JPS5856674A - Ｓｏｐの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒ
ｉｓ）酵母の新規菌株に関する。また本発明絋、メチオ
二冫含量の高いピキアパストリス（Ｐｉａｈｉａｐａｓ
ｔｏｒｉｇ’，酵母の菌株に関する。さらには本発明は
、メチオニン含量の高い改良酵母を用いて、酸素付加炭
化水素基質で単細胞たん白質を生産する方法、およびそ
こから得られる生産物に関する。

１９５０年代に、世界的なたん白質・不足がせまってい
るという予測がなされた。黴生物学的に生産されるｔん
白質が動物の鋼料を補足し、また人間の食物成分として
も使える可能性があるというζとで関心を集めた。

一般に酵母は栄養価が高いことで知られており、長い間
、動物にも、そしてある程度は人間にも、食料不足を補
うものとして用いられた。一般に酵母のたん白質含量は
ヘ＜、おそらく他のはとんどのた４白質源よ）も、ビタ
インＢ類の含量が高い。

しかし酵母は剌た、硫アミノ酸（特にメチオニン）含量
が低いことが知られている。

上記より、動物飼料に酵母を使うときは、メチオニンの
添加が必要なことがわかる０ 必要なのは、単細胞たん白質生産性が高く、メテオニン
含量がずっと高い（上昇している）適幽な酵母であるＯ メテオニン含量の非常に高い（約６．５重量一まで）ピ
キアパストリス（Ｐｉａｈｉａｐａａｔｏｒｉｓ）酵母
の変異株を本発明者は見出した。さらに本発明看はこれ
らの高メテオニン変異株を単細胞たん白質の生産に用い
た。これらの変異株を用いて得゛られた単細胞たん白質
はメテオニン含量が非常に高く、飼料用にメチオ二冫を
添加ｔる必簀婢が大はげに減少、あるいは不要にさえな
った◇ 本発明者の発見したものはいろいろな点で、３６種のメ
チオニン含量の非常に高い新規なピ中７パストリ，Ｘ（
Ｐｉｏｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）変異株を會む０これら
は皆１９８１年９月９日以前κ米国農務省ノーデンリー
ゾヨナルリサーテツボットリー（ＮｏｒｔｈｅｒｎＲ＠
ｇｉｏｎａＩＲｅｓｅａｙｌｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
）Ｋ寄託され、個々の薗株−はそれぞれζζκ示した寄
託番号がついている。

微生物は長い進化の過程の中で、不要な代謝物を過剰に
作シ出さないようＫする、よシ厳密な制御゛機構をつく
シあけてきたと考えられている０すべての微生物は生存
のために、アζノ酸のような細胞成分の生合成をコント
ロールしなければならない。黴生物によるアミノ酸の生
合成には主に２つの機構が存在すると考えられているｏ
（１）ア宥ノ酸生成反応の最終生産物κよる、この一連
の反応の最終の反応をフィードバック阻害する、酵素活
性のアロステリツク阻害、（２）酵素合成の遺伝的抑制
あるいは抑制解除として考えられる大まかな制御０ 生成したメチオニンを酵母細胞よク除去しないかぎり生
合成酵氷の活性を上げるのは不可能であろうし、またメ
チオニンの生合成は酵母細胞κよって厳密に制限されて
いるため、生合成酵素を＝一ドしている遺伝子を余分に
加えたｐ挿入したルしても、メチオニン増加という点で
は、たとえ効果があったとしてもあま９大きくないよう
に思えた。したがって本発明者は７イードパツク阻害中
フィードバック抑制を受けない、メチオ異冫合成の制御
機構を通らない方法Ｋ注目した０われわれは本来厳密に
コントロールされた細胞の制御機構を妨害する方法を開
発し、それによルメチオエンを過剰生産するビキアパス
トリスの変異株を作シ出した・一゛株改良のためにわれ
われが用いた方法は、類似体を用いてメチオニン合成を
支配する制御を免れる方法である。これらの類似体はメ
チオニンの毒性類似体あるいは反代射物と呼ばれる．わ
れわれの知る限りでは、ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉ
ａｐａａｔｏｒｉｓ）由来で高メチオニン含有菌株はこ
れまでのところまだひとつも開発や生産はなされていな
い。またわれわれの知る限り、酸素付加炭化水素飼料で
増殖させた菌株より得られる高メチオニン含有ｔキアパ
ストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｇ）株から単細
胞たん白質は、これまでひとつも得られていない。

われわれが開発したメチオニン含有．量の高いビキアパ
ストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｇ）株は、ｔキ
アパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｇｔｏｒｉｓ）ＮＲＲ
ＬＹ−１１４３０より得られる。このビキアパストリス
（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＮＲＲＬＹ−１１４
３０自身は非常に便利廃２な性質を有しており、高無機
塩濃度中で特によく増殖するため発酵液中での酵母の細
胞濃度が上昇し、また酸素付加炭化水素鋼科（特に低級
アルコールがよく、メタノールが最も好ましい）で高い
生産性を示す。

コｏＭＲＲＩＩ！−１１４５０という命名自体が、この
親株が米国ｊＩｓ省、農業研究サービス、ノーデンリー
ジョナルリサーチラボｙトｖ−（ペオリア、イリノイ６
１６０４）に公式に寄託されたことを示す。この菌株と
共に適尚な培養菌株を寄託することによシ、下記の如く
寄託機関よｊ）ＩＩＲＲＬＹ−１１４３０の個々の誉号
がつけられた。

本発明の一態様において、このビキアパストリｘ（Ｐｉ
Ｏｈｉ＆ｐａｓｔｏｒｉａ）ＮＲＲＬＹ−１１４３０ｔ
ｌＡ理して、メチオザン生産能カがきわめて高い３６個
の突然変異株をつくった。

これら３６個のピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓ
ｔｏｒｉｇ）の変異株は、それぞれが＆二一クで新規で
あク、これらも上記の寄託機関に寄託した◎これらのユ
ニークな培養菌株は高無機塩換度で特によく増殖し、好
気性発酵条件下で酸素付加炭化水素の発酵では高い薗体
淡度１が得られ、酸素付加炭化水素飼料（特にメタノー
ルのような低級アルコール）で高い生産性を示す。われ
われの得たこれらのユニークな菌株は次のように番号を
つけられた。

上記Ｍ′ＮｔＬ誉号は、われわれが６６個の新規な酵母
菌をそれぞれ公式の寄託機関に寒天斜面培養を２本ずつ
寄託したことを示し、寄託機関よ９こζに示したような
菌株喬号を与えられたことを示している。

本発明の一態様は、これら３６種の新しい培養曹（菌株
）に属する酸素付加辰化水素資化性黴生物を水性好気性
培養条件で培養する方法を供する０ピキアパストリス（
Ｐｉｃｈｉａｐａｔｃｏｒｉｓ）よ夛得られたこれらの
新規で３−二一クな微生物は、おのおの次のように分類
されている。

門二子のう菌類 綱：原生子のり薗類 目：工冫ド〈セターレｘ（ｍｎｌｏｍｙｃｅｔａｌ●−
）科：ナツカａ４％セタツシー（ａａａｃｈａｒｏｍｙ
ａ＠ｔａｃ＠ａり属：ビキア（Ｐｉｃｈｉａ） これらのユニークな菌株は次表κ示した性質によ少さら
に特徴づけられる。

本発明はある点において、アルコール資化性のいかなる
ビキアパストリス（Ｐｉｏｈｉ亀ｐ亀＠ｔｏｒｌ４）甑
株にも適用できる。必ずしもすべてのビキアパストリス
（Ｐｉａｈｉａｐａｇｔｏｒｉｓ）菌株が低級アルコー
ルを資化する能力を持っているのではないから、これは
重要なことだと考えられる．しかしながらこのように特
徴づけられた菌株は、メチオニン生産能力の高い他の突
然変異株を生産することができる、ビキアパストリス（
アｌｏｈｌａｐａｓｔｏｒｉｓ）の適切な出発菌株であ
ると考える． 以下のすべての例において、使用した培地は下記のもの
より選んだ。

ａ）すべての培地は４Ｘ１０−’Ｉ／ｔの一オチンを含
む。

１））ＴＭ黴量金属、Ｏｕ８０４・５ｍｇｏ、６０ｗ；
”ｅ８０ｑ”Ｍｎｌ３０，．Ｈ，Ｏ、３００１１ｇ：Ｍ
ａｌＭ００，・２−０、２ｏｏｉｖ；ＨＢ”’ｓｓ２０
’ｌ：ｚｎｓｏ，・７Ｔ１＠Ｏ、２１；１●ａｔ，．６
Ｈヵ０、４．８ｊ’；ち０、ｉｊ；Ｈ，８０４，３１Ｌ
′．酵母の連続培養法については、１９８０年１月１５
日付出願のＰｒｏｏ出願番号第１１０，４５７号の同時
係属出願に説明してある． 本発明の新規酵母のメチオニン含量の測定はマツケンジ
ーとテナシュク（ＭａａＫ＠ｎｇ１＊ａｎ４テ●普ａ−
５ｃｈｕｌｃ）（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ９７
，１９−２４．１９７４）の方法により分析した。

指数増殖している酵母細胞を（メチオ品ンに対する）抗
代謝物を含むＩＭ２Ｇプレート上に広げた。われわれの
選んだ抗代謝物はエチオニンである。！レートは３０℃
で数日間インキユペートした。エチオ１冫耐性のコロニ
ーを採取した．培地中に存在するメチオニンの類似物質
は細胞中のメチオニンの合成を止める。もちろんこの類
似物質れ はたん白質中Ｋはとりこま庫い。そし【この処理方法は
エチオニン耐性のコロニーの選択、そして高メチオニン
生産株の選択を可能にする。

別法として、この酵母を突然変異誘発物質に接触させた
．突然変異誘発物質は種々の化学物質や照射物質から選
択できる。不可逆性で、菌株の退化が避けられるようｋ
なった突然変異株が好ましい．われわれがつくり、発見
し、寄託した突然変異株では、菌株の退化はまったく認
められず、したがって工業的使用ｋは最適と考えられる
．選んだ央然変異誘発物質は、不可逆的突然変異をひき
詔こすことができるだけ強力でなければならない。′あ
る場合には弱い突然変異誘発物質を強いものと組み合わ
せることもできる。弱い央然変異一発物質とし【は、２
−アミノゾリン、５−デロモウツシル、ヒドロキシルア
ミン，水硫化ナトリウムなどがある。強い突然変異誘発
物質としては、スルホン酸エチルメタン、ニトロソグア
ニジン（Ｍ−メチルー菖一二トロンーＮ−二トロソグア
ニジン）、ＸＯＲ１９１（アクリジン誘導体のひとつ、
ミツ−（Ｍｉｌｌｅｒ）著「］！ｘｐ＠ｒｉｍ＠ｎｔｓ
ｉｎＭｏｌ●ｏｕｌａｒＧ＠ｎｅｔｉｃｓＪ（１９７２
、コールドスゾリンダハーパーラボラトリー）８１３０
頁の第１５▲図の構造参照）、亜硝酸（やや多量必要な
こともある）、多量の紫外線照射、Ｘ線などがある． 現在好ましいのは、入手し易さ、比較的強い突然変異誘
発性、取り扱いが比較的容易で安全なことから、スルホ
ン酸エチルメタンである．本発明はアルコール資化性ビ
キアパストリス（Ｐｉｏｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株に
広《適用可能であり、技術上周知の量と接触方法を用い
て、いかなる強い突然変異誘発物質も使用できる． ここに示す実施例で、われわれの発見し蕾菌株を得る特
別な方浩をさらに詳しく説明する。

１００１のＹＭ培地Ｋ１白金耳（約０．５−１０×１０
６細胞）のピキアパスダトリス（Ｐｉ＠ｈｉｌＬｐａｓ
ｔｏｒｉｌ）ＭＲＲＩ＋Ｙ−１１４３０ｋ接種シ％ｌ１
転ｍ盪機（二二一デツンズウィックサイエンテイフイ７
／，Ｇ−２５製）上で３０℃で一晩インキユペートシた
。８−１２時間間隔で，培養液をその濁度に応じて２０
−１００倍希釈した。したがって１−５一の増殖培養液
を新しいＹＭ培地で１００１ＩｊＫ希釈した．このよう
な希釈操作の２日目の最後に行なう第４回目の希釈で、
さらに８−１２時間インキユベーションした後で，（Ｓ
ＯＯｎｍの吸光度が約１．０になるようにした．適切な
希釈率は試行錯誤で決めたが、一般的には約１００倍で
あった．もつとも実際の希釈率はこの値とは大きく異な
り、たとえば１０−５００倍であった。

ＩＭＩＧ培地中で指数増殖している酵母の１０一を２５
０−の三角フラスコに添加した。ここにスルホン酸エチ
ルメタンな０・４ｍ加え、回転振盪器（ニューデツンズ
ウイツクサイエンティフィック、０−２５溢）上で室温
（２５℃）で４５分間振盪する．生存率カウントで測定
すると、このインキュペーシ運冫により酵母の９８一以
上が死滅した．次にこのスルホル酸エチルメタンで処理
した培養液を約ｉｏ．ｏｏｏｘｙで１０分間遠心し、酵
母とスルホン酸エチルメタン（培地を含む）を分離させ
た。酵母を再び４０１１１４のエ−１培地Ｋ浮遊させ、
約１０，０００ｘｊｌで約１０分関連心した．こうして
洗浄した酵母を１００ｄの新しい工ＭＩＧ培地に浮遊さ
せ、６０℃で約１０時間（１−２世代）インキユベート
した。生存酵母の細胞書度をペトロフーハウデ−（Ｐｅ
ｔｒｏｆｆ−Ｈａｕｓｓ＠ｒ）鼾測ｆ’ｆ／パーで測定
した。次ＩＣＩＭ１ＧＩｌｌあるいはＩＭ１ＧＭＬ培地
を含むプレートに広げたときに、プレート１枚あたり１
５０−２００コロニーが得られるようκ必要な希釈を行
なった。！レートを６０℃で３日間・インキユペートシ
、さらに精課するために生存コロニーをようじで採取し
た． 分．離した単一コロニーを０．５−のｎｔ．２ｇ培地に
浮遊した．プレートを５０℃で２日間インキユペートシ
た．最初の画Ｈ’１！＊ｆレートより単一コロニーを採
取し、０．５−のＸＭｇ培地に浮遊させ、再び工Ｍ２Ｇ
培地を含むプレートに画線接種した。このようＫ精製し
た物質を以下に示すようにクロスフイーデイング（ａｒ
ｏｓｓｆ●ｅｌｉｎｇ）実験を行った．オハ、イオ州コ
ロンデス、オハイオ州立大学のパテルスジエネテイツク
ストックセンター（Ｂｍａｉｌｌｕｓ（｝＠ｎ＠ｔｌｓ
ｔｏｏｋＯｓｎｔ＊ｒ）より供給されたＢ．ｆチｗｘ（
Ｂ，ｓｕｂｔｉｌｉｓ）１▲１４５（ｐｕｒｙ６ｍｅｔ
ＢＳ力８ｈ４）ｔｏ約１００万［ｉｌ＆−、ｎｔ２ａ培
地（アテニンとロイシンを５０μ１１ｌｄずつ加えてあ
る）を含む！レートの上κ広げた。前記したエチオニン
とノルロイシン添加で得られたコロニーの血存酵母を、
枯草菌を接種したプレートに格子状Ｋ接種した。！レー
トを３０℃で５日間インキユベートシ、枯草菌κまわり
を取り囲まれて増殖し【いるコロニーをさらに試験する
ために集める。

２５０１１７用三角フラスコ中の１０ローのｌＭ１Ｍ培
地に、クロスフイーデインダ（ａｒｏｓｅｆ●●覆ｉｎ
ｇ）夷験（前記）より単離した酵母を接種した．ガスク
ロマトグツフイーで濁定してメタノールがすべてなくな
るまで三角フラスコを室温ｋ保っ．培養液の１部を凍結
乾燥機で直接乾燥させ、別の１部を約１０，０００ｘ＆
で１０分間、随時遠心分離した．遠心分離後の上清とペ
レット画分も共に凍結乾燥させた．前記した方法を用い
てすべ【の試科のメチオニン含量を欄定した。その結果
を表に示す。

親株の酵母κ対してきわめてメチオニン含量の高い突然
変異株が多数得られた。さらｋ％凍結乾燥細胞と遠心分
離細胞を比較夾験すると、ほとんどすべてのメチオニン
が酵母細胞の中にとりこまれていた．したがって飼料調
製のようなこの後の加工段階で失なわれるようなことは
ないだろうと思われた．したがって本発明の高濃度メチ
オニン含有酵母は、栄養間からみて利用可能なメチオニ
ン濃度の高い補強たん白質になると思われる．本発明の
一態様Ｋよれば、好気性水性発酵（好ましくは連続発酵
）を用い、酸素付加炭化水素性の適尚な炭素エネルヤー
基質（特に低級アルコール、好ましくはメタノールある
いは工．，タノール）で、栄養無機塩、資化可能な窒素
源、酸゛素、そして必要に応じ一オテンおよび／あるい
はチアミンなどのビタミンを添加し、われわれの開発し
た変異株のどれかひとつを用い、好気性発酵培養からメ
チオニン含量の高い単細胞たん白質が生産される。

酸素付加炭化水素原料の好気性発酵の，どのような標準
的発酵条件でも用いることができる。現在好んで用いら
れる条件は、発酵液中で高濃度が維持できる条件である
。黴生物を正常に増殖させ、微生物変換過程における細
胞の炭素およびエネルイー源の資化をできるだけ大きく
シ、発酵培地中で細胞濃度が最も大きい最大のａｍ収率
な得るためＫ，選んだ無機栄養物を正しい比率で適切な
量だけ、供給培地の中へ供給する必要がある．ひとつに
は用いた酵母と基質により、発酵液の組成は広範囲に変
化するが、本発明Ｋｉｄける発酵液（すなわち液体と細
胞の合計）中の無機物含量は比較的高く、これまで先行
技術において適切あるいは実際的と考えられてきた濃度
よりも高い．下表に示したのは、発酵液中の種々の元素
の最小必要量、使用可能な広範囲の量、そして好ましい
範囲の量を示してある．濃度は元素として表示し【ある
が、元素のすべ【あるいは一部は可溶性イオンの形で、
あるいはＰのようにリン酸塩のような結合製で存在する
場合もあることは知られ”Ｃ＆Ｎる．４ｒ元素の量は発
酵液（細胞を含む水層）１ｔあたりのグラム数あるいは
鷹リグラム数で示してある。

イオウは硫酸塩の形で用いるのが好ましい．必要な金属
のいくつかを硫酸塩の形で加えれば、ふつうイオウが最
小必要量よりは多《加えられるため有効である．表に示
した金属の′いくつかあるいはすべては、硫酸塩として
使用できるし、また硫酸塩が存在する．マグネシウム、
カルシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガンは硫酸塩あるいは
塩化物として用いるか、あるいは硫酸塩あるいは塩化物
ｋ変換される化合物の形で用いることが好ましい．カリ
ウムは硫酸塩、塩化物、あるいは９ｙ酸塩として用いる
か、あるいはこれらκ変換される化合物の形で用いるこ
とが好ましい．リンはＶ冫酸、あるいはリン酸塩、一水
素リン酸塩、二水素リン酸塩（たとえばカリウム塩ある
いはアンモニウム塩）の形で用いるか、あるいはこれら
の塩κ変換される化合物として加えることが好ましい．
少なくともトレース量で存在する他の元素としては，ナ
トリウム中コバルト（たとえば八ロｒ冫化物あるいは硫
酸塩）、モリデデン（たとえばモリブデン酸塩）、ホウ
素（たとえばホウ酸塩）、セレン（たとえば亜セレン酸
塩あるいはセレン酸塩）、ヨウ素（たとえばヨー化物）
などがある．典鳳的な高ａ胞濃度発酵では、゛発酵液は
体積にして約半分の上清培地と半分の細胞を含む。しか
しながらこの体積にして半分を占める細胞は、発酵液の
無機塩含量の少なくとも約６分の２を含有する． 水性発酵条件に現在好んで用いられる基質は、かなり水
溶性の炭素一酸素一水素化合物である．「酸素付加炭化
水素」とは、使用可能な化合物を記述する本開示に詔い
て一般名として用いており、必ずしも基質の由来を限定
するものでない．本一示における酸素付加炭化水素とは
、水溶性の炭水化物、およびかなり水溶性で１分子あた
り１から２０個の炭素原子を含むアルコール、ケトン、
工１ ステル、酸、アルデヒド、および混合物を含む。

酸素付加炭化水素としてはたとえば、メタノール，エタ
ノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、
１−プロパノール，２−ｒロパノール、グリセロール、
１−デタノール、２−デタノール、３−メチル−１−デ
タノール、１−ぺ冫タノール、２−ヘキテノール，１．
７−へ！タンジオール、１−オクタノール，２一デカノ
ール、１−ヘキサデカノール、１−エイコナノール、ア
セトン、２−ゾタノン、４−メチＪ／−２−ぺ冫タノン
，２一デカノン、３−ぺ冫タデカノン、２一エイコサノ
ン、ホルムアルデヒド，アセトアルヂヒド、ゾロビオン
アルデヒド，デチルアルデヒド、ヘキサノール、７−メ
チルオクタノール、テトッデカナール、エイコナナール
，酢酸、ゾロビオン酸、酪酸、グルタール酸、５−メチ
ルヘキサン酸，アゼクイン酸、ドデカン酸、エイコナン
酸、イ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酪酸ゾロビ
ル，ヘキサン酸イソプロピル、５−メチルオクタン酸ヘ
キシル、ドデカン酸オクチルなどとそれらの混合液があ
る． 現在好ましいのは、炭素原子１から４個の水溶性アルコ
ール，炭素原子２から４個の水溶性の酸、および水溶性
炭水化物である。好ましいのは水溶性１水酸基脂肪族炭
化水素アルコールである。２−メチル−１−プロパノー
ルはいくつかの酵母κ対して阻害作用かあることに注意
すべきである。

そしてこのような酵母な用いる発酵ではこのアルコール
は避けるべきである．現在最も好ましいのは炭素原子１
か４個のアルコール（２−メチル−１−プロパノールな
除く）である。このうちメタノールとエタノールが他κ
比較し【最も好まし−１。

そし【比較的コストが低いためメタノールか最も好まし
い。

メタン、エタン、その他の酸化のように、石油ガスは酸
化され、水溶性物質が用いられ、対厄するアルコールや
種々のアルデヒド、ケトン、酸などを主κ含む混合液か
得られる。時Ｋ石油化学コンｔナートと呼ばれる総合的
精製、化学加工複合体で生章される種々の石油精製原科
からの、同様Ｋ適切な炭化水素画分も発酵のためＫ使用
できる。

増殖中の細胞が盛んＫ摂取するため、上清中の塩濃度は
比較的低い。細胞中の無機塩は、いくつかは結合有機型
になることもあるため、供給したままの形でないことも
ある．もちろん発酵液の無機塩の分析により、総無機塩
含量がわかるであろう。

技術上周知なようＫ，選んだ酵母の増殖にビメζン（有
機増殖因子）の存在が好ましいときは、無機塩以外にリ
タミンを発酵液に加えてもよい．発酵自身は、微生物の
急速な増殖を助けるためＫ発酵液の酸素分圧を有効に維
持させる、分子状酸素の必要な好気性プｐセスである．
分子状ＩＩ！素は空気や酸素を強化した空気、あるいは
大部分純粋な分子状酸素のようκ、分子状酸素を含む気
体Ｋより供給される．酸素付加炭化水素基質聖用いるこ
とにより、微生物の増殖に必要な総酸素必要量は、パラ
フィンを用いた時の必要量より減少する．それでも、基
質の資化とそれに対応する黴生愉の増殖は、部分的Ｋは
燃焼工程であるから、充分な量の酸素の供給が増殖κ必
費である●酸素不足Ｋより酵母の増殖が制限されること
のないような速さで、分子状酸素を発酵液に供給しなけ
ればならない．発酵檜の設計により、酸素の培養液への
移動能力が大きくかわる．総通気速度はかなり広範囲に
変化するが、効率的な駿素移動を持つ発酵榴では一般κ
通気速度裔キ、１分間Ｋク會発酵檜の液量１ノあたりの
分子量酸素を含む気体を、約０．５から８、好ましくは
約１から６部＜＊用し【いる圧力と２５℃において）通
気する．ζθ量は、通常量の酸素な含有する空気を反応
檜ｋ供給した場合κ基づいて計り、純粋の分子状酸素の
場合は、１分間κつき発酵槽の液量１ノあたりの純粋の
分子状酸素はそれぞれ約０．１から１．７、好ましくは
０．２から１．３部（使用している圧力と２５℃におい
【）となる。

微生物の発酵に使用する圧力範囲は大きく変動する．典
型的圧力は約０から１５０ｐｇｉｇで好ましくは約０か
ら６０ｐｍｎｇ，装置と運転費用と酸素溶解度のバラン
スを保つために、さらに好．ｔし《は少なくとも大気圧
より少し高い圧力である．大気圧より高い圧力は水性発
酵液中の溶存識素濃度を上げ、これが細胞増殖速度を上
昇させるという長所がある．同時Ｋ圧力を上げると装置
と運転費用が増加するためＫ前記の利点声うちけされる
。

発酵温度はいくぶん変動するが、一般に約２５℃から６
５℃の範囲にあり、好ＩＬ＜は約２８℃から５０℃であ
る。しかしこれらの菌株の場合は約３０℃付近が好まし
い。

酵母は資化可能な窒素源を必要とする．資化可能な窒素
は、窒素含有化合物あるいは、酵母κよる代謝利用に適
した形の窒素な放出することができる化合物Ｋより供給
される。たん自加水分解物のようＫ株七の有機窒素源化
合ＩＩＩＪを用いることは技術上可能であるが、ふつう
はアンモエ７、水酸化アンモニウム、尿素、およびリン
酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、ピｑリン酸アン毫
二クム、塩化アンモニウムなどの種々のアンモエクム塩
のような安い窒素含有化合物な用いることかできる●気
体のアンモニア自身は大規模操作に適しており、適量を
水性微生物発酵液の中へ発泡させ【使用することができ
る。同時Ｋこのようなアンモニアはｐ｝１：Ｆントロー
ルκも役立つ。

この水性微生物発酵液の中のーの範囲は約３から７の範
囲であり、好ましくはそしてふつうは約３．５から５．
５である。ある微生＠かどの範囲の一を好むかはある程
度用いる培地、用いる微生一κより、したがって癲業者
に容易に測定でぎるように、培地の変化Ｋよりいくぶん
変化することもある。

発酵槽内の発酵液の平均保持時間は、あるｓｊｌ！発酵
温度や使用する酵母κより、かなり変動する．ふつうは
保持時間は約２から３０時間であり、好ましくは現在は
平均保持時間で約４から１４時間である。

前記した炭素およびエネルイー基質のいくつか（＃Ｋメ
タノールあるいはホルムアルデヒドなど）は，充分な微
生物の増殖κ阻害作用かあり、発酵中の微生一κ対し有
毒でさえあることもある．したがって比叡的高濃度の基
質は避けるべきであり、発酵液中の基質濃度は最高の許
容濃度Ｋ維持することが好ましい。いくつかの低級アル
ー−ルκついては発酵液中のこのレベルはふつう約０．
００１から５体積一で、好ましくは約０．０１から０．
０５体積一である。一方アルデヒドの場合は選んだ微生
物を飢死させたり、増殖速度を阻害したりしないように
するために、このレベルはアルデヒドの毒性のためＫア
ルコールの１０分の１Ｋすべきである。

炭素およびエネルイ源物質が、アルデヒドな微生物に害
を与える可能性のある濃度で含む場合は、まず基質を適
尚量の窒素含有化合物（好ましくはアンモニア、水駿化
アンモニウ五、あるいは他の活性アンモニウム化合物）
ｖ，アルデヒド１％ルにつきそのような窒素含有化合物
を約０．０１から１０モル相当の比率で処理することに
より、゛アルデヒドの悪影響は軽減される。このように
処理した基質は炭素エネルイー源κなるはかりでなく、
必要な資化可能な窒素の少なくとも１１１１ｋ−含む。

都合のいいことに、発酵は炭素含有基質が制限因子とし
てコントロールされるように行なわれ、したがって炭素
含有基質の酵母細胞への高い変換効率が得られ、また酵
母細胞が多量の・非変換基質κよク【汚染される可能性
な避けることができる。

水溶性基質のときは残った微量でも容易Ｋ洗いさること
ができるので、汚染は問題ではない．しかし高．級ｎ−
パラフィンのように非水溶性基質の場合は、適切な溶媒
洗浄Ｋよる畏存炭化水素の除去のような添加生成物処理
工程が必要Ｋなるため、汚染か問題となる． 均一な生成物を均一な量だけ住産することが管理し易い
こと、及びすべての装置の最も経済的な使用という点か
ら、連続操作がきわめて望ましい。

連続操作では、基質としての炭素エネルギー源、水性無
機塩培地，資化可能な窒素源、そして分子状酸素を含む
気体が、発酵槽中の発酵ｉ［Ｋ連続的Ｋ供給され、それ
と一緒に発酵ｉ［が連続的に除去される．ある程度炭素
含有基質の性質Ｋより、添加した炭素エネルギー基質と
添加した水性無機塩培地の量の比率は広範囲Ｋ変わるが
、ふつうはこれは約１：９から６：４であり、現在好ま
しくは約２＝８から５：５の範囲である。

必要な場合は、水性無機塩培地を発酵槽へ加える前Ｋ，
炭素エネルヤー源物質の一部あるいはすべて、および／
あるいはアンモニアのような資化可能な窒素源の一部あ
るいはすべてを水性無機塩培地に加えることができる。

高細胞換度発酵Ｋおけるわれわれの仕事の中で最も都合
のよかったのは、約４０体積一のアルコールと６０体積
一の無機塩培地の比率を使用したことである．炭素およ
びエネルギー源の濃度、一、溶存駿素、発酵檜からの排
ガス中の駿素あるいは二酸化炭素、元透過法により測定
される細胞濃度などの、発酵槽Ｋ導かれる各流れは好ま
しくはあらかじめ決められた速度、あるいはモニターす
ることにより側定できる必要事項に対する応答κ応じて
コント■−ルされる。最大の細胞増殖速［ｔ−得ること
、炭素とエネルギー源を有効に利用すること、供給基質
Ｋ対し最大の酵母細胞収率な得ることのためκ，種々の
物質の供給速度は変化する．したがってある鵬度は用い
た基質により、われわれの発明の方法でｆ家酵母細胞は
、基質１００ｇ．あたり約３０から１１０グラムの収率
が得られる． すべての装置、反応槽すなわち発酵装置、蓉器、パイプ
、循環あるいは冷却装置などは滅曹するのが望ましく、
ふつうは蒸気を用いて約２５０″Ｆ（１２１℃）で少な
くとも約１５分間処理する．分子状酸素や炭素含有基質
などのすべての必要な栄養物の存在下で、滅菌反、応槽
Ｋ培養した特定の黴先物を接種する。

使用する発酵槽の董は本発明の発酵過程に決定的な影譬
な与えるものではないが、現在好ましいのは気泡充満製
発酵檜中での操作である．生成した気泡を増加させたり
一持させたりするように設計された発酵槽は、所期の高
細胞淡度や高い増殖速度を維持するのに必蚕な酸素移動
を増加させる工騙に有効である． 発酵を始めるとぎは、水性無機塩培地、適切な濃度の炭
素源、資化可能な窒素、必蚤な場合には微量成分、およ
び酵母の接種量を滅菌発酵槽Ｋ加え、適切な流量の駿素
および種々の供給装置なゆつくり始動させる．もし必要
なら、最初の発酵基質はブドウ糖のようなもので始めて
、細胞濃度が増加するにつれて徐々にメタノールなどκ
変え【い〈こともできる．水性発酵液の低無機塩１１度
から始めて、高濃度の無機塩ｖＶする水性無機塩培地を
発酵液の中Ｋ加え【高無機塩濃度κもっていくことは可
能である。しかしわれわれはふつう発酵槽Ｋ高無機塩培
地を加えるだけで、ただちＫ操作を始める．＊種菌が加
えた塩類や基質を充分Ｋ摂取して利用が始まる充分な細
胞裔度Ｋ達するまで、スタート時κはふつう短い時間の
おくれがあることは当業者に容易Ｋ理解できる。

高細胞濃直プロセスＫおいて生成する酵母細胞は回収さ
れる。もし必要なら、通常法によりはとんど細胞のはい
っていない上清液から細胞外生成物を回収することもで
きる．たとえは＃ｌとんど細胞のはいっていない排出液
を７七トンあるいは低級アルコール（メタノールあるい
はエタノールなど）により処理し、細胞外に生産される
いかなる高分子物質でも沈澱させることができる。この
細胞を含まない排出淑はまた溶媒抽出および／あるいは
塩基抽出により、もし必要なら他の細胞外物質（たとえ
ば培養中に生成する色素、ビタミン、有機酸）を回収す
ることもできる。このような途中の処理の有無にかかわ
らず、細胞を含まない排出液は、排液処理の問題をでき
るだけ避けるために、水分補給の一部あるいは大部分あ
るいはすべてとして発酵檜にもどすこともできる．黴生
一細胞はふつう熱あるいは化学的千段Ｋより殺し、これ
は発酵槽の排出液から細胞を分離する前でもあとでもよ
い。酵母細胞は人間にとっても動智にとっても価値ある
たん白質源である。人間が消費する場合は、必要に応じ
処理ｔして核酸を減らすが、動物の飼料として用いる場
合は今のところそのような処理は不必要のようである．
高細胞撮度操作を用いるプ鴛セスでは、たとえは発酵混
合１［１ノあたり約６０から１６０グラムの酵母細胞（
乾燥重量）、好ましくは約７０から１５０グラムが高収
率で得られる。もし必要なら遠心分離その他の分離手段
で細胞を発酵混合液から分離できる。またもし必要なら
、濃縮細胞は水を混合するなどして洗一し、再遠心する
などして分離し、あるいは遠心前または遠心中に水を加
えて細胞より無機塩培地を充分に除去することができ、
分離した無機塩埠地ｔ含む洗浄液は水分および無機塩培
地の補給用に発酵槽にもどすことかでき、こうすること
により排水処理問題をはとんどあるいは完全になくすこ
とができる。回収された細胞は単に乾燥するだけで、将
来の使用のための乾燥物が得られる。もし必要ならこの
高細胞濃度発酵檜排出液全体を乾燥させて、細胞と塩類
ｔ含む残存水溶性物質が得られ、この全乾燥物は高たん
白質性高塩類含有性の非常Ｋｖ用な動物飼料とし【使用
できる。

データを含む本開示はこの発明の価値と有効性′ｌｋ：
説明している．本発明の例、本発明の分野の知識や背景
、微生物学、化学、および他の応用科学の一般原則か基
礎となって、条件の範囲、構成成分の一般的グループを
含む本発明の広範囲の記載がなされ、これが特許請求の
１範囲の基礎Ｋなっている．

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）好気性水性発酵条件下で、メチオニン産生簡の高
   い少なくともひとつのビキアパストリス（Ｐｉａｈｉａ
   ｐａ＠ｔｏｒｉｇ）種を水性発酵で、有効量の酸素付加
   炭化水嵩エネルヤー源、資化可能な窒素源、および無機
   塩を用いて培養し、意生される一胞生童物を単細ｊ１九
   ん白質物質として回収する、単細胞九ん日質物質の製造
   方法において、この高メチオニン産生ビキアパストリス
   （Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）種が ピキアパストリス（Ｐｉｏｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ
   −１２４３７ビキアパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｇｔ
   ｏｒｉａ）！−１２４３８ビキアパストリＪ（Ｐｉａｈ
   ｉａｐａｇｔｏｒｉ８）！−１２４３９ビキアパストリ
   ｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａム切ｔｉｅ）Ｙ−１２４４０ピキ
   アパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１
   ２４４１ビキアパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｃｙ
   ｒｉａ）Ｙ”１２４４２ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉ
   ａｐａｅｔｏｒｉａ）Ｘ−１２４４３ピキアパストリｘ
   （Ｐｉｃｈ１ａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４４４ビキ
   アパストリス（Ｐｉｏｈｉａｐａｓｔｏｒ１ｇ）！−１
   ２４４５ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒ
   １ｇ）！−１２４４６ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ
   ｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４４７ビキアパストリｘ（
   Ｐｉａｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１２４４８ビキア
   パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２
   ４４９ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉ
   ｓ）！−１２４５０ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ’
   ｐａｇｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４５１ビキアパストリス（
   Ｐｉｃｈｉａｐａ＃ｔｏｒ１！）！−１２４５２ビキア
   パストリス（Ｐ１ａｈ１ａｐａｇｔｏｒ１ｓ）Ｙ−１２
   ４５３ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｇｔｏｒｉ
   ｅ）Ｙ−１２４５４ビキ，アパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａ
   ｐａａｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４５５ビキアパストリス（
   Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１２４５６ビキア
   パストリス（Ｐｉａｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１２
   ４５７ビキアパストリｘ（？ｉｃｈｉａｐａｇｔｏｒｉ
   ｓ）！−１２４５８ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐ
   ａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４５９ビキアパストリｘ（Ｐ
   ｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒ’ｉｓ）Ｙ−１２４６０ビキア
   パストリｘ（Ｐｉｃｈｌａｐａｓｔｏｒ１ｇ）Ｙ−１２
   ４５１ビ−？７パストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒ
   ｉｓ）！−１２４（５２ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉ
   ａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−１２４６３ビキアパストリｘ
   （Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉａ）Ｙ−１２４６４ピキ
   アパストリス（Ｐｉｏｈｉａｐａａｔｏｒｉａ）！−１
   ２４６５ピキアパストリｘ（Ｐｉａｈｉａｐａｓｔｏｒ
   ｉｓ）！−１２４６６ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ
   ｐａｓｔｏｒｉｇ）！−１２４６７ピキアパストリス（
   Ｐｉａｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１２４（５８ビキ
   アパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１
   ２４６９ビキアパストリｘ（Ｐ１ｃｈｉａｐａｓｔｏｒ
   ｉｓ）！−１２４７０ビキアパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａ
   ｐａａｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４７１ビキアパストリス（
   Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１２４９５よル成
   る群から選ばれることを特徴とする、上記単細胞九ん白
   質物質の製造方法。
2. （２）エネルヤー源が、アルコール、ケトン、アルデヒ
   ド、有機酸、エステル、あるいは混合液よ）成る群よ〉
   選ばれ九化合物である、特許請求ＯＩＩ１１１ｊｌＩ１
   項κ記載の方法。
3. （３）エネルギー源の化金物が、メタノール、エタノー
   ル、エチレングリコール、ゾ四ビレングリコール，１−
   ７’ロパノール、２−，ｌ”ｌ−パノール、グリセロー
   ル、１−デタノール、２−ゾタノール、３−メチル−１
   −ｆタノール、１−碩冫メノール、２−ヘキサノール、
   １．７−へプタンジオール、１−オクタノール、２−デ
   カノール、１−へキナデカノール、１−エイコサノール
   、アセトン、２一ソタノン、４−メチル−２−ペンタノ
   ン、２一デカノン、６−ペンタデカノン、２−エイコサ
   ノン、ホルムアルデヒド，アセトアルデヒド、プ四ビオ
   ンアルデヒド、ゾチルアルデヒ？，ヘキサナール、７−
   メチルオクタナール、テト２デカナール、エイコサナー
   ル、酢酸、ゾｐビオン酸，酪酸、グルタール酸、５−メ
   チルヘキナン酸、アゼライン酸、ドデカン酸、エイコナ
   ン酸、ギ酸メチル，酢酸メチル、酢酸エチル、酪酸プロ
   ビル、ヘキ夛ン酸イソ−ｆａピル、５−メチルオクタン
   駿ヘキシル、ドデカン酸オクチル、および混合液よ夛成
   る群から選ばれる、特許請求の範ＨＩＩｇ２項に記載の
   方法。
4. （４）アルコールが、１個から４個の炭素原子よ〉成る
   、特許請求の範囲第２項Ｋ記載の方法。
5. （５）アル；−ルがメタノールあるいはエタノールであ
   る、特許請求の範囲篇４項κ記載の方法。
6. （６）温度が２５℃から６５℃の範囲、ｐＨが約３から
   ７０Ｉｔ！！，圧力が約０から１５０ｐｇｉｇの範囲、
   そして平均保持時間を基準にして発酵時間が約２から６
   ０時間の範囲である水性発酵条件を用いる，特許請求の
   Ｉ！Ｉｌｊｉｊ項から第５項までのいずれか１項κ記載
   の方法。 （７》ビキアパストリス（Ｐｉａｈｉａ’ｐａｓｔｏｒ
   １ｇ）の善黴を持つ、生物学的純粋培養酵母κおいて、
   このビキアパストリス（Ｐｉａｈｉａｐａｓｔｏｒｔｓ
   ）はビキアパストリｘ（Ｐｉａｈｉａｐａｓｔｏｒｉ’
   ａ）！−１２４５７ビキアパストリ，＜（Ｐｉｏｈｉａ
   ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｙ−１２４３８ピキアパストリス（
   Ｐｉｃｈｉａ如ａｓｔｏｒｔｓｓ）！−１２４３９ビキ
   アパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１
   ２４４０ビ−？７パｘ｝リｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏ
   ｒｉｓ）Ｙ−１２４４１ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉ
   ａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４４２ビキアパストリス
   （Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉａ）Ｙ−１２４４３ピ中
   アパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１
   ２４４４ビキアパストリｘ（ＰｉｏｈｉａｐｌＬ１１ｔ
   ｏｒｉｓｉ）ｙ−１２４４５ピキアパストリｘ（Ｐｉｏ
   ｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４４６ピキアパスト
   リス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４４７
   ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａａｔｏｒｉｓ）！
   −１２４４８ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｇｔ
   ｏｒｉｇ）ｙ−１２４４９ビキアパストリス（Ｐｉｃｈ
   ｉａｐａｅｔｏｒｉｓ）！−１２４５０ピキアパストリ
   ｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４５１ピ
   キアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−
   １２４５２ビキアパストリス（Ｐ１ｃｈｉａｐａｇｔｏ
   ｒｉｇ）Ｙ−１２４５３ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉ
   ａｐａａｔｏｒｉｇ）！−１２４５４ピキアパストリｘ
   （Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｘ−１２４５５ピキ
   アパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１
   ２４５６ピキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒ
   ｔｓ）！−１２４５７ビキアパストリス（Ｐｉｃｈｉａ
   ｐａｓｔｏｒｉａ）！−１２４５８ピキアパストリス（
   Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４５９ビキア
   パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｇｔｏｒｉｓ）Ｙ”１２
   ４６０ビキ１パストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒ１
   ｓ）！−１２４６１ピキアパストリス（ＰｉｃｈｉｌＬ
   ｐａｓｔｏｒｉｓ）ｘ−１２４６２ピキアパストリス（
   Ｐｉｏｈｉａｐａｓｔｏｒｉａ）Ｙ−１２４６５ビキア
   パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ｘ−１２
   ４６４ピキアパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉ
   ｓ）！−１２４６５ピキアパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐ
   ａｓｔｏｒｉｇ）！−１２４６６ピ争アパストリス（Ｐ
   １ｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）Ｙ−１２４６７ピキアパ
   ストリｘ（ＰｉｃＭａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１２４５
   ８ピキアハストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）
   Ｙ−１２４６９ビキアパストリｘ（Ｐｉｃｈｉａｐａｓ
   ｔｏｒｉｓ）！−１２４７０ビキアパストリス（Ｐｉａ
   ｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）！−１２４７１ビキアパＸト
   リス（Ｐｌｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉ，ｓ）Ｙ−１２４９
   ３よ〕成る評よｐ選ばれ、培養酵母は、資化可能量の炭
   素（大部分が酸素付加炭化水素化合物のＳ′Ｑ供給され
   る）、窒素、有機増殖因子、および無機栄養物を含む水
   性栄養培地中で、好気発酵κよ）回収量の単細胞たん白
   質を童生できることを臀黴とする、上記純粋培養酵母。