JPS585187A - 新規なプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えＤＩム枝術を工業微生物学及び遺伝学に応用する
ことが急速に発展している。組換えＤＩム技術の一部及
び−区分は外来ＤＭＡをベクターに挿入することであり
、これがとのＤｌｒムを有用な宿主中に導入し保持する
ことを可能にする。その様な宿主−ベクター系は大腸菌
（１ｓｏｈ＠ｒｉｏｈｉａ　ｃｏｌｉ　）、枯草菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　）、二：ｚ　−ａ
　＊ボラクラサ（Ｎｅｕｒｏａｐｏｒａ　ｃｒａａｓａ
　）及びサツカロンセスセレピシア（ａａＣＯｈ＆ｒＯ
ｆｆｉ７０＠＠　ｃ＠ｒ＠ｖｉｓｉａｓ　）について記
載されている［　Ｆ＠（１，Ｒ＠ｇ、　４５．６７２４
−６７４９、［ガイドラインズフオー　リサーチインポ
ルピング　リコンビナント　Ｄ１１Ｉムモレキュルス」
フレデリックノンディーニス　１９８０　）。ファージ
もプラスきドも多くの数のベクターがこれらの系で使用
する九めに開発されている。最近の化学及び特許文献は
ストにブトミセス属の種の中の２つの同様の系を記載し
ている〔ネイチャー　２８４　、５２６−５３１、抗生
物質生産ストレプ）（セス中の種間遺伝子運搬の丸めの
ＤＮＡクローン化系、ピツデスエム、ショツテルジエー
エル、及ヒコーエンエスエヌ　１９８０゜ネイチャー　
２８６．５２７〜５２９、ストレプト２セス中のＤＩム
クローニング＝ストレプト電セス　ファージ中に挿入さ
れ九１）ＢＲ３，２２からなる二官能性レプリコン、シ
ュレッジニーイー及びチャーターケーエフ　１９８０　
、　Ｊ、　Ｂａｃ、ｔｅｒｉｏｌ　。

■、３６０〜３６Ｂ、大腸−に由来する抗生物質抵抗性
遺伝子のストレプ）（セス　リビダス中に於けるクロー
ン化及び表現、ショツテルジエーエル、ビツブスエムジ
エー及びコーエンエヌ、シー１９８１　）。

プラスオドｐＯｃ　１は生物学的に純粋なストレプトミ
セス　フラディア　ＮＲＲＬ　１１４４３の培養基から
得ることが出来る。このプラスミドは１９８０年１０月
四日公開番号第２０４５２５３で公開の英国籍杵出願第
８００７０８０中に開示されている。

プラスオドｐＯｃ　１３は微生物ストレプト建省ス’７
５ディア（８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅａ　ｆｒａｄｉａｅ
　）　ＮＲＲＬ　１２４９４から得ることが出来る。こ
のプラスきドは適当な培地上に培養基を生育させ、菌糸
体を断裂させ、断裂した菌糸体を培養し培養基を適当な
時間の螢で収穫し、そして次に菌糸体を溶菌することに
よりＭＲＲＬ　１２４９４から得られる。その溶菌物か
ら本質的（純粋な］＞ＤＣ１３を単離できる。種々の制
限エンドヌクレアーゼに対するプラスミドｐＯｃ　１３
の感受性は容易な修飾を可能にし、多くの宿主ベクター
系への適合を可能にする。

プラスミドｐ［ｌｃ　１３はストレプトミセス　フラデ
ィア（８，ｆｒａｄｉａ　）のここでφ８１Ｐ１と命名
するアクチノファージのプロファージ状態である。従っ
てストレプト２セス　フラディアからのｐＵｃ１３ＤＮ
ムはプラスきドのキュアーされたストレプトきセス（８
ｔｒ＋ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　）及びきりｏ−ｖ−ノスボ
ラ（Ｍｉｃｒｏ−ｍｏｎｏｓｐｏｒａ　）宿主の原形質
をトランスフェクトするのに使用出来る。

プラスオドｐＤｃ　１３はＰＬＩＣＩ　Ｋ関連している
が幾つかのキー区域でこれは明確に異なっている。

ｐＵＣ１３ｔｆ　ｐＵｃ　１　（Ｄ　高イコピー数）変
異体（３〜５Ｘ）である点でｐｔｌｃ、　ｌとは異なっ
ている。ＰＴＪＣ１３の制限酵素開裂パターン及び分子
量はｐＵｃ　ｌのものと同じである。Ｉ＞ＵＣ１３はプ
ラスオドのキュアー（除去）された培養基に形質転換出
来、形質転換プレート（平板培養基）上に溶菌斑（プラ
ーク）を与えるが、一方ｐｕｃ　１は同様に形質転換さ
れたときに形質転換プレート上に膿＠（ポック）を与え
る。

従ってｐＵｃ　１３はｐＵｃ　１の遺伝的な変異体であ
る。

］＞ｔ）Ｃ１３を含有する菌株から得たφ８Ｆｌファー
ジのＤＮＡは線形で存在し、分子量（５５，７±１．８
）ｘｌＯ’の分子量を有し、これはｐＵＣ１３ＤＮＡよ
り約１０１大きい。φ８７ＩＤＮムの制限酵素開裂パタ
ーンはＰＩ］Ｃ１３のものと同じであるからプラスｆＰ
　　キュアーしキュアーしたストレプトはセス　フラデ
ィア原形質をｐＵＣ１３ＤＮＡで形質転換させるとφ８
７１を生成しｐＵＣ１３プラスｉドがφ８？１のプロフ
ァージ状態ている。加の粒子からの測定は次の通りであ
る。

願長９３．７±４，５ｎｍ％頒幅８６．９±３．２ｎｍ
１尾の長さ２５７．８±５．２ｎｍ、尾の幅８〜１０ｎ
鵬φｓｙ１は次の新規な性質を持つ。

ム、栄養要求マーカーを導入する能力 Ｂ、その宿主中でプラス（Ｐとじてを保持され、バクテ
リオファージの形で宿主から宿主へと容易に移される能
力 Ｃ０φ８Ｆｌのプロファージ状態であるｐＵｃ　１３　
ＤＮＡはプラスオド　キュアーされた菌株中に形質転換
され、プラーク（溶薗斑）形成の表現によって認識され
る。

Ｄ、φ８Ｆｌはストレプトミセス　リンコルネンシス、
ストレプトミセス　ニスピノサス、及びストレプトミセ
ス　コエリヵラーに感染性である。

φ８Ｆ１及びそのプロファージの１）［ｌＣ１３はスト
レプ）（セスと建りロモノスボアの神霊に貴重なりロー
ニング　ベクターでありかっ遺伝マツピン〆の道具であ
る。

微生物 ｐＯＣ１３はストレプト２セス　フラディア　ＮＲＲＬ
１２４９４から得られる。このものの生物学的に純粋な
培養基は米国イリノイ州ペオリアの米国農務省ノーザン
リージョナル　リサーチ　ラボラトリ−の永久保存収集
所から入手可能である。これは１９８１牛６月ｎ日に寄
託され九。

ｐＵＣ１３の特徴 分子量約５０．４１±２．６メガダルトン細胞当りコピ
ー数　３〜５ 制限エンドヌクレアーゼ感受性 １）ｔｌｃ　１３は制限エンドヌクレアーゼに対して次
の感受性を持っている。

制限エンドヌクレアーゼに対するプラスミド感受性開裂
位置　　　　　　　開裂位曾 酔　　素　　　ｐＯＣ１３酵　　素　　　ｐＵＣ１３Ｂ
ａｍＨＩ　　　＞１５　　　　　Ｈｌｎｄ［［２ＢａＯ
Ｒ工　　　ＯＫＰｎＩ　　　〉１５Ｐａｔ　Ｉ　　　〉
Ｉｇ　　　　　ｒｈｏ　Ｉ　　　〉１５ＸｂａＨ２８ｍ
ａｌ　　　＞１５ Ｂｇｌｌ　　　　５’　　　　　Ｂａ１ｌ　　　　７こ
れらの結果は過剰の制限酵素存在下でｐＵＣ１３のＤＩ
ム消化によって得られた。制限位置数は０．７又は１．
０嘔のいずれかのアガロースゲル中で分離可能な断片の
数から決定され友。

ストレプトミセス　フラディア（ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
＠５ｆｒａｄｉａｅ　）　ＮＲＲＬ　１２４９４は浸漬
好気的条件下の水性栄養培地中で生育出来る。この生物
は炭素源、例えば資化可能な炭水化物、及び窒素源、例
えば資化可能な１素化合物や蛋白質性物質を含有する栄
養培地中で生育出来る。好ましい炭素源にけグルコース
、黒ざとう、蔗糖、ダリセロール、澱粉、とうもろこし
澱粉、乳糖、デキストリン、糖蜜などが含まれる。好ま
しい窒素源にはコーンステイープリカー、酵母、自己消
化した醸造酵母と２ルクソリツド、大豆ｉ−ル、綿実ミ
ール、コーンオール、ンルクソリッド、カゼインの膵液
消化物、フィッシュオール、デイステイラーズソリッド
、動物ペプトン液、肉骨スクラップなどである。これら
の炭素及び窒素源の組合せを使用することが有利である
。微量金属例えば亜鉛、マグネシウム、マンガン、コバ
ルト、鉄などは水道水及び未精製成分を培地滅菌前に培
地成分に使用するから加え為必要がない。

接種し九培地は微生物の満足な生育に導く任意の温度で
培養することが出来る。例えば約１８°と（資）°Ｃの
間、好ましくは約２０”Ｃとγ°Ｃの間、で出、来る。

普通微生物の最適生育は約３ないし１５日内に得られる
。培地は普通生育サイクルの間じゆう酸性の１１である
。最終ｐＨけある程度ケよ存在するならばその緩衝液に
、を九ある程度は培地の初期ｐＨに依存する。

次の実施例は本発明の方法及び生成物を例示するもので
あるが、限定するものと解釈されるべきでない。他に記
さないときはすべての百分率は重量、溶媒混合物比率は
容量である。

実施例［生物学的に純粋なストレプ）＜セス７ラデイア
（８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｓｓ　ｆｒａｄｉａｅ　）ＮＲ
ＲＬ　１２４９４の培養基からのプラス７ドｐＬＩｃ　
３３の単離 ストレプトミセス　フラディア（８ｔｒｅｐｔｏｍｙｃ
ｓｓｆｒａｄｉａｓ　）　ＮＲＲＬ　１２４９４の生物
学的に純粋な培養基からの胞子を次の培地１０ｄ中に接
種する。培地はグルコースｌ悌、ペプトン０．４嘔、酵
母抽出物０．４チ、Ｍｇ日０＆、　７ＨｉＯＯ，０５憾
、ＫｎｌＰｏ、　０．２憾、及びに、ＨＰｏ、　０．４
９ｋを含有する。

培地ｔ５０１１ｊのエレンマイヤーフラスコで予め滅菌
しておく。接種後プラス；を３２”Ｃで約２４−３６時
間１００〜２５０　ｒｐｍで作動するガンプ又はプラｙ
ズウィック回転振とり機上で培養する。培養完了後、０
．５１Ｌｌの培養基を５０ｄエレンマイヤーフラスコ中
に０．５〜２．Ｏｓ　（ｗ／ｖ　）グリシンを含んでい
る上記培地１０−に移す。グリシンの添加は後に細胞溶
菌を促進する。培地のグリシン量は、目標音以後の細胞
溶菌を促進する仁とにおき慣用の調整法で変化させるこ
とが出来る。フラスコを次に更にスル３６時間諺°Ｃで
上の様にガンプ回転振とう機上で培養する。この培養の
後、菌糸体を低速遠心例えば６０００　Ｘ　１％１５分
、４°Ｃでプロスから分離し、そして−糸体ペレットか
ら上澄を傾斜で除く。

上澄を捨て、ペレットを等張緩漬液、例えば加９Ｇ　（
Ｗ／Ｖ　）蔗糖を含有するＴｍａ緩衝液（０，０３Ｍ）
リス（ヒドロキシメチル）７２ツメタン（トリス）、Ｑ
　、ＱＱ５　Ｍ　Ｉ！ｆＤＴム及び０．０５Ｍ　Ｎａｃ
ｔ　ｓ　ｐＨ−８，ｏ　）　ｔ、５ｌＩｊＫ再懸濁する
。次に同緩衝液中の０．３−の５■ｌ−リゾチーム及び
０．１５＋ｄの１ｗ９／−リボヌクレアーゼを加え混合
物を胛°Ｃで（９）分時々混合しながら培養する。次１
１Ｃ０，６ｍＶ）　０．２５　Ｍ　ＩＣＤＴＡ　（ｐＨ
−８，０）を加えこの混合物をＭでで１５分培養する。

次に５ｑ／ｄプロナーゼ０．３−を加えこの物を３７゛
Ｃで１０分間培養する。続いて菌体懸濁液をＴ１８緩衝
液中の２−サルコシル３．０１１１の添加で溶菌し、こ
の混合物をｎ″Ｃで加〜（９）分培養する。ｆ＃菌物は
次に針なし使い捨て注射器５０ｄを５〜１０回通して剪
断にかける。

粗製溶口吻は次に例えば塩化セシウム（好ましい）や硫
酸セシウムなどの塩及び割込染料のエチリウムノロ電ド
と混合して密度１．５５０の溶液を与える。この溶液を
１４５０００　ｘ　ｆで平衡まで遠心する（密度勾配平
衡遠心法）。共有結合で閉じられた環状のプラス２ドＤ
Ｉムは線状染色体ＤＩム及び線状プラス電ドＤＮムの強
い螢光バンドの下に淡い螢光バンドとして長波長紫外線
（３２０ｎ！１ｍ）照射丁で遠心チューブ中に見える。

共有結合で閉じられた環状プラスミドＤＭＡは、それを
密度勾配平衡物から除き、に容イソプロピルアルコール
で２回処理してエチジウムプ０（Ｐを抽出し、次に水相
を適当な緩衝液例えば０．１　ｘＢＢＣ緩衝液（０，０
１５Ｍ　Ｈｍ（４％０．００１５　Ｍ　ＭＩＬｉＣａＨ
ｓｏｖ２Ｈ電０　＋　ｌ”−７，４）に対して運針し本
質的ＫＭ眸なＰＵＣ１３を生成することにより特性決定
の丸めに調製される。

ｐＵＣ１３の特性決定の手順 ｐＵＣ１３の分子量の漿算は個々のＤＩム分子の電子顕
微鏡から得られ九。〔クラインシュイツト　ニー　　ケ
−（ｌｃｌｅｉｎｓｃｈｍｉｔｔ、ム、Ｌ　）　（１９
６８）核酸分子の電子顕微鏡に於けるモルイヤー技術。

狂「メソッドインエンザイモロジ」（エスピー　コ關ウ
ィック（８，Ｐ、　Ｃｏｌｏｗｉｃｋ　）及び１ヌ　オ
ー　カプラ７　（Ｎ、Ｏ，Ｋａｐｌａｎ　）編集）第１
２１巻３６１〜３７７頁。

アカデきツクプレスニュー曹−り〕。プラスｉＰ　ｐ［
７Ｃ１３は平均の外形長２５．７２±１．３２７ＩＩｌ
及び対応する分子量５０．４１±２．６０メがダルトン
を有することが、内部対照として分子量１０．３２　ｘ
　１０’を有するプラスミドＰＭＬ　３１を使用して見
出された。

ストレプトミセス　７ラデイア）ＪＲＲＬ　１２４９４
中のプラスンドＤＩムパーセントは培養基を〔メチル−
ｓＨ〕チ２ジンで標識し、粗製溶菌物を調製し、そして
ｓａｇ物試料を塩化セシウム臭化エチリウム密度勾配物
中で遠心することによって決定された。勾配物は分−化
され、同位体計数を行ない、そしてプ５スｉド　バンド
の放射能パーセントをプラスミドＤＭＡを定量するのに
使用してプラスはトコピー数を計算する〔ラドロフ　ア
ール（ＥｔａｄｌＯｆｆ　！１．）、バウアー　ダプリ
ュ（Ｂａｕｅｒ　Ｗ、　）及びピノダラドリエ−（ｖｉ
ｎｏｇｒａａ　Ｊ、）　１９６７　［閉ｆｌｌ　二重Ｄ
ＭＡ　４１１　出及び単一の染料浮揚密度法：ヘラ細胞
（Ｈｅ１ａ　Ｃｅ１ｌ　）中の閉環ＤＮムＪ　Ｐｒ０Ｏ
，Ｎａｔ、ムｃａｄ、　８ｃｉ、　ＵＳＡ　５７１５１
４−１５２０１゜ 制限酵素消化及びアガロースゲル 制限酵素は市販調製物としてミルズラボラトリー及びニ
ューイングランドバイオラぜズから得られ友。酵素消化
物は少なくとも２培過剰のエンドヌクレアーゼを使用し
て供給者により特定された条件に従い調製した。

ある実験ではプラス２ドＤＩムを１個よ）多いエンドヌ
クレアーゼで消化し友。これらの実験には２つの方法を
使用した。第１の方法ではプラス電ドＤＮムはより低い
イオン強度要求を有する酵素でまず消化し、次に＃！２
の酵素の等容の２×緩衝液の溢加彼より高いイオン強度
要求を有する酵素で消化した。第２の方法では一つの酵
素消化の制限断片をｌｌ１ｌ＃！用アガロースゲルから
タナ力及びワイスブラＡ　（Ｔａｎａｋａ　ａｎｄ　Ｗ
ｓｉｓｂｌｕｍ　）により記載された様に単離する〔タ
ナカ、ティー（Ｔａｎａｋａ、　？、　）及びワイスプ
ラム、ビー（Ｗ・１・ｂｌｕｍ、　Ｂ、　　）　１９７
５、試験管内に於けるコリシンＭＬ　−Ｒ因子複合プラ
スミドの組立：デオΦシリボ核酸増幅手段、Ｊ、Ｂａａ
−ｔｅｒｉｏｌ、　１２１３５４−３６２　）。単ｍさ
れ＊ｍｍ断片をエタノール沈澱で濃縮し、次に他の制限
酵素で消化する。二重消化実験を単一消化実験と比較し
、異常な制限パターンが得られないこと、即ち酵素によ
る非特異的ＤＮＡ−豐が消化混合物のイオン強度を変え
死後に起きないことを確かめた。

消化し九試料は０．７〜１１アがロースゲルにかけ、ゲ
ル高さ譚当りｌＯ〜１５　Ｖの一定印加電圧で２時間電
気泳動を行った〔シャープピーｘ　−（５ｈａｒｐ。

Ｐ、ム、）、サグデンジｘ、　−（８ｗｇｄｅｎ、　Ｊ
　）及びサンプルツクリｘ　−（８ｗｍｂｒｏｏｋ、　
Ｊ　）　１９７３、インフルｘｙザ＠　（Ｈａｓｍｏｐ
ｈｉｌｕｇ　ｐａｒａｌｎｆｌｕｅｎｉｇａ・）中の２
つの制限エンドヌクレアーゼ活性の分析用アガロース−
エチジウムブロマイド電気泳動を使用する検出。バイオ
ケ建ストリー１２巻３０５５−３０６３　〕。

制限フラグメントの分子量は酵素ｌｅａ　Ｒ工で消化し
九バクテリオファージラムダＤＮムの標準移動パターン
と比較して決定した〔ヘリングアール　ピー（Ｈａｉｌ
ｉｎｇ　Ｒ，Ｂ、）、グッドマンエイチ　：ｃ　Ａ　（
Ｇｏｏ（１−ｍａｎ、　１１０Ｍ、）及びポイヤーエイ
チダブリｚ　（ＢＯｙｅｒ。

ｎ０ｗ、　）　１９７４゜アガロースｌルミ気泳動によ
るラムドイド　バクテリオファージ及び他のビールスか
一うのエンドヌクレアーゼＲ，ＷＱＯＲＸ　ＤＩム断片
の分析。

Ｊ、ＶｉｒＯＩＯｇ７１４１２３５−１２４４　〕。

方法 実施例ＩＫ記載め様にして得九プラスｔｒ　　プロファ
ージ　ＤＮＡ　ｐＴ］Ｃ１３はプラス２ドをキュアーし
九ストレプトずセス宿主の原形質をトランスフェクトす
るのに使用する。ζζで使用の「プラスミドをキュアー
した」という用語はプラスミドを有さないか又はプラス
ミドが存在して奄トランスフエクシ冒ンにそれが干渉し
ないことを意味する。

宿主例えばプラスミドｐＵｃ　ｌを含有する８、７ラデ
イアをキュアーする標準方法はこの微生物を２ｍｌ／−
のノボビオシンを含有する８−培地〔オカニシエム、ス
ズキケー、及びウメザワ　エイチ、１９７４、ストレプ
ト２セテ原形質の形成及び逆転：培養基条件及び形態研
究、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ、８０．３８９−
４００１中で３２”Ｃで２〜３日生育させることである
。この培養基を次に単一のプラスミドのキュアーされた
コロニーを得るためにプレー）Ｋ出す。

トランスフェクション用原形貧は次の様に生育菌糸から
つくることが出来る。胞子を８−培地に接種し、（°Ｃ
で冴−胡時間生育させる。この培養基を均質化して１．
０噂のグリシンを含有する新しいＢ−培地の培養基に接
種するのに使用する。グリシｙ補充培養基を更に２４−
４８時間ジｃで生育させ、３０００　ｘ　ｆで遠心分離
するととＫより、収穫し、０．３Ｍショ糖で１度洗い、
０．３　Ｍショ糖中に再懸濁させる。この懸濁液をδ〜
Ｉ分プロンソン　モデル２２０超音波水浴中で超音波処
理し、３０００　ｘ　ｆでペレット化し、ペレットを５
１９７ｄのリゾチームを含むＰ−培地〔オヵニシェム、
スズキヶー及びウメザワ　エイチ１９７４、ストレプト
２セテ原形質の形成と逆転：培養基条件と形態研究、Ｊ
、　Ｇｅｎ。

ＭｉＯｒＯｂｉｏｌ、　ｓｏ　　３８９−４００１中に
再懸濁させる。菌糸体とリゾチームをＭ″Ｃで原形質が
放たれるまで培養する。−糸体の残骸を原形質懸濁液か
ら滅菌綿栓を通する過により除く。残留リゾチームを２
回、プロトプラストをペレット化させてこれらをＰ−培
地で洗うことにより除く、最後に原形質をＰ−培地に再
Ｓ濁させる。

原形質のトランスフェクションは次の様にして行いうる
。およそ２Ｘ１０″′のプロトプラストラ１０００×ｔ
で７分遠心分離させることによ抄ペレット化させる。上
澄を除き、原形質を、ペレットと共に残っている最少容
量の緩衝液中に穏やかに再懸濁させる。原形質の各分割
したものに２ＤｓＬの滅菌ＴＩ緩衝液（１０ｍＭ）すｘ
　Ｈ（４１ｍＭ　ＩＤＴム、１）Ｈ８，０）（’）種々
量のｐＵｃ　１３　ＤＮＡを含有しているものを穏やか
に混合しながら加える。０．５−の種々の濃度の、Ｐ培
地中のポリエチレングリコール１００Ｇを加え、続いて
１分後等容量の１）ｌｔＧ　１０００溶液最初の濃度の
半分で、そして更に３分俵４−のＰ培地を加える。

懸濁液を０．３　ｄのＰ−培地中に再懸濁する。０．１
１の懸濁液に、１４のグルコース及び１嘔ノ酔母抽出液
を含有しているＲ２培地〔オヵニシエムスズキヶー、及
びウメザヮ　エイチ、１９７４上記〕上を、２Ｘ１０’
のプラスミドのキュアーされた１１株の胞子と共に榎わ
せる。平板培養基を３２”（１”で培養する。

実施例３ 他のストレプトミセス　プロファージヲ、実施例２に開
示の手順を使用して、他のストレプ）１セスプラスｊ）
”ＤＮＡでプラスイドのキュアーされた菌株の原形質を
形質転換することにより検出することが出来る。形質転
換プレート上の溶菌床の存在はプラスきドがプロファー
ジであることを示している。

実施例４ 組換えた及び遺伝的にマークしたアクチノファージは実
施例２でプラスミドプロファージ　ＤＮＡを上配組換え
プラス２ドブロフアージ　ＤＮＡ　４Ｃ代えることＫよ
ってストレプトミセスの種の中で組換えプラス２ドブロ
フアーＪ）　　ＤＮＡをトランスフエクシ望ンさせるこ
とによって得ることが出来る。

この方法例示はｐＵＣ１３を４９．５　ｘ　１０’及び
０．５ｘｌＯ’ダルトンの片をエンドヌクレアーゼＨ１
ｎａ　ｍで切断することである。感染活性に対して本質
的でないと決定されている小さな断片は組換えプラス２
ドを与えるために＃陣することが出来、これは適当な宿
主微生物、例えば原子核生物又は低級真核生物中でＤＮ
Ａをクローン化するためのベクターとして使用すること
が出来る。例えばグルコース　イソメラーゼ遺伝子など
の外来ＤＮＡはｐＵｃ　１３のこの鍔導体の単−Ｈ１ｎ
ｄ１［位置にクローン化することが出来る。同様な方法
で、ＰＵＣ１３の様に自律的に複製するプラスイドとし
て存在する他のアクチノンセテのプロファージは宿主−
ベクター系でベクターとして使用することが出来る。

実施例５ 実施例♀でプラス２ドブロフアーリ　ｐＵｃ　１３　ｆ
他のストレプトきセスプラスミドプロファージＤＮＡで
置換えることによってアクチノファージが得られる。ア
クチノファージは「致死接合囃殖」又は溶−斑形成の表
現型によって＜１Ｏ−９の頻度でプラスイドのキュアー
され九宿主個体群中Ｋｉｌ鐵される。

実施例６　　土壌試料からのストレプトミセス中プラス
ミド　プロファージを含有す る菌株の単離及び展開方法 この方法は次の手順を含んでいる。

（１）ストレプトｉセスの非溶原菌株を種々の土壌試料
と共Ｋｓ−培地の様な富んだ培地中で２〜３日間生育さ
せる。培養基の膜ろ過の後、ろ液を希釈しプラスきドの
キュアーされた１株の胞子と共にファージ溶菌床形成の
活性に対して試験する。

（２）ｍ原菌味を溶菌床の中心から単離し、精製し、致
死的な接合生殖を生じる能力又は非溶原曹株に対して溶
菌斑表現形について試験する。

（３）致死的な接合〜殖又は溶菌床を生じる菌株をプラ
スミドの存在について試験する。

ここに記載の仕事はＮ工■ガイドライン中に特定された
物理的及び生物的封じ込め要求に合致させてすべて行な
われたものである。

出願人　　ジ　アラデジ冒ン　カンノ譬ニー代理人　、
、１１ヶ９４．オ□ｆ′−を１　　　１ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、寄託所入手番号ＮＲＲＬ　１２４９４を有す、るス
   トレプト電セス　フラディア（１）ＵＣ１３）。 ２、次の特性を有する本質的に純粋なプラスミドプロ７
   アージ　ｐＵＣ１３ （亀）分子量５０．４±２．６メガダルトン（ｂｌ　　
   ｆｉ胞当たり３〜５のコピー数（０）　　制限エンドヌ
   クレアーゼ感受性が以下の通り 酵素　　１）ＵＣ１３酵素　　ＴｌＵＣｌ３和ミＭ１　
   　　ン１５　　　　肋匹■２１ａｏＲ１ＯショＩ　　　
   ン１５ 加Ｉ　　　≧１８　　　　狂■　　　ン１５Ｌ逓■　　
   　　２　　　想鋸■　　　ン１５ＢＩＥＩＩＩ　　　　
   　５　　　　　脇Ｉ７そして （（Ｌ）　　プラスｉＰがキュアーされたストレプトは
   セス培養基に形質転換され九ときに形質転換平板培養基
   上に溶曹斑を与える仁と。 ３、次の特性を有するφａｙｌと命名されるＰＵＣ１３
   から得られるアクチノファージ （ａ）　　ＩＩ形 （ｂ）　　分子量５５．７士１．ｓ　ｘ　１ｏ（（ａｔ
   　　ｐＵＣｓ３のものと同じ制限酵素開裂パターン （（１１以下の測定値の多面体の頭と末端構造を有する
   長い尾を有すること、 頭の長さ　　　９３．７±４．５ｎｍ 頼　　幅　　　　　　８６．９±３．２　ｎｍ縄の長さ
   　　２５７．８±５．２　ｎｍ縄の＠　　　　８〜ＩＱ
   　ｎｍ （ｅｌ　　栄養要求マーカーを導入する能力、及び （ｆ）　　プラスｉＹとして宿主中に保持され、容易に
   宿主から宿主へとバクテリオファーリとして移動する能
   力。 ４、プラスミドプロファージ　ＤＩムでプラス２ドの中
   ニア−されたストレプトオセス宿主の原形質をトランス
   フェクションすることからなるアクチノファージを製造
   する方法。 ５、上記プラスミドのキュアーされたストレプトミセス
   がストレプト２セス　フラディアであり、上記プラスミ
   ドプロ７アージ　ＤＮＡがｐＵＣ１３である特許請求の
   範囲第４項に従う方法。 ６、組換えプラスミドプロファージ　ＤＮＡでプラスミ
   ドのキュアーされたストレプトミセス宿主の原形質をト
   ランスフェクトすることからなる組換え及び遺伝的にマ
   ークされたアクチノファージの製造方法。 ７、上記組換えプラスミドプロファージ　ＤＮＡがｐＯ
   ｃ　１３から０．５　Ｘ　ＩＱ’　Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片
   を削除し、外来ＤＭＡ　ｌ　ｐｏｃ　ｔ３の網健突然変
   異体の残りの単−Ｈ１ｎａｍ位置中にクローン化させる
   ことによって構成される特許請求の範囲第６項の方法。 ８、　　Ｅ）ＵＣｌ３から０．５　Ｘ　１０’　Ｈ１ｎ
   ｄＩＩ断片を削除することによって得られる１）ＬＩＣ
   １３の／Ｘ４突然変異。 ９．７ラスミドのキュアーされ九菌株の原形質をプラス
   ミドＤＮＡで形質転換させ、形質転換平板培養基上で溶
   −斑を観察することからなるプラスミドをプロファージ
   として決定する方法。 １０、　（１１種々の土壌試料と共にストレプトミセス
   の非溶１［１株を生育させ、 （２）培養基をろ過し、 （３）生じるる液を希釈し、プラスきドのキュアーされ
   九菌株の胞子と共にファーリ溶菌斑形威活性を試験し、 的接合体を生じる能力について藷↓１専試験し、そして （６）プラス２ドの存在に対して致死的な接合を生じる
   １株を試験することからなる、土壌試料からのストレプ
   トきセス中のプラスミド　プロファージを含有する１株
   を単離、１ＩＪｌ＝−虻る方法。 １１、ベクターとして、自律的に複製するプラスミドと
   して存在するアクチンずセテ　プロファージを使用する
   ことからなる、］）１Ｍを適当な宿主中に導入する方法
   。 １２、上記アクチンばセテ　プロファージがｐＵｃ１３
   である特許請求の範囲第１１項による方法。