JPS5863385A - 免疫系由来の細胞用培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １９７５年にＫＯｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎは、
正常の抗体生産細胞を骨髄腫細胞と融合することにより
、正常の抗体生産細胞を不滅のものとすることが出来る
と発表した（　Ｉｔｏｈｌｅｒ、　ＧおよびＯ０Ｍ１ｌ
ａｔｅｉｎ。

１９７５　、　ｎａｔｕｒｅ　２５６　：　４９５　）
。ノ・イブリドーマとして知られる生成されたノルイブ
リッドは単−抗原決足基に特有の均一な又は単クロン性
の抗体を虫、産する。単クロン性抗体の使用は生物学の
殆んどあらゆる分野において一般的なものになつている
。例えば単クロン性抗体は蛋白質の親和性精製の為に、
組織適合性試験の為に、種々のウィルスの研究の為に、
ラジオイムノアッセイの為に、細胞表面の抗ｉｖ研究す
るのに使用されている。

更に最近率クロン性抗体が薬品対象物、免疫療法および
有毒物質吸収試薬のような医学的適応性を有することが
認められた。

ハイプリドーマ細胞ラインにより生産された単クロン性
抗体を精製することがしばしば望まれ、かつ成る場合に
は必須のことになっている。試験管内において、ハイプ
リドーマは通常１０から２０パーセントの血清を添加し
た栄養培地中で生育する。ハイプリドーマによる抗体の
生成は通常培養液ミリリットル当り免疫グロブリン蛋白
質が１から１００マイクログラムの範囲であるから、崩
潰の使用により非常に大量の＃棟構造の蛋白質が導入さ
れ、異種構造の蛋白質は最終的に抗体和製中に除去され
ねばならぬ。ハイデＩＩ　Ｐ−マ細施ラインを培養する
無血清培地の開発により、抗体精製の仕事が非常に単純
化される。

マウスのハイプリドーマ細胞ラインを無血清培地中で生
育さす試みが進行している。例えば、市販されていない
が、完全なｘｓｃｏｖｅ氏の変形イーグル培地が、ねず
みのリンパ細胞の無血清培養用に開発され、ＦＯから誘
導されたハイプリドーマ生育用（Ｆａｚｅｋａａ　ｄｏ
　ａｔ、　Ｇｒｏｔｈ、　Ｓ、およヒＤ。

Ｓｃｈｉｅｄｅｇｇｅｒ、　１９８Ｑ　、　Ｊ、工ｍｍ
ｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ３５：１）、親の骨髄腫ラ
イ／ＳＰ２１０−Ａｇ−１４変異体（８ｃｈｕ１ｍａｎ
　、　Ｍ、等１９７８．　Ｎａｔｕｒｅ２７６　：　２
６９）生育に成程度成功して使用されている。然し完全
な工５ｃｏｖｅ氏培地の調製が困難なことにより、血清
含有培地の代用としては好まれない。更にＰ３−ＭＳ−
１−Ａｇ４−１ハイプリ）１’　−ｖ細胞ライン（Ｏｈ
ａｎｇ、　’ｒ、等、１９８０　、　、Ｔ。

工ｍｍｕｎｏ１０Ｍｅｔｈｏｄｓ　６９　：　３６９　
）であるが、親の骨−１庫で無いものは、インシュリン
およびトランスフェリンのみ付加した強化ＲＰＭ工１６
４ｏから成る非常に単純な培地中・で生育することが報
告されている。然しこれ等のハイプリドーマの世代時間
はＪｆ［ｌ清添加培地の１日未満に比較し、無血清培地
では６日程度である。

本発明は先行技術の欠点を有しない培地を供する。この
培地は免疫系から生じた各−細胞の無血清培養に使用出
来る。これはハイプリドーマ以外に、種々の免疫系の悪
性細胞および通常のリンパ細胞のような他の細胞タイプ
を含む。又本発明は血清の添加と共に使用する時、上記
の細胞タイプの生育を改良する培地を供する。　　　　
　　　　　Ｃ１次の組成物が骨髄腫およびハイプリドー
マ細胞ライン、特にねずみ由来の骨髄腫およびハイプリ
ドーマ細胞ラインを無血清の環境下で生育させる理想の
培地を供することが確認された。

Ａ、１）約０−１００μｇ／−インシュリン２）約１−
１００μｇ／−トランスフェリン６）約０−２００μＭ
　　エタノールアミンから成る群から選ばれた成長因子
、 Ｂ、−次の脂肪酸の群から選ばれた少くとも１檜の脂肪
酸と約１　：　０．５から１：４の範囲のモル比で複合
させた、約１００−１０００μｇ／−の牛の匍清アルデ
ミン（ＢＳＡ）： １）アラキドン酸 ２）オレイン酸 ３）リノール酸 ４）パルミチン酸 ５）ステアリン酸 ６）リルン酸 ７）パルミトレイン酸 次のアミノ酸の群から選ばれたアミノ酸：１）約０−１
００１ｖ／Ｊ　　Ｌ−アラニン２）約１００−１０００
■／ＡＬ−アルギニン６）約０−１００■／ＩＩ、　　
Ｌ−アスパラギン４）約０−１００架／４３　　Ｌ−ア
スパラギン酸５）約０−１００１１１＆／Ｊ　　Ｌ−グ
リ’／７６）約７．５−１５０１ｎｙ／ＡＬ　−ヒスチ
ジン７）約１０−５００呼／Ｊ３Ｌ−イソロイシン８）
約２５−５００■／Ｊ３Ｌ−ロイシン９）約２０−４０
０′Ｉｖ／ノＬ−リシンＨＯ１１０）約７．５−１５０
ｗ／４３　Ｌ−メチオニン１１）約０−１５０ダ／ｉ　
　Ｌ−セリン１２）約１０−２００１１夕／ｉ’Ｌ−ト
レオニン１３）約７．５−１５０Ｍ９／Ｊ　Ｌ−フェニ
ルアラニン１４）約２．５−２５１ｖ／Ａ　　Ｌ−）リ
ゾトファイ１５）約１０−１００〜／ＡＬ−バリン１６
）約０−１００■／ｆｉ　　Ｌ−グルタミン＃！塩１７
）約０−２００■／ｉ　　Ｌ−プロリン１８）約０−１
００■／Ｊ　ヒドロキシ−Ｌ−プロリン１９）約１０−
１００ｍｇ／ノチロシン２０）約２５−５００■／Ｊシ
スチン ２１）約１００−３０００■／Ｊグルタミン２２）約０
−５．５１１Ｆ／４　　　Ｌ−α−アミノ−ｎ−酪酸２
３）約０−３．９■／Ｊ　　Ｄ−グルコサミンＨＯ’１
２４）約０−４．２１ｋｇ／４　　Ｌ−タウ１１ン２５
）約０−９．４ダ／４３　１−−オルニチンＨＯＩｐ６
次のビタミンから成る群から選ばれたビタミン： １）約０−５■／１３　　　’Ｐ−アミノ安息香酸２）
約０−３１１＃９／Ａ　　　ビオチン３）　約０．１−
３〜／！　ｄ−パシトテン酸カルシウム４）約１．０−
１０．０即／Ｊ垣化コリン　４５）約肌５５−５１ａ／
ぷ　ニコチンアミド６）約０．５−３１４９７４３　　
ピリドキシン−Ｈ３Ｎ２）約０．１−１．０９／Ｊリボ
フラビン８）約０．５−３．０■／ぷチアミンＨ０１９
）約ｏ　−ｉ　ｏ、ｏダ／ＪビタミンＢ１１１０）約１
０．０−５０．０〜／彫イノシトール１１）約０−０．
０２５啼／！Ｄトコフエロール酸性コハク酸エステル １２）約０−０．２５■／Ｊ　カルシフェロール１３）
約０−０．０２５岬／！メナジオン１４）約０−０．０
６２５■／Ｊニアシン１５）約０−０．２５〜／！　ビ
タミンＡ１６）約０．５−３．０■／！　葉酸 Ｅ、均衡塩類溶液 １０次の化合物から成る群から選ばれた微量化合物： １）約０−０−０１　’％’／　Ａ　　０ｕ８０４・５
１１２０２）約０−　Ｉ　Ｘ　１０’７”Ｍ　　］Ｆ’
ｅＳＯ４・７　Ｈ２Ｏ５）約０−０．１ｑ／Ａ　　　Ｚ
ｎ８０４・７ＨＰ０４）約　０−ＩＸｌｏ−フＭ　　　
　Ｌｉ０１５）約０−２．５　Ｘ　１０−６Ｍ　Ｍａｒ
ｓｅｓ。

００次の補酵素から成る群から選ばれた補酵素：１）約
０−０．２５ダ／Ｊ　補酵素Ａ ２）約０−０．７■／！　　　ジホスホピリジンヌクレ
オチド ３）約０−１．０〜／！　　フラビンア少ニンジヌクレ
オチド ４）約０−１．０■／−ｅ　トリホスホピリジンヌクレ
オチド ５）約０−１．０即／−ｅ　コカルざキシラーゼ６）約
０−１．０■／Ｊ　ウリジン三燐酸ナトリウムＨ０次の
核酸誘導体から成る群から選ばれた核酸誘導体： １）約０−１０〜／フ　　デオキシアデノシン２）約０
−１０ｍｇ／４　　デオキシグアノシン３）約０−１０
〜／Ｊ　デオキシシチジンＨＯＩ４）約０−０．１〜／
Ｊ３５−メチルシトシン５）約０−７３■／Ｊ　チミジ
ンおよび工０次の物質から成る群から選ばれた付加成分
：１）約０−２０１１１９／１３　　リポ酸２）　　約
０−１００啼／Ａ　ピルビン酸ナトリウム６）約０−４
０■／ぷ　ヒポキサンチン４）約２０００１ｎｇ／　Ａ
　　ＮａＨＯＯ３５）約１０００−４５００９／！グル
コース６）約０−２０〜／Ｊ３　　フェノールレッド７
）約Ｑ−１０１１＆／Ａ　　グルタチオン８）約０−５
０〜／！　アラキドン酸 ９）約０−１．８を／Ｊ３　　Ｄ−グルクロノラクトン
１０）約０−１．８〜／廓　ｌルクロン酸ナトリウムＨ
２Ｏ１１）約０−１２．５〜／１３トイーン８０゜更に
上記の無崩清培地を、生育を最適にする一度に一請節し
た。従って最良の無怖清培地は次の通りである： Ａ、１）約５μｇ／ｗｄ　　インシュリン２）約５０μ
ｇ／ｗｔ　　）ランスフェリン６）約２０μＭ　　　エ
タノールアミンから成る群から選ばれた成長因子 ３０次の各脂肪酸と１＝１０モル比で複合させた、約１
００μｇ　／　ｄの牛崩清アルデミン（Ｂ８Ａ）：１）
アラキドン酸 ２）オレイン酸 ３）リノール酸 ４）パルミチン酸 ５）ステアリン酸 ６）リルン酸 ７）パルミトレイン酸 ００次のアミノ酸の群から選ばれたアミノＭ：１）約１
０鞍／４３　　　Ｉ、−アラニン２）約２００■／４３
　　Ｌ−アルヤニン３）約５０Ｍ？／Ｊ　　　Ｌ−アス
パラギン４）約２０を／１３　　　Ｌ−アスパラギン酸
５）約１０■／１３　　　Ｌ−グリシン６）約１５ｗＪ
９／−＃　　　Ｌ−ヒスチジｙ７）約５０即／４３　　
　Ｌ−イソロイシン８）約５０即／１３　　　Ｌ−ロイ
シン９）約４０１５７／／？　　　Ｌ−リン７ＨＯ１１
０）約１５１１１ｐ／Ａ　　　Ｌ−メチオニン１１）約
３０■／４３　　　Ｌ−セリン１２）約２０！／７　　
　Ｌ−）レオニジ１６）約１５■／ｉ　　　Ｌ−７エニ
ルアラニン１４）約５〜／−ｅ　　　　Ｌ−）リデトフ
ァン１５）約２０Ｍｅ／４　　Ｌ−ハｙ　ｙ１６）約２
０〜／婆　　Ｌ−グルタミン酸塩１７）約２０ＩＲＱ／
廓　　Ｌ−プロリン１８）約２０〜／！　　ヒドロキシ
−Ｌ−ゾロリン。

１９）約２０■／婆　　チロシン ２［］）約５０〜／２　　シスチン ２１）約３００１１に／！　グルタミン２２）約０．５
５Ｗ＃　　Ｌ−Ｃ’−アミノ−ｎ−酪酸２６）約０．５
９１１９／４３　　Ｄ−グルーｔｔミ７ＨＯ１２４）約
０．４２＃夕／４３　　Ｌ−タウリン２５）約０．９４
１１１９／Ｊｔ　　Ｌ−、ｔルニチｙＨｃＩＤ０次のビ
タミンから成る群から選ばれたビタミン： １）約１〜／４３　　　　ｐ−アミノ安息香酸２）約０
．２〜／−１３ビオチン ３）約０．２５１１＆／ノ　ｄ−パントテン酸カルシウ
ム４）約６〜／！　　　塩イ仁コリン ５）約１牧／−ｅ　　　ニコチンアミド６）約１１１Ｊ
Ｇｔ／４３　　　　ｆリド−１／／−ＨＣｌ２）約０．
２〜／ぷ　　リボフラビン ８）約１〜／！　　　チアミンＨＯ１ ９）約１．０〜／！　　ビタミンＢ１２１０）約６５９
／！　　イノシトール １１）約０．００２５〜／ぷＤ−）コフエロール酸性コ
ハク酸エステル １２）約０．０２５■／Ｊカルシフエロール１３）約０
．００２５■／！メナジオン１４）給電００６２５■／
！ニアシン １５）約０．０２５１１１２／彫　ビタミンＡ１６）約
１１ＩＩｙ／ノ　　　　葉酸 Ｅ、均衡塩類溶液 １０次の化合物の群から選ばれた微量化合物：１）給電
００１２５１１５１／　４３０ｕ８０ａ　’　５Ｈａ０
２）約１０′″ＩＯＭ　　　　　ｐｅｓｏ、、７ａ２゜
３）約０．０２８　ＤＩ／　−１３Ｚ”ＢＯ４・７　Ｈ
２Ｏ４）約１０〜’Ｍ　　　　　ＬｉＯ］。

５）　　約２−５　ｘ　　Ｉ　　Ｑ−８Ｍ　　　　Ｎａ
１ｓｅｏ４Ｇ０次の補酵素から成る群から選ばれた補酵
素＝１）約０．０２５ｍ９／−６補酵素Ａ ２）　　約０．０７〜／ＩＩ　　　　ジホスホビリジン
ヌクレオチド ３）　　約ｏ、１し、／Ａ　　　フラビンアゾニジジヌ
クレオチド ４）　　約０．１１１Ｖ／４　　　）リホスホビリヂン
ヌクレオチＶ ５）約０．１１ｎｙ／４　　　コカルボキシラーゼ６）
給電１〜／！　　ウリジン三燐酸ナトリウムＨ０次の核
ｍ誘纏体から成る群から選ばれた核酸誘導体： ’Ｉ）約ｆ〜７１３　　　　デオキシアデノシン２）約
１■／彫　　　　デオキシグアノシン６）約１即／ぶ　
　　デオキシシチジンＨＯ１４）約０．０１〜／！　５
−メチルシトシン５）約１岬／Ｊ　　　チミジンおよび 工１次の物質から成る群から選ばれた付加成分＝１）約
０．２岬／、Ｉ３　　　リボ酸 ２）　　約１１０！／Ａ　　Ｖルピン酸ナトリウム６）
約４Ｗ／Ｊ３　　　　ヒボキサンチン４）約２０００　
Ｗ／　Ｊ３　ＮａＨＯ０３５）約２０００■／！グルコ
ース ６）約５〜／−ｅ　　　フェノールレッド７）約１〜／
Ｊ　　　グルタチオン ８）約５〜／−ｅ　　　アスコルビン酸９）約０．１８
〜／ｉ　　Ｄ−グルクロノラクトン１０）約０．１８〜
／ノ　グルクロン酸ナトリウムＨ２゜１１）約１．２５
〜／２　トイ−７８０゜均衡塩類溶液は０ａ（Ｎｏ３）
２．４Ｈ２０，ＫＯＩ、　ＭｇＳＯ４−７Ｈ２０，Ｎａ
１ｌおよび１Ｊａ２ＨＰＯ４から成る群から選ばれた塩
を含有する。理想的な塩のｄｌｌは次の通りである。

約１００１１Ｑ／−ｅ　　Ｏ＠Ｌ（ＮＯ３）２・４Ｈ２
０約４００ｍＱ／ｐ　　Ｋｏｌ 約１００１Ｒ？／　−ｅ　　ＭｇＳＯ４，７ＨｓＯ約６
０００１１Ｖ／１３　Ｎａ１ｌ　オよび約８００　ｗ／
　−ｅ　　Ｎａ２ＨＰＯ４上記の組成物は好ましい均衡
塩類組成物を示す。

コレハ、Ｋａｒｌｅの均衡塩類溶液として知られており
、Ｂｒｙａｎｔにより、　「Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎＭａｎｕａｌ　Ｊ　Ｖｏ
ｌ、　１．　／Ｉ６４、ｐｐ、１８５−１８７（１９７
５）の「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　５ａｌｉｎｅ
　Ｊ中に教示されている。然しどんな均衡塩溶液でも使
用出来る。１つの実行可能な代案としてＨａｎｋ氏の月
ｇＪ塩類があり、それはＨａｎｋ　＆　Ｗａｌｌａｎｃ
ｅによる［Ｒｅ’１ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｏｘｙｇｅｎ　
ａｎｄ　Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　１ｎｐｒｅｓｅｒｖ
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ　ｂ７　Ｒｅｆｒｉ
ｇｅｒａｔｉｏｎ　Ｊ、［Ｐｒｏｃ、　Ｂｏａ、Ｅｘｐ
、　Ｂｉｏｌ、　Ｍｅｄ、　Ｊ、７１：１９６−２００
およびＨａｎｋによる［１（ａｎｋ′ｓ　Ｂａ１ａｎｃ
ｅｄＥｌａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐＨＣｏ
ｎｔｒｏｌ　Ｊ、「Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ａｓ
５ｏｃｉａｔｉｏｎ　Ｍａｎｕａｌ　Ｊ　、　ＶＯｌ、
１．４１ｐｐ、　５−４　（１９７５）に教示されてい
る。

これ等の組成物はハイプリドーマ細胞ラインの試験管内
培養において、単クロン性抗体を生産し、最後に精製す
る目的で、崩清の使用を避ける手段を提供する。通溝は
数百の異なる蛋白質を含有する複合生物的流体である。

ハイブリドーマａ廁の培簀に通溝を使用することは非常
に余分の蛋白質（約６−３０１ｖ／ｄ）を生育培地に導
入することになり、生前培地ａ率り・／性抗体の精製中
に除去しなければならない。対照的に、本発明の培地は
全て精製された６−類の蛋白質のみを含有し、それ等の
蛋白質全体の可能な最高濃度は約７６５マイクログラム
／−のみである。従って単りロ／性抗体は本発明の規定
培地の上ｆｌ＆から、アフイニテイ・クロマトグラフィ
のような挺に複雑な技術によるよりはむしろ単純な蛋白
質分別法により精製出来る。アフイニテイ・クロマトグ
ラフィはハイプリドーマを通溝添加培地中で生育させる
時には欠くことの出来ないものである。

本明細書で記述する培地は、８Ｐ２１０−　Ａ、−１４
マウス骨髄腫細胞およびこの親から銹導された／’ｔイ
デリドーマ、或種のＰ　５−　Ｎ８１−　Ａｇ−４−１
ハイプリドーマ、ＦＯマウス骨髄腫、およびＭＰＯ−１
１骨髄腫とハイプリドーマ細胞ラインを生育させるのに
使用出来る。人間のリンパ球細胞ラインおよび人間のハ
イプリドーマ細胞ラインの無通溝培養にもまた正常のリ
ンパ細胞用培地としても使用出来る。ミド−ダンおよび
抗原の増殖の刺激剤として効果があり、混合リンパ細胞
培養による抗体の生産に効果がある。この培地中で種々
の細胞の免疫系を培誉出来るが、試験管内で血ｍを添加
せずにそのような生成物が得られる培養系をつくるか、
又はそのようなエフェクター分子の検定システムを考案
する手段を提供することにより、リンフ才力イン又は悪
性の、転移したおよび／又は正常の免役系細胞により試
験管内で生成させた他の生長因子のようなエフェクター
分子の精製を容易にする。例えば一定の細胞の無面清生
育はそのようなエフェクター分子により決まるか又は刺
激されうる。

ホルモンと生長因、子の非常に単純な結合が、適当な栄
養培地に添加された時に、８Ｐ２１０−　Ａｇ　−１４
マウス骨髄腫細胞の無穐清生育を助けることが分った。

最適の補足成分はインシュリン、トランスフェリン、エ
タノールアミンおよび必須脂肪酸および非必須脂肪酸と
複合した、牛通溝アルデミン（Ｂ８Ａ）から成ることが
確認された。本発明に記述されている栄養培地は８１？
２１０−　Ａｇ　−１４マウス骨髄魔細胞を上記生長因
子により生育させるのに最適であった。次にＳＰ２／Ｕ
−Ａｇ−１４の生育に最適の配合な柚々の異なる細胞タ
イプ（例を下記した）について試験した。この組成物を
種々の異なる細胞の培養に使用した場合に効果のあるこ
とが証明された。

培地の調製 本発明の無血清培地は通常の手順で上記した各成分を単
純に添加することにより調製出来る。一般ニインシュリ
ン、トランスフェリン、ＢＢＡと結合した脂肪酸、抗生
物質、グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムは培地の
使用直前に添加する。

栄養培地（上記成分なし）を調製し、４−８℃、４ケ月
以内液体として貯蔵する。又基本培地は他の通常の組織
培養基と同様な方法で乾燥粉末として調製することが出
来、滅菌された水とフィルターで還元することが出来る
。Ｑ、１Ｎ　ＨＣＮ中のインシュリンを貯蔵する場合に
は最終配合により１００−１０００倍萬い濃度に調製し
、４℃の液体として貯蔵する。５０倍のトランスフェリ
ン、エタノールアミンおよびＢＢＡと結合した脂肪酸の
ストックを調製して、凍結貯蔵する。

Ｐｅｎｔｅｘという商品名で工ｎ４ｉａｎａσ−＋　Ｍ
ｉｌｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｏｆ　Ｂｅｋｈａｒ
ｄｔ社より販売されている牛血清アルブミンは、次の脂
肪酸の１棟又はそれ以上と１：１のモル比で結合する：
リノール酸、リルン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸
、アラキドン酸、パルミチン酸およびステアリン酸。

更に詳記すると、９５係エタノール中１．５　ｘ　１０
＝ｙ脂肪酸（０，５ｍ　）の溶液を１０−の牛血清アル
ブミン（燐酸緩衝塩溶液５０＃／ｄ）に混合しながら滴
下する。牛血清アルデミ／と別個に被合した各脂肪酸の
ストックを調製し、テ過滅菌し、−２０℃で貯蔵する。

適当なり８Ａ調製品はＰｅｎｔｅｘ　ＢＡＡの代りに使
用出来、ＢＳＡ対脂肪酸比は約０．５−４．０の範囲と
することが出来、はｙ最良の生育状態を維持出来る。

細胞生育試験 本発明の培地中における特殊な細胞ラインの生育を試験
した実験の報告書は次の通りであった。

生育面上の培地をピペツシで靜かに取ることにより、細
胞を培養フラスコから分離するか、又は細胞が懸濁状態
で生育している場合には、単一細胞の懸濁状態を保持す
るように、細胞なピペットで静かにとった。再懸濁され
た細胞をクリニカル遠心機で（例えば、８００工ｇ）で
遠心分離し、燐酸塩緩衝液で一度洗浄し、燐酸塩緩衝液
中で８懸・濁させた。細胞懸濁液の１試料を本発明の培
地に添加シ、２　Ｘ　Ｉ　Ｄ’細胞／ミリリットルの最
終細胞濃度とした。平行して試験した対照培地＆’＠（
Ｍも添加しない基本培地および１０％の牛胎児血清を添
加した基本培地、インシュ１」ン、トランスフェリン　
エタノールアミンおよびＢＢＡと複合した脂肪酸を含ま
ない本発明の培地で−あった。細胞懸濁液の１試料を２
４のくぼみのある４１に量滴定用プレー　）　Ｃｍｔｃ
ｒｏｔｔｔｅｒ　ｐｌａｔｅ　）に添加し、各〈＃マみ
に１Ｗｔの細胞懸濁液を入れた。その′プレートを約６
７℃で、約７４　ｃｏ、　−９３’Ｉｋ空気の雰囲気下
で培養した。培養物を日々顕微鏡で検査し、６カ）ら５
日後に細胞数を数えた。細胞ｇｔ言００ｕｌｔｅｒ電子
粒子計数器を使用して数えた。

６〜４日毎に、細胞を２５−のプラスチック組織培養フ
ラスコ内の５−の生育培地中に絖いて２次培養した。細
胞は各継代培養毎に２　Ｘ　１０’細胞／Ｎｔに希釈し
た。最初の継代培養にを言、上記の如く細胞を調製した
。その後の継代培養を言細胞を再懸濁し、直接に各生育
培地中で希釈した。

細胞数を数え、る為、２４のくほみのある微量滴定用デ
レーＦの培養物を、生育表面力１ら勢よくピペットで取
って分離した。生成した＃Ｉ胞懸濁液を工５ｏｔｏｎ　
ｌ　（ａｏｕｌｔｅｒ　ＤｉｌＬｇｎＯＩ３ｔｉＯ１ｉ
　）で１０−にｓｙｔ、、細ｍ　ノ数ヲａｏｕｘｔｅｒ
粒子計数器（Ｍｏｄｅｌｚｆ、　０ｏｕｌｔｅｒ　ｌ１
ｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、　Ｈｌａｌｅａｈ、　Ｆｌｏｒｌ
ａ　）を使用して測定した。フラスコ内（２５ＣＩｌ！
”）で生育する培養物を再懸濁し、０．２ｄ又（１１，
０−の懸濁液で怖釈し、細胞数を数えた。

下劣に記載の全ての）１イデ１】ドーマ細胞ラインはね
ずみ由来のものであり、キーホー゛ル１】ンベツ）　（
ｋｅｙｈｏｌｓ　１１ｍｐｅｔ　）　ヘモシアニンに特
異性を有する抗体！生成した。ノ・イブ１Ｊドーマ細胞
ラインから培養上澄液を集め、キーホール１】ンペーッ
トヘモシアニンに特異性を有する］−９（）　抗体ノｖ
　／（ルを間接酵素結合イムノアッセイにより検査した
（　ＫＬ工８Ａ　：Ｖｏｌｌｅｒ、　Ａ、、　Ｄ、　Ｂ
ｉｄｗｅｌｌおよびＡ。

Ｂａｒｔｌｅｔｔ　（１９７９）、Ｔｈｅ　Ｅｎｚｙｍ
ｅ　Ｌｉｎｋｅｄ工ｍｍｕｎｏａｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５
ａｙ　（ＫＬ工８Ａ）　ニーハイクロプレート利用のア
ブマドラクトの指針。ＤｙｎａｔｅｃｈＩＣｕｙｏｐｅ
、　Ｂｏｒｏｕｇｈ　Ｈｏｕｓｅ、　Ｒｕｅ　ｄｕ　Ｐ
ｒｅ、　Ｇｕｅｒｎａｅｙ。

英国から援助を受けおよび利用出来る〕。０．１　Ｍ炭
酸塩−重炭酸塩緩衝液（Ｆ）１９．６）中にキーポール
リンペットヘモシアニン（２０ｇ／ｄ）０．５ｓｖを添
加することにより、ポリスチレン製培養管を抗原で被覆
した。その管を４°０１晩培養した。培養期の終りに、
管を０．（）　５１のトイーン２ｏおよび０．０２１ア
ジ化ナトリウム（ＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ　）を含有する燐
酸緩衝塩溶液で６度洗い、振動乾燥し、０．５−の稀釈
培養上澄液を台管に添加した。各培養上澄液を１／１０
　Ｋ稀釈し、続いて２倍の稀釈度にした。抗体を被覆し
た管を使用して２回セして被覆しない管を１回使用して
、′稀釈物を試験しへ稀釈した上澄液を貧有する管を３
７℃で２Ｆｋ？ｊｎＡ培養した。培養期の終りに管をＰ
ＢＳ−ｔｗｅｅｎで３度洗い、振動乾燥し、うさぎでつ
くった抗マウスエｇＧと結合した０、５−のアルカリ性
ホスファターゼ（Ｍｉｌｅｓ−Ｙｅｄａ、　ＩＪｋｈａ
ｒｄｔ、工ｎａｉａｎａ　ｃａｔ　揖６１−２７８）を
供給者の指示通り、ＰＢＳ−ｔｗ　ｅａ　ｎで稀釈して
台管に添加した。その管を６７℃で１時間培養し、ＰＢ
Ｓ−ｔｗｅｅｎで３度洗浄し、ジェタノールアミン緩ｌ
Ｉ液（１０俤ジエタノールアミン、０．０２４　ＮａＮ
３．　ｏ、ｏ　１　’６　ＭｇＣｌ２−６Ｈ２０，ｐＨ
９，８）　中（０１〜／　ｄ　ｐ−ニトロフェニル燐酸
塩０．５　ａＩｔを台管に添加した。６７℃で６０分培
養後、０．２５ｗｔの５　Ｎ　ＮａＯＨを台管に添加し
た。各反応混合物の吸光度は４０５　ｎｍ　　で測定し
た。０．４から０．７の示度の０Ｄ４０δを生じた稀釈
度が報告値の算定に使用された。Ｗ＆していない管およ
び負の対照物の０Ｄ４０１Ｓの示度は常に０．０６ユニ
ツト未満であった。

データは１０４細胞当りの吸光度単位として示されてい
る。

ねずみのハイプリドーマ培養によるハイテリドーマの生
育と抗体の生成を維持する培地として、本発明の培地の
効果を評価する為に、そのようなハイプリドーマを生成
することが必要であった。

ＢａＩｔ）／　ｅマウスはキーホールリンペットヘモシ
アニンにより免疫性が与えられ、それ等の膵臓を除去し
、５Ｐ２１０−　Ａｇ　−１４マウスの骨髄腫又はｐ３
−ＮＢ　−１−Ａｇ−４−１マウスの骨髄腫細胞と一合
させた。融合剤はポリエチレングリコール１５００であ
った。細胞１１合法とハイプリドーマ細胞の培養はＧａ
１ｆｒｅ、　Ｇ、、　８．Ｈｏｗｅ、　Ｏ，Ｍｉｌｓｔ
ｅｉｎ、　Ｇ。

ＢｕｔｃｈｅｒおよびＪ、Ｈｏｗａｒｄ、　１９７７　
、　Ｎａｔｕｒｅ２６６：５５１：ｌ記載されている。

例　　１ ８Ｐ２１０−　Ａｇ　−１４マウス骨髄腫細胞は本発明
の培地および１０憾の牛脂児通溝を添加した基本培地中
で培養した。細胞は２４のくぼみのある微量滴定器のく
ばみ当り２Ｘ１０４細胞を接糧し、日日細胞数を数えた
。８Ｆ２１０−Ａｇ−１４の世代時間は上記規定培地内
では約１８時間であり、通溝を添加した基本栄養培・地
内では１５．５時間であり、８Ｐ２１０−　Ａｇ−’ｌ
　４細胞は本発明の用地内では繰返し再培養出来た。こ
の無血清培地中で１２回の継代培養後、８Ｐ２１０　Ａ
ｇ−１４の世代時間は約１７時間であり、基本的にその
用地における最初の継代培養時の世代時間と同様でめっ
た。、８Ｐ２１０−Ａｇ−１４細胞は無ｉｆ１清培地中
忙おφて、通常通溝中におけると同様に培養フラスコに
ゆるく付着するよりはむしろ単一細胞として懸濁状態で
生育する傾向かあることが認められた。

インシュリン、トランスフェリン、エタノールアミンお
よびＢＡＡと複合した脂肪酸の重要さは、その特異成分
を含まない培地を―製することによりきめられた。イン
シュリンをはふくと、上文で列挙した本発明の処方を使
用した場合に観察される最終細胞密度の６５％の最終細
胞密度に減少することがわかった。トランスフェリンは
８Ｐ２１０−Ａｇ−１４細胞の生育にとって、それを欠
いた場合全く生育しないので完全に必須のものであった
。

エタノールアミンを除いても細胞の生育に＊＊な影曽は
ないが、一方脂肪酸と結合したＢＳＡ　ｉ分が欠除した
場合には細胞の生育が全組成分を使用した場合の１０憾
未満となった。又脂肪酸のないＢＳＡ　’４脂肪酸−緒
合ＢＡＡの代りに添加した時には、８Ｐ２１０−Ａｇ−
１４の最終細胞密度が全組成分を使用した場合に見られ
る最終細胞密度の５俤未満になった。

例　　田 前記の如く、８Ｆ２１０−　Ａｇ　−１４マウス骨ｆ１
１腫細胞を培養する為に開発された本発明の培地は又８
Ｐ２１０−　Ａｇ−１４ハイプリドーマの生育を助ける
。

８Ｐ２１０−　Ａｇ−１４細胞およびキーホールリンペ
ットヘモシアニンに対する抗体を生産する４１１の固定
された８Ｐ２１０−　Ａｇ−１４ハイプリドーマ細胞ラ
インを上記の組成物中および牛脂児崩清を１０係添加し
た基本栄養培地中で培養した。約４日間培養後、８Ｐ２
１０−　Ａｇ−１４細胞は本発明の培地中における密度
に達し、その密度は血清を添加した基本培地中の密度の
約８５優であった。本発明の培地中の４種のハイシリド
ーマ細胞ダインの細胞密度は表１で示す如く、庇清添加
基本坩地中で到達した密度の２４から７５憾の範囲であ
った。

表　１　無血清培地１における８Ｐ２１０−　Ａｇ−１
４日Ｐ２／Ｕ−Ａｇ−１４親の骨髄腫　　　１．ｌＸ１
０’　　１．！１Ｘ１０’８Ｂ−６−０１（Ｄｌｔ）　
　ＳＰ２１０−Ａｇ−１４６−７ＫＸ１０５１’、５１
Ｘ１０’ハイプリドーマｄ ８１−１−Ｄ４（１３２）　　　　　　　　ｌ　　　　
　　　　　　５．８ｘ１０５　７．ｌＸ１０５８８−２
−Ｄｌｚ（！’５）　　　　　　　Ｉ　　　　　　　　
　　２．６Ｘ１０’　　　１．ｌＸ１０’８４−６−４
Ｆ（ＤＩ）　　　　　　　　＃　　　　　　　　　　７
．１ｘ１０５　１．１ｘ１０’ａ、各タイプ（２Ｘ　１
０’ｄ　）の細胞を無血清又は血清添加培地の２４のく
ぼみのある微量滴定プレートに移殖した。細胞の計数は
移殖４日後に行った。

ｂ　本発明の培地。

Ｃ１０１の牛胎児血清を有する基本栄養培地。

ｄ　全ハイプリドーマはキーホールリンベットへ：１．
。

モジアニンに特異性を有する工ｇＧ抗体を生産する。

ハイプリドーマの到達する密度は血清添加培地中に比較
し、本発明の培地中では可成り低いけれども、最初の接
種時の値からの細胞数の増加は、各場合とも相当な・も
のであった。例えば４櫨の１験した細胞中で最も生育の
おそいノ・イブリドーマ細胞（８８−２−ＤＩ２（ＸＰ
５））の、本発明σン培地中における細胞密度は最初接
極時の値の１３倍に場加した。無血清培地中で生育した
４檀のノ・イブリドーマ細胞うイン全ての培養上澄液中
における抗体の滴定濃度は、表■に示す如く、血清添加
培地中における抗体滴定濃度に等しいか又はより太きか
った。

表　■　無血清および通溝添加培ψ中で生育しＳＰ２１
０−Ａｇ−１４親骨髄腫　　　０．０００２　０．００
０１８Ｂ−６−０１（Ｄｌｌ）　　８Ｐ２１０−ＡＦ−
１４１６，６１４，６ハイプリドーマ　ｂ ｓｌ−１−Ｄ、（ｒｃ２）　　　　　ｙ　　　　　　８
・８５・８８８−２−ＤＩ２（Ｆ５）　　　　＃　　　
　　　３１，１　　　２３．６８４−３−４Ｆ（ＤＩ）
　　　　　＃　　　　　　１６．１　　　１８．７１　
各細胞ラインを無血清の又は血清を添加した培地中に接
植した（２×１（Ｊ４／−）。４日後に上澄液を集め、
定′１ｋＥＬ工８Ａ分析法により、キーホールリンペッ
トヘモシアニンに対し％１４性を有する抗体を測定した
。

１　本発明の培地。

０１０憾の牛脂児通溝を添加した基本栄養培地。

１　此等のハイプリドーマはキーホールリンペットヘモ
シアニンに対する特異性を有する単クロン性抗体を生成
する。

例１で述べた如く、ＢＰ２１０−　Ａｇ　−１４骨髄腫
細胞は本発明の培地中において懸濁状態で生育した。

又４種のＳＰ２１０−Ａｇ−１４ハイプリドーマは全て
この培地中において懸濁状態で生育した。

全てのハイプリドーマ細胞ラインを本発明の培地中で少
くとも７回の継代培養に対し連続的に貴培養して約３０
から３５倍の個体数の増加を示した。１つのハイプリド
ーマ細胞ライン８ｌ−１−Ｄ４（Ｅ２）を連続的に再培
養し、生育率を屋時的に試験をし、培誉上澄液を取り、
抗体力価を測定した。本発明の培地および血清添加培地
中における第１回の継代培養の世代時間はそれぞれ１８
および１７時間であり、１２回目の継代培養における世
代時間はそれぞれ１８．５および１８時間であった。本
発明の培地中における長期間の継代培養は表■で示す如
く抗体の生産に影響しなかった。

表　１　長期間の継代培養に及ぼす無血清用地中におけ
る抗体生産の影響 抗体力価（０Ｄ４０５／１０’細細 胞代培養数　　　　　無血清培地ｂ　　ｎ［Ｉ清添加培
地０１　　　　　　　　　　　　　　Ｂ、６　　　　　
　　　５．８３　　　　　　　　　　　１０．２　　　
　　　　　８．５６　　　　　　　　　　　　　Ｂ、０
　　　　　　　　５．９１１　　　　　　　　　　　　
９．０　　　　　　　　６．５ａ８１−１−Ｄ４（Ｆ！
２）ａｊｌヲ無ｍ清培ｊ［ハ１０％ＦＢＳを含む血清添
加培地中で連続して再培養した。上澄液を定期的に集め
、定量ＥＬＩ８Ａ　６ｉ１４足法により、キーホールリ
ンペットヘモシアニンに１　本発明の培地。

１０係の牛胎児の崩潰を添加した基本培地◎継代培養数
に拘らず、無血清培地中のキーホールリンペットヘモシ
アニン抗体のレベルは１ｏ４細胞当り８から１００Ｄ４
゜５＄Ｌ位であった。又通溝添加培池において種々の継
代培養時に集めた上撹赦中の抗体のレベルは本発明の培
地におけるより僅かに低い傾向があるが、比較的一定し
ていた。

血清添加培地中では培養上澄液中の抗体のレベルは１０
′細胞当り約５．５から８．５０Ｄ４゜５単位の範囲で
あった。

例　　ｌ 他の−ｒラウス１１髄腫およびハイプリドーマ細胞は本
発明の培地中で良く生育した。例えばＦＯ。

５Ｐ２１０−　Ａｇ　−１４の変異体はＩＩＩＩｆＷ中
で得られる密度の約５０係の密度、に達した。又本発明
はＭＰＯ−１１隻 マウス営髄庸細胞を□生育させるのに優れた培地であっ
た。対照的にｐ５−１８−ｉ−Ａｇ４−１マウス骨−纏
細胞は本発明の培地中で全く生育しなかつた・試験した
６−類のｐＢ−Ｎθ−１−Ａｇ−４−１）・イブリドー
マ細胞ラインの中２種類は無血清培地中で生育しなかっ
た。然しく　Ｎ１Ｏ−４−Ｄ４（Ｆ４））を生育した１
つの細胞ラインは５日の培賛後蚊初接糧時の値より１０
倍大きく、１０ｑｂの牛胎児σ）゛　血清を添加した基
体培地が達した密度の約６０係の細胞密度に達した。こ
れ等の結果を、ＳＩＶにｉｆ’　ｌ’、１した。

表　■　無血清培地中の他のねずみ骨１！［ＭおよびＰ
３−Ｎ８−１−Ａｇ−４−１親の骨髄−ＭＳ−１１，５
Ｘ１０’　１．ＩＸＩＬｌ’ｕｉｏ−，５−ｐＢ（Ｎ５
）ｃ　　　Ｎ８−１ノ・イブ１ノ　ドーー７１．４刈０
’　　２．９Ｘ１０５Ｎ１０−３−０１０（Ｄ６ｙ　Ｎ
５−１）・イブリド−Ｊ　１．６ｘ１０”ｚ、１Ｘ１ｏ
”′　各タイプの細胞（２ｘ１０’／ｍ）を無朋清培地
および１０係の牛胎児の血清を有する血清添加培地中の
２４のくぼみのある微量調定プレート中に接種した。

ｂ　接種４日後に細胞数を数えた。

０　接種５日後に細胞数を数えた。

６　これ等のノ・イブリドーマはキーホールリンペット
ヘモシアニンに対する抗体を生産する。

６　本発明の培地。

ｆ　ｉｏｎの牛胎児の血清を添加した基本培地。

例　　■ 本発明の培地は人間のリンパ球細胞ラインの生育を助け
る。４種の細胞ライン（ＢＭ、ＡＲ，８８６６、および
８２２６）、全て多種類の骨！ａ暉を有する患者からの
培養で同定したものであるが、本発明の培地中で生育し
た。無血清培地中のそれ等の世代時間は全て約２０時間
であった。血清添加基本培地中で、それ等は１５−１８
時間の倍加時間で生育した。

代理人　　浅　村　　　皓 外４名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）無穐清又は低血清の状態下で培養細胞を増殖させ
   るための培地であって、 Ａ、１）約０−１００μｇ／ｄインシュＩＪン２）約１
   −１００μｇ／ｄ　）ランスフエＩＪ　／６）約０−２
   ００μＭ　エタノールアミンから成る群から選ばれた成
   長因子。 ９０次の脂肪酸の群から選択された少くとも１糧の脂肪
   酸と１　：　０．５から１：５の範囲のモル比で複合さ
   せた、約１００−１０００μｇ　／ｍｌの牛の血清アル
   ブミン（ＢＡＡ）： １）アラキドン酸 ２）オレイン酸 ６）リノール酸 ４）パルミチン酸 ５）ステアリン酸 ６）リルン酸 ７）パルミトレイン酸 Ｃ０次の７ミノ＃Ｉ％から選択されたアミノ酸：１）　
   約０−１００■／ｉ　　Ｌ−アラニン２）約１００−１
   ０００勢／Ｊ３　　Ｌ−フルヤニン６）約０−１０Ｑ■
   ／４３　　　　　Ｌ−アスパラギン４）約０−１００〜
   ／ｉ　　　Ｌ−アスパラギン酸５）約００−１Ｏ０１１
   Ｊ／−ｅ　　　Ｌ−グリシｙ６）約７．５−１５０ダ／
   ＪＪ　　Ｌ−ヒスチジｙ７）約１０−５００■、’Ｊ３
   　　Ｌ−インロイシン８）約２２５−５００１Ｒ＃　　
   Ｌ−ロイシン９）約２０−４００即／ｉ　　Ｌ−リジン
   ＨＯ１１０）約７．５−１５０ダ／ｌ　　Ｌ−メチオニ
   ン１１）約０−１５０■／Ｊ３　　　Ｉ、−セリン１２
   ）約１０−２００ｍｇ／ノ　Ｌ−）レオニン１６）約７
   ．５−１５０ｇｖ／ノ　Ｌ−’７ｚ＝ルアラニン１４）
   約２．５−２５　ＩＩｇ、／ノ　　Ｌ−）リデトファン
   １５）約１Ｏ−１００１１ｖ／ノ　Ｌ−バリン１６）約
   ０−１００ダ／４　　　Ｌ−グルタミン酸塩１７）約０
   −２００Ｗ／Ｊ　　　Ｌ−ゾロリン１８）約０−１００
   ９／Ｊ　　ヒドロキシ−Ｌ−ゾロリン １９）約１０−１００■／！　チロシン２０）約２５−
   ５００１ｖ／Ａ　　シスチン２１）約１００−３０００
   １ｖ／ぶグルタミン２２）約０−５．５′ＩＩｇ／Ａ　
   　　　Ｌ−α−アミノ−ｎ−醋酸 ２３）約０−３．９ダ／１３　　　　Ｄ−グルコサミン
   ＨＯＩ２４）約０−４．２１ｋｇ／Ｕ　　　　Ｌ−タウ
   リン２５）約０−９．４ダ／Ａ　　　　Ｌ−オルニチン
   ｌ（Ｏ’１′Ｄ０次の物質から放る群から選択されたビ
   タミン＝１）約０−５８９／４３　　　　　ｐ−アミノ
   安息香酸２）約０−３〜／−ｅ　　　　　ビオチン６）
   約０．１−３Ｍｇ／Ｊ　　　　”−パントテン酸カルシ
   ウム ４）約１．０−１０．０〜／Ｊ　塩化コリン５）約０．
   ５−５■／！　　　　ニコチンアミＦ６）約０．５−　
   、３１１ｖ／ｉ　　　ビ１ノドキシ７−ＨＯＩ７）約０
   ．１−１．ＯＮｇ／Ｊ３　　　リボフラビン８）約０．
   ５−３．０〜／Ｊｊ　　　チアミンＨＯ１９）約０−１
   ０．ＯＮｇ／、＃　　　ビタミンＢ１１１１１）約０−
   ０．０２５ダ／−ｅＤ−トコフェロール酸性コハク酸エ
   ステル １２）約０−０．２５ｍｇ／ｉ　　　カルシフェロール
   １３）約０−０．０２５１１／ＪＪ　　メナジオン１４
   ）約０−０．０６２５１＃ｙ／Ｊｌ　　ニアシン１５）
   −約０−０．２５■／！　　ビタミンＡ１６）約０．５
   −３．０８９７１３　　　葉酸Ｅ、均衡塩類溶液 １１次の仕合物から成る群から選択された微量化合物： １）約０−０．０１１ｖ／４　　０ｕ８０４−５Ｈ，０
   ２）約０−　Ｉ　Ｘ　１０−８Ｍ　　　Ｆｅ８０．−７
   Ｈ２０３）約０−０．１ｍｇ／−ｇ　　　　Ｚｎ８０４
   −７Ｈ２０４）　　約０−ＩＸｌｏ−フＭ　　　　　　
   　Ｌｉ０１５）約０−２．５ｘ１０″″’Ｍ　　Ｎａ２
   ８ｅＯ４Ｇ０次の補酵素から成る。、声から選択された
   補酵素： １）約０−０．２５〜／Ｊ　　補酵素ム２）　　約０−
   ０．７１Ｖ／４　　　　ジホスホビリジンヌクレオチド ３）約０−１．０Ｍｇ／−６フラビンアデニアデニンジ
   ヌクレオチド ４）約０−１．０〜／１　　　。トリホスホピリジンヌ
   クレオチド ５）約０−１．ＯＨｙ／Ａ　　　　コカルざキシラーゼ
   ６）約０−１．０〜／！　　　　ウリジン三燐酸ナトリ
   ウム Ｈ０次の核酸誘導体から成る群から選択された核酸誘導
   体： １）　　約０−１０８９７−１３　　　　デオキシアデ
   ノシン２）約０−１０１１ｋｉｌ／−ｅ　　　　デオキ
   シグアノシン６）約０−１０１１９／Ｊ、　　　　デオ
   キシシチジンＨＯＩ４）約０−０．１１ｖ／Ｊ　　　　
   ５−メチルシトシン５）約０−７３■／Ｊ　　　チミジ
   ンおよび工６次の物質から成る群から選択された付加成
   分＝１）約０−２０８１；／／ｉ　　　　リボ酸２）約
   ０−１０００４／！　　ピルビン酸ナトリウム３）約０
   −４０Ｗ／−ｅ　　　　ヒボキサンチン４）約２０００
   　Ｗ　／　−ｅ　　　　ＮａＨＯＯ３５）約１０００−
   ４５００即／Ｊグルコース６）約０−２０１１ｇ／Ｊ　
   　　　　フェノールレツＦ７）約０−１０ダ／！　　　
   グルタチオン８）約０−５０〜／Ｊ　　　アスコルビン
   酸９）約０−１．８〜／Ｊ、　　　　Ｄ−グルクロノラ
   クトン １０）約０−１．８＃／４　　　　グルクロン酸ナトリ
   ウムＨ２Ｏ １１）　　約０−１２．５〜／！トイーン８０を包含す
   る、上記培地。 （２）無血清の又は低血清の状態下で培養細胞を生育さ
   せる、ための培地であって、 Ａ０次の物質から成る群から選択された成長因子：１）
   約５μｇ／−インシュリン ２）約５０μｇ／―　　　トランスフェリン６）約２０
   μＭ　　　　　エタノールアミ７９０次の各脂肪酸と１
   ：１のモル比で複合させた、約１００−１０００μｇ　
   ／ｍｌの牛の血清アルブミン（Ｂ８ム）： １）アラキドン酸 ２）オレイン酸　　　　　　　　　　　　　　　１６）
   約６）リノール酸　　　　　　　　　　　　　　　１４
   ）約４）パルミチン酸　　　　　　　　　　　　　　１
   ５）約５）ステアリン酸　　　　　　　　　　　　　　
   １６）約６）リルン酸　　　　　　　　　　　　　　　
   １７）約７）パルミトレイン酸　　　　　　　　　　　
   　１８）約Ｃ０次のアミノ酸から成る群から選択された
   ア　　１９）約ミノ酸＝２０）約 １）約１０′ＩＩｇ／ぶ　　Ｌ−アラニン　　　　　　
   　　２１）約２）約２００ダ／Ｊ３　　Ｌ−アルギニン
   　　　　　　　２２）約３）約５０′ｍｇ／、６　　　
   Ｌ−アスパラギン　　　　　　２６）約４）約２０■／
   １３　　　Ｌ−アスパラギン酸　　　　　２４）約５）
   約１０ダ／１３　　　Ｔ−−グリシン　　　　　　　　
   ２５）約６）約１５■７１３　　　Ｎ−−ヒスチジン　
   　　　　　　９６次。 ７）約５０１１１Ｐ＃　　　Ｌ−インロイシン　　　　
   　タミン＝８）約５０ＭｇＺぷ　　Ｌ−ロイシン　　　
   　　　　　　１）約９）約４０ｍｇ＃　　　Ｌ−リジイ
   Ｈａ１２）　　約１０）約１５〜／ｉ　　　Ｌ−メチオ
   ニン　　　　　　　　３）約１１）約６０■／Ｊ３　　
   　Ｌ−セリン　　　　　　　　４）約１２）約２０１１
   Ｉ９／Ｊ　　　ジ−トレオニン　　　　　　　５）約１
   ５〜／Ｊ３　　　Ｌ−フェニルアラニン５ａｉｔ／Ａ　
   　　Ｌ　−）　ＩＪ　ｆ　）　ｙｙｙ２０１１ｙ／Ｊ　
   　　Ｌ−バリン ２０１に？／−＃　　　Ｌ−グルタミン酸塩２０〜／ｉ
   　　　Ｌ−プロリン ２０ダ／Ｊ　　ヒドロキシ−Ｌ−プロリン２０■／！　
   　チロシン ５０〜／Ｊ　　シスチン ３００〜／！　グルタミン ０．５５１に９／−１ｊ　　Ｌ−ａ−アミノ−ｎ−酪酸
   ０．３９１Ｒｇ＃ｌａ　　Ｄ−グルコサミンＨＯＩ−０
   ，４２■／１３　　Ｌ−タウリン ０．９４％／Ａ　　Ｌ−オルニチンＨＯ１ビタミンから
   成る群から撰択されたビ １１１＆／−＃　　　　ｐ−アミノ安息香酸０．２　Ｗ
   ／４３　　　ビ矛チン ０．２５■＃（１−パントテン酸カルシウム６〜／Ｊ　
   　　塩化プリン ’１１１／ｌｊ　　　　ニコチンアミド６）約１ダ／Ｊ
   　　　ピリドキシン−ＨＣｌ２）約０．２〜／ぷ　　リ
   ボフラビン ８）約１■／！　　　チアミンｆｌａｘ９）約１．０〜
   ／Ｊ３　　　ビタミンＢｌｌ！１０）約６５〜／Ｊ　　
   イノシトール １１）約０．００２５■／１３Ｄ−トコフェロール酸性
   コハク酸エステル １２）約肌０２５■／Ｊカルシフェロール１６）約０．
   ００２５Ｗ／ｉメナジオン１４）約０．００６２５８９
   ／Ｊｊ　　ニアシン１５）約０．０２５ダ／Ｊ　　ビタ
   ミンＡ゛１６）約１■／！　　　　　葉酸 Ｅ、均衡塩類溶液 １０次の物質から成る群から選択された微量化合物： １）約０．００１２５”Ｐ／ＡＯｕ８０４　・５Ｈａ０
   ２）約１Ｑ−１０Ｍ　Ｆｅ８０４−７Ｈ２０゛　３）　
   　約　０．０２８”ｆ／／−＃　ＺｎＥｉＯ，＠　７　
   Ｈ２Ｏ４）約１Ｏ−９ｙ　Ｔ、＋１Ｇ１ ５）約２．５　ｘ　１０−８ＭＨａ、１８ｅＯ。 ００次の補酵素から成る群から選択された補酵素： １）約０．０２５■／！補酵素Ａ ２）約０．０７１１９／Ｊ　　ジホスホｔリヂンヌクレ
   オチド ３）　　約０．１〜／！　　　フラビンアデニンジヌク
   レオチド ４）約０．１１１ｖ＃　　　）リホスホぎりジンヌクレ
   オチド ５）　　約肌１１１＆／−ｅ　　　コーカルボキシラー
   ゼ６）約０．１■／！　　三すン酸つリジンナトリウム
   Ｈ０次の核′酸誘導体からなる群から選択された核＃Ｒ
   Ｔａ導体： １）約１■／！　　　　デオキシアデノシン２）約１１
   １９／ｉ　　　　デオキシグアノシン６）約１ダ／Ｊ　
   　　デオキシシチジンＨＯＩ４）約０．０１ダ／Ｊ）　
   　５−メチルシトシン５）約１ダ／！　　　チミジンお
   よび １１次の物質から成る群から選択された付加成分： １）約０．２■／Ｊ　　リポ酸 ２）約１１０〜／！キルビン酸ナトリウム６）約４〜／
   ！　　　ヒボキサンチン ４）約２０００　”？　／　Ａ　ＮａＨ００３５）約２
   ０００〜／！グルコース ６）約５〜／！　　　フェノールレッＰ７）約１■／Ｊ
   ３　　　　グルタチオン８）約５■／Ｊ　　　アスコル
   ビン酸 ９）約０．１８１１ｇ／４　　Ｄ−グルクロノラクトン
   １０）約０．１８■／Ｊ　グルクロン酸ナトリウムＨ２
   Ｏ１１）約１．２５ダ／１３　　）イーン８０を包含す
   る上記培地。 （３１０ａ（ＮＯ３）２　儂４ａ２ｏ　、　ＫＯｌ、　
   Ｍｇ８０４−７　Ｈ２Ｏ、Ｎａ１ｌ　。 およびＮａ２ＨＰＯ４から成る群から選択された塩を特
   徴とする特許請求範囲第１項又は第２項に記載の生育培
   地。 （４）塩が次の濃度（Ｉｆｉａｒｌｅの塩）である、特
   許請求範囲２１１ｇ３項記載の生育培地二　′ａ、約１
   ００１１＆／Ｊ　　Ｏａ（１１０５）ｇ・４Ｈ２０ｂ、
   約４００■／彫　［０１ Ｃ０約１００ｉｖ／Ａ　　ｖｇｓｏ、、７ａ２゜ｄ、約
   ６０００　Ｗ／　Ｊ３　Ｎａ１ｌｅ、約８００　ＩＱ／
   　−ｅ　　Ｎａ２ＨＰ０４（５）牛血清アルブミンを１
   個又はそれ以上の脂肪酸と約１＝１のモル比で複合させ
   た、特許請求範囲第１項又は第２項記載の生育培地。 （６）培養細胞がＳＰ２１０−Ａｇ−１４骨゛髄腫細胞
   である、特許請求範囲第１項又は第２項記載の生育培地
   。 （７）培養細胞がＳＰ２／Ｄ−Ａｇ−１４ハイプリドー
   マ細胞である、特許請求範囲第１項又は第２項記載の生
   育培地。 （８）牛血清アルブミンと複合させた少くとも若干のパ
   ルミチン酸およびステアリン酸を特徴する特許請求範囲
   第１項記載の生育培地。 （９１Ｈａｎｋの均衡塩類溶液を更に含有する、特杵晴
   求範囲第１項又は＄２項に記載の生育培地。 ＯＩ　　特許請求範囲第１項又は第２項に記載の炭酸塩
   −夏炭酸塩緩衝剤の代用となる緩衝系として、又は特許
   請求範囲第１項および第２項に記載の炭酸塩−重炭酸塩
   緩衝剤と共に第２緩備剤として、Ｎ′−２−ヒドロキシ
   エチルピペラジン−Ｎ−エタン−スルホン酸を特徴とす
   る特許請求範囲第１項又は第２項記載の生育培地。 ０１）培養細胞がＰ３−Ｎａ−１−１ｇ−４−１ハイプ
   リドーマである、特許請求範囲第１項又は第２項記載の
   生育培地。 ０２　　培養細胞がＦＯマウス骨髄腫およびハイプリド
   ーマ細胞である、特許請求範囲第１項又は第２項記載の
   生育培地。 ａ３　　培養細胞が人間のリンパ球細胞である、特許請
   求範囲第１項又は第２項記載の生育培地。 Ｑ４１　　培養細胞がＭＰＯ，−１１骨髄腫およびハブ
   プリドーマ細胞ラインである、特許請求範囲第１項又は
   ＋＠２項記載の生育培地。 ００　　培養細胞が免疫系から生ずる細胞ラインである
   、特許請求範囲第１項又は第２項記載の生育培地。 （至）培養細胞が個々に棺製された細胞集団として又は
   細胞の混合物として培養された通常の免役系の細胞であ
   る、特許請求範囲第１項又は第２項に記載の生育培地。 ａη　血清を特徴する特許請求範囲第１項および第２項
   に記載の生育培地。 （至）　（インシュリン、トランスフェリン、エタノー
   ルアミン、およびＢ８Ａと結合した脂肪酸以外の全ての
   成分）崩清を有する免疫系から、酸濃度における或種類
   から生ずる細胞を培養するのに使用する、特許請求範囲
   第１項又は第２項記載の基本培地。