JPS5857151B2 - セイブツガクテキカツセイノ マクザイリヨウ - Google Patents

セイブツガクテキカツセイノ マクザイリヨウ

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JPS5857151B2
JPS5857151B2 JP50107150A JP10715075A JPS5857151B2 JP S5857151 B2 JPS5857151 B2 JP S5857151B2 JP 50107150 A JP50107150 A JP 50107150A JP 10715075 A JP10715075 A JP 10715075A JP S5857151 B2 JPS5857151 B2 JP S5857151B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野は触媒フィルターである。
更に詳しくは、本発明は、反応性物質がバルク流または
拡散のいずれかによってマトリックスと接触するにした
がい触媒反応を起こすように、たとえば酵素または抗体
のような生物学的活性剤を施こした重合体微孔質マトリ
ックスに向けられている。
重合体微孔質マトリックスは、この種の材料が沢適用と
して広（・用途を有することが見出されているため、本
明細書において時折微孔質膜フィルターと呼ばれる。
酵素が成る種の生化学反応に対し触媒として機能しうろ
ことは熟知されている。
しかしながら、酵素を触媒として作用させるために導入
した溶液から、その酵素を回収することはしばしば極め
て複雑かつ困難であり、したがって生化学反応における
触媒として酵素を使用することは実験室段階を超えては
進歩していない。
触媒としての酵素の使用に関連する別の問題は、酵素が
比較的短かい保存寿命を持つということである。
この短かい保存寿命は、酵素が極めて高価でありかつ特
に、高純度では取得困難であるため、重大なことである
。
回収問題ならびに酵素保存寿命の問題は、酵素を不溶性
物質の表面に結合させるならば、著しく減少するという
ことが知られている。
そのような表面に結合させた酵素を用い、次いで酵素が
その触媒となるような反応体を含有する溶液を、酵素が
結合されている表面の上に通し、酵素によって反応を触
媒させる。
この操作の場合、酵素はその場に結合されているので、
その酵素はその場所に残存しそして反応性溶液からそれ
を回収する必要がない。
更に、結合酵素は溶液中の酵素よりも長い保存寿命を有
することが判った。
酵素を表面に結合させるための一公知方法は、膜もしく
はフィルム上に反応体を通すことによって酵素反応が行
なわれうるように、酵素に対して複合化および結合する
ことのできる、フィルム状の非孔質担体を使用すること
である。
この公知の従来技術方法において、酵素は、たとえばコ
ラーゲンまたはゼインのような蛋白質から作られた薄い
蛋白質膜に、結合されるかまたは不動化される。
特定の酵素は、膜が弱酸で膨潤された後に、その膜に結
合される。
結合酵素によって反応を触媒させるための上記の手順は
多くの欠点を有しており、そのうち最も重大なものは、
この種の非孔質フィルムを用いた場合単位溶積当りに結
合させうる触媒の量が、本発明°の構造体を用いて単位
溶積−Ｍ’）に結合させうる量と比較して、少ないとい
うことである。
したがって、一定の触媒容量を得るためにはずっと多く
の従来の非孔質構造体が必要とされる。
蛋白質を用いて生物学的活性剤もしくは触媒を高微孔質
の重合体材料に結合させた、本発明の生物学的活性の孔
質膜材料を用いれば、反応体に曝される接触表面の量は
著しく増加する。
したがって、本発明の目的は、生物学的活性剤が結合さ
れておりかつ反応体を通過させうる不活性な重合体材料
を提供することである。
本発明の別の目的は、酵素が結合されておりかつ膜を通
して反応体が流れるときに酵素と反応体との間の接触を
促進する、微孔質の重合体膜を提供することである。
更に本発明の目的は、反応性物質がそこを通過しかつそ
れによって触媒されうるような、酵素被覆された重合体
基体を提供することである。
更に本発明の目的は、重合体微孔質マトリックス上に不
動化された生物学的活性剤を含有する、新規なカラムを
提供することである。
先ず最初に、以下のより詳細な記述により最も広範な局
面において本発明を説明する。
最も広範な局面において、本発明は、生物学的活性剤を
結合した微孔質の重合体膜マトリックスであるところの
基体を含む触媒材料である。
活性剤は、不活性な蛋白質により、孔質の重合体マトリ
ックスに結合されている。
生物学的活性剤用の基体として使用することのできるｒ
過膜は広く知られており、チグモンデイ等（Ｚｓｉｇｍ
ｏｎｄｙ ｅｔ ａｌ） ＶＣ係る「ｐ過およびその製
造方法」と（・う名称の米国特許第１，４２１，３４１
号およびロベル等（Ｌｏｖｅｌｌ ｅｔ ａｌ）に
係る「微孔質ナイロンフィルム」という名称の米国特許
第２．７８３，８９４号に開示された方法にしたがって
製造することができ、それら特許の教示を参考のため本
明細書中に記載する。
この種の膜は、高精度を以てかつ高水準の膜通過流量に
て、粒体から粒子を除去するのに使用される。
その他の分離材料でそれ程広範囲の潜在用途を提供する
ものは、あったとしても数少ない。
例数なら、特定の状況において興味があるであろうもの
は巨大分子溶質のリス）Ｋよってのみ制限されるからで
ある。
生物学的物質の滅菌ｒ過、水圧流体から微粒子物質を除
去するための水圧流体のｒ過、および水分析のための細
菌の集収が典型的な用途である。
本発明の生物学的活性剤の基体として使用される膜フィ
ルターは、純粋かつ生物学的に不活性なセルロースエス
テルもしくは同様の重合体材料から作られた薄い孔質構
造体である。
それらは、１４マイクロメーター乃至２５ナノメーター
（０，０２５マイクロメーター）の多くの明確な孔径お
よび直径１３〜２９３ｒＩｒｒｎの範囲の円板として工
業生産される。
勿論、それらは任意の所望形状に成形することができる
。
これら膜フィルター中の孔は寸法が極めて均一である。
たとえば、０．４５マイクロメーターの平均孔径にて市
販されている一膜フイルターにおける、孔径分布の総範
囲はプラス・マイナス０．０２マイクロメーターである
。
膜フィルター表面は１ｃｒｔ１当り何百万もの毛細孔を
含み、この毛細孔は全フィルター容積の約８０％を占め
る。
上記したように、生物学的活性剤はたとえば水不溶性蛋
白質のような物質によって孔質の重合体フィルターに結
合されている。
重合体膜に酵素および抗体を結合させるための有用な２
種の不活性蛋白質はゼインおよびコラーゲンである。
ゼインはとうもろこしのフロラミン（アルコール可溶性
蛋白質）である。
これは唯一の市販されているプロ□ランでありかつ数少
ない容易に入手しうる植物蛋白質の一つである。
ゼインは主としてとうもろこし穀粒の胚乳中に生ずる。
アルコール−可溶性蛋白質の量は胚乳蛋白質総合有量に
直接に関係し、ゼイン含有量は各種とうもろこし試料に
おいて乾物の２．２〜１０．４ ％の範囲である。
ゼインは、大低の蛋白質と比較して、親水基が比較的乏
しいことが特徴である。
事実、高比率の非極性（炭化水素）および酸アミド側鎖
が有機溶媒に対するゼインの溶解性の原因であり、かつ
プロラミンとしての分類の根拠である。
市販ゼインの一種は、イリノイ州アルコ在のコーン６プ
ロダクト社（Ｃｏｒｎ Ｐｒｏｄｕｃｔ、ｓ Ｒｅｆｉ
ｎｉｎｇＣｏ ｍ ｐａ ｎｙ ）によって製造された
アルボゼイン（Ａｒｇｏ Ｚｅｉｎ）Ｇ −２００であ
る。
コラーゲンはヒドロキシフロリン即ちグリシン型蛋白質
であり、これは動物結合組織および骨の主な有機成分で
ある。
これは広範な種類の哺乳類および魚類の部分から良好な
収率で得ることができ、そしてしばしば豚、羊、および
牛の朧：成用として使用しえない子牛の皮である皮なめ
し原料；および燐酸カルシウムを除くため酸処理した後
に残った牛の骨を乾燥して得られる組織であるオセイン
、から得られる。
酵素を重合体マトリックスに結合させるためにはコラー
ゲンおよびゼインが好適物質であるが、その他の蛋白質
およびポリペプチドも使用できる。
適当な水不溶性天然蛋白質のその他の例は、それらに限
定するものではないが、フィブリノーゲン、ケラチン、
グルテリンなどを包含する。
適当な合成ポリペプチドの例は、それらに限定するもの
ではないが、ポリイソロイシン、ポリトリプトファン、
ポリフェニルアラニン、ポリチロシンおよびロイシンと
ｐ−アミノフェニルアラニンとの共重合体を包含する。
水不溶性となるように処理しうる成る種の水溶性蛋白質
も、酵素を結合させるのに使用することができる。
改質または未改質の形における特定の合成ポリペプチド
または天然蛋白質の選択は、主として酵素（または抗体
）の性質および遭遇するであろう反応環境によって決定
される。
コラーゲンおよびゼインは、それらが多数の酵素に対し
て不活性であるため、好適な天然蛋白質材料である。
広範な種類の異なった型の酵素を、たとえばコラーゲン
およびゼインのような天然蛋白質により、重合体ｒ過膜
に結合させることができる。
たとえば、適する酵素にはアミラーゼ、リゾチーム、イ
ンベルターゼ、ウレアーゼ、ウリカーゼ、セルラーゼ、
カテコールメチルトランスフェラーゼ、シュークロース
６−ゲルコジルートランスフエラーゼ、ヘキソキナーゼ
、カルボシルエステラーゼ、ＤＮアーゼ、アリールエス
テラーゼ、リパーゼ、ペクチンエステラーゼ、ゲルコア
□ラーゼ、アミロペクチン−１，６−グルコシダーゼ、
オリゴ−１，６−グルコシダーゼ、ポリガラクチュロナ
ーゼ、αグルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−ガ
ラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ガラクトー
スオキシダーゼ、カテコールオキシダーゼ、カタラーゼ
、パーオキシダーゼ、リポキシダーゼ、グルコースイソ
メラーゼ、ベントザナーゼ、セロビアーゼ、キシロース
イソメラーゼ、スルフィトオキシダーゼ、エタノールア
ミンオキシダーゼ、ペニシリナーゼ、炭酸アンヒドラー
ゼ、グルコノラクトナーゼ、３−ケトステロイドｄデヒ
ロドゲナーゼ、１１−β−ヒドロキシラーゼ、アミノ酸
アシラーゼおよびグルコース−６−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼが包含される。
酵素および多酵素系の適合した組合せもこの方法でコラ
ーゲンにより複合化させることができる。
例としては、ヘキソキナーゼとグルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼおよびヘキソキナーゼとグルコ
ースオキシダーゼが包含される。
しかしながら、特に適するものはリゾチーム、インベル
ターゼ、ウレアーゼおよびアミラーゼである。
リゾチームは、薬学研究および下水処理において微生物
を加水分解するために、単独でまたは他の酵素および／
もしくは細菌と組合せて、広く使用されている。
リゾチーム−蛋白質膜複合体のための一つの特に重要な
用途は細胞の溶解である。
インベルターゼ即ちβ−Ｄ−フラクトフラノシターゼは
食品および飲料工業においてならびに分析目的のために
広く使用されている。
インベルターゼは蔗糖をグルコースとフラクトース即ち
転化糖にまで加水分解するのを触媒するために使用する
ことができる。
インベルターゼは蔗糖、ラフィノース、ゲンチアノース
ならびにメチルおよびβ−フラクトフラクトースにおけ
るβ−Ｄ−フラクトフラノシル結合の加水分解に有効で
ある。
インベルターゼ−蛋白質膜複合体のための一つの特に重
要な用途は蔗糖の連続加水分解である。
ウレアーゼは、尿素が炭酸アンモニウムに変化するのを
触媒しうる高度に特異的な酵素であり、尿試料中の尿素
含量を測定するのにしばしば使用される。
その高度に特異的な活性のため、ウレアーゼ−蛋白質複
合体膜に関する一つの効用は人工腎臓の用途である。
更に詳しく云えば、ウレアーゼ−蛋白質複合体膜は、た
とえば人間の排棄物の処理におけるような、尿素の反復
加水分解のために使用することができる。
α−アミラーゼは「液化酵素」と呼ばれ、殿粉、グリコ
ーゲンおよびデキストランをランダムに加水分解するこ
とが知られている。
β−アミラーゼは蔗糖、グリコーゲンおよびデキストラ
ンからマルトーズを生ぜしめることができる。
その他の適当なアミラーゼに代 α−グルコシダーゼ、
ア□ログルコシダーゼ、ア□ロー１．６−αグルコシダ
ーゼ（脱分枝性酵素、ｄｅｂｒａｎｃ−ｈｉｎｇ ｅｎ
ｚｙｍｅ ）、オブリゴー１．６−ゲルコジダーセ（限
界デキストリナーゼ）、イソマルターゼ、およびイツト
リアーゼが包含される。
本明細書において使用される「アミラーゼ」という語は
、これらおよびその他アミラーゼの１種もしくはそれ以
上を総称的に指す。
本発明のアミラーゼ−蛋白質複合体の特に重要な一つの
用途は、殿粉基質を酵素的活性膜上に連続通過させて、
殿粉の連続加水分解を行なうことにある。
数種の酵素を同時に蛋白質膜と複合化させることができ
る。
たとえば、α−ア□ラーゼは殿粉分子をランダムに開裂
させうるので、他の一層特異的な酵素のために反応個所
を与えるように、α−アミラーゼを他の種類の酵素と複
合化させることが極めて望ましい。
本発明にしたがって不活性蛋白質を微孔質の重合体膜に
被覆するための手順を下記の実施例１および２に示す。
こＳで、本発明は以下の実施例に示された方法に限定さ
れるものでなく、むしろこれら実施例は当該分野の精通
者に本発明の実施方法を教示するためのものであり、し
たがって決して本発明を限定することを意図したもので
ないことに注目すべきである。
実施例 １ エタノール１８ｃｃ、、ｎ−ブタノール３４ＣＣ，、水
８ＣＣ，セルソルブ溶剤３江およびゼイン７．９グラム
を混合することによりゼイン溶液を作った。
ゼインは上記の溶剤に容易に溶解し、かつこの溶液は室
温（２０℃）で作ることができる。
この溶液を、ゼインを全部その中に溶解させうるのに十
分な時間、混合する。
その後、微孔質の重合体フィルターをこのゼイン溶液中
に浸漬する。
ベッドフォード・マサチューセッツ在のミリボア社（Ｍ
ｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐｏｒａｔ、１ｏｎ）から販
売されている“ＳＳ′型フ型用イルターて知られた、３
．０マイクロメーターの平均孔径を有するフィルターを
使用した。
フィルターを室温にて約２４時間、溶液中に保った。
次いで、被覆されたフィルターを空気乾燥させる。
実施例 ２ ０、ＩＮ酢酸８〇−中の酸可溶性コラーゲン０．７１よ
り成るコラーゲン溶液から、コラーゲン被覆されたフィ
ルターを作った。
微孔質の重合体膜フィルターをコラーゲン溶液中に約２
４時間浸漬する。
次いで、酵素または抗体と複合化させる前に、コラーゲ
ン被覆されたフィルターを空気乾燥させる。
たとえば酵素のような生物学的活性剤を蛋白質被覆され
た重合体フィルター上に複合化させる手順は極めて簡単
である。
上記の手順にしたがって、複合化用の蛋白質被覆された
フィルターを作った後、この蛋白質被覆されたフィルタ
ーを酵素の溶液と約４８時間接触させる。
この期間中に、予め蛋白質分子間に形成された副次的結
合（コラーゲン−コラーゲン結合またはゼイン−ゼイン
結合）は酵素と不活性蛋白質被覆との間に結合（コラー
ゲン−酵素結合またはゼイン−酵素結合）を形成すると
信じられる。
しかしながら、酵素がフィルターに結合する正しいメカ
ニズムは正確には判っていない。
しかしながら、酵素と不活性蛋白質被覆との間の結合は
強固である。
複合化の間には、酵素活性に対して有害な如何なる化学
反応も起こらない。
したがって、酵素は最少の活性損失をもって、フィルタ
ーにしっかりと結合される。
酵素を蛋白質被覆されたフィルター上に複合化させる手
順は変えることができる。
しかしながらそれぞれの場合、膜は酵素含有の水溶液中
に、複合化が起こるまで、維持される。
通常、複合化は１０時間乃至２日間の間に完了する。
この期間中の温度範囲は、使用する特定酵素に応じて、
４〜２０℃の範囲内に保つべきである。
最大の酵素複合化は、洗浄の後に酵素が結合している物
質のその活性によって測定する。
したがって、酵素活性は、複合化が何時完了するかを示
すのに使用することができる。
酵素含有の物質は、結合酵素を害さぬように室温もしく
はそれ以下で乾燥するのが好ましい。
酵素を安定的に不動化させる、ゼイン被覆されたフィル
ターの能力およびフィルターの孔を通って流れる反応体
のための反応を触媒する、この材料の能力を、インベル
ターゼ、ＤＮアーゼおよびウリカーゼを用いて例示し、
これを実施例３，４および５に示す。
実施例 ３ インベルターゼ ４枚のゼイン−インベルターゼ複合フィルター＊＊をイ
ンベルターゼ溶液（１２，５■鷹の粗インベルターゼ調
製物）から取り出し、そして直列に重ねた。
重力−誘導流速をしぼり、フィルターの積層を通過する
働程の各栓流（ｓｌｕｇ）に対する平均滞留時間を９〜
２４秒にすることにより、６係蔗糖溶液２５ｒｒｌｌを
フィルターに通した。
フィルターの積層を、各操作の間に水５０ＣＣで十分に
洗浄した。
その結果を下記に要約する。操作４および５０間に、反
応器全体を解体し、各フィルターを十分に洗浄しそして
勝手な順序で再組立した。
実施例 ４ ＤＮアーゼ ６枚のゼイン−ＤＮアーゼ複合化フィルターを５η／−
のＤＮアーゼ溶液から作り、そして積み重ねた。
蒸留水ゆすぎのときに流出するＤＮアーゼの量は、下記
に示すように急速に安定した。
次いで、ＤＮＡ溶液（０，８２ｍＩ！／ＣＣ，）をフィ
ルター積層に通した。
その結果を下記に要約する（ＤＮＡはフィルターによっ
て保持されなかった）。
結合酵素を含有する本発明のフィルターは多くの用途を
有している。
本発明のフィルターに関する二三の用途を以下の実施例
に示す。
実施例 ５ アルコール飲料 Ａ、マトリックス−結合酵素を用いることにより、酵母
を系に加える必要なしに、アルコールへのグルコースの
発酵を達成することができる。
Ｂ、マトリックス−結合リゾチームおよびα−アミラー
ゼを用いることにより、飲料がフィルターの目を詰める
傾向が少なくなる点まで酵母を破壊することができ、し
たがって飲料濾過の経済を一層魅力的にする。
実施例 ６ 石油／燃料 石油蒸留物を資化し、これを蛋白質に変える成る種の細
菌の能力について、多（の研究を行なった。
資化性酵素を結合させることにより、細菌を使用するこ
となく、新規かつ安価な食料源を作るのにこれら反応を
より経済的かつ効果的に行なうことができる。
実施例 ７ 医薬品／化粧品 Ａ、酵素でなく抗原を表面に結合させることにより、そ
の抗原に対して特異的な関連する人間抗体を単離するこ
とができる。
即ち、抗原は選択的に抗体を結合する。
次いで、カラムを０．ＩＮの沃化カリウムまたは他の複
合解除剤 （ｄｅｃｏｍｐｌｅｘｌｎｇ ａｇｅｎｔ）で洗浄する
ことにより抗体を離脱させることができ、したがって薬
品としての用途にまたは更に研究用に純粋な抗体を回収
することができる。
Ｂ、マトリックス−結合抗体を反復使用して、関連する
抗原を単離することができる。
Ｃ１たとえばＤＮアーゼおよびＲＮアーゼのような酵素
をマトリックスに一体化させることによりそしてビール
ス性（ＤＮＡまたはＲＮＡに基づく）ワクチンをカラム
に通すことにより、抗原活性を維持しながら、ワクチン
中に含まれる遺伝性物質を不活性化させることができる
。
何故なら、ビールス性蛋白質は損傷されないからである
。
Ｄ、リゾチームを不溶性マトリックス中に一体化させる
ことにより、懸濁液を、細胞壁を溶解させることによっ
て定常的かつ安価に清澄させることができる。
続いての限外濾過または膜濾過はその残骸を除去するこ
とができる。
実施例 ８ その他の食品および飲料 Ａ、インベルターゼを不溶化させることにより、グルコ
ースおよびフラクトースへの蔗糖の加水分解を飲料およ
びシラツブ用に触媒することができる。
Ｂ、現在では廃棄されている成る種の魚類蛋白質をハハ
インで加水分解し、かくしてこれを可溶化させることに
より、経済的な高蛋白飲料を製造することができる。
実施例 ９ 医療／臨床 Ａ、多（の酵素試薬が日常の臨床診断および分析測定の
ために現在使用されている。
これら酵素を不溶化させることにより、下記の臨床試験
を行なうための迅速かつ再使用しうる系を作ることがで
きる。
■、ヘキソキナーゼと組合せたグルコース−６−ホスフ
ェートデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ−ＮＡＤＨ変移を追
跡することにより、グルコースを検出するのに使用する
ことができる。
これは波長３４０ナノメータにおいて分光分析的に観察
することができる。
２、ポーラログラフの酵素電極を使用することにより、
ＬＤＨを検出することができる。
結合酵素はラクテートオキシダーゼである。
３、ウリカーゼによる、実施例５に記載された方法にし
たがう、血清中の尿酸濃度の測定。
４、ＬＤＨ測定用のＤＰＮ−ジアホラーゼ。
５、尿素測定用のウレアーゼ。
Ｂ、血流中に導入されたまたはカプセル化された結合酵
素は、たとえばフェニルケトン尿症のような酵素欠乏病
を治療するのに使用することができる。
＋ Ｃ，ウレアーゼは、尿素をＮＨ４＋ＨＣＯ３に変化させ
、したがって尿素を分解することにより血液を化学的に
無毒化するのに使用することができる。
上記の用途に加えて、結合酵素には他に多くの用途があ
る。
たとえば、酵素反応の性質を研究している者は誰でも、
実際に、問題の酵素の不溶化から利益を得るであろう。
更に、蛋白質分解または細胞膜破壊を含めて生化学操作
を日常前なっている人達は、結合されたプロテナーゼま
たはりゾチーム（ｌｙｓｏｚｙｎｅ）を含有する系から
それぞれ利益を得るであろう。
上記の他に、複雑なブ連の生化学反応を迅速に行なうこ
とを望んでいる人は、異なった結合酵素を直列に接続し
て、反応式の収率を著しく促進させかつ増大させること
ができるであろう。
勿論、本発明による膜結合酵素は臨床診断において広範
な用途を有している。
たとえば、体液中の種々な代謝物を検出するために酵素
分析法を用いることは、近年極めてポピユラーなものに
成ったと思われる。
本発明のフィルターによって有利に改良しうるそのよう
な酵素分析法には次のものが包含される。
トアルデヒド十ＮＡＤＨ ＮＡＤ−ＮＡＤＨ変移は、前記したように３４０ナノメ
ータにおいて分光分析的に検出することができる。
２、不安ノイローゼの診断に対する血清ラクテートの検
出 ここでも、ＮＡＤ−ＮＡＤＨ変移は記載したように検出
することができる。
各種酵素（たとえばＤＮアーゼ、インベルターゼ）の活
性は、数週間にわたって初期値の±Ｊｌ内で安定である
ことが示された。
本発明にしたがって結合されたウリカーゼは、冷凍条件
（４℃）の下で貯蔵しかつ室温で使用する場合には、５
ケ月間にわたって安定であることが示された。
安定性の期間についての上限は見られなかった。
活性は、単に基質を膜フィルターー酵素複合体の孔に一
定流速で通しそして基質→生成物の転換で示される活性
を分析することによるだけで分析される。
本発明の重要な態様は、活性な膜物質を含有する酵素カ
ラムである。
そのようなカラムを第１〜５図に示す。
これはキュベツト６０、下部カラム部分６２および上部
カラム部分６４を含んでいる。
カラム６６は、遠心分離器に入れることができるように
寸取りされる。
キュベツト６０、および部分６２と６４はたとえばポリ
スチレンのような透明なプラスチック材料から成形され
る。
部分６２および６４の下部末端は支持リング６８および
７０とそれぞれ合わされている。
支持リング６８および７０は２つの機能をもっている。
支持リングは、キュベツト６０を下部部分６２にそして
下部部分６２を上部部分６４に接続するための手段を与
える。
また、支持リングはフィルター膜７２および７４の位置
を定める。
下記に十分詳細に説明するように、プレフィルタ−７２
は平均孔径０．４５ミクロンを有する膜フィルターであ
り、そしてフィルター７４は本発明により酵素を含浸さ
せた膜である。
プレフィルタ−７７４が目詰りするのを防ぐことである
。
第１図に示すように、キュベツトおよび下部カラム部分
の上部にはそれぞれベント８０および８２が備えられて
いる。
フィルターの下部にベントを挿入することは、フィルタ
ーを通るｒ液の適正な流れを生むのに有利であることが
判った。
上部カラム部分６４もまたベント８４を有することが示
されている。
上部カラム部分にベントを挿入する理由は、下部カラム
部分と交替しうるようにするためである。
ベント８４の上方にはフィルターがないので、これは上
部カラム部分を下部カラム部分と交替しうるようにする
以外の目的には役立たない。
カラム部分には、また、ショルダーも備えており、この
中にテフロンガスケット８６および８８が合わされてい
る。
この点で、図面において下部カラム部分の下に一枚のフ
ィルター７４が示されていることに注目すべきである。
以下の記述から一層間らかになるように、フィルター７
４を通って流れる試料の滞留時間を増大させるために、
生物学的活性フィルターの積層を含ませるのが有利であ
る。
しかしながら、簡単化するために、図面においては、た
った１枚の活性フィルター７４しか示していない。
本発明の酵素カラムを使用する分析は、終点間の総変化
を測定するものである。
たとえば、物質αを測定すべきものとしかつこれを酵素
反応α→βにしたがってβに変えうるものとし、そして
またαおよびβが異なる特性的な吸収スペクトルを有す
るものとするならば、酵素と反応させた試料および未反
応試料の間の、特定波長における光学的吸収の差が初め
に存在したα濃度の測値になる。
この種の測定において、滞留時間は反応が完結するのに
十分である。
本発明の酵素カラムに対する一つの重要な用途は、尿酸
を酵素ウリカーゼと反応させることによる血清中の尿酸
の分析である。
分析が依存する反応は次の通りである。
この反応において、尿酸は紫外線吸収性の物質またはク
ロモゲンであり、そしてこれは反応の出発時における高
い光学密度系に寄与する。
光学密度は反応が右方に進むにしたがって減少する。
尿酸は、２９２ナノメータに光学センターを有する波長
帯で光を吸収する。
したがって、尿酸の量は、未反応試料によるそのような
光の光学的吸収を、既知量のウリカーゼと反応した同一
の部分の吸収と比較することによって測定される。
２つのものの間における吸収の差から、尿酸の量を計算
することができる。
この分析を更に次の実施例によって示す。
実施例１０ 酵素カラムによる尿酸の測定 Ａｏ、ゼインフィルターの製造 ■、含浸フィルターおよびカラムフレフィルターの処理 使用したフィルターは１３ｍのゝゝＳＳ”ミリポアフィ
ルタ−である。
２９２ナノメーターで吸収する全ての離脱しうる物質を
洗い出すために、蒸留水を、流出液のピーク光学密度の
増加分が初めの蒸留水のそれに近づくまで、基質フィル
ターに通すことができる。
次いで、洗浄したフィルターを空気乾燥する。
２、ゼインフィルターの調製 ウリカーゼで含浸せしめるべきフィルターを、実施例Ｉ
Ｋ示した手順により、先ずゼインで被覆する。
３、酵素との複合化に先立つ、ゼインフィルターの処理 上記の段階１を繰返す。
ゼインフィルターを、２８０ナノメータにおける△０．
Ｄが蒸留水に対して０．０１以内となるまで、蒸留水で
ゆすくｔ次いで、フィルターを室温にて再び空気乾燥す
る。
Ｂ、酵素カラムの製造手順 装置 １、十分に洗浄され、蒸留水でゆすがれ、かつ乾燥され
た１０−のビーカー・・各組３個の・・製造すべきカラ
ムに対して。
２、正方形のパラフィルム（ｐａｒａｆｉｌｍ）。
３、酵素溶液製造用の、上記のようにゆすいだ、きれい
な乾燥試験管（直径〜１０ ｍｍ ）。
４、カンデイダ・ウチルス由来のシグマ・ウリカーゼ、
シグマカタログＮＣＬＵ−８５００、比活性２．５〜６
．５単位１７１１ｇ。
５、砕氷（ブレンダーで細かく砕いたもの）および酵素
溶液を入れるための氷−水浴用の盆、および複合化用ビ
ーカー。
手順 １、製造すべきカラム１個につき０．５■ノ酵素を、約
２．５平方インチのグラシン紙上で、秤量する（ １．
０個のカラムを作る場合には５ηの酵素を秤量する）。
２、氷上の一本の試験管に、製造すべきカラム１個につ
き２００λの蒸留水を加える。
次段階を行なう前に、試験管の内容物を０℃にする。
３、酵素を定量的に蒸留水に移して、２．５ 噂刀−溶
液を得る。
溶解するまで十分攪拌する。４、氷上に保ちながら、６
００μｔの酵素溶液を各１０ｍ１ビーカーに加える。
ビーカーは、ビーカー壁を十分冷却するために、酵素の
添加前に少なくとも１０分間砕氷中に置くべきであろう
。
５、各ビーカーに、直列１／ｉ：３２枚の１３ｍゼイン
フィルターを入れる。
各フィルターを通して酵素溶液を十分にしみ込ませる（
ｗｉｃｋ ｕｐ ）。
操作してないときは、ビーカーをパラフィルムで覆って
お（。
ビーカーは常に氷上に置くべきである。
６、シみ込みが完了したら、フィルターの積層が互いに
緊密接触していることを確かめる。
ビーカーにしっかりとパラフィルムをかぶせ、テープで
巻（。
２〜４℃に少なくとも２４時間保存する。
７、最少２４時間（４８時間が好ましい）の後、ビーカ
ーの覆いを外し、ペトリ皿中のきれいな、吸収性リント
のない織物の上にフィルターをひろげ、冷凍機内で緩和
な乾燥の下に乾燥する（即ち乾燥剤の存在下にペトリ皿
の蓋をゆるめておく）。
室温にて下記段階を行なうことができる ８、 Ａ、 ０．０ＩＮ硼酸塩緩衝液ｐＨ８，２を
、ケミカル・ラバー社より出版された「生化学ハンドブ
ツク」の１９６８年ノーバー版の Ｊ−１９５頁（ｐａｑｅ Ｊ −１９５ｏｆ ｔ、ｈｅ
ｌ ９６８５ｏｂｅｒ ｅｄｉｔ、ｉｏｎ ｏｆ ｔ
、ｈｅＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
、ｒｙｗｈｉｃｈ ｉｓ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ
ｔｈｅＣｈｅｍｉｃａｌ Ｒｕｂｂｅｒ Ｃｏｒｎｐａ
ｎｙ）の記載のように調製する。
フィルターを緩衝液でぬらす。
Ｂ、第１〜５図の管の各部分に次のものを装填する。
１、上部部分６４ ａ、 １−テフロンガスケット８６ ｂ、１−緩衝液で予めぬらした、上記 した型の予めゆすいだプレフィルタ ７２ ２、下部部分６２ Ｃ，テフロンガスケット８８ ｄ、１２−上記のように作ったウリカ ーゼ・ゼインフィルター７４ 酵素カラムの状態調節 両力ラムを４０ＣＣの硼酸塩緩衝液で減圧下にゆすぐ。
これにより、カラムは「状態調節」される。カラムは状
態調節の後、使用するまで２〜４℃に保持すべきである
。
分析 尿酸酵素分析管は２本のカラム、即ち酵素カラムと比較
カラムを使用する。
比較カラムは、これ力奪素を含有していない以外は、酵
素カラムと同一である。
等しい量の希釈血清試料を、各カラムのプレフィルタ一
部分の中に入れる。
遠心力は試料を、プレフィルタ−を通し、酵素もしくは
比較部分を通してキュベツト中に引き入れるであろう。
酵素部分は、結合したウリカーゼを有するフィルターの
積層を含有している。
積層された孔質マトリックスの、高い表面積対容積の比
のため、表面に結合された十分なウリカーゼが存在し、
したがって試料がキュベツト部分に入る前に、尿酸のア
ラントインへの変化の完結が確保される。
更に、ウリカーゼは、部分が繰返し使用できるように、
酵素部分に物理的に残存する。
比較部分にはウリカーゼが存在しないので、比較カラム
中の試料の尿酸は未変化のま又である。
プレフィルタ一部分は、酵素もしくは比較部分を目詰り
させうるような試料中の如何なる粒子をも除去する。
これは定期的に交換せねばならない。
プレフィルタ一部分およびキュベツトの双方は使い捨て
ユニットである。
試料と酵素マ） ＩＪラックスの間の最少接触時間（滞
留時間）は、尿酸の完全変換を得るために必要なことで
ある。
これは、遠心分離器の回転速度を１１０００ＲＰ領域に
セットして、２００ｆの相対遠心力を与えることにより
達成することができる。
大儀の臨床用卓上遠心分離器に関しては、最低回転速度
から出発し、そして６分間の終りＫ（名目上の処理時間
）全ての緩衝溶液が最頂室からキュベツト中へ移らない
場合には、必要とされる処理時間が６分より短かいが３
分以上となるように回転速度のセット位置を次に高い速
度位置まで進めることが推奨される。
操作手順 １、酵素もしくは比較部分が真中になるように、酵素も
しくは比較部分の上にはプレフィルタ一部分を、そして
酵素もしくは比較部分の下にはキュベツト部分を置くこ
とによってカラムを組立てる。
各カラムの全長は１５ｒｒ１１円錐形遠心分離管と同等
である。
２、分光光度計にスイッチを入れる。
波長を２９２ナノメーターにセットする。
３、血清試料０．２ｒｒｌｌを緩衝液５．８ｒｎｌで希
釈する。
４、希釈された血清試料２．８ｒＩｌｌを、２本のカラ
ムのそれぞれにおけるプレフィルタ一部分に加える。
一対の管を相対位置において遠心分離器ヘッド中に入れ
る。
５、上記で選択した回転速度にて６分間、管を遠心分離
する。
６、試料を容器に移し、２９２ナノメーターにおける試
料の光学密度（’０．Ｄ、）を測定する。
シングルビーム測定ニ関して ａ、比較円筒（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｔ、ｈｉｍｂｌｅ
）からの試料のＯ，Ｄ、を０．４にセラトスる。
ｂ、酵素カラムからの試料の０ 、Ｄ、を測定する、Ｄ
ｌ。
ダブルビーム測定に関して ａ、試料容器が釣り合った対であることを確かめる。
ｂ、酵素キュベツトからの試料を含む容器を比較位置に
置き、比較キュベツトからの試料を含む容器を試料位置
に置く。
Ｃ０光学密度の読みを取る、△Ｏ０Ｄ。
７、下記の関係により、尿酸の濃度を計算する。
シングルビーム測定に関シテ 尿酸（■喝） ＝Ｃ０，４−Ｄｌ）Ｘ４２．５ダブルビ
ーム測定に関して 尿酸（鳴憾）＝△Ｏ，Ｄ、Ｘ４２．５ ８、カラムを４℃の冷凍束中に再貯蔵する前に、緩衝液
３−を容管の最頂室へ加えることにより、カラムを緩衝
液で流し洗わねばならない。
管を、５分間遠心分離する。
本発明の酵素カラムを用いることから生ずる幾つかの重
要な利点がある。
一つの利点は、他の系を用いては行なうことが困難な特
殊試験が可能になることである。
この点に関し、酵素カラムは尿酸分析に限定されるもの
でないことに注目すべきである。
実際、本発明の酵素カラムを用いて多くの酵素分析を有
利に行なうことができる。
本発明の酵素カラムを用いて、より便利に行ないうる分
析の例は、前記した反応を用いるグルコースの分析であ
る。
酵素カラムは、スタットテスト（ｓｔａｔ、 ｔｅｓ
ｔ）を行なうのに特に有利である。
酵素カラムによる尿酸の分析は、従来のシステムを用い
たときの３０分間に比較して、６〜７分間で行なうこと
ができる。
勿論、結合酵素法の基本的利点は、その特異性および結
合酵素の再使用性である。
本発明によるウレアーゼ膜の別の用途は尿素の測定用で
ある。
この方法の論議に関しては、クラウス・モスバッハによ
る「人工マトリックスニ結合すれた酵素」と題する論文
（’ Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｏｕｎｄｔ、ｏ Ａｒ ｔ、
１ｆｉｃｉａｌ Ｍａｔ、ｒｉｘ’ 、 ｂｙ Ｋｌａ
ｕｓＭｏｓｂａｃｈ 、 Ｓｃ ｉｅｎ ｔ、ｉｆ ｉ
ｃ Ａｍｅ ｒｉ ｃａｎ 。
Ｍａｒｃｈ 、 １９７１、ｐ、ｐ２６〜３３）を参照
することができ、その教示を参考のためこＳで記載する
。
このサイエンテイフイク・アメリカン論文の第３２頁に
、ウレアーゼ含有ゲルを用いる尿素の測定が開示されて
いる。
本発明においては、ウレアーゼは孔質の重合体膜に結合
させ、そしてサイエンテイフイクアメリカン論文に開示
されたウレアーゼ含有ゲルに代えている。
本発明は、その思想または本質的特徴から離れることな
く、その他の特定形態に具体化させることができる。
したがって上記の具体例は全ての面において例示用のも
のであり、本発明を限定するものでないと考えるべきで
ある。
本発明の範囲は、上記の記載によってではなく、後記の
実施態様によって示され、したがって実施態様の均等の
意味および範囲内に入る全ての変化は本発明の範囲に入
ることを意図する。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明による酵素カラムの分解透視図である。 第２図は本発明による酵素カラムの正面図である。 第３図は第２図と同様であるが部分的に断面を示した図
である。 第４図は第３図の線４−４に沿って切った断面図である
。 第５図は第３図の線５−５に沿って切った断面図である
。 図において、６０はキュベツト、６２は下部カラム部分
、６４は上部カラム部分、６８おヨヒ７０は支持リング
、７２はプレフィルタ−１そして７４は酵素を含浸せし
めた濾過膜である。

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. １ 生物学的に活性な蛋白質物質を不動化するための複
    合膜構造体であって、約２５ｎｍから１４μｍの毛管孔
    径を有する微孔質薄膜から成り、この膜は生物学的に不
    活性な合成重合体からつくられ、かつその膜の表面には
    不活性蛋白質物質の薄い水不溶性被覆を有し、この被覆
    は、■蛋白質物質の有機溶媒溶液にこの膜を浸漬し、つ
    いで■乾燥して、不活性蛋白質物質の薄層を得ることに
    より生成され、この膜はその連通性毛管孔を保持し、か
    つ生物学的に活性な物質の溶液とこの被覆膜を接触させ
    て、生物学的に活性な蛋白質物質を膜面に安定に不動化
    する、上記構造体。
JP50107150A 1974-09-06 1975-09-05 セイブツガクテキカツセイノ マクザイリヨウ Expired JPS5857151B2 (ja)

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