JPS5853761A - クレアチニン抗体、その製法並びにクレアチニンを免疫学的に測定する方法およびそのための試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、クレアチニン抗体、その製法、クレアチニン
を免疫学的に１ｍｍする方法及びそれに好適な試薬に関
する。臨床化学ではクレアチニンの測定は腎機能を診断
するための最も重要な方法０１つである。尿素測定に比
べて、タレアチニ１０測定は、血清中のクレアチニン一
度が食餌法、特に蛋白質ｏＨ富な食餌の摂取により作用
されないという決定的な利点を有する。

尿素に比べて限界範囲における血清中０夕・レアチ二ン
濃度は極めて低い（正常値の上限は男でり．ｌＯ＊／ａ
，女でＯ．ＱＯＭＩ／／ｄｔ）Ｏソｔ％故りレアチ二ノ
試験の高い感度及び特異性が求められている。

臨床実験室においてタレアチ二ノ試験は標準試験法とし
て重要であるので、同時にできる限り低い作業経費で実
施可能であり、特に自動分析装置で使用するのに好適で
あることが求められた。

従来量も頻繁に使用されたクレアチン／（Ｑ＠定法ハ、
Ｍ　、ヤツフエ（：ｒ＊ｔｔ＝　）により見出されたア
ルカリ性媒体におけるクレアチニンとピクリン酸とＯＩ
ｋ色反応に基づいている。この場合、試料の酸性脱蛋白
（例えばシック四ル酢酸又はぜタリン酸で）の後、上澄
み中でピクリン酸の添加及びアルカリ性化後に赤色があ
られれ、それを光度測定法により測定する。しかしこの
簡単な方法は一連の重大な欠点を有している。ヤツアエ
反応が５０以上の色原体、特に一般に血清中に存在する
ダルコース、♂ルベート、アセトアセテート及びア七ト
ンのような成分の作用を受け、それ故りレアチ品ンに特
異なものではないことが明らかになった〔文献：　＠０
１１ｉａ＊Ｏｈ＠ｎ、　”、２６巻、１１１９〜１１２
６頁（１９８０年）〕。殊に、これらの１非クレアチ工
ン色原体”はクレアチニン濃度が低い（〈１ダ／Ｂ）場
合に妨害し、これによりタレアチニンＯ検出下限が規定
される（クレアチニン盲範凹！　”　ＯｒＩ＆ｔｉ！ｌ
ｉ！１に１．１ｍｌ＋１＠ｒ　’　ｌ１ｓｒｅｉｏｋ　
）　Ｑ反応媒体におけるｐＨ値の僅かな移動も色の深み
の変化をもたらす。最後に、一部は腐食性かつ毒性の試
薬の使用も取扱いＯ際Ｏ危険発生の原因である◎ヤツ７
工反応の一連の変更は精確さ及び実施可能性を改良する
が、原則的な欠点を完全に解消するものではない。

他の公知法はクレアチニンをＯ−ニド四ベンズアルデヒ
Ｐの添加下にメチルダアニジンに変換し、これを坂口度
応により測定する。クレアチニンとカリウム／水銀−チ
オンアネートとの間Ｏｊ１色反応も知られている。しか
しこの両方の方法は臨床実験慮では不適当であることが
明らかになった。　　　、、、、。

更に、ヤツ７工反応を酵素的部分工程と組合曽ることに
より非特異的な色原体による妨害を回避することは知ら
れている。その際に、血清試料を用いて、タレアチェン
アｔＰヒｒロラーぜ／クレアチンキナーぜ／ムＴ？で処
理する前とその後で得られたヤツ７工反応の呈色を漏電
しかつ吸光度の差からタレアチェソ含量を計算する（１
ムｒ（Ｉｋ　ｍ　Ｐｋ＆ｒＩａ　＃　”　％第５巻、８
９３〜８９６頁（１９８０年）〕。

この方法は特異的であるが、その実施は非常に煩雑であ
りかつ自動化が非常に困難である。

更に、クレアチニンイミノヒｆｖｘツーぜの作用により
クレアチニンから遊離するアンモニアをアンモニア選択
性電極〔１ムｎａＬ、ｏｈ・ｍ、”第４６巻、２４６〜
２４９頁（１０７６年）〕を用いて又は螢光側走法によ
りダ］続（ダルタメー）デヒ１１ナーぜ反応における夏
ムフＨ消費量について〔Ｏ１１ｎｓＯｈ１ｍ、ム・ｔ＆
”、第１００寺、２１〜２３頁（１９８０年）〕測定す
る。しかし試料中に遊離アンモニアが比較的多量に存在
する可能性があるため、この種の測定を十分に妨害なし
に実施することができるかどうか、それ故常用診断に普
及し得るかどうかは疑わしし１゜最近−完全酵素的クレ
アチニン試験が記載され、この場合クレアチニンをクレ
アチニンに変換し、クレアチンをムＴＰによりクレアチ
ンリン酸に変換しかつその際に生じ゛るＡＩ）Ｐを♂ル
ベートキナーゼ及びツタテートデヒＰ田ゲナー４（ＬＢ
Ｈ）との結合反応において反応溶液中の夏ム１ｍ！含量
の減少について光度測定する（　＠ｇｏａｎｄ＊７．０
Ｌｉｎ、Ｌａ１１．Ｉｎｖｅｓｔ、　”　、Ｗｌ漬２Ｇ
）、１２６頁（１９７２第）〕。

この方法は血清試料を脱蛋白する必要はなくかつクレア
チニンに特異的である。しかし多量０試料を使用しても
測定シグナルは比較的低いため、この試験の感度は低い
′クレアチニン濃度範囲に限定されている。更に試料盲
値測定が必要であるのでこの方法を自動分析器で適用す
るのは困難である。

それ故、簡単で自動化可能な、同時に非常に特異的でか
つ前記の理由から特にタレアチエン濃度範［＜ＩＩＱ／
ｄｌ（＠クレアチニン盲”範囲）で非常に敏感なタレア
チ轟ン試験が求められる。

それ故、本発明は従来のクレアチニン測走法の欠点を解
消するという課題に基づいている。

本発明ではこの課題はクレアチニンに対する特異的な抗
体により解決される。

本発明によるクレアチニノ抗体はそれが特異的にクレア
チニンとへゾテンー抗体コンプレックスを形成すること
を特徴とする。

クレアチｘ−ｙは抗体を形成するすべての生体中に広く
分布するが抗体形成を惹起することのできない物質であ
るので、クレアチニンに対する抗体を製造し得ることは
驚異的である。分子量が比較的低くかつ血清濃度が高い
ので、タレアチ！／がへゾテン担持物質との接合体とし
て抗体の形成を惹起することができ、その抗体が非常に
特異的で１それは例えばタレアチｙ及び尿素のような基
本的な構造的特徴がクレアチニンと共通している物質と
殆んど交叉反応せず、それ欽定量的測定法に好適である
ことを予測することもできなかった。免疫学的試験法が
約４０年未知られておりかつ同様に長い間特に低い濃度
範囲で改良されたクレアチニンｍ憲法に対する要求がな
されていたが、この種の有効な特異的な免疫学的クレア
チニン測定法を見出し得なかったことも前記Ｏ事実に帰
因する。

本発明による抗体の製造は、クレアチニンと、架橋員と
しての脂肪族又は芳香脂肪族カル−ｙ酸を介して結合し
ている例えば蛋白質のような抗血清０形成に好適な物質
とＯ接合体を免疫原として抗血清Ｏ形成に使用すること
を特徴とするＯ 本発明方法で免疫化に使用したクレアチニン接合体は、
クレアチニンを脂肪族又は芳香脂肪族カルタン勲に結合
させ、その、後カルーン酸から由来する部分のカル−キ
シル基が抗血清Ｏ形ｔ１．ｒｔ惹起し得るハプテン担持
物質と結合して製造する。この際辷、炭素原子りな（と
も３個、殊に炭素原子４〜１６個を有する脂肪酸並びに
７＃中ル傭鎖基を有する芳書族カルーン酸が好適である
と明らかになった。芳香＊１ｌｌＣ＃ｉ［千１〜４個の
アルキル基を有する安息香酸誘導体が特に好適である。

代表的な例は１メチル安息香酸、エチル安息香酸及びゾ
ａｄル安息香酸である。これら芳香脂肪族カル−ン酸Ｏ
オ９−マー、例えばメチルベンゾエート−エチル安息香
酸も同様に好適である＠ 免疫学的にへｙゾテンと見なされるクレアチニンとカル
ーン酸との間の結合は公知方法により活性化されたカル
ーン酸鱒導体の使用下に行なうことができる。八ｗ　ｒ
　ｙ化カルーン酸、特に・−ｆｖｘムカル−ン酸を水性
アルコール性媒体中で又は相応する八ｗ　／　ｙ化カル
−）酸エステルの場合には無水媒体中で使用し、次いで
けん化すると優れている。最良の結果は・−ゾ璽ムカル
ーン酸エズテルな用いて、次いでけん化すると達成され
、その際に６０−重での収率で得られた。水性アルコー
ル性媒体中でクレアチニンとの反応は高められた温度で
、有利に沸点で行なう。カルーン酸エステルを使用する
場合、溶剤としてクメチルホルムア電？１傘ル＾ア竜ｒ
、テ）ツヒｌＰｍ７ツノ等のような極性宥機博剤を使用
すると有利である。反応を有利にア竜ｙ１例えば令ノー
、ジ・又はトリアルキルアｔｙの存在において行なう。

生成物のけん化は種やかな加熱下に水性アルカリ性媒体
中で実施することができる。結合は窒素を介すると共に
へ基を介してもν・安息１１酸ジアゾ１ウム蝮による一
アゾ化により行なわれる。

＾ゾテン担持物質との結合は、水性有機謀体中でア４ｙ
及びり冒ル蟻酸エステルＯ存在において行なうと有利で
ある。水／クオキ−？ｙが反応媒体として時に好適であ
ることが明らかになった。

ζＯようにして得られた？レアチ皐ン接合体は免疫原と
して抗血清の形成に使用する。この際に、ＩＩｊＩ者に
公知Ｏ方法により選択した動物種に投与する。投与は例
えば皮肉、筋肉内又は皮下に行なう。殊に、免疫原をア
田イｙトアジＨＡントと一緒にｔ／１ＪＩｋｆＩＩ形成
を促進するため使用する＠羊Ｏ場合、次の免疫化工程が
良好であることが判明した＝ ０　　政、内　　　　１ＭＩＩ　　　　　　◆７　　筋
肉内　　ｉｌｌ　　　　　◆ １４　　皮下　　　１ｉｆｌｌ　　　　　◆３０　　筋
肉内　　１１ｆ　　　　令 ６０　　皮下　　　Ａｌｌ　　　　　◆それ以後　皮下
　　　　ｌｌ１ｆ　　　　　　令このようにして得られ
た本発明による抗体を含有する抗血清は、殊に初めから
抗体に結合している愈清タレアチエｙを除資する透析後
にタレアチェン測電に使用することができる。しかし抗
体Ｏ富化もしくは精製を行なうと有利である。そ０ＩＩ
Ｉｋ：、硫酸アｙ看１ウムＬ６螢ル盲でで析出する蛋白
質フツタシ曹ンを単一すると有利でありかつ透析により
低分子成分を除★する更に精製を免疫吸着により行なう
ことがで會る。この際、抗体製剤は担体結合Ｏフレアナ
エン接合体を介して轡瞥些邊−９すＯ際、抗体櫨タレア
チェン纏合体に吸着されかつ不純物の洗浄−輪＊俵にタ
レアチ晶ン溶液で再度溶離する。酸又はｍｓ波に対する
透析により、形成されたコｙゾレツタスを再び分離しか
つ精製抗体を単離することができる。

他の好適な精製法韓、硫酸７ｙ％蟲つ＾７ラタシ冒３／
Ｌ８ｔ９ａｅ−ル／ｌを食塩に対して透析し、クレアチ
ニンを添加し、次いで担体結合のクレアチニンと恒温保
持することから成る。この巖に、クレアチニンｌＮ１１
４性抗体コンプレックスはカラムを遥して　流れ、この
ようにして不所望な特異性（例えばスペーサ或い嬬へゾ
テン担持物質に対して）を有する抗体を分離することか
で會る。

本＊＠０他ＯＷｉ的嬬こＯ新規抗体をフレア千晶ｙＯＩ
ｌｔＦ＆ｌ：使用するこ２である。これは、タレアチ！
ｙＩＩ台′体と抗体とｏｒｔｒｔｏ結金又応が納金アチ
ニンにより濃度に応じて“妨害されることをベースとし
、その際抗体は同種の或いは有利Ｃ社他種〇へゾテｙＩ
Ｉ持物質とのフレアナエン接合体に対して調ｌｌ１１Ｉ
れている。例えば、抗体は抗血清の廖でもしくはそれか
ら得られた免疫／　ｖｓ　ｆすｙアラタシｍｙＯＩＩで
使゛用することができ、これは予め稀ゾｖ１ぜオン酸又
は稀塩酸に対する透析Ｏよう°な好適な前゛処理により
付着している血清クレアチニンを除＊した【１０区。

Ｈ１ｍムｖｌ及びその他共着％＠１．−鵬ｍｍｏＬｌｌ
ｅｔｋｏａｍ”、３７巻、５７〜７０買（１９６０年）
参照〕。

そし故、本発明によるタレアチａｙｏｎ疫学的測定法は
、タレアチェｙ−抗体をタレアナ二ノ含有試料溶液と恒
温保持し、その後クレアチニンとハブテン担持物質とＯ
接金体を添加し、その際に両方の成分の一方、抗体又は
接金体はＩｆ形又は溶解形で、他方ＯＳ分は溶解形で存
在しており、かつ抗体とクレアチニン・接合体と０間の
結合次発の阻害性４０１１度を測定することを特徴とす
る・ 抗体の生成に使用するタレアチ！ｙ接合体と結合反応Ｏ
Ｗ窺に使用するタレアチ二ｙｗ！合体は異なった、しか
し場合により同一〇ハシテン値持物質を含有してよい（
例えば血清アルｆミｙ）、後者Ｏ場合に唸試験中Ｏハシ
テン拒持物質４Ｃ対する交叉屓応紘、亭来目的のハブテ
ンとＯ結会夏応を測定する前に、抗体フラタシ璽ンにハ
ブテン担持物質を、ハブテン担持物質に対する抗体Ｏ沈
澱に必要な一度で添加し、その際に滉濁廖腐Ｏ側定によ
る試験の実施（ｔＸ夏Ｉム。

夏ＸＭＸム）０１１４Ｃ１初めにタレアチニン接合体−
抗体とへゾテｙＩＩ持物質とＯ交叉次発により生成した
沈澱を例えば遠心分離又は濾過により除脅して選択的に
遮蔽することができる。

抗体とクレアナａｙ接合体とＯ閏の結合Ｏ但書は、クレ
アチニンをフレアナエン接合体と混合する前に抗体に多
く添加する程強まる。この阻害作用は測定すべ會試料溶
液中ＯＩ　Ｉｌｌ／＃より低いクレアチニｙＯ１＆度範
囲において非常に優れており、こＯ一度範囲で嬬従来有
利に適用された公知のタレアチ＝ｙｌｌｌｊｌ＊０利用
性は制ａＳれている。

へゾテン自体が相応するへゾテン接合体とこれに対して
調製された抗血清との間の完疫学的結合反応Ｏ際に阻害
剤として作用しかっこの性、　　質を種々の試験法（例
えばＲＩＡ、　！ＩＭ：Ｅ−ξＭＴａＸ１１ム、ＴＩ［
ム又はｗｘｗｘム）により遊離ハシテンの宏量測定にも
利用する多くの例が文献に既に記載されている。ところ
が従来文献には免疫すべき動物の生体内に極めて僅少で
産生ずるに過ぎない＊ルモνのような低分子物質に対す
る抗体０取得が記験されたに過ぎない〔１０〜１゜毫ル
／　Ｉ　＃　１．ｌｃｅ胆ｍｄａｗｉ及びその他共著％
　”　ＪｌｌＩｍｍｔｍｎｏｌｏｇ、Ｍ＠ｔｋｏａ−”
−３７巻−６７〜７０頁、付録参照〕 ハシテン担持物質としては免疫学的に公知〇愉質が好適
である。基本的に、この何は、抗体形成に使用する宿主
中に産生しないすべてＯｉ４種蛋肉蛋白えば種々の由来
の血清アルデセノ、並びにキーホール（Ｋ＠ｙｍｋｏｌ
・）９ンフオシアエン、（すｄｅ）、／リサツカツｒ１
アガ讐−ス、Ｉリリシン、活性炭である。他の公知Ｏへ
ゾ？）／１１１持愉質Ｏ例は１エクスベリメンタル・イ
ムノＷ−一”、プラッタウェル、サイアンチフィツタ、
Ａｆリケーシ璽ンメ（＠冨Ｘν・ｒｉ鳳・ｍｔａｌｚｍ
ｌｌｍｍｏｌｏｇｙ”％ｍ１ａｏｋｖ＊ｌｌ　ｓ　＃ｏ
ｉ＊１ｉＬｌｆｉ。

２１１１１１１１１＆ＩＩＪｎ−）　、　ｊ１３版、１
〜１１頁０１フδ都）Ｏハフｆｆツタに挙げられている
。公知Ｏ好適な担持物質とハシテンとの結合法も挙げら
れている。

優れている担持物質は種々０由来０血清アルデセｙ％例
えば牛血清アルデセン、ヒト血清アルブミン等及びエデ
スチンである。

本発明範囲で抗体とは精製抗体並びに抗血清、抗血清か
ら得た免疫ダ田プリｙ７ツクシ冒ン、抗体７９／メン）
、例えばｙ（ａｂ）ＪＩｌ−、ハ１−及び１マー７ラダ
メンシである。

一般に、抗体形成には、抗体形成するすべての生体を使
用することができる。羊を使うと優れている。細胞培養
から得られるような単一り讐−ン性抗体もまた該当する
（免疫化工程参照）。

クレアチニｙのクレアチ１ン接合体と抗体との結合反応
に対する阻害作用は周知Ｏｆ＆疫学的方法により直接漏
電することができる。例として標識化した抗体もしくは
抗原を使用する方法、例えばＲＩＡ又はＩＣＸム、！Ｈ
ＡＱ実施形、ＭＸａＸＩＩム又はＩｌ１Ｍｘ！、接合体
と抗体との間Ｏ免疫沈降の阻害に関する混濁漏電（ｒｚ
ｗｘム原ＩＩ）もしくは相応する比濁法（ＭＸＭＸム原
Ｉｌ）＃Ｉｆｉが挙げられる。更に、凝集阻止試験（１
ムＯＩＡ　ｗ１１１？ａｒｔｉｏ６１０ｏｕｍｔＬｎｇ
　Ｘｍｍｕｍｏ−人ｓｗａｙ　）及び補体結合反応を適
用することができる。これらの方法はすべて当業者に公
知であり、ここで詳説する必要はない〔例えば、ＭＸム
の実施形は＠ＯＬ１ｍ、Ｏｋ１ｍ、ムｅｔａ”、８１巻
、１〜３６頁（１９７７都）及び１７．０１１ｎ、ＯＭ
ｍ、０１１ｍ、１１１ｏｏｋ＠ｍ、”、１ａＡＬ１９７
〜２０８頁（１９８０年）＃照〕。

酵素標＠０場合、良好に使用される酵素、例えばβ−ガ
ラクトシダー４１ベルオ中シ〆一ぜ、アルカリ性ホス７
アターぜ、Ｉルコースオキシダーゼ、ダルコース−６−
ホスフエートーデｔｆｖｘグナーぜ及びルシフエラーゼ
が挙げられる・補酵素による標識化には例えば夏ムｐ又
は夏Ｄ１もしくはその還元工程物が該当する。抗体もハ
プテンも標識することができる。

前記の方法Ｏうち優れているもＯは混濁ｉ１！！である
。それは結合友応Ｏ但書を所定Ｏ時間間隔で免疫沈降を
測定することにより測廟し、そＯＩＩに比濁分析法（散
乱光測定）かつ會た濁り測定法（透過光測定）を適用す
ることができる他の優れた方法は、結合又応の阻害を結
合していないハシテン担持物質−タレアチ二ン接合体を
標識抗体、特に優れているのは酵素標識した抗体で遺制
ｙｉ１ｔ、かつ標識物質Ｏ結合割合又は非緒会割合を測
定することにより行なう。こＯ場合、例えば放射性物質
（ｎｚム）、酵・索もしくは補酵素（ｘｘ＊　）　％け
い光（７ＸＡ）ＳＸｋ’ン標織化（＠ｌｉａｔｍｒｅ璽
＠Ｗ　ｉｔｅｘｏｇｙ　”　％　２３６巻１９３〜９４
頁（ＩＧ）７２都）参照〕による標識化が好適である。

標識した抗体として標識した抗抗体を使用することもで
きる（二重抗体＠）Ｏ 本発明の他の目的は、クレアチニンのｊ＠疫学的測定用
試薬であり、これは試薬がタレγチェン抗体、クレアチ
ニンとハシテン担持＊質と０接合体及び緩衝物質を含有
することを特徴とする。殊に、本発明による試薬は免疫
沈降を促進する物質も含有する。こ０場会、４リエチレ
ンＩ９コールが特に好適であり、それを単独で又は場合
により表面活性物質と一緒に使用する。

ぼりエチレングリコールとしては分子量２００〜２００
０００ものが好適であり、分子量６０００±２０００が
優れている。試薬中のぼりエチレンＩ９″：１−ルの好
適な論度はαｌＮ６審量搭である。

抗体成分及び適用される標識化については前記の記載が
本発明による試薬について相応して該当する。

濁り測定法の場合、クレアチニン／ヒト麿清アルｆ々ン
Ｏ％ル此、−ｉ　’！、−Ｉｌｏ　ｏクレアチニンとに
ト慮清アルブミンとから０ＩＩｌ！会体α５〜５゜ＯＪ
　Ｉ　／　ｍｌ　、接合体に対してそル比αｌ〜１００
タレアチェンに対する抗体、ポリエチレンＩリコール０
１〜８重量−、イオン強度α０３〜α４．）ｉ［４〜１
００緩衝物質を含有する試請が優れている。

ｍＭＸＴ法に関しては有利に本発明による試薬は活性受
容部位に関してタレアチｘｙ抗体１０〜ｌ　ｏ−１４モ
ルフ！、タレ７チエンー！レートデｋｆｗグナーぜ接合
体１０　　”　ｌ　Ｏ−１４％　ｋ　／　ｊ、オキサル
酢酸０．０δ〜６０ミ９噌ル／１％＊スフエート緩衝液
（ｐｍ　　６〜８．５　）　５〜２００ミＶモル及び買
ムＩ）Ｈα０５〜α４ｔ’Ｊ’ｌ！−ルを含有する。

本発明範ＩＩＩ″Ｃ″は緩衝物質としてＰＨ範囲各〜１
０、殊に６〜９で有効な公知のものを使用することがで
會る。溶解試薬中の緩衝剤―度はα００６〜ＬＯ４ル／
４．殊にα０１＃０．１七ル／ｊである。＠囲α０３〜
・Ｏ，０ＴＪＩ！−ル／ｊが特に優れている。

有利に、試験における抗体濃度縮約１０−４〜１０−１
４モルｉｔ、殊に１０〜１０　４ル／１であり、その際
にモル／１とは活性受容部位を表わす。

本発明方法を実施するに当り、分析すべき溶液を直接試
薬に添加することができる。クレアチニンが高濃度で存
在する場合、試料を予め水で稀釈する。

一般に、測定は温度１０〜６０℃、特に１′６〜４０℃
で実施することができる。

クレアチニン接合体０＠造は、公知方法で１例えば”ジ
ャーナル９オデ・ノイオａ　／　ｐ　＃　ａケミストリ
ー（、Ｔ、！１１０１．（ｊｈ・帽）”、２２８１１１
＋、７１３〜７２７頁（１９５７年）に記ＪＩ！された
混合無水物による作業法により行なうことができる。酵
素による標識化も同様である。

次に本発明を実施例により詳説する。実施例中使用した
略記は次のものを表ｉす３ ０ｘ　　　クレアチンキナ−せ Ｒ８Ａ　　牛血清アルブ電ｙ 罵１ム　ヒト處清アルデ之ン ＲＸム　ラジオ・イムノアラ七イ ＩＭＫ！　エｙチム・！ルチプライｒ・イムノアラ七イ
・テクニック（Ｉｎ露ｙｍ＠論幻、ｔｉｐｌｉ・ｄＸｍ
ｍｗｍｏｉｓｓａｙ　Ｔ・ｅｋｎｌｑｕ＠）ｍｚｘｓム
工ｙチム・９ｙ夕ｔ・イ＾ノソルベン）Φアッセイ（Ｉ
ｎｍｙｍ＠Ｌｉｎｋ＠ｄＩｍｍｍｍｏｓｏｒｌｒ・ｍｔ
　　ム−ｍａｙ）テＩＭｘム夕−−ジチ・インｔｔシ曹
ン・イムノ・アッセイ（Ｔｕｒｌｉｄｌｔｙ　Ｉｍｋｌ
ｌｚｌｔｌｏｎＸａｙｍｕｍｏ　　ム―−亀１　） ＭＸＭＸムネ７工田メ）リッタφインヒＣシ曹ンｅイ＾
ノφアッセイ（１＠）１８１０１１＠ｔｒｊ、（＄Ｉｎ
ｈｉｂｉｔｉｏｎ　　Ｘ諺ｍｕｍｏ　　ム５ｓａｙ　　
）１１　　塗布緩衝剤 ＩＰ　　恒温保持緩衝剤 ！！・＊ｗｌａ０４９オ中ジエチレンーツル♂タンモノ
ラウレート 夏ム１　ｓ；チンアセ？アデニン−σヌクレオチｒ 夏ムＤν　品コチンア叱ｔアゾ品ンージ翼タレオチ？ホ
スフェート ＤＭｆｆ　　−メチル本ルふアミｒ ■　洗浄緩衝剤 ８Ｐ　　基質緩衝剤 Ｐ１１７７−１ａ　　ｐ−エトジフェニルホスフェ−）
―　夏１゜ ＩＬＴ　　　室温 ムｒ　　アルカリ性ホフファター４ ムト！Ｏアルカリ性ホスアアターぜ試験組会曽Ｔｌ１ｆ
ＡＱＵＡＩτ−１１１− 緩衝剤ｔ ）ｆａ、ＩＫ−ホスフェート　　６６セリ啼ル／１）ｌ
Ｉ　５ＬＯ １８ム　　　　　　　　　　１０電９令に／１、ｒｉ、
＠−０α番− 菫ａも、　　　　　　　　　　　　α１１にポリエチレ
ンｌリコールｗｏｏ　　　　　　　　　　　　２．４ｊ
ＧＢｒＬＪ・−！ＩＳ＃９ｚチレｙＩ９：ｌ−ルテウリ
ルエーテル　　　　　　　　　　　　　　　　　α４ｓ
創μ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　αａＳ
１１ム　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　α
δ≦ム）免疫原ＯＩＩ造 誉酸 ？レアチ慕−’ｌＬ３＃（Ｚｏｏ竜リモリモルびシーゾ
田＾−メチルー安息喬酸２Ｌ５＃（１００セ９幡ル）を
水／エタノール（１１１）混合物２δ〇−中で１時間還
流沸騰させる。冷却後に未戻応Ｏｆｗ＾メチル安息書酸
が析出する。それを濾別し、濾液を約１００−重で濃縮
し、そｏｓイオｙ交換体カラム（１）ｏｗ＊７　（ＩＩ
ＩＹム社）１番８；メッシユ２００　Ｎ４００．に対イ
オン　ホルミエー））上に注ぐ。水で溶■する際に所望
の生成物が純粋な物質で得られる。

融点〉２６０℃、収量２．６１Ｃ９，６％’）Ｉｆ　値
（ｆタノール／氷酢酸／水６０／１５／２６）露α番６ １１１１１１体ｔ−（＃レア％１ル）−メチル−４ンゾ
エートーメチルー安息誉酸を単一し、これもまたへブテ
ンとして使用することができる。

両方の物質の菖ＭＩＬＸＪ＃）ルにより予ｌｌ１１！１
れた構造が証明される。

クレアチ１ン１１３Ｉ（１００セリ令ル）を：ＤＭ：Ｉ
Ｆ　ｌ　５　Ｑ−申に■濁ｇｔかつ約５ｓｏ　Ｎ１００
℃に加熱する。この溶液にｆｖｘム酪酸エチルエステル
１７．４ｍｇ（１２０竜す七ル）及び）リエチルアミン
１６．５ｍ＜１２０竜９％ル）を同時に攪拌下に徐々に
滴加する。なお３６時間攪拌する。こＯ際溶液は殆んど
澄明になる。溶液を濾過しかつ得られた濾液を鍋細する
。そＯ後、残渣を水中に取りかつ活性炭を加える。短時
間沸騰後、活性炭を濾別し、再度濃縮する。残渣°　を
乾燥させ、次いでインゾｔｌＡノールから再結晶させる
。

融点１’ｒｅ　〜１７８’ｃ；収量１α６１（３δ憾） ＲｆＭα７δ（ゾＷノノール／アｙ令ａア／水閤５！３
１１） この物質は１ｐｗｆ＊４１’として得られる。こＯニス
ｔ＃は水に溶解することにより直ちにけん化する。こ０
１１ｍＩＣ４０〜δ０℃でν冨　１０に保持しながら１
１−力竜イソー〆を滴加する。−値の低下がもはや起ら
なくなった時ｃ１璽−＊＊で中和する・その後、溶液を
湯纏乾圃′しかつア−ｋ）３／に取る。不溶物を濾取し
かつ再度−纏する。そＯ後、イソゾｗＡノールから再結
晶ＩＦする。物質鯰−ＩＦｗりｗ９ｒとして存在する。

収量冨ａｌｌ（６８ｊＧ） ｌｉｔ　　諺α６６（メタノール／りＷａホルム１雪ｌ
） 牛麿清アルｆ竜３’：ｓ、６　＃を水／ジオキ９ｙ（１
゛ｔｌ）２５０−中に溶かし、これにｌ　Ｍ　−ｘａｏ
ｘａ６−を加える。こａｘｉｓ解が始まる。次いで、番
℃に冷却する。こ０１１１１！にり背キ！ｙ６〇−及び
′ＤＭｙ５−中Ｏタレアチ墨ン酪酸１．ＴＩ。

トリゾチルア竜ンＬ７−及びタール４ｍイソブチルエス
テルα９δ−〇溶液を滴加する。

こＯＡラッチ２番時間番℃で攪拌し％　＋ｏ＊流動する
脱塩水に対して３６時間透析する。その後、溶液を凍結
乾燥さ曽る。

４、３０方法を繰返すが、但しＩｃより得られたクレア
チ品ルーメチルー安慮書酸蟲幡に量を使用する。このよ
うにしてタレアチ畠ｙとγルデミンとの間ＯｔＳ橋員と
ｂ″Ｃ０メチル安息書安息有酸る相応する接合体が得ら
れる。

Ｓ）抗血清０ＩＩＩＩＩ造 抗血清取得のため使用し゛た動物の免疫化は次Ｏように
集施する富 動物種冨、羊 免疫Ｊ［：タレアチＪ−ｙａ−３＃　）−メチル安息誉
讃−Ｒａム（！Ｉ！合体） ＊疫化工１ｉｔ Ｏ皮肉　　　　ｌダ　　　　　φ フ　　筋肉内　　　１ＩＩＩ　　　　　　÷１番　　皮
下　　　　１１１Ｉｉ　　　　　　◆ＳＯ筋肉内　　　
１＊　　　　　　φ ６０　　皮下　　　　ｌ＃　　　　　◆以降　　皮下　
　　　１１１１　　　　　　＋Ｌ　試料採血！４δ日目 ０》抗血清０１１Ｒｍ 羊抗麿清に型温で１メーアエＷ−ルを加え、６２時間攪
拌し一遠心分離し、沈澱を廁塵する上澄みに固体°硫酸
アノ％ニウムを徐々にＬ６毫ル／１１！で添加しかつ微
時間番℃で攪拌する。混合物を遠心分離し、上澄みを廁
素する。沈澱を原容積の７５１ｇにしく菖ａ−α０δ−
を食Ｖｔ！ｘ−ｔｏ、５０ｔ　９ａａ−ｈ及び１６０１
　１００ｔ　９　毫に／　Ｉ　ｓ　ｐＨ”ｒ、ｏ　）　
、’ｅ”　０４ｌＩａ０１　ＣＬ１５モル／１に対して
約２４時間透析し、次いで場・合により遠心分離する。

この溶液を次のように更に処理するｉ ＆）１１０１．３ｔリモル／１に対して約Ｉｓ〜１０時
間透析し、その間に透析溶液を敢換え（容量比１　！　
Ｚｏｏ）、沈澱を遠心分離しかつ一票する。この溶液を
νｏ、　ｌ　ｏセＩ４Ｉル／１及びハ０１１δ０ミリモ
ル／１に対してく１２時間透析しく容量比１　！　１０
０）、沈澱を遠心分離する。

別法： ｂ）　　透析をデＷぜオン酸１−／ｊに対して〉２１１
次１ｃ　Ｈ０１１ミリ％＆／ｊに対して）ｇｈ透析しく
容量比１　：　１００）、冨ａｌＧｏ、で中和する。沈
澱を遠心分離しかつ廃棄する。

例１ ’！１１１Ｘム原理 鶴）試薬 前記Ｏム）により製造した゛タレアナエン−３−シーメ
チル安息香酸と、エデスチン並びに牛慮清アルデミｙと
Ｏ接合体を使用する。

前記ｏｎ）　　により得られた抗血清をプｗｇオフ１１
１幡ル／１、次にｍｏ１１Ｌリモに／Ｉに対して透析し
、その後重炭酸塩で中和する。場合により５ＨＯ１３＊
９％ル／１．次にホスフェ−）緩衝液１０１９％ル／ｌ
とＭ＆０１１５０ミリ％Ｊ＆／１０１１に金物（ｐｍ　
７）に対して透析することができる。沈澱を遠心分離す
る。

抗麿清種釈を！Ｉ夏ムＱｌ！Ａ夏テ０−１ト　緩衝剤で
行なう（１１釈して１５分後に沈澱を場合により再度遠
心分離する）。

タレアチ晶ノ溶液宴饋度α２〜１００１１ＩＩ／’ｒＸ
ＩＡＱｔＦＡｌｌ？’　−Ｆｍｌ−１１衝ｉ［ｄｇキ轟
ベツ）（ａｍｌａｍ）中にそれでれ羊の抗Ｒ８ムクレア
チ晶ン抗血清もしくはエデスチｙ−クレアチ晶ン抗血清
（ｘｘｗｈｔ４ｖｈ社０嗜１１−緩衝液で１！６〜１：
５０に稀釈）１ｍｇ、異なる濃度のクレアチニン溶液１
００ａｊもしくは緩衝液１００Ｊ１１ｊ（盲検用）をぜ
ベット装入しかつ６〜１６分間２６℃で恒温保持する。

その後、ｌム一又はＲＳム−クレアチニン接合体■ １〜３Ｉｖ／　Ｔ！ＩＡｑｔｒＡＩ？　　緩衝［−０１
Ｆｉ［＋ｔ’Ｌｆれ２０ｓｌを添加混合しかつＩＩムク
レアチ１）−もしくは■ムタレアチ＆７接合体の添加後
に混濁の増加を光度測定法で３６６　ｍｍ　で測定する
（１□　開始前％］１Ｒ１ｉ始して１ｏ分後）。添付ｍ
ｈｏ嬉１図はこうして測定した検量線であり、クレアチ
ニン血清に対する吸光度差をゾ四ツシした。

例２ ＭＸ５ＸＩＪム原珊（”　Ｌｏｆ　Ｘｓａｍｔｓｍｏｌ
ｏｇｙ”、１２３巻１５４８〜１５５０買（１９７９ 年）の方法と同じ〕 １、　１１７塗布緩衝剤 １ａ、Ｏｆｆ、α２％ル／１、Ｉ１１！Ｑ、３〜９．δ
２、　　ｚｙ　恒温保持緩衝剤 本スフニー）α０５％ル、１１７．２ （ｘｉｔ、ｔｏ４１５’１ｓｖｏ、　Ｗ　２　ａ　５　
ｍｌ／Ｔ　Ｌδ−）Ｍａｉｌ　　α１％８７１Ｓ５．Ｂ
６１／１／９シｙｌｊＧ ！Ｗ・・ｍ２０　　α０５− 璽ａｌ、　　　　　　　　　α０２％ ３　　ｖｙ洗浄緩衝剤 夏ａｏｌ　　α１５峰ル／ｌ、８．、’ｒ６１／１ｔ’
ｖ＊＊ｍ　２０　　α０δ嘩 ：Ｗａｌｌｓ　　　　α０２％ ４　　ＩＦ　基質緩衝剤 ムｒ試験 制剤１個／緩衝剤７６−又は ！１１アト夏　１７ダ／１２３８５番からの緩衝液＆１ ｏｓｔ 微量滴定プレー）をクレアチェｙＳＭム接會体（ｗａｒ
ムδ□　ｓ　Ｉ　／　ｄ　；盲信ｘｇム２００　ｓ　ｌ
　（５０ＡＩ／ｓｓｇ））で塗布し、室温で約１６時間
恒温保持し、その後吸引する。その後Ｘν　３０ＯＳｔ
な施し、恒温保持し、裏皮吸引し％　Ｗ）Ｆ３ＱＱｊｊ
を施し、吸引する。引続いて、クレアチニン血清を施す
。ビＯため、抗血清１ＯＯＯμノをＩＰ　中でｌ　ｔ　
２００〜ｌ　：　２０００に稀釈し、タレアチニン試料
１０１１１もしくはｘｙｌｏａノ（盲信用）と共に室温
で３０分間恒温保持し、このようにして得られた抗血清
稀釈液２００ｊｌ＋ｊをＩＦ１″４Ｉシた微量滴定プレ
ート上に施し、６０分間密閉して（ゾラスチツタ袋）放
置し、吸引し、ｖｙ３００Ｊｌｊを施し、再度吸引する
。

接金体を塗布するために、ム？　　１５０ｍｔＦ／−を
含有するつｔ４抗羊ｘｚａ　ＡＰ　　２００　ｓ　Ｉ　
（ＩＦ　ｌδ−幽りム１で標識した抗抗体δ０ｓｌ）を
魁理した微量滴定プレート上に施し、５７℃で２〜６時
間保持し、その後＠　ＩＩ　Ｌ　、曹　３００Ｊ４で２
回洗浄する。呈色１！！豐るためＯ基質緩衝剤２００１
１１　（７１Ｐ７１７１１ｉＦ／緩衝剤１０−）を加え
かつ混合物を３０〜６０分間恒温保持する。評価は、試
験溶液１５０声ｌを夏−冨δ０Ｏｓｌを用いてα１％ル
／ｊ％４０５鶴で盲信に対し、１１＊ｔ、て行なう。第
２図は員なるクレアチニン濃度で得られた検量線である
・ 例６ ６０セ９％ルホスフエーシ緩衝液（）ｌ［Ｔ、δ）２０
０−に次Ｏ％Ｏを連続的に添加混合する試料（又は盲信
用にへＯ）　　　　α００２−緩衝溶液（ホスフエーシ
δ０ セｌ令ル／Ｉｓ　ｙｍ　　７．５）中 Ｏオキナル酢酸フ×１００　毫 に／Ｊ　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｌｏｏｍ
タレアチ二ノ−ＩＩム抗血清又 はｙ−／ｗデ１！／４ＸＩＯ”テ 毫ル／１（結合部位濃度”）　　　　　　Ｏ，０１ｍｇ
緩衝溶液中Ｏタレアチ晶ン− ！レー）デヒｙｖｘ／ナー４！１１会 体ｌＸｌ０　　％に／Ｉ　　　　　　　　（１０５ｍ水
中の肩ムＤａｌ、４ｘｌＯモル／ｌα０４〇−夏ムＤＨ
溶液の添加後、酵素活性（１７分）を３＋０工諷及び３
０℃で分光光度測定法により測定する。

何番 例３で　記載したように行なうが、オキナル酢酸の代り
にダルコース−６−ホスアエー塾を同量で、クレアチニ
ン−１０）ｌ接合体０代りにダルコース−６−ホス７工
−トデヒＩＰｍ／ナーぜとＤＩＭからの接合体を使用し
かつｗｈｖ菖溶原溶液りに舅ムＤ溶液を使用する。

【図面の簡単な説明】

１：１ｍはｎＭＸム試験におけるタレ７ｆ晶）１０最終
濃度に対する吸光度差をゾ璽ツ）した検量線、第２図は
Ｍ’ｌａＸｍム試験におけるタレアチ二ノの最終濃度に
対する吸光度差をゾ讐ットした検第１頁の続き ｏ発　明　者　へルムート・レンツ ドイツ連邦共和国トウライング ・ヴアルトシュミットシュトラ ーセ７ ■発明者　　ヨアヒム・ジーデル ドイツ連邦共和国ベルンリート ・バーンホーフシュトラーセ６ ０発　明　者　ブリギツテ・パウツツ ドイツ連邦共和国へルシング・ キーンタールシュトラーセ２７ ＠発明者　　ヴインフリート・アルベルトドイツ連邦共
和国ベール・モー スシュトラーセ１０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、特異的にクレアチニンとへゾテンー抗体コンプレッ
   クスを形成するクレアチニン抗体。 ２　特異的にクレアチニンと＾ゾテンー抗体フンゾレツ
   タスを形成するクレアチニン抗体を製造する方法におい
   て１クレアチ二ント、架橋員としての脂肪族又は芳香脂
   肪族カル−ｙ酸を介して結合している抗血清形成に好適
   な蛋白質との接合体を抗血清形成するための角疫原とし
   て使用するクレアチニン抗体の製法３、　カルーン酸架
   橋員が炭素原子少なくとも３個を含有する接合体を使用
   する特許請求の範囲第２項記載の方法。 先　接合体が架橋員としてアルキルフエ品ルカルーン酸
   又はそのオリ−マーを含有する特許請求ｏｖａｖｓｗｉ
   ｓ項記ａｏ方ｓ。 ａ　接合体が蛋白質として血清アルｆミｙ又はエデスチ
   ンを含有する特許請求ＯｆｌｉＷｉｍ２項〜ｊ１４項の
   いずれか１項に岬職Ｏ方法。 ａ　接合体を７田イｙトアジ：ＬＡントと一緒に抗血清
   形成に使用する特許請求の範囲第２項〜第６項のいずれ
   かＩＪＪ＆：記ｌｌの方法。 ７、精製するに当り形成した抗血清から硫酸アンモニウ
   ムＬ８モルまでで析出する蛋白質７ラクシ璽ノを単離し
   、透析しかつ場合により担体結合のクレアチ４ノ接合体
   の免疫吸着及び結合していないクレアチニンとの溶離に
   より更に精製する特許請求の範囲第２項〜第６項のいず
   れか１項に記載の方法。 ａ　特異的にクレアチニンとハシテン−抗体コンプレッ
   クスを形成するクレアチニン抗体をクレアチニン含有試
   料溶液と恒温保持し、クレアチニンとハプテン担持物質
   との接合体と反応寄せるが、その際に抗体と接合体の一
   方の成分は面相又は溶解形で、他方０成分は溶解形で存
   在し、かつ抗体とクレアチａｙ接合体との結合反応の阻
   害を測定することを特徴とす◆クレアチニンを免疫学的
   にｉｉｍする方法。 ９、抗体を抗血清、それから得られた免疫／Ｗプリン７
   ラクシ冒ンの形で又は抗体７うＩメントとして使用する
   特許請求ｏｆｌ１ＭＷｉｌｌｉＢＴＲ記載の方法。 １０、結合反応０Ｉｌｉｌ害を所定の時間間隔における
   免疫沈降の混濁測定により測定する特許請求の範囲第８
   項又は第９１項記載の方法。 ＩＬ結合反応の阻害を１結合していないへゾテン担持物
   質−クレアチらン接合体を標識した抗体で逆滴定しかつ
   結合した又は結合していない標識物質の割合を測定する
   特許請求の範囲第８項又は第９項記載の方法。 １２、酵素又は種酵素で標識した抗体を使用する特許請
   求の範囲第１１項記載の方法。 １＆放射性−又はけい光標謙した抗体を使用する特許請
   求の範！！ｆｌｌ１１項記戦の方法。 １本ハブテン担持物質が、抗体を取得する際にへブテン
   担持物質として使用した物質と基本的には交叉反応しな
   いクレアチニン接合体を使用する特許請求の範囲第８項
   〜第１３項のいずれか１項に記載０方法◎ １５、抗体の取得に使用した、ハプテン担持物質と交叉
   度応するハプテン担持物質を含有するクレアチニン接合
   体を使用し、遊離ハプテン担持物質を抗体溶液と混合し
   、その際に形成した沈澱を分離しかつ得られた上澄みを
   抗体溶液として試験に使用する特許請求ｏｍＮｍＮ第１
   紀 １１１５項のいずれか１項に記Ｉ！の方法。 １７、特異的にクレアチニンと、へゾテンー抗体コｙｆ
   しｙｌＸ＊ｆｌｉ成するタレアチ墨ン抗体、クレアチ＝
   ｙｊ′＾ゾテン担持物質との接合体及び緩衝物質を會宥
   するクレアチニンを角痺学的に測廖するための１ｉｃＪ
   ＩＩ０ １８、ポリエチレングリコールを含有する特許請求の範
   囲第１７項記載の試薬。 １９、抗体が抗血清、免疫１０ゾリン７ラクシ冒ン、抗
   体フラＩメント又は単一り田−ｙ性抗体として存在する
   特許請求１１１ｉ１ｊｌｌフ項又１ｆｊｌｌ１８１［Ｅ
   ＩＯｌｉｃｌｉ。 ２０、抗体を標識した特許請求の範囲第１７項〜第１９
   項のいずれか１項に記載の方法。 ２１、クレアチニン／血清アルジミン−モル比ｌ：ｌ〜
   ｌＸ３０のクレアチニンと血清アルブミンとからの接合
   体０．　５〜５００ｓｌ／ｍ、接合体に対してモル比０
   ．１〜１０の抗体、Ｉリエチレン！リコールα１〜８重
   量襲及びイオン強度α０３〜０．４の緩衝物質、１１Ｍ
   ４〜１０を含有する特許請求の範囲第１７項〜第１９項
   のいずれか１項に記載の試薬。 ２２、活性受容部位に関してクレアチ品ンーへゾテン担
   体接合体に対する抗体１　０’″４〜ｌ　ｏ１４モル／
   Ｉ，クレアチニｙ―！レートデｋｙＦｗ−４　　　　　
   　−１番 ゲナーぜ接合体１０　〜１０　　令ル／１、オキサル酢
   酸０．０５〜６０々リモル／Ｉ，ホスフェート緩衝剤δ
   〜２００１す毫ル／ｌ。 ｐｌ　　６〜ａ５、ｍ１ｎＩｔ　　α０５〜α４ミリ螢
   ル／ｌを含有する特許請求Ｏ＠Ｉ！１１１１７項〜第２
   ０項のいずれか１項に記載の試薬。