ｓｔａ。

Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ　Ａｎｎ、Ｒｅｐｏｒｔ　１９７３年第８６巻第２２頁のダ ヴリュ・オー◆アトキンソンの論文、トバコ・サイエンス１９７１年第１５巻第 ４１頁〜第４３頁のエイ・コイワイ等の論文、および米国特許第２．３１７７９ ２号には他の微生物を基にした醗酵および煙草の熟成記載されている。これらの 各方法も非高温微生物および低温醗酵条件、例えば２５〜５０℃（日本特許第７ ３７４９９９９号）、３０〜３５℃（ニス・ニー・ガーブリアル）および３０〜 ４０℃（エイ・コイワイ等）を使用している。

廃水中の窒素含有化合物の濃度を減少させるための生物学的方法も当業者に知ら れている。これらには例えば米国特許第３８２９３７７号および第４２２５４３ ０号を含む。

それらも非高温微生物および低温条件例えば１０〜５０℃（米国特許第３８２９ ３７７号）を使用している。それらも廃水に加えるべき炭素源例えばモラツセ（ 米国特許第４２２５４３０号）および０１〜Ｃ３炭化水素（米国特許第３８２９ ３７７号）を必要としている。

最後に煙草を１スイーチング」シたとき高温微生物の生長が生ずることが知られ ている。しか七、ながらかかる微生物は、煙草中の窒素含有化合物の含有量を減 少させるために使用されていなかった。それよりもむしろそれらは葉巻（６） 煙草の芳香およびおだやかさに悪影響を与えるとのみ発表されていた。かかる方 法には例えばアプライド・マイロバイオロジー１９６７年１月、第１５巻第１１ ７頁〜＠１１９頁のシー・エフ・イングリッシュ等の「インレイジョン・オン・ サーモフィルス・フロム・ブロードリーフ・トバコ・アンド・イフエクト・オン ・ピュア・カルチャー−イノキュレイジョン・オン・シガー・アロマ・アンド・ マイルドネス」の論文、およびＡ　ｄｕ　ｔａｂａｃ、　５ｅｃｔ、第２頁〜第 １６頁Ｂｅｒｇｅｒａｃ　Ｓ、　Ｅ、　Ｉ、　Ｔ、　Ａ　（１９７９年〜１９８ ０年）の「フレーストーレイジーサーミク・トリートメント・ストーレイン」に 提出されたビー・デュメリーおよびジエイ・ビー・アルボの１パーテイシペイシ ヨン・オン・マイクロオルガニズムス・イン・ザ・ファーメンティジョン・オン ・ダーク・トバコ」の論文を含む。

土壌および下水汚物を脱窒するための微生物も知られている。かかる方法は、例 えばエム・ベンツ・クリステンセンオヨヒビー・ハレメスのＰｒｏｇ、　Ｗａｔ 、　Ｔｅｃｈ、第８巻第５０９頁〜第５５５頁（］、　９７７年）の「バイオロ ジカル・デ；−トリフイケイション・オン・シューウイジ二ア・リタレイヂャー ・レヴユー」、ディー・ディー・ホヒトのソイル・サイエンス第１１８巻第１７ ３頁〜第１７９頁（１９７４年）の「ザ・イフエクト・オン・テムペラチャー、 ベーハー・アンド・エアレイジョン・オン・ザ・プロダクション・オン・ニドラ ウス・オキルイド・アンド・ガセアス・ナイトログ１ンーア・ゼロオーダー寺カ イネチック・モデル」；（７） ジエイ・エム・ブレムナー詔よびケイ・シャクのジャーナル・オン・アグリカル チュラル−サイエンス第５１巻＃ＩｒＩ４０頁〜第５２頁（）９５８年）の「デ ニトリフイケイション・イン・ソイル■、ファクターズ・アフエクテイング会デ ニトリフイケイション」；およびエッチ・ノミクのアクタ・アグリカルチャー・ スカンジナヴイ力第６巻第１９５頁〜第２２８頁（１，９５６年）の１インベス テイゲイシヨンズ・オン・デニトリフイケイション・イン・ソイル」に記載され ている。これらの文献には脱窒化に高温微生物を使用することは記載されていな い。更に硝酸塩減少の速度か醗酵温度の増大と共に増大することを報告している 論文は観察された速度増が生化学反応における標準温度効果に寄与し、新しい群 の微生物の活性化および生長ではない。そしてかかる温度依存速度増大が煙草醗 酵に観察されることの教示はない。

従って、これらの先行技術の方法は煙草材料中の窒素含有化合物の含有量を減少 させるための尚理法および高温微生物の使用をしていない。こｔｚらの従来法に は、煙草材料の窒素含有化合物を高温微生物で異化経路により高温で代謝できる こと、またはかかる細菌が煙草自体のミクロフロラから分離できることを教示し ているものはない。またこれらの従来法には、かかる異化代謝が添加剤の不存在 下に醗酵ブイヨンまたは煙草Ｒ二Ｆ＋るいは実質・的に非滅菌醗酵条件下に生じ うることを教示しているものはない。

（８） 本発明はこれらの全ての基準を満足させる。本発明は煙草材料中の一定の窒素含 有化合物の濃度を高温醗酵法で高温気生物の作用により減少させる。本発明は高 温微生物の嫌気性異化代謝経路により煙草材料中に存在することのある硝酸塩お よび他の窒素含有化合物の濃度を減少させる。

そして本発明は醗酵ブイヨンまたは煙草材料への添加物の必要なしに、かつ実質 的に無菌醗酵条件を維持することの必要または醗酵前の煙草の最終滅菌の必要な しにががる減少が得られるようにする。

以下の説明から明らかになるように、本発明の扁理法は、かかる嫌気性異化代謝 を促進するで７度でｐＨおよび他の条件を維持しながら、使用する実際の醗酵条 件下で、煙草の窒素含有化合物の嫌気性異化のできる少なくとも１種の高温微生 物と煙草材料を接触させることを特徴とする。以下の記載から、本発明の高温微 生物は好ましくは煙草の目新の微生物またはその一定の突然変異に属する高温微 生物の純粋培養または混合培養を含むことが判るであろう。

本発明の高温法および尚温微生物により、煙草材料中の一定の窒素含有化合物の 濃度は、醗酵ブイヨンまたは煙草材料への添加物の必要なしに、醗酵前の煙草の 最終滅菌の必要なしに、実質的に無菌醗酵条件を保つ必要なしに、また酸素を除 去するため不活性ガスで醗酵ブイヨンをスパーンングまた処理上−る必要なしに 減少さ゛ぜ−ることかできる。

従ってかかる高温法および高温微生物は、工業的に有効で経済的に効率的な方法 で、これらの生成物に非煙草化合物（９）！ｌｅＢ、ｆｆ５８−５０１５７３（ ４）の添加の可能性なしに煙中の窒素の酸化物およびおそらく他の酸化物の減少 した量を有する喫煙製品の製造を提供する。それらはまた同様に効率的で経済的 な方法で硝酸塩および他の窒素含有化合物の減少した量を有する他の煙草製品の 製造を提供する。

本発明は微生物的脱窒化によって炒草材料中の硝酸塩および他の窒素含有化合物 の濃度を減少させるための新規な方法および新規な微生物を提供する。本発明の 高温法および高温微生物は、嫌気性、異化的代謝経路により煙草材料中の硝酸塩 および他の窒素含有化合物の濃度の迅速がっ効率的な減少を提供する。この結果 は、ががる代謝を促進する程度でｐＨおよび他の条件を保ちながら使用する実際 の醗酵条件下、煙草材料中の硝酸塩および他の窒素含有化合物の嫌気性異化ので きる少なくとも１種の高温微生物と煙草材料を接触させる工程を特徴とする高温 法で達成される。

かかる方法および微生物での処理後煙草材料から作られた煙草製品は、硝酸塩お よび他の窒素含イ〕化合物の量が減少させられた。更にこれらの煙草材料がら作 られた喫煙製品は、喫煙時窒素の酸化物、およびおそらく他の酸化物の著しく低 下した量を与える。

概説すると、本発明方法は、かかる代謝を促進する嫌気性詔よび高温条件下で煙 草材料の脱窒化・のための嫌気性異化代謝経路により使用１．た実際の醗酵条件 下特徴ある少なくとも１種の高温微生物と煙草材料とを接触させる工程が（１０ ） らなり、これによってこれらの煙草材料中の硝酸塩および他の窒素含有材料の濃 度を効率的かつ経済的に減少させる。

本発明の実施に当って、使用する実際の醗酵条件下で、異化脱窒化として普通に 知られている一連の代謝工程により煙草材料中の硝酸塩を窒素ガスに還元する高 温微生物を使用する。この代謝経路による硝酸塩還元は以下に略示する ＮＯ３−→ＮＯ２−→ＮＯ→Ｎ、０→Ｎ２↑の一連の代表的な酵素反応によって 行なわれると信ぜられる。かかる方法は硝酸塩をアンモニアおよび蛋白質または バイオマスへの変換である同化脱窒化とは対照的である。

本発明の目的のため異化還元は、硝酸塩の代謝還元の最終生成物である窒素ガス が処理した煙草材料から完全かっ容易に除去できることから異化還元を選択する 。更に処理した煙草材料の主たる特性に潜在的に影響を与え、またはこれらの煙 草材料から作った煙草製品の特性に影響を与え、あるいはこれらの煙草材料から 作った喫煙製品によって作られる煙に影響を与えることのできる他の窒素含有代 謝生成物または他の化合物は本発明の方法または微生物によって要求されない。

本発明方法は、煙草材料に栄養素または補助剤を加える必要がなく、醗酵のｐＢ を微生物培地自体の作用に保たれ、煙草材料をそれらをその培地の接触させ−る 温度と実質的に同シ泥度で、即ち醗酵ブイヨンの冷却をする必要なしに微生物培 地に加え、醗酵ブイヨンの烈しい撹拌必要なしに、（１１） 微生物と接触させる前に煙草材料と最終滅菌または無菌醗酵条件を必要とせずに （何故なら煙草材料と高温微生物との間で接触のための嫌気性高温条件が他の微 生物の生長を阻止するから）、そして酸素を除去するため醗酵ブイヨンのスバー ジングまたは他の処理を必要としないことから有利に実施できる。

高温微生物は硝酸塩の異化性代謝のための代謝経路を有していさえすればよいの であるから、本発明方法において有用であるべきその基本単独について述べ得な いことを明瞭に理解すべきである。これは、幾つかの試験または生長媒体条件下 、例えば標準生物学的特性化試験で操作するかかる代謝経路を有しうる生物につ いてはそのとおりである。

むしろ、本発明の高温法において有用であるべきためには、ここに説明する実際 の高温、嫌気性条件下で、煙草材料中の硝酸塩および他の窒素含有化合物の異化 代謝を可能にする作用性代謝経路を＾湿゛薇生物が有していなければならない。

各種のかかる高温微生物は、ここに説明する個々の使用条件ド煙草材料の活性脱 窒化剤のためスクリーニングによって選択することができる。かかる後者の微生 物のみが本発明の範囲内に含まれることを理解すべきである。

かかる微生物は煙草自体であるのが好ましい。煙草材料からかかる微生物を分離 するため種々な方法が有用であるが、本発明で使用する一つの方法は、従来の方 法を使用して抽出煙草液の一部を作ることであった。次にこの液を０９ＭのＮａ Ｃ１溶液で稀釈し、軟質寒天（５３℃）と混合した。

（１２） 形成された混合物を栄養寒天培地上に塗り、３日間５５〜６０℃で培養させた。

５５〜６０℃で良く生長したコロニーを硝酸塩ブイヨン（１０Ｐ／１ＫＮＯ，） 寒天プ゛７−ト上に斜面培養し、再び５５〜６０℃で培養した。硝酸塩ブイヨン 上で生長したコロニーを分離し、ここｌこ説明する実際の醗酵条件下煙草材料を 脱窒化するそれらの能力に基づいて本発明方法で使用するために選択した。

別法として、本発明の方法に有用な混合培養物は、例えば再生煙草処理ライン中 の種々な場所から取った抽出された煙草液の代表試料を混合して作った。これら の混合物を次に抽出した煙草液または硝酸塩含有培地を混合物と接触させて高温 脱窒化活性を示す微生物の存在について分析した。かかる培地で生長したコロニ ーを次いでここで説明する実際の醗酵条件下煙草材料を脱窒するためのそれらの 能力に基づいて本発明方法において使用するため選択した。

かかる必要な活性を示す混合培養物の個々の微生物は、最初に述べた方法を用い または５５℃で煙草抽出物上で選択した混合物を単に培養し、各培養物を分離し 、ここに説明する醗酵条件下煙草材料の活性脱窒化剤であるこｔらの培養物を選 択することによっても単離できたことは勿論である。

本発明方法で有用であり、上述した方法の一つ以上で分離した微生物は、１９８ １年１０月１°日、付で、米国メリーランド州、ロックビルのアメリカン・タイ プ拳カルヂャー・コレクションに寄託された。そこでそれらは下記寄託番号が与 えられた。

培養物　ＰＭ　−１：　ＡＴＣＣ３１９７３陪養物　ＰＭ　−２：　ＡＴＣＣ３ １９７４培養物　ＰＭ　−３：　ＡＴＣＣ３１９７２培養物　ＰＭ　−４：　Ａ ＴＣＣ３１９７１力ルチヤーＰＭ−１は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクションでバチルス・スペシーズとして特徴づけられた。その形態学的および 生化学的特性を以下に示す。

生態学的特性 細胞は一つずつ発生し、鎖中で約３０〜４０μ×０．７〜０−８μであるダラム 変性非運動性杆状体である。内性胞子は初め観察されなかった。続いての分析で は内性胞子の存在か表われた。

栄養ブイヨンで貧弱な生長が見られた。寒天培地生長は薄い透明な分離したコロ ニーを生じ、これは集団中で半透明であった。コロニーは全体がなめらかで光っ ており、徐々に不透明になる。

生化学的特性 最高生長温度＝６０℃ リドマスミルク　変化なし 炭水化物酸生成 酸　ガス ラクトース　生長なし く１４） マニトール　生長なし ｐＨ６，０での生長　十 ＰＨ５，７での生長　十 クエン酸塩　− プロピオン酸塩　− アジドグルコース　士 卵黄反応　弱 澱粉加水分解　十 馬尿酸塩加水分解　− ゼラチン加水分解　−（悪い生長） カゼイン加水分解　−（悪い生長） 硝酸塩から亜硝酸塩へ　＋ 硝酸塩からＮ！へ　− フォーゲス−プロスカラエル　− メチレンブルー　生長せず ＮａＣ１１Ｑ％　− 培養物ＰＭ−２は４種の明らかに異なるコロニーの混合塔（１５） 養物としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションで特性指摘された。

コロニーの二つは生化学的および生態学的にもＰＭ−１と同じである。他の二つ のコロニーはバチルス・リケニフオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｏｈｅｎｉ ｆｏｒｍｉｓ　）の純量（ｂｉｏｔｙｐｅ　）である。それらは主としてそれら の空気耐性において異なる。それらの生態学的および生化学的特性は次のとおり であ゛る。

細胞はダラム陽性、運動性杆状体で、単独で約３．　ＯＸ　Ｏ，７μで生ずる。

卵形内性胞子が観察された。

栄養ブイヨン上で良好な生長が証明された。栄養寒天生長は曇った乾燥した純白 でない、平らなマット状の根株拡がりのコロニーを生じた。この菌株は嫌気性生 長を示したか、硝酸塩ブイヨンから嫌気的にガスを生じなかった。

生化学的特性 最高生長温度・・５５℃ リドマスミルク−７〜１４日で中性、ペプトン化、還元された。

炭水化物酸生成 酸　ガス （１６） ｐＨ６，０での′生長　十 ｐＨ５，７での生長　十 Ｎａアジド中での生長　− クエン酸塩　干 プロピオン酸塩　＋ アジドグルコース　− 卵黄反応　− 澱粉加水分解　十 馬尿酸塩加水分解　− ゼラチン加水分解　十 カゼイン加水分解　十 チロシン分解　− 力タラーゼ　＋ 硝酸塩から亜硝酸塩へ　＋ 硝酸塩からＮ２へ　− ジヒドロキシアセトン　士 インドール　− フォーケス−プロスカラエル　＋ メチレンブルー還元　十 メチレンブルー再酸化　− Ｍａｉｌ　５％士 ＮａＣ１７％　十 Ｍａｉｌ　ＩＱ％　＋ 細胞はダラム陽性、運動性杆状体で、単独に鎖状で生じ、３、ＯＸｏ、８μであ る。卵形末端および中央内性胞子が観察された。

良好な生長が栄養ブイヨンで証明され、栄養寒天生長は曇った乾燥した平らな根 株コロニーを生じた。幾つかのコロニーは粘液様で高凸状水泡を形成する。この 菌株は嫌気的に生長しなかった。

最高生長温度−５５℃ リドマスミルク−７日および１４日でアルカリ性、ベントン化、還元された。

炭水化物酸生成 酸　ガス ｐＨ６，０で生長　十 ｐＨ５，７で生長　十 クエン酸塩　十 プロピオン酸塩　弱 （１８） Ｎａアジド中での生長　− アジドゲルコール　− 卵黄反応　− 澱粉加水分解　士 馬尿酸塩加水分解　− ゼラチン加水分解　十 カゼイン加水分解　十 硝酸塩から亜硝酸塩へ　十 硝酸塩からＮ２へ　− ジヒドロキシアセトン　＋ インドール　− ７、ｔ−１’スープロスカウエル　＋ メチレンブルー還元　士 メチレンブルー再酸化　− ＮａＣ１ｌＱ％　＋ 培８物ＰＭ−３はバチルス・リケルフオルミスとしてアクリカン・タイプ・カル チャー・コレクションで特性指摘ＪＶた。その生態学的および生化学的特性を下 記に示す。

生態学的特性 細胞はダラム陽性、運動性杆状体で０８×３〜３．５μズあり、単独に（まれに 鎖状）生じ、丸い末端を有す。内セ（１９） 胞子は位置において末端近くにあり、形は卵形〜筒状である。２種のスロニーが 存在し、一つは曇った平らかつ不規則であり、一つは全体がなめらかで光ってい る。コロニーは色が白で不透明である。

生化学的特性 最高生長温度二５５℃ リドマスミルク−＋ 炭水化物酸生成 酸　ガス クエン酸塩　十 プロピオン酸塩　十 ゼラチン加水分解　十 トリプシン分解　− 栄養寒天での生長−ＰＨ６，０＋ シ　ジヒドロキシアセトン　＋ メチレンブルー還元　十 メチレンブルー再酸化　− ｐＨ５，７で生長　十 卵黄反応　− （２０） 澱粉加水分解　十 馬尿酸加水分解　− カゼイン加水分解　十 カタラーゼ　＋ 硝酸塩から亜硝酸塩へ　＋ 硝酸塩からＮ２へ　− インドール　− フォーゲス−ブロスカラエル　＋ ＮａＣ１５％　＋ Ｎａ（：ｌ　７％　＋ ＮａＣ１１Ｑ％　＋ 培養物ＰＭ−４はバチルス−シルカランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎ ｓ　）　（無胞子性菌株）としてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクショ ンで特性指摘された。その生態学的および生化学的特性を下記に示す。

生態学的特性 細胞はダラム陽性、運動性杆状体、０．５Ｘ３．Ｏμ、単独で生じ、丸い末端を 有する。内性胞子は観察されなかった。

コロニーはなめらかで光って＄す、半透明である、時間経過と共に中心凹部が現 われる。

生化学的特性 最高生長温度−４５℃ リドマスミルク−＋ 炭水化物酸生成 酸　ガス マンニトール　生長なし クエン酸塩　− 卵黄反応　− 澱粉加水分解　− プロピオン酸塩　− ゼラヂン加水分解　− トリプシン分解　− 栄養寒天での生長−ｐｉ（６，０＋ ジヒドロキシアセトン　− メチレンブルー還元　生長なし メチレンブルー再酸化　生長なし ｐＨ５，７での生長　子 馬尿酸加水分解　− カゼイン加水分解　生長なし カタラーゼ　＋ 硝酸塩から亜硝酸塩へ　十 硝酸塩からＮ、へ　− インドール　− （２２） フォーゲス−プロスカラエル　− ＮａＣｌ　１９％　− 再び生態学的特性または生化学的特性は、こここ示す醗酵条件下煙草材料を脱窒 化する微生物能力の予想もしくは示唆できえないことを強調しなければならない 。その代りに、これらの生態学的および生化学的特性は、他の微生物からそれを 区別するためおよび微生物を特性づけるための標準試験およびブイヨンを基にし た単なるマーカーである。

例えばＰＭ　−１，４種の混合培養物ＰＭ−２の何れか、ＰＭ−３、またはＰＭ −４は硝酸塩を賜に代謝するための能力をかかる標準試験で示したのはない。そ れでもなお本発明の方法の条件の下で、ＰＭ４、混合培養物ＰＭ−２、ＰＭ−３ およびＰＭ−４は煙草材料の嫌気性異化脱窒化に有用である。

勿論本発明は上述した微生物に専ら限られるものでないことも理解すべきである 。むしろ、ここに示す条件下で嫌気性異化代謝により煙草材料中の硝酸塩および 他の窒素含有化合物の濃度を減少さぜる能力によって特性づけられる他の高温微 生物が本発明の方法において有用である。かかる微生物には種々な他の源例えば 土壌からの微生物のみならず煙草の目新ミクロフロラに属するものも含む。それ らはまたここに示す条件下嫌気性異化代縮′により煙草材料中の硝酸塩および他 の窒素含有化合物の濃度を減少させる同様の能力を示す、これらのまたは他の微 生物の突然変異ま（２３） たは起源的に工学的な微生物も含む。かかる微生物は上述した方法と同様の方法 で分離し、選択し特性づけることができる。

微生物が多くの代謝処理をする能力を有する場合、通常微生物を誘導処理するこ とが重要であり、これによって本発明方法によりそれらを使用する前に、ここに 示す条件の下で煙草材料中の硝酸塩の嫌気性異化代謝により良好に馴化または条 件調整される。従って本発明の高温微生物の選択した培養物に誘導処理を受けら れることか必要であり、この間にその酵素系がかかる嫌気性異化脱窒化により良 好に適用される微生物の蓄積か得られる。ここに［条件調整された微生物」とは 、かかる作用を有する酵素系によって特性づけられ、ここに示した条件の下で煙 草材料の嫌気性異化脱窒化により良く馴化される微生物を意味するものとする。

誘導処理は制御された条件の下で微生物の生長および維持によって行なうことが できる。例えば好ましくは水性煙桿−抽出物から誘導された、硝酸塩−窒素を含 有するブイヨンを、上述した如くして分離し選択した脱窒性高湿微生物の培養物 で接種するとよい。通常ブイヨンは支持体に対し、少なくとも１０Ｆ、更に好ま しくは少なくとも約１００Ｆ（そして好ましくは１４００ｐよりは多くなく）の 硝酸塩−窒素含有率を有すべきであり、接種物蓄・積の所望量を達成すべきであ る。しかしながら約１００００Ｆより大なる硝酸塩−窒素の濃度を、本発明の高 温微生物に悪影響を与え（２４） ることなく、本発明の方法における煙草の脱窒化に馴化させた細胞によって使用 した。勿論、かかる高濃度は初期誘導には好ましくないことを理解すべきである 。通常接種された培養物はブイヨンの容積の約１０％、より好ましくは１０〜３ ０％とすべきである。

誘導中炭素源、硝酸塩、リン酸塩、アンモニウム塩および金属塩の如き添加剤を 使用してもよいが、本発明の方法においては、誘導が追加された媒体中でもたら されるとき作用できる誘導抑圧統制機構を避けるため誘導のための追加添加剤を 用いずに抽出した煙草液口体を使用するのが好ましい。例えばかかる好ましい実 施態様において、初期培養物は、硝酸塩を含有する蛋白質含有培地、例えば無菌 イースト抽出物、硝酸塩ブイヨン、脳心臓浸出液、栄養ブイヨン、トリグリコレ ートブイヨン、トリプチケース大豆ブイヨンまたは任意の市場で入手しうるブイ ヨン中に本発明の１種以上の４５温微生物のコロニーを接種することによって作 る。次いでコロニーを５０℃で増殖させて本発明によるかかる微生物の初期中間 燦期相培養物（１ｎｉｔｉａｌ　ｍｉｄ−１ｏｇｃｕｌｔｕｒｅ　）を作る。次 に抽出した煙草液を培養物に連続的に供給してそれを煙草抽出物に馴化させ、条 件調節した微生物を作る。

最も好ましくは、誘導は次のとおりに行なう。抽出した煙草液のＰＨ（１４７％ 酵器中で）をＮａ（ＪＨまたはＫＯＨの如き塩基を添加して７．２に規制して抽 出した煙草液の１０％溶液（そして９０％は飲料水）を作る、このｐＨは多分稀 釈さしない。次いで液は最も好ましくは３０分間９０℃で低温殺菌する。液の温 度を５０℃に調整した後、上述した如く作った本発明の少なくとも１種の高温微 生物の中間対数期相培養物（上述した液容量の１％以下）を撹拌（５０〜１００ 　ｒｐ＋ｎ　）　しつつ稀釈した液に加えた。稀釈した液−１％培養物のｐＨが 上昇し始めた後（約１６時間）、ｐＨを〜７．２で保つに充分な速度で６０℃で 抽出した煙草液を培養物に加え、オーバフローを５０℃で保った第二醗酵器に集 めた。数時間後、第二醗酵器中に約１０１のオーバーフローを集めた。本発明の 条件調節した抽出した煙草液を含有する脱窒化した抽出した煙草液のこのオーバ ーフローは本発明の大規模脱窒化法のための接種物として使用できる。

本発明方法におル）で使用するための高温微生物の接種物を作るための最適条件 はある程度使用する特定微生物によって決ることは勿論理漣すべきである。例え ばＰＭ−１〜ＰＭ−４の培養物の場合、ブイヨンの初期ｐＨは５〜１０．　好ま しくは７〜８５とすべきであり、初期温度は４５〜６５℃とすべきで、５０〜５ ５℃の温度が好ましい、ブイヨンｔｌｌｌＪ約２０〜１００　ｒｐｒｎとすべき である。同様に煙草材料の嫌気性異化脱窒化への最適適応性を生ぜしめるのに要 する誘導期間は、硝酸塩と培養物の相対量、誘導条件および個々の微生物によっ て変化する。しか°しながら一般には８〜２４時間で充分である。

本発明方法は煙草の葉令体、カットまたはチップにした（２６） 煙草、再構成煙草、煙草の茎、ストリップ、粉末等およびこれらの組合せの如き 煙草材料を脱窒するのに使用できる。

ここで使用するとき、煙草および煙草材料は、生のまたはキュアしたまたは貯蔵 した煙草の如きあらゆる形の煙草を含むことを理解すべきである。更に本発明方 法によって脱窒された煙草材料を少なくとも一部に含む煙草製品は、全体を未処 理煙草材料を用いて作った製品と比較したとき硝酸塩および他の窒素含有化合物 の減少した濃度を示す。かかる煙草製品には喫煙または他の手段によって消費さ れる製品、例えば噛み煙草、嗅ぎ煙草等を含むことができる。

更にかかる煙草製品を燃焼によって消費するとき、それらは減少した窒素酸化物 送出量と多分一般に減少した酸化物送出量を示す。かかる後者の喫煙製品には例 えは葉巻、紙巻煙草、シカ−ロス等を含む。

本発明方法によれば、かかる煙草材料は通常の任意の方法で本発明の高温微生物 と接触させることができる。例えば水性煙草抽出物の場合、連続法、バッチ法を 使用して良好な効果を得ることかできる。また固体煙草材料の場合、醗酵、スイ ーチングおよびキュアリングが有用である。

本発明の実施に当って、本発明の微生物と接触させるための煙草材料は従来の方 法を用いて作られる。例えは煙草材料を水性溶液と接触させ、硝酸塩を含む可溶 性成分を抽出するとよい。接触時間は水対煙草比お°よび水性溶液の温度によっ て決る。水溶液と接触させて作られた水性抽出物は通常の固体−液体分離法を用 いて、不溶性繊維状煙草残（２７） 渣から分離する。例えば絞り、遠心分離および沖過法を使用できる。必要ならば 次に分離した煙草抽出物は可溶性固体および／または硝酸塩含有量を調整するた め処理してもよい。しかしながら一般には本発明によれば約２１％以下の可溶性 固体および約１００００Ｐ以下の硝酸塩−窒素を含有する抽出物を処理できる。

勿論本発明の微生物と接触させるため煙草材料を作る別の方法も使用しうろこと は理解すべきである。これらには例えば本発明方法においてそれらを接触する前 に約５％〜約４０％の固体濃度、好ましくは約５〜２０％の固体濃度を有するス ラリーを形成するため水中に煙草材料を懸濁させることを含む。あるいは固体煙 草材料の場合、本発明の微生物の生長を可能にするに充分な水含有率を与えるた め通常の噴霧法を用いて煙草を作ることかできる。

本発明方法においては、本発明方法を開始する前に煙草材料の最終的滅菌または 実質的に無菌状態での操作は必要ない。事実、実質的に非無菌条件を使用しうろ こと、例えば煙草材料の最終滅菌をしないことおよび醗酵のため開放タンクを使 用することは本発明の方法および微生物の利点である。しかしながら連続流動系 においては、水性煙草抽出物を先ず３０分間９０℃で低温殺菌（非最終滅菌）す るとより安定した流速が維持できる。この処理は約１０”細胞／−から１０３〜 １０’細胞／ゴまで汚染軸°胞繁を減少さぜる。

異化脱窒化を含む醗酵中域圧の適用はある場合には脱窒化速度を改良することを 示した。これは減圧の適用の結果（２８） として系からの窒素ガスのより急速な拡散とそれらの移動に少なくとも一部原因 があると信ぜられる。従って本発明方法の実施中、醗酵容器に減圧を有効に保つ とよい。

減圧を生せしめるため任意の通常の手段を使用できる。

醗酵中和用する減圧度は一部含有された微生物の生長動力学および負の圧力下代 謝脱窒化法に要求される逐次酵素系を生ぜしめる微生物の能力によって決る。例 えば充分に高い減圧度では、微生物的機能は悪影響を受ける。一定の微生物に対 しこれが生ずる正確な程度は当業者の実験によって経験的に決定できる。更に高 減圧下で生じつる潜在流体過沸とう効果および脱窒化される煙草材料の粘度も系 に適用しうる減圧度を制限する。一般に約５　Ｑ　Ｑ　ｍｍＨｇ以下の範囲の減 圧が微生物に悪影響を与えることなく脱窒化を容易にすることか判った。低粘度 の溶液を用いるとき、圧力は一般に約５　Ｑ　ａ＋ａ＋Ｈｇ〜約２００　Ｉｏｍ Ｈｇの範囲で保つべきであり、一方高粘度例えば約５００センチポイズ以上の粘 度の溶液では約１５　Ｑ　ｍｍＨｇ〜約５　Ｑ　Ｑ　ｍｍＨｇの範囲の減が許容 できる。

煙草材料の脱窒化のための接種物の細胞濃度およびその接種物の相対容量はある 程度まで判断事項であるが１本発明方法においては約１０’〜１０１細胞／−を 有し、煙草材料の容量の約１０〜３０％の容量を有する接種物を使用するのが好 ましい。

接種物の製造を用いるとき、煙草材料の醗酵の最適条件は、使用する特定微生物 、煙草材料中の窒素含有化合物の量、接種物中の細胞の濃度、処理すべき煙草材 料の種類と接種物の相対容量によって決る。培養物ＰＭ−１〜ＰＭ−４に対して は、効率的な脱窒化は、４５〜６５℃好ましくは５０〜５５℃の温度、５〜１０ 、好ましくは７．０〜８．５のｐＨ。

および例えば通常の底プロペラ−または多段羽根車による撹拌で少なくとも水性 煙草液中で２０〜１００　ｒｐｍの撹拌によって達成される。

接種物への水性煙草抽出物の供給速度も使用する特定微生物、細胞量および細胞 数、抽出物の硝酸塩濃度およびその他の醗酵条件によって決る。しかしながら培 養物ＰＭ−１〜ＰＭ−４にとって、好ましくは４８〜５０℃で、固体約２１％以 下および硝酸塩−窒素含有率約１００００Ｐ以下を有０．１／ｈｒ）接種物に供 給することが連続法において好ましい。勿論稀釈速度はある程度硝酸塩濃度によ って決ることは理解すべきである。例えば９００ＯＦＦＩＮＯ３−Ｎで約０．０ ４／ｈｒの稀釈速度が有効であることが判った。

あるいは醗酵器仕込物のｐＨを検査し、約５〜１０のｐＨ好ましくは約７．０〜 ８，５を保つよう流速を調整する。これらの速度は醗酵器が一部になる時から始 まる実質的に脱窒化された抽出物の同じ量の除去をする。勿論フェトバッチ（ｆ ｅｄ−ｂａｔｃｈ　）法にはより早い速度を使用できる。好ましくはこれらの方 法における添加速度は醗酵仕込物のｐＨを監視し、約５〜１０．好ましくは約７ 〜８．５のｐｌ＋を保つよう流速を調整することによって決定する。あるいは供 給速度（３０） は醗酵器仕込物の硝酸塩含有率を監視することによって制御できる。供給完了し たとき、醗酵器の条件は、短時間実質的に完全な脱窒化を確実にするため保つべ きである、この時間は供給速度、培養物の細胞量および容量、硝酸塩濃度および 使用した特定微生物によって決る。

脱窒化中、醗酵仕込物中の溶解酸素含有量は硝酸塩の窒素ガスへの嫌気性異化還 元を生せしめるのに充分な低さとすべきである。典型的には０．５　Ｐ以下の溶 解酸素濃度が適切である。しかしながら最適には異化脱窒化を促進させるためで きる限り零（０）に近い濃度が更に望ましい。醗酵仕込物の初期酸素含有率は零 より大であってもよいが、その含有率は本発明の微生物自体によって、培養段階 の始めの部分で望ましい低濃度が達成されるよう急速に減少する。典型的にはか かる酸素含有率減少は醗酵開始後３０分以内に完了する。本発明方法の実施中、 同じ機構で零に近い酸素濃度を保つことができる。脱気すべき容量に等しい流速 で１０分間窒素またはヘリウムの如き不活性ガスでのスバーシングか一般に約〇 −の溶解酸素にヤ」達させるのに有効である。しかしながらスバージングが必要 なく、本発明方法の操作中一般に使用しないことが本発明方法の利点である。

脱窒化に続き、本発明により処理した水性煙草抽出物は、例えば通常の煙草再構 成法を用いてシートに作った水不溶性または他の煙草材料と一緒にするとよ・い 。かかる再構成前に、必要によりまたは所望により処理した煙草材料は濃縮して もよい。次いで形成さｔた再構成煙草は各種喫城製（３１） 品に使用できる。かかる喫煙製品は燃焼中窒素酸化物の減少した送出詔よび他の 酸化物の減少した送出を示す。

本発明の方法および微生物による固体煙草材料の処理のため、使用する微生物は 煙草材料に接種物を噴霧して煙草材料に加えてもよく、あるいは固体煙草材料自 体に既に存在する微生物を使用してもよい。何れの場合においても煙草材料は微 生物の生長を支持するに充分な湿りを有していなければならない、かかる必要な 水含有量は当業者によって従来通りに決定できる。更に煙草材料のｐＨアよひ他 の特性は処理前または処理中に調整できる。ｒｔ後に炭素源は還元糖における低 さである固体煙草材料、例えばバーレー煙草茎の脱窒化速度を増大させるため加 えることかできる。

下記実施例は本発明の例示である。

実施例　１ 本実施例は水性煙草抽出物の脱窒化における本発明の方法右よび微生物の使用を 示す。

水性煙草抽出物を、６０分間９０℃で水対煙草比１０：１を使用して水でバーレ ー煙草ブレンドを抽出して作った。

かくして形成した抽出物を通常の方法で不溶性煙草残渣から分離した。必要なら ば稀釈または蒸発の如き通常の手段で抽出物の固体百分率および硝酸塩−窒素濃 度を所望の濃度Ｉこ調整した。煙草抽出物は約７５％の可溶性固体および約４０ ００１！’ｌの硝酸塩−窒素を含有し、・ｐＨ５，５を有していた。

この抽出した煙草液３７．８５／を５００１の醗酵器に入（３２） れ、そのｐＨをＫＯＨで７．２に調整した。液を３４１１の水道水を加えて１′ ｏ％濃度に稀釈し、１．５時間９０℃でこの稀釈した液を低温殺菌した。液を５ ０℃に冷却し、ゆっくりと撹拌（約５　ｒｐ＋ｌＩ）　ｌ、つつＰＭ−１の中間 対数期相培養物４１（液容量の１％）を加えた。後者の培養物は、シャイカ−フ ラスコ中に分散させた無菌トリプチケース大豆ブイヨン（硝酸カリウム１２／ｌ を含有）中に、トリプチケース大豆寒天の穿刺上で貯蔵したＰＭ−１の中間対数 期相培養物を接種し、接種したブイヨンを１２時間５０℃で振とうして作った。

接種後、醗酵仕込物の撹拌を続け、その温度は５０℃で保ち、そのｐＨを連続的 に監視した。約２４〜３６時間後にｐＨが上昇し始めた。その点からｐＨを、上 述した如く作り９０℃で３０分低温殺菌した抽出煙草液（４０００Ｆ　Ｎ−Ｎｏ 。

ｐＨ５，５）を加えて約７．２に保った。２〜３日約ｐＨ７，２および５０℃で 醗酵後、上述した如くして作り、３０分９０℃で低温殺菌した抽出煙草液を、約 Ｑ、　ｌ　／ｈｒの稀釈速度で醗酵器に供給し、オーバフローを貯蔵タンクに集 めた。

このオーバーフロー約１００６ａｌを集めた時、それを撹拌しつつ５０℃で保っ た５　００　ｇａｌタンクに流入し、上述した如くして作り、３０分９０℃で低 温殺菌した抽出煙草液をタンク中にＱ、　５　ｇａｌ　７分の速度で５０℃で供 給した。

タンクが一杯になったとき、本発明の方・法および微生物で脱窒化したその中に 含有された抽出煙草液は０デのＮ−ＮＯｓおよびＮ−Ｎｏ、含有率を示した（標 準比色定量分析による）。

（３３）　特衣昭５８−５０１５７３（１のこのとき５００　ｇａｌタンクの５ ０％を喫煙製品製造のため使用した。タンクが一杯になるまでＱ、　５　ｇａｌ 　７分の流速で煙草抽出物を加え、次いでタンクの５０％を流入する上記方法を 数週間何回も繰返し、実質的に同じ結果を得た。

上述した如くして脱窒化した煙草液の一つのバッチを更に喫煙製品を作るために 更に使用した。脱窒化した液を従来の方法を用いて処理し、煙草材料のブレンド からの繊維状残渣のシートに付与して再構成煙草を作った。次にその再構成した 煙草の一部を通常の煙草材料のブレンドと混合し、喫煙製品を作り、標準喫煙試 験で分析した。これらの試験の結果を表Ｉに示す。

混合培養物ＰＭ−２を用い追加の実験も行なった、この場合それぞれ４０００お よび２００ＯＦＦＩＮ０３−Ｎを有する煙草抽出物を脱窒化した。再構成煙草シ ートを作り、代表的な煙草ブレンドと混合した。ブレンドを用いて紙巻煙草を作 り、分析的に喫煙した。この結果も表■に示す。米国特許＠４１３１１１７号に より作った再構成煙草を含有する対照試料を比較のため分析的に喫煙した。それ ぞれの場合において、再構成煙草は全ブレンドの２０％または２７％とした。喫 煙した全ての紙巻煙草は同じ通常のフィルターをそれにとりつけた。

（３４） 対照−２０％　１６．２２０．５１．１４　９，８１３．６０，２４０，８２０ ．１４対照−２７％　１４．９１８．９１．０８　９．４１４．００．２５０， ８８０．１３ＰＭ−１（ａ）２Ｏ４％　’　１４，６　１８．２１．０Ｂ　１０ ，７１０．５０．１７　−　−−ＰＭ−１（ａ）２７％　１４．３　１７．６１ ．０６１１．２１２．００．１８　−　−ＰＭ−メ）２ｏ％１４，０　１７．５ １．００１０．３１１．５０．１８０，７９０．１０ｐｕ−＞ａ）２７％１２， ０　１５．９０．９’７　９．９１ｏ、ｓ　Ｏ，１５０，８１ｏ、ｏｓＰＭ−メ ”９２０％　１６，３２０．５　＋、１ａ　１０．３１３．１０．２００，８９ ０．１３ＰＭ−メ”２７％　１４，２　１８．０１．１０　９，６１３．１０． １６０，８８０．１２（ａ）４００ＯＦＦＩＮ０３−Ｎを用イエ出発１１ニーｍ 草抽出物１（ｂ）２０００ＦＮ０３−Ｎを用いて出発した煙草抽出物；上記デー タから、本発明の方法および微生物特に好ましい微生物ＰＭ　−１は煙草材料中 の窒素含有化合物および他のＣＯの如き酸化物の濃度を減少させるのに有用であ ることが明らかである。これらの減少は、１回の吹き込みについてのかかる化合 物の濃度を比較したときさらに明瞭になっている。

本実施例は本発明の高温微生物の突然変異体を作り、選択し本発明方法で煙草材 料の脱窒化にこれらの突然変異体を用いた本発明による一具体例を示す。

１４Ｉ！の醗酵器（醗酵器＋　１　）　ニ１０　ｆ／ｌ（Ｄ　ＫＮＯａヲ補給し た１０１！のトリプチケース大豆ブイヨンを仕込んだ（（３５） ｐＨ７，８）。仕込物を殺菌し、温度を５５℃に調整し、１００ｒｐ預の撹拌を した。

前述した如くして作った抽出した煙草液（ｐＨ５，９６゜１４４４　Ｆ　Ｎ０ｘ −Ｎ）をｐＨ７゜０に調整し、６０℃に加熱し、その温度で保った。次に醗酵器 す１に５−７分の速度でそれを供給した。この供給を２４時間保ち、オーバーフ ローを集め、５５℃で貯蔵した。

次に醗酵器す１からのオーバーフロー１００−を１０００−フラスコ中の無菌ト リプチケース大豆ブイヨン５００ｄと混合し、５ｆｎｇのニトロソグアニジン（ 突然変異誘導剤）を加え、振とうせずに混合物を５５°Ｃで４時間放置した。

次に１２のＫＮＯ２を加え、混合物を、１４１！の醗酵器（醗酵器す２）中で１ ０ｙのＫＮＯ□を補給した１０／の無菌トリブチケース大豆ブイヨンと一緒にし た。

４時間後醗酵器す２の内容物を、５５℃で保った別の醗酵器（醗酵器す３）中に １５ゴ／分の速度で供給した。同時に上述した如く作り、ｐＨを７．０に調整し た抽出煙草液も醗酵器４３中１こ２０ｍ１７分で供給した。これらの−緒した供 給を２４時間継続した。各６時間毎に別の突然変異誘導した培養物を上述した如 く作り、１０１のトリプチケース大豆ブイヨンと混合し、１０ｙのＫＮＯ□を補 った後、その培養物を醗酵器す２に加えた。醗酵器す３からのオーバーフローを 集め５５℃で保った。

２４時間後、嫌気性高温条件下で抽出した煙草液中でよく生長した突然変異ｌｉ １！導された微生物の混合培養物をここ（３６） で含有する醗酵器す３への供給を調整した。このとき醗酵器す３へ５０−７分の 抽出煙草液（ｐＨ５，９６、１４４４ＰＮｏ、−Ｎ）を加え、醗酵器す３からの オーバーフローを１５−７分で醗酵器す３に再循環させた。下記データが得られ た。

初期測定値 ｐＨ５，９６７，９６７，７１ ＮＯ，−Ｎ（Ｆ）　１４４４　０　Ｏ Ｎｏ、−ＰＩ（Ｆ）　０　０　０ ＮＨ３（Ｆ）　５０７　２２１０　１８３１３時間 ｐＨ５，３６７，９７，７ Ｎｏ３−Ｎ（Ｆ）　１５０７　０　Ｏ ＮＯ□−Ｎ（ＦＦＩ）　０　０　０ Ｎｏ３−Ｎ（Ｆ）　１５８７　０　Ｏ Ｎｏ、Ｎ（ｐｐ＠）　０　０　６３ ＮＨｚ（Ｐ）　５１０　１４４８　１３７２ＮＯ３−Ｎ（ＦＦ”）　１５８７　 ０　０ＮＯ２−Ｎ（に）　０　０　０ Ｎｉ１３（Ｆ）　５１０　１４４８　１３７２２８時間 ｐＨ５，２５７，６６７，４８ ＮＯｘ−Ｎ（Ｆ）　１７００　０　Ｏ ＮＯ□−Ｎ（ＦＦＩ）　０　０　０ ＮＨｓ（Ｆ）　６００　１５７６　３０８（３８） 実施例　３ 本実施例は固体煙草材料の脱窒化における本発明の方法および微生物の使用を示 す。

１．９９％のＮｏ、Ｎを含有する滅菌してないバーレー煙草茎１卸を通常の方法 で作り、室温で４００　ｄＨ，Ｏを噴霧した。

２時間放置後、煙草を再び４００７！のＨ，Ｏで噴霧し、更に２時間放置後、室 温で７７１−のＨ２Ｏで最後の噴霧をした。

噴霧した煙草の茎を次いで７２時間５０℃で保温した。形成された茎はこのとき 減少した硝酸塩濃度（１，５１％Ｎｏ３−Ｎ）を有していた。水の代りに５％グ ルコース溶液を用いて上記方法を繰返したとき、１．４０％Ｎｏ、−Ｈの硝酸塩 濃度を有する煙草材料を提供した。このことは、本発明の方法において、（還元 糖における低さである）固体バーレー煙草茎の処理には必要ないのであるか、炭 素源が、これらの煙草茎における脱窒化の速度を増大するのに有効に使用しうろ ことを教示している。

１２日間培養後煙草材料を１％グルコース溶液１０〇−で噴霧し、次いで更に２ 日間培養した点以外は上述した方法と類似した方法で、本発明方法で５００２の バーレー煙草茎を処理した。下記の結果が観察された。

Ｑｈｒ　２．３２ ７２ｈｒ　１，９０ １２日　１．７０ １４日　１．５６ （３９） 本発明の多数の具体例を以上示したが、本発明の基本的構成は本発明の方法を利 用する他の具体例を与えるため変更しうることは明らかである。従って本発明は 実施例によって上述した特定例よりもむしろ請求の範囲で本発明の範囲が規定さ れるべきであることは認められるであろう。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ！１代謝を促進する嫌気性および高温条件下、煙草材料の脱窒化のための嫌気性 異化代謝経路によって特性指摘される少なくとも１種の高温微生物と煙草材料を 接触させる工程を含む煙草材料の脱窒化方法。 ２　上記煙草材料を全体が煙草葉、カットまたはチップにした煙草、再構成煙草 、煙草茎、細断物、粉末およびこれらの組合せからなる群から選択する請求の範 囲第１項記載の方法。 ３　上記煙草材料を先ず水で抽出して約１ＯＦＦＩから約１００００Ｐ以上まで の硝酸塩−窒素含有率を有する水性煙草抽出物を作り、上記抽出物を上記微生物 と接触させる請求の範囲第１項または第２項記載の方法。 ４　上記煙草材料を先ず水中に懸濁して約５〜約４０重量％の濃度を有するスラ リーを形成させ、上記スラリーを次いで上記微生物と接触させる請求の範囲第１ 項または第２項記載の方法。 ５　上記煙草材料を水中に懸濁させて約５〜約２０重量％の濃度を有するスラリ ーを形成させ、上記スラリーを次し１で上記微生物と接触させる請求の範囲第４ 項記載の方法。 ６、上記煙草材料を先ず水で噴霧して上記微生物の生長のため充分な水を有する 煙草を形成させ、次いで上記煙草を上記微生物と接触させる請求の範囲第１°項 または第２項記載の方法。 ７、、に配水が約１〜約５％の炭素源も含有する請求の範囲（４１） ＠６項記載の方法。 ８、上記嫌気性＄よび間湿条件が約り５℃〜約６５℃の温度を含む請求の範囲第 １項記載の方法。 ９　上記嫌気性彰よび高温条件が約５〜約１０のｐＨを含む請求の範囲第１項記 載の方法。 １０、上記ｐＨか約７〜約８．５である請求の範囲第９項記載の方法。 １１、上記高温微生物を、通常の煙草材料のミクロフロラに属する高温微生物、 他の源からの高温微生物、発生的に工業的な高温微生物、かかる微生物の突然変 異体およびこれらの組合せからなる群から選択し、かかる微生物の全てかかかる 代謝を促進する嫌気性および高温条件下で煙草材料の脱窒化のための嫌気性異化 代謝経路によって特性指摘される請求の範囲第１項記載の方法。 １２　上記高温微生物を、ＰＭ、−１、ＰＭ−２，ＰＭ−３゜ＰＭ−４、バチル ス・シルカランスおよびバチルス吻すケニフオルミスの線型、それらの突然変異 体およびこれらの組合ゼからなる群から選択し、４−記純型および突然変異体は かかる代謝を促進する嫌気性および高温条件下で煙草材料の脱窒化のための嫌気 性異化代謝経路で特性指摘される請求の範囲＠１１項記載の方法。 １３　煙草材料の通常のミクロ７０うに属する高温微生物、他の源からの高温微 生物、発生的に丁巣′的な高温微生物、かかる微生物の突然変異体およびこれら の組合せからなる群から選択し、かかる微生物の全てが代謝を促進する嫌気（４ ２） 性および高温条件下に煙草材料の脱窒化のための嫌気性異化代謝経路によって特 性指摘された高温微生物。 １４、代謝を促進する嫌気性および高温条件下で煙草材料の脱窒化のための嫌気 性異化代謝経路によって特性指摘されるＰＭ−１、ＰＭ−２、ＰＭ−３，ＰＭ− ４、バチルス・シルカランスおよびバチルス・リケルフオルミスの純量、その突 然変異体および上記前れかの組合せからなる群から選択した請求の範囲第１３項 記載の高温微生物。 】５１代謝を促進する嫌気性および高温条件下で、煙草材料の脱窒化のための嫌 気性異化代謝経路によって特性指摘された少なくとも１種の高温微生物と煙草材 料を接触させる工程を含む方法によって作られた脱窒化された煙草材料の少なく とも一部を含む煙草製品。 １６、上記製品を紙巻煙草、葉巻、シガーロス、噛み煙草および嗅煙草からなる 群から選択する請求の範囲第１５項記載の煙草製品。