JPS585672B2 - テイフエニルアラニンプラステインノセイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 フェニルケトン尿症は１９３４年Ｆろｌｌｉｎｇにより
発表された遺伝性代謝異常疾患であってそのまま放置す
れば知能障害を来たす非惨な病気である。

本症に罹った新生児は先天的にフエニルアラニンをチロ
シンに変換するフエニルアラニンヒドロキシダーゼを欠
いているため、血液中に異常な量のフエニルアラニンの
蓄積が起り、一方尿中にはフエニルピルビン酸及びその
誘導体であるフェニル酢酸、フエニル乳酸、フエニルア
セチルグルタミンなどの異常代謝産物が排出されること
が特徴である。

本症の主要な臨床像である強度の神経障害については、
今のところその理由は不明である（フエニルアラニン自
体は神経系に何等の影響を及ぼさないと云われる）。

しかしながら、本症に罹患した子供の８０〜９０％が垂
篤な知能障害の状態に陥ることは事実であって、それに
よる家族の苦悩もさることながら、社会的にも唯唯しい
問題であって、その予防ないし治療が要望される理由で
もある。

本症に対し損われた酵素を補給する積極的手段は現在未
だ開発されていないので、今のところ信頼しうる唯一の
予防ないし治療手段は生後３ケ月以後の新生児に低フエ
ニルアラニン食 （ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ ｄ
ｉｅｔ）を給与してフェニルケトン尿症の発生を抑制す
る食餌療法である。

ところが、フエニルアラニンは極めてありふれたアミノ
酸であって、あらゆる蛋白質中に４〜６％の割合で含ま
れているため、特に本アミノ酸の少い天然食品を選ぶこ
とは不可能である。

このため普通に採られている手段は蛋白分解物を活性炭
の如き吸着剤で処理してフエニルアラニンを含む全芳香
族アミノ酸を除き、これに所望によりチロシン、トリプ
トファンなどの必須アミノ酸を補給したアミノ酸混合物
を用いることである。

しかしながら現在市販されているどの低フェニルアラ二
ン食もアミノ酸混合物が主体であるために異様な味及び
臭気を有することは避けられない。

したがって、乳児はともかく、長じるに従って拒食の傾
向を示すようになる。

またこれらの食餌はアミノ酸であるから蛋白質の如くテ
キスチュアを与えることも不可能である。

低フエニルアラニン食による食餌療法は生後学齢まで、
もしくはそれ以上の期間にも及ぶ長期に亘るものである
から、アルチャル氏が提唱するように自然にバランスの
取れた天然蛋白質又はそれに近い物質であることが理想
的である。

（Ａ，Ｍ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｎａｔｕｒｅ、２４８、
６４３（１９７４））。

本発明の主要な課題は天然蛋白質に近い性質を有する合
成蛋白質を経済的に製造しようとすることである。

本発明者は研究の結果、肉類、卵、大豆、徴生物蛋白の
如きアルブミン又はグロプリン系蛋白質がペプシン、キ
モトリプシンの如き芳香族アミノ酸のペプチド鎖に対し
親和性を有するエンドペプチダーゼ及びエクソペプチダ
ーゼと（エンドペプチダーゼの混合物）による二段酵素
処理によって芳香族アミノ酸又はその残基（但し本書中
ではゝ芳香族アミノ酸“なる語をトリプトファンを含め
たニュアンスで使用する）を末端に有するポリペプタイ
ドに分解され、この酵素分解物をゲルろ過して得られる
殆んど芳香族アミノ酸成分を含有しないポリペプタイド
混合物を常法どおりプラステイン合成に附すことによっ
て、良好な収率でフエニルアラニン、チロシン及びトリ
プトファン含量の低いプラステインを合成するのに成功
した。

本発明者はさらに上記プラステイン反応に際しチロシン
及びトリプトファンのカルボン酸残基をエステル化した
誘導体を添加することによって上記産物中に不足するア
ミノ酸であるチロシン及びトリプトファンをペプチド鎖
中に組みこんだプラステインを得ることができた。

これらのプラステインは単なるアミノ酸混合物と異り、
各種のアミノ酸がペプチド鎖で連結した高分子（平均分
子量２０００程度）の新規蛋白質様組成物であるので、
天然蛋白質と類似の物理、化学的及び栄養学的性質を有
し、このためフェニルケトン尿症用食餌として適切であ
る。

本発明方法は本質的に以下の主シエーマにより示される
。

以下前記シエーマに基き本発明の概要を説明する。

本発明は天然の蛋白質を原料とする。

蛋白質としては水溶性又は塩類水溶液に可溶であるもの
、即ちアルブミン又はグロプリンに属するものが好まし
く、グリアジン又はプロラミン蛋白はその後のプラステ
ィン合成が困難であるので余り好ましくない。

好適な蛋白質の例としては獣肉、魚肉、大豆等の種子蛋
白、微生物蛋白などがある。

これらの蛋白質は芳香族アミノ酸に親和性を有するエン
ドペプチダーゼにより芳香族アミノ酸のアミノ基側及び
／又はカルボキシル側ポリペプチド鎖を切断する。

〔ｆは芳香族アミノ酸の残基を示す〕

以上の如＜ （ａ）（ｂ）いづれの場合にも芳香族アミ
ノ酸を先端又は後端に有するポリペプチドを生じ、（ａ
）と（ｂ）の分解が同時に起ったときは遊離のアミノ酸
を生じる。

反応は原料蛋白質を水に溶解又は懸濁し、適当な（芳香
族アミノ酸に対し特異的な）エンドペプチダーゼ作用を
有する酵素を加えて行う。

酵素は必ずしも純品である必要はな《、粗酵素でよい。

今のところ最も適尚と思われるのはペプシンであるが、
キモトリプシンも使用できる（但しキモトリプシンは不
純物が多くて作用が弱い上しかも高価である）。

ペプシンはまた作用域がＰＨ２以下の強酸性領域に属す
るので、反応（インキュベイション）中基質の腐敗を防
ぐためにも都合が良い。

微生物起源のエンドペプチダーゼは一般に芳香族アミノ
酸に対してのみの特異性は有しないため本発明の目的上
不適当な場合が多い。

使用する酵素の量はその力価を基準に経験的に定められ
るべきである。

ペプシンの場合好適の濃度は基質（蛋白質）に対し略０
．０６−０．２％（但しＤｉｆｃｏ製、表示力価１：１
００００、ｃｏｎｔｒｏｌ ５５５０１５において）で
あった。

酵素濃度が好適範囲を大巾に上廻ると芳香族アミノ酸に
対する特異性が失われる。

以上の如くして得た氷解物（１）は芳香族アミノ酸を末
端に有するポリペプチドを主とする混合物であるので次
いでこれにエクソペプチダーゼを作用させて芳香族アミ
ノ酸を遊離させる。

（式中Ｒ，Ｒ／はその他のアミノ酸残基を示す）因みに
エクソペプチダーゼには攻撃位置がＣ端のペプチド鎖で
あるかＮ端のペプチド鎖であるかによってカルボキシペ
プチダーゼとアミノペプチターゼの２種に大別されるが
、氷解物（１）が確率的に（ａ）（ｂ）２種のポリペプ
チドを等量含有するであろうことを考えると、このもの
は両酵素の混合物である方が能率的である。

純粋なカルボキシペプチダーゼとしてはカルボキシペプ
チダーゼＡ１またアミノペプチダーゼの純品としてはロ
イシンアミノペプチダーゼなどが知られているが、これ
らの標品は著し《高価であるので実際的ではない。

むしろ実際的と考えられるのは両酵素を含む粗酵素を使
用することであって、プロナーゼ（科研化学製）は現在
のところ目的上好適な唯一の市販品である。

本酵素は上記２酵素以外にエンドペプチダーゼ類を含有
し先にエンドペプチダーゼの作用で形成されたポリペプ
チドをより小さな平均分子量８００程度のポリペプチド
に分裂させる。

この程度の分裂は後のプラスティン合成のため却って都
合がよい。

プロナーゼの作用ＰＨ範囲は酸性からアルカリ性に亘る
広い領域に跨るが、発明目的上はエクソペプチダーゼが
主として作用し他の蛋白分解酵素の作用が比較的抑えら
れるようなＰＨがよい。

下表（第１表）は魚肉蛋白のペプシン氷解物（１）を種
種のＰＨでプロナーゼ処理した場合の遊離アミノ酸生成
率＊及び氷解度である。

エクソペプチダーゼ処理の終った材料を次いでゲルろ過
に附して芳香族アミノ酸成分（遊離アミノ酸及びペプチ
ド）の除かれた両分を採収する。

ゲルろ過剤には架橋デキストラン（商品名セファデック
ス）、ポリアクリルアミドゲルなどがあるが、実用的に
は価格、無毒性その他の観点より前者の方が好ましい。

ろ過剤を選択する際考慮すべきもう一つの観点は分子篩
としての目的の大いさを略分子量１０００程度のポリペ
プチドの通過を許す大いさに選ぶことである。

ゲルろ過におけるもう一つの効果は芳香族アミノ酸の吸
着である。

溶出溶媒の適切な選択によって芳香族アミノ酸の流出は
遅延せしめられ、殆んど芳香族アミノ酸を含まない分画
が得られる。

溶媒は親水性のものから実験的に適当なものを選ぶべき
であるが、毒性の見地より酢酸エタノールなどが実用的
となる。

他の親水性溶媒例えばメタノール、イソプロパノール、
プロピオン酸、アセトン、メチルエチルケトンなども使
用できるが、毒性、臭気などの点で食用の製品を得る目
的には余り好ましくない。

水も使用できないことはないが分画が不明瞭である。

下表は酢酸及びエタノールについての実験成績である（
使用ろ過剤：セファデツクスＧ−１５）。

一般に、酢酸はエタノールに比し芳香族アミノ酸成分の
溶出を遅延させる効果が犬であるが、反面大豆蛋白由来
のポリペプチドの如く親水性の乏しい試料に適用したと
き、初期の溶出位置に濁りを生じる欠薇があるので、魚
肉蛋白氷解物の処理により適している（水性エタノール
ではそのような欠点は認められなかった）。

これに反しエタノールは回収が容易であること及びゲル
ろ過中水解物の腐敗を防ぐことなどの利点がある。

以上の如くして得た芳香族アミノ酸成分の除かれた氷解
物（２）′は次に常法どおりプラステイン合成に附す。

反応はどのようなプロテアーゼを用いて行われてもよい
。

但し氷解物（２）′は必須アミノ酸であるトリプトファ
ンに欠けており、また代謝経路上フエニルアラニンから
誘導されるチロジンにも欠けているので、栄養的には両
アミノ酸をプラステイン中に組みこんだ方が好ましい。

この目的には両アミノ酸をエステル化して（２）′に加
えパパインの如き疎水性アミノ酸に対し活性を有するＳ
Ｈ酵素を用いて反応させる。

必要あればロイシンやメチオニンも同様にプラステイン
中に組みこめるがパパインの疎水性親和部に対し活性の
低い酸性アミノ酸や塩基性アミノ酸を組みこむのは難し
い。

同様にイソロイシン及びバリンを組みこむのも立体障碍
により困難である。

以上の如くして得た低フエニルアラニンプラステイン中
には少量の遊離アミノ酸及び低分子量ポリペプチドを含
み、これらの夾雑物は製品の味を劣化する恐れがあるの
で、これを除去した方が好ましい。

この目的には犬体Ｍ．Ｗ．５００以下のものを除けばよ
く、このため種々の限外ろ過器が有利に利用できる。

限外ろ過は同時に氷解物中の微生物を除去する効果も持
っているので、無菌的な製品を得るのにも有利である。

但し本ろ過は発明目的上必須の手段ではない。

限外ろ過したプラステイン溶液は一般蛋白質製品と同様
に真空凍結乾燥、噴霧乾燥、膜状加熱乾燥などを行って
製品とする。

製品は白色無味の無定形粉末で、水に易溶であり、フエ
ニルアラニンを除き均斉のとれたアミノ酸組成を有する
。

次表（第２表）は以上の方法により得た製品のアミノ酸
組成である。

以下実施例により本発明の実施態様を具体的に述べる。

但しこれらは単に例示用であって発明の技術的範囲を制
限するためのものではない。

実施例１ 魚肉蛋白質（商品名 Ｐｒｏｔａｎｅ１Ｓｏｐｈａｒｍ
ａｉｓ，Ａ．Ｃｏ，（スイス）製）１０グに水を加えて
全量１ｌとし濃塩酸を加えてｐＨを１．５に調整し、均
一な溶液を得た。

この溶液にペプシン（ＤｉｆｃｏＣｏ．製）１０〜を加
え攪拌しなから３７℃で４８時間反応させた。

この反応液（氷解物１）の１０％トリクロロ酢酸により
測定した氷解度は６７．８％であった。

反応液を濃苛性ソーダ溶液でＰＨ６．５まで上げ、プロ
ナーゼ１００ｍｌを加え、さらに５時間インキユベート
した。

この間反応液のＰＨは１時間毎に濃苛性ソーダ溶液で６
５に維持された。

得られた氷解物２は凍結乾燥した。氷解物２の凍結乾燥
粉末５グに０．５Ｍ酢酸１０ｍｌ、を加え不溶物を遠心
除去して得た上清（可溶固形分４．６４？）をセファデ
ツクスＧ−１５を充填したカラム（５×７５ｃｍ）に負
荷し、２５℃において０．５Ｍ酢酸を溶出液として６ｍ
ｌ！／分の割合でがん流させ、流出液はフラクションコ
レクターを用いて２０ｍｌ宛集め、各分画毎に２８０ｍ
ｍにおける光学密度を測定した。

（第１図参照）図面から明らかな如く、流出液は■〜■
の４個のフラクションに分画され、それら各フラクショ
ンのアミノ酸組成（重量百分率）は次表（第３表）のと
おりであった。

前表から明らかな如く分画■はトリプトファンフエニル
アラニン及びチロジンを全く含まない。

そしてこれらのアミノ酸は夫々第■、第■及び第■分画
に濃縮されている。

特にトリプトファンが第■分画の大部分を、チロジンが
第■分画の過半を占める事実は注目に値しよう。

これらの分画は再びエステル化して次のプラステイン合
成時におけるトリプトファン及びチロジンの強化に利用
することができる。

因みに各分画の収率はゲルろ過原料であるプロナーゼ処
理物（氷解物２）を１００として次のとおりであった（
但し収率は窒素の回収率で示す。

）。各フラクションはそのまま凍結乾燥し、次の工程に
備えた。

フラクションＩ２ｆ、チロジンエチルエステル２００ｍ
９及びトリプトファンエチルエステル３０ｍｇを２０％
水性アセトン２ｍｌ中に溶かし、苛性ソーダ水溶液でＰ
Ｈを６．５に調節し（この操作は必ずしも行う必要はな
い）、これにパパイン（Ｄｉｆｃｏ Ｃｏ製）２０ｍｇ
を加えて３７℃、４８時間プラステイン反応を実施した
。

反応物に０．ＩＮ苛性ソーダの１０％エタノール溶液１
００ｍｌを加え、ホモゲナイズ後５時間室温で攪拌し、
エステル結合を切断した。

次いで濃塩酸を用いてＰＨを７．０に合わせ、遠心ろ過
して上清を集めた（沈渣量は極めて少かった）。

この上清に１０％エタノ−ル１００ｍｌを加え、Ａｍｉ
ｃｏｎ４０２型限外ろ過器を通して分子量５００以上の
両分を集め、減圧でエタノールを除去後凍結乾燥し低フ
エニルアラニンプラステインの製品を得た。

収率は原料蛋白に対し７８．９％、製品は第２表記載の
アミノ酸組成を有し、官能テストの結果、完全に無味無
臭と判定された。

実施例２ 前例の実験を大豆蛋白質を用いて反復した。

酸沈犬豆蛋白（不二製油株式会社、（大阪）製）１０グ
に水１ｌを加え、ミキサーでよく攪拌してから濃苛性ソ
ーダ水溶液でＰＨ１２とし、遠心分離して上清を集めた
。

上清に濃塩酸を加えてＰＨを４．５とし、析出する沈澱
を遠心分離し、以下前例の如く酵素分解、ゲルろ過、プ
ラステイン合成及び限外ろ過を行った。

但しゲルろ過の溶出液には１０％エタノールを使用した
。

本例においてゲルろ過による各フラクションのアミノ酸
組成及び収率は下表（第４表）のとおりであった。

（第２図参照） 製品は第２表のアミノ酸組成を有し、無味、無臭の白色
粉末である。

参考例 実施例１及び同２の原料プロナーゼ氷解物及び最終製品
の味を熟練した官能検査員に判定させた。

結果は次表（第５表）のとおりである。

【図面の簡単な説明】

第１図及び第２図は夫々実施例１及び実施例２における
ゲルろ過パターンを示す。 第３図及び第４図は夫々実施例１及び実施例２のフロー
チャートである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アルブミン又はグロプリン系蛋白質を芳香族アミノ
   酸に対して親和性を有するエンドペプチダーゼで処理後
   エクソペプチダーゼで処理して芳香族アミノ酸及び本酸
   を末端に有するポリペプチドを遊離させ、この氷解物を
   次にゲルろ過法により芳香族アミノ酸成分を含む分画と
   該酸を殆んど又は全く含まない分画に分別し、後者を常
   法によりプラステイン合成に附すことを特徴とする低フ
   エニルアラニンプラスティンの製造法。 ２ アルブミン又はグロプリン系蛋白質を芳香族アミノ
   酸に対して親和性を有するエンドペプチダーゼで処理後
   エクソペプチダーゼで処理して芳香族アミノ酸及び本酸
   を末端に有するポリペプチドを遊離させ、この氷解物を
   次にゲルろ過法により芳香族アミノ酸成分を含む分画と
   核酸を殆んど又は全く含まない分画に分別し、後者にト
   リプトファン及び／又はチロシンをエステルの形で添加
   してプラスティン合成に附すことを特徴とする低フエニ
   ル７ラニンプラスティンの製造法。