JPS585193A - 高分子間錯合体によつて包括する固定化酵素の製造法 - Google Patents
高分子間錯合体によつて包括する固定化酵素の製造法Info
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は高分子錯合体を利用して酵素を包括し、よって
固定化酵素を製造しようとするものである。
固定化酵素を製造しようとするものである。
従来、酵素の固定化に関しては、担体結合法、架橋法、
包括法等数多く知られているが、このうち、包・話法は
、酵素タンパク自身が固定化担体と化学的に結合してい
ないので数多くの酵素に適用できる利点がある。ポリ７
クリルアξドゲル中に包括した固定化酵素は工業的にも
利用されている好例であるが、本発明のような高分子間
錯合体形成を利用して包括する酵素固定化の例は、まだ
知られていない。
包括法等数多く知られているが、このうち、包・話法は
、酵素タンパク自身が固定化担体と化学的に結合してい
ないので数多くの酵素に適用できる利点がある。ポリ７
クリルアξドゲル中に包括した固定化酵素は工業的にも
利用されている好例であるが、本発明のような高分子間
錯合体形成を利用して包括する酵素固定化の例は、まだ
知られていない。
高分子間軸体（又は、高分子量コ／プレックス）は、互
いに相互作用するよう壕二種類の高分子溶液を混合する
事によって容ＪＩＫ得る事ができる（高分子間軸体「高
分子間軸体」第７巻「機能高分子」（共立出版）第８章
参照）。例え、は正電荷を有すや４１ビニルピリジウム
塩水溶液を等量の負電荷金有するポリスチレンスルホン
酸水済液と混合すると瞬時に沈デンを生成し、いわゆる
ポリイオンコンプレックスが得られる。このポリイオン
コンプレックスは、静電気的結合力によって形成された
高分子間錯合体でおって高分子量塩結合によって架橋し
た網目構造やラダー構造を有していると考えられている
。このような高分子間鍜μは、静電気的結合力に限らず
、ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）やポリアクリル酸（Ｆ
ＡＡ）とポリビニルピロリドン（ＰＶＰｄｎ）又はポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）等の連錯関水素結合で形
成される高分子間錯合体、ポリアミノスチレンとポリ無
水マレイン酸等の間で発現する電荷移動相互作用で形成
される高分子間錯合体、その他ステレオコンプレックス
等、その種類は様々であり、本発明においてもその種類
や調整法を問わない。また、上記掲載文献にも記述があ
るように、高分子間錯合体の一方の成分を高分子として
、酵素と共に存在させ、他方の成分をモノマーとして共
存せしめ、いわゆる「マトリックス重合」の手法をもち
いて重合と同時に酵素を包括させる事も可能である。肝
要な事は、高分子間錯合体が作る網目ないしラダー構造
を利用して酵素を包括せしめ、よって固定化酵素の製造
をはかろうとする方法である。高分子間錯合体によって
形成される網目構造密度は、一般に極めて高くかつ安定
であって酵素を網目中に捕捉し、包括するに充分でめる
。しかも、本発明のような高分子間錯合体で得られる網
目は第一にたとえばアクリルアミドゲル等、化学的架橋
法によって形成した網目構造と異なり、錯合体生成の諸
条件、即ち−ｐＨやイオン強度溶媒の種類、温度等によ
って容易に架橋密度やその分布、結合強度等を制御しう
る特徴を有している。しかも、この網目は適当に選んだ
条件下で高分子溶液を混合するだけで得られ、その工程
が極めて簡便容易、迅速であるばかりでなく経済的、効
率的でありて化学的架橋のような放射線や電子線、光等
による酵素の損傷失活、重合の為の加熱ないしは冷却、
減圧等の操作も必要としない。これが本発明の第２の特
徴である。
いに相互作用するよう壕二種類の高分子溶液を混合する
事によって容ＪＩＫ得る事ができる（高分子間軸体「高
分子間軸体」第７巻「機能高分子」（共立出版）第８章
参照）。例え、は正電荷を有すや４１ビニルピリジウム
塩水溶液を等量の負電荷金有するポリスチレンスルホン
酸水済液と混合すると瞬時に沈デンを生成し、いわゆる
ポリイオンコンプレックスが得られる。このポリイオン
コンプレックスは、静電気的結合力によって形成された
高分子間錯合体でおって高分子量塩結合によって架橋し
た網目構造やラダー構造を有していると考えられている
。このような高分子間鍜μは、静電気的結合力に限らず
、ポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）やポリアクリル酸（Ｆ
ＡＡ）とポリビニルピロリドン（ＰＶＰｄｎ）又はポリ
エチレングリコール（ＰＥＧ）等の連錯関水素結合で形
成される高分子間錯合体、ポリアミノスチレンとポリ無
水マレイン酸等の間で発現する電荷移動相互作用で形成
される高分子間錯合体、その他ステレオコンプレックス
等、その種類は様々であり、本発明においてもその種類
や調整法を問わない。また、上記掲載文献にも記述があ
るように、高分子間錯合体の一方の成分を高分子として
、酵素と共に存在させ、他方の成分をモノマーとして共
存せしめ、いわゆる「マトリックス重合」の手法をもち
いて重合と同時に酵素を包括させる事も可能である。肝
要な事は、高分子間錯合体が作る網目ないしラダー構造
を利用して酵素を包括せしめ、よって固定化酵素の製造
をはかろうとする方法である。高分子間錯合体によって
形成される網目構造密度は、一般に極めて高くかつ安定
であって酵素を網目中に捕捉し、包括するに充分でめる
。しかも、本発明のような高分子間錯合体で得られる網
目は第一にたとえばアクリルアミドゲル等、化学的架橋
法によって形成した網目構造と異なり、錯合体生成の諸
条件、即ち−ｐＨやイオン強度溶媒の種類、温度等によ
って容易に架橋密度やその分布、結合強度等を制御しう
る特徴を有している。しかも、この網目は適当に選んだ
条件下で高分子溶液を混合するだけで得られ、その工程
が極めて簡便容易、迅速であるばかりでなく経済的、効
率的でありて化学的架橋のような放射線や電子線、光等
による酵素の損傷失活、重合の為の加熱ないしは冷却、
減圧等の操作も必要としない。これが本発明の第２の特
徴である。
本発明によって実現できる第３の特徴は１１種々の重金
属や有機、無機化合物、カＨ・、温度、塩、その他の酵
素阻害因子から酵素・を保護する機能を有していること
である。本発明によって作られる高分子間架橋構造は化
学結合による−ものでない為、反応条件ｔｌえる事によ
り容易にへ構成可能である。架橋密度や分布、結合強度
等も錯合体部位によって様々に変化して多様性を有して
いる。これら錯合体形成部位の、一部は、非結合性部位
（高分子間錯合体を形成しうる基でいな−がら、実際に
分子間結合に関与していない部分）と共に化学的にボテ
ンシャルが高くなっており１他のイオンや試薬が共存し
た時に優先的に結合する能力を有している。これが重金
属イオンやｋｌＨ１塩基性有機物等酵素に対する阻害作
用を有する化合物が共存した時に酵素を保護する機能を
示す理由となっている。
属や有機、無機化合物、カＨ・、温度、塩、その他の酵
素阻害因子から酵素・を保護する機能を有していること
である。本発明によって作られる高分子間架橋構造は化
学結合による−ものでない為、反応条件ｔｌえる事によ
り容易にへ構成可能である。架橋密度や分布、結合強度
等も錯合体部位によって様々に変化して多様性を有して
いる。これら錯合体形成部位の、一部は、非結合性部位
（高分子間錯合体を形成しうる基でいな−がら、実際に
分子間結合に関与していない部分）と共に化学的にボテ
ンシャルが高くなっており１他のイオンや試薬が共存し
た時に優先的に結合する能力を有している。これが重金
属イオンやｋｌＨ１塩基性有機物等酵素に対する阻害作
用を有する化合物が共存した時に酵素を保護する機能を
示す理由となっている。
同じ理由で、本来、フリーの酵素が有する最適のｐ、Ｈ
域、イオン強度、温度等、いわゆる酵素の最適条件を変
化制御せしめる事も可能なのである。
域、イオン強度、温度等、いわゆる酵素の最適条件を変
化制御せしめる事も可能なのである。
本発明に適用される酵素は制限はない。しかし高分子錯
合体に関しては、その成分となる高分子および錯合体そ
れ自身が酵素に対し、活性會失くしたり低下させた抄し
ないような組み合わせを選ぶ事が肝要である。また、高
分子錯合体の結合力や種類によっては、所定のＩｉＨ域
や温度、イオン強度など錯合体生成の条件以外では一解
離したり、結合がゆるみ酵素逸脱の原因になったりする
のでこの点も考慮に入れる事が必要である。逆に、高分
子間錯合体生成の条件が酵素活性の低下を屯たらすよう
な場合もめる。また、基質によっては、包括された酵素
と接触できず酵素活性を示さない場合がある事は他の固
定化法と同１様である。要は、以上？諸点を考ｊ１！に
入れて最適の酵素−高分子錯合体の組み合わせを選び出
す事が１！！である。
合体に関しては、その成分となる高分子および錯合体そ
れ自身が酵素に対し、活性會失くしたり低下させた抄し
ないような組み合わせを選ぶ事が肝要である。また、高
分子錯合体の結合力や種類によっては、所定のＩｉＨ域
や温度、イオン強度など錯合体生成の条件以外では一解
離したり、結合がゆるみ酵素逸脱の原因になったりする
のでこの点も考慮に入れる事が必要である。逆に、高分
子間錯合体生成の条件が酵素活性の低下を屯たらすよう
な場合もめる。また、基質によっては、包括された酵素
と接触できず酵素活性を示さない場合がある事は他の固
定化法と同１様である。要は、以上？諸点を考ｊ１！に
入れて最適の酵素−高分子錯合体の組み合わせを選び出
す事が１！！である。
次に本発明の実施例を示して詳しく説明する。
実施例１
分子量７８万のポリメタクリル酸（ＰＭＡＡ）５１量チ
水溶液１００−に食塩１０Ｆ加え、市販のイベルターゼ
を用い、ＰＥＧのかわりに、分子量ａ６万のポリビニル
ピロリドン（ＰＶＰｄｎ）ａｓ重量％水溶液１ｏｏ ｗ
ｉ加え、他は５ｊ！施例１六同様に調整したところ、は
ぼＩｏｏ ％の収率で高分子間錯合体が得られた。実
施例１の方法でインベルター（包括率をしらべたところ
約ａｏ％であった。
水溶液１００−に食塩１０Ｆ加え、市販のイベルターゼ
を用い、ＰＥＧのかわりに、分子量ａ６万のポリビニル
ピロリドン（ＰＶＰｄｎ）ａｓ重量％水溶液１ｏｏ ｗ
ｉ加え、他は５ｊ！施例１六同様に調整したところ、は
ぼＩｏｏ ％の収率で高分子間錯合体が得られた。実
施例１の方法でインベルター（包括率をしらべたところ
約ａｏ％であった。
次にこの固定化酵素ａ２ｐを用い、その活性を種々の紗
Ｈ域でしらべたところ表２の結果を得た。
Ｈ域でしらべたところ表２の結果を得た。
表２
表２の結果はフリーの場合に有するインベルターゼの活
性の約ｓｏ、−ｓｓ％であった。ｔたこのようにして得
られた固定化酵素をくり返し使用した処、酵素の逸脱は
はじめの１６日間で、］／Ｈ４，５において約６チ、ｐ
Ｈ１ｓにおいて約３チ紹められたが、シＨ？−０におい
ては、酵素の逸脱は認められなかつ友。又、ＰＨ６以上
では錯合体の溶解が生じた、 実施例４ 分子量２５万のポリスチレンスルホン酸ナトリクムの５
重量％水溶液にインベルターゼ水溶液１０ｓ１ｊｔ加え
、この溶液にカキマゼながらゆっくりとポリヒニルベン
ジルトリメチルアンモエウムクロ９（ド（分子量２０万
）の５１１ｓ水溶液’ｉ ｌＯ（。
性の約ｓｏ、−ｓｓ％であった。ｔたこのようにして得
られた固定化酵素をくり返し使用した処、酵素の逸脱は
はじめの１６日間で、］／Ｈ４，５において約６チ、ｐ
Ｈ１ｓにおいて約３チ紹められたが、シＨ？−０におい
ては、酵素の逸脱は認められなかつ友。又、ＰＨ６以上
では錯合体の溶解が生じた、 実施例４ 分子量２５万のポリスチレンスルホン酸ナトリクムの５
重量％水溶液にインベルターゼ水溶液１０ｓ１ｊｔ加え
、この溶液にカキマゼながらゆっくりとポリヒニルベン
ジルトリメチルアンモエウムクロ９（ド（分子量２０万
）の５１１ｓ水溶液’ｉ ｌＯ（。
ｄ加え、イオン結合に基づく高分子間錯合体をつくった
。この錯合体を水洗後Ｆ別乾燥し、白色粉末状の高分子
間錯合体をほぼ１００％の収率で得次。このようにして
得られる固定化酵素をアセトン−臭化ナト９ウ。赫水で
溶解して、実施例１と同様の方法で紫外分光分析をおと
なつ九ところ、約８０チのインベルターゼが包括されて
いることがわかった。この固定化酵素へ２Ｆをもちい種
々のＰＨで１０１量チシヨ糖溶液を基質として活性を測
定こうして得られる固定化酵素はＰＨｘ−”ＰＨｔｓの
範囲で解離溶解する事はなく、固定化酵素としての機能
を広いＰＨ域で発揮した。又、酵素の逸脱もｓ ＰＨ２
，−ＰＨ１３の範囲ではじめへ１日間で約２％と低かっ
た。
。この錯合体を水洗後Ｆ別乾燥し、白色粉末状の高分子
間錯合体をほぼ１００％の収率で得次。このようにして
得られる固定化酵素をアセトン−臭化ナト９ウ。赫水で
溶解して、実施例１と同様の方法で紫外分光分析をおと
なつ九ところ、約８０チのインベルターゼが包括されて
いることがわかった。この固定化酵素へ２Ｆをもちい種
々のＰＨで１０１量チシヨ糖溶液を基質として活性を測
定こうして得られる固定化酵素はＰＨｘ−”ＰＨｔｓの
範囲で解離溶解する事はなく、固定化酵素としての機能
を広いＰＨ域で発揮した。又、酵素の逸脱もｓ ＰＨ２
，−ＰＨ１３の範囲ではじめへ１日間で約２％と低かっ
た。
実施例５
刊
インベルターゼの阻害剤であるアメリン、Ｃｕ。
）（
邸 に対する高分子間錯合体の保−作用をしらペ１−９
Ｍ存在させ実施例１，３．４で調整した固定化酵素につ
いて検討した処、表４の結果を得た。
いて検討した処、表４の結果を得た。
以上のようにいずれの阻害剤の場合においても高分子間
錯合体による酵素の保護作用が見られる２＋ が、特に、ア＝ ＩＪン、ＨＰ の場合に顕著であ
ったＯ 実施例６ 実施例４と同じ方法で、糸状菌グルコースオキシダーゼ
２０ ｉｍｓ水溶液２０ ｍを使用して酵素固定化をは
かっ九〇得られた固定化酵素の酵素包括率を実施例４と
同様の方法でしらべたところ、約４５チであった。この
固定化酵素ＩＰをもちい、ＧＩＨ４５にて１０ ％グル
コース水溶液をもちいて紫外吸収スペクトルによって酵
素活性をしらべたところ％ ａ ｘ ｌｏ Ｍ／ＭＩ
Ｎで酸化さ れている事が明らかになり、高活性を有す
る固定化酵素が得られた事がわかった。
錯合体による酵素の保護作用が見られる２＋ が、特に、ア＝ ＩＪン、ＨＰ の場合に顕著であ
ったＯ 実施例６ 実施例４と同じ方法で、糸状菌グルコースオキシダーゼ
２０ ｉｍｓ水溶液２０ ｍを使用して酵素固定化をは
かっ九〇得られた固定化酵素の酵素包括率を実施例４と
同様の方法でしらべたところ、約４５チであった。この
固定化酵素ＩＰをもちい、ＧＩＨ４５にて１０ ％グル
コース水溶液をもちいて紫外吸収スペクトルによって酵
素活性をしらべたところ％ ａ ｘ ｌｏ Ｍ／ＭＩ
Ｎで酸化さ れている事が明らかになり、高活性を有す
る固定化酵素が得られた事がわかった。
実施例７
実施例４で詞製した固定化酵素５りを直径１゜噛のカラ
ムにつめ１９Ｈ４Ｌ６の緩衝液で充分洗浄、＊ａ後ショ
糖２チ含有するｐＨ４−の緩衝溶液１００ＷＬｌを１ｄ
／分の流速でカラム上部から流下させた。カラムを透過
した溶液を旋光度法によりて分析した処、シ曹糖の８２
チが加水分解されている事がわかった。
ムにつめ１９Ｈ４Ｌ６の緩衝液で充分洗浄、＊ａ後ショ
糖２チ含有するｐＨ４−の緩衝溶液１００ＷＬｌを１ｄ
／分の流速でカラム上部から流下させた。カラムを透過
した溶液を旋光度法によりて分析した処、シ曹糖の８２
チが加水分解されている事がわかった。
以上
特許出願人 長 １）義 仁
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） 高分子連鎖間におけるイオン結合、水素結合
、電荷移動相互作用力など、いわゆる２次的分子間結合
力によって生成する高分子間錯合体によって包括する固
定化酵素の製造方法。 （２） （１）の製造法に関しｓ ｐＨｓ イオン強
度、溶媒、温度等を変化せしめ、高分子錯体中への酵素
包括率及び生成した固定化酵素の反応活性を制御する事
を特徴とする特許請求範囲（１）の製造方法。 （２））（ｌ）の製造法によって生成する固定化酵素に
関し、高分子錯合体によってｓ ＤＨｓ温度、イオン
強度、金属、有機無機試薬その他種々の酵素活性阻害の
要因から酵素を保躾する事を特徴とする特許請求範囲（
１）の製造方法。 （４） （１）の製造法によって生成する固定化酵素
に関し、高分子錯合体の存在によって、本来酵素がフリ
ーの状態で有する最適、ｐ・Ｈ１温度、イオン種やイオ
ン強度等最適条件を変化させる事を特徴とする特許請求
範囲（υの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10006781A JPS585193A (ja) | 1981-06-28 | 1981-06-28 | 高分子間錯合体によつて包括する固定化酵素の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10006781A JPS585193A (ja) | 1981-06-28 | 1981-06-28 | 高分子間錯合体によつて包括する固定化酵素の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS585193A true JPS585193A (ja) | 1983-01-12 |
Family
ID=14264113
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10006781A Pending JPS585193A (ja) | 1981-06-28 | 1981-06-28 | 高分子間錯合体によつて包括する固定化酵素の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS585193A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60232243A (ja) * | 1984-04-28 | 1985-11-18 | Res Dev Corp Of Japan | 架橋高分子重合体からなる吸着剤 |
-
1981
- 1981-06-28 JP JP10006781A patent/JPS585193A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60232243A (ja) * | 1984-04-28 | 1985-11-18 | Res Dev Corp Of Japan | 架橋高分子重合体からなる吸着剤 |
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