JPS5871460A - エストラジオ−ル−３−グルクロナイド測定用抗原およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はエストラジオール−３−グルクロナイドの免疫
学的測定用抗原およびその製造法に関するものである。

さらに詳しくは、エストラジオール−３−グルクロナイ
ドの特異抗血清を得るだめのハブテン蛋白結合抗原の新
規合成法に関する。

エストラジオールはエストロゲンの一種であシ遊離型九
抱合型等が知られている。このうち遊離型は血中には存
在するが・尿中には通常出現せず１グルクロン酸抱合型
あるいは硫酸抱合型として排せつされる。なかでもグル
クロン酸抱合型については一近時１その生理的意義が注
目されるようになり１臨床病理的には為血中および尿中
のエストラジオール−３−グルクロナイドとエストラジ
オール−１７−グルクロナイドを分画測定することによ
リ１排卵の予知、不妊症の薬物療法の指標に役立つこと
が指適されている。

従来鳥体液中のエストラジオールは結合型エストラジオ
ールを加水分解して１遊離型としだ後１抽出後１コーバ
ー反応を利用した比色法為または蛍光法あるいは免疫測
定法等を組合せて測定されてきた。しかし々がら氷解操
作を必要とするこれらの測定法は、操作が煩雑であシ１
総エストラジオール量から遊離エストラジオール量を差
引くことによって、抱合型と蛋白結合型の総量と遊離エ
ストラジオールの比率を測定することは可能であるが１
グルクロン酸抱合型であるエストラジオール−３−グル
クロナイドとエストラジオール−１７−グルクロナイド
の分画測定はほとんど不可能てあった。

本発明は体液中のエストラジオール−３−グルクロナイ
ドを免疫学的に測定する時に必要となる特　−異抗体を
作製するためのハプテン−蛋白結合抗原の新規な合成法
に関するものであり為該抗原を用いて作製された抗体を
使用することによ９１体液中のエストラジオール−３−
グルクロナイドを検体中に共存する類似物質の影響を受
けることなく特異的に測定することが可能となる。

近時１体液中のホルモンの測定法として賞月されている
ラジオイムノアッセイは放射性核種で標識したホルモン
と該ホルモンに対する抗体の結合比が反応液中に加えら
れた抗原、すなわちＡ非標識ホルモンの量によって変化
することを利用した方法であり一感度が高く為多数検体
の測定が可能であることから）臨床検査に適した方法と
なっている。しかしながら１その特異性に関しては議論
の多いところである。すなわち１一般に体液中には測定
対象物質と類似の構造を有する物質が多数共存している
ので）測定に用いる抗体は測定対象物質とのみ反応する
もの、即ち特異性が高く）交叉反応性の低いものが要求
される。測定対象物質との結合定数が犬で為かつ１特異
性の高い抗体が用意されれば該対象物質を測定するため
のラジオイムノアッセイは、はぼ確立したことになる。

前述の如く１体液中のエストラジオールを従来法で測定
する場合１一般的には氷解操作が必要になるがラジオイ
ムノアッセイにおいては、エストラジオールグルクロナ
イドと特異的に結合する抗体が用意されれば）水解操作
が不要となり為特異的Ａかつ）高感度な測定が可能とな
るので、今日ではエストラジオールグルクロナイドに限
らす１各種のステロイドホルモンの抱合体を水解せずに
免疫学的に測定するだめの特異抗体の製造法、　Ｉｌｌ
ち１特異抗体を製造するための抗原として、どのような
物質を使用すればよいかという点に免疫学的な測定法を
確立するだめの研究力！進められている。　　　− その一つの例として１エストロゲン−３−グルクロナイ
ドのカルボキシル基にＢＳＡを結合させた島いわゆるハ
プテン−蛋白結合抗原が合成され１該抗原を用いて作製
された抗体を用いて為エストロゲン−３−グルクロナイ
ドを測定する方法が報告されているが）該抗体は特異性
が低く１遊離エストロゲンおよびエストロゲン−１６−
グルクロナイド等に対して）交叉反応性を示すので為満
足出来る結果を与えていない。（Ｐ、−匹ｊｅｅｍ　ｅ
ｔ　ａｌ　：ＢｉｏｃｈＭｃＥＬＬＪπｍ１１５１　、
３６９〜３７６　、１９７５年）また１カルボキシフエ
ニルアゾエストリオール−１６−グルクロナイドのＣ９
位、またはＣ６位にカーポジイミド法を用いてＢＳＡを
結合させた九ノーブテンー蛋白結合抗原の場合為該抗原
を用いて作製された抗体は１遊離エストロゲンに対し為
２・２％以下という比較的低い交叉反応性を示し１改−
良された特異性を示したが１なお不充分であり１この不
充分な特異性はベンゾイル基にＢＳＡを結合させる際に
＼同時にグルクロン酸部分のカルボン酸にもＢＳＡが結
合するためであると推定されテイル。（Ｊ、ＲｏＳｏａ
ｒｅｓ　　ｅｔ　ａｌ　：　ＦＥＢＳ　Ｉｐｔｔ、　６
１．２６３〜２６６．１９７６年） また１エストロンサルフエートのＱ、位ニＢＳＡを結合
させる方法（、Ｔ　、　Ｋｉｍｋａｒａ　ｅｔ　ａｌ　
：　Ｊ　、　５ｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｆ９．１３　、
１０７５　、１９８０年）、ニストロケンＤ環グルクロ
ナイドのＣ，Ｎまたは０４位にＢＳＡを結合させる方法
（Ｔ、動曲ヱｅｔ　牡：Ｊ、Ｓ彷ｍ足Ｂｉｏｃｈｅｏ＋
、　９　、７８５　、１９７８年）の場合１ノ飄ブテン
−蛋白結合抗原を用いて作製された抗体は、いずれもハ
ブテンに対して１高い特′異性を示すことからＡノ・ブ
テンとＢＳＡの結合部位力１ら離れているハブテン分子
の一部分が抗原性決定部位と力っていること一抗体の特
異性は該抗原性決定部位に向けられることが理解される
。

このことはエストロゲン−３−グルクロナイドの場合、
Ａ環０８位に近隣するＣ７、あるいはＣ２位に担体蛋白
を結合させた抗原よシも、Ｂ２Ｏ２位に担体蛋白も結合
させた抗原の方がＡ環の構造を良好に認識する抗体を産
生させる上で有利でちることを示している。

しかしながら、目下のところ）エストラジオール−３−
グルクロナイドの０６位にＢＡＡを結合させることによ
り、エストラジオール−３−グルクロナイドに対する特
異抗血清を得るだめのノ・ブテン−蛋白結合抗原の合成
法についての報告はない。

このような観点からへ本発明者１ｂエストラジオール−
３−グルクロナイドを免疫学的に測定する時に使用出来
る特異性の高い抗体を作製することを目的として九ノ・
ブテン−Ｂ、８Ａ結合体を鋭意検索した結果１本発明を
完成するに至ったものである。

本発明は、エストラジオール−３−ゲルクロナイドのＡ
環グルクロン酸部位にＢＳＡが結合しないよう≠にしな
がらステロイド骨格Ｂ環のＣ６位にＢＳＡを結合させた
ハプテン−ＢＳＡ結合体の合成法に関する。

本発明に基づいて合成された特許請求の範囲第１項に記
載されている物質）すなわち為６−オキツエストラジオ
ールー３−グルクロナイド−６−（０−カルボキシメチ
ル）オキシム−ＢＳＡ結合体を用いて作製された抗体は
、すでに公知の方法で得られたエストラジオール−３−
グルクロナイド−ＢＳＡ結合体を用いて作製された抗体
に比較してＡステロイドのＡ環構造の認識性が特に優れ
ておシ１特異性においても、さらに向上することが明り
ょうとなり１本発明を完成するに至った。

本発明に基づいて作製された抗体はエストラジオール−
３−グルクロナイドのラジオイムノアッセイ用として特
に好適であるが１ラジオイムノアツセイに限らず１羊赤
血球またはポリスチレンラテックス粒子を担体とする凝
集反応および凝集阻止反応に用いることも可能である。

本発明は１特許請求の範囲第２項イ）〜二）に記載した
工程に基づいて６−オキソエストラジオール−３−グル
クロナイド−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−
ＢＳＡ結合体を合成する方法に関するものであるが）本
発明のさらに加わった特徴の一つとしてニスドラジオー
ル−３−グルクロナイドのグルクロン酸部分の保護基を
合成工程の最終段階九すなわち１特許請求の範囲第２項
二）に記載した工程において脱離させることにある。

本発明に基づくエストラジオール−３−グルクロナイド
測定用の抗原として用いられる新規ステロイド化合物は
為化学構造式 で示される６−オキツユスト２ジオールー３−グルクロ
ナイド−６−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳ
Ａ結合体である。

本発明に基づく新規ステロイド化合物は、下記の構成）
すなわち１ で示される６−オキソエストラジオール−１フ〜アセテ
ートをメチル（２，３，４−）リーＯ−アセチルー１α
−プロモー１−デオキシ−Ｄ−グルコピラノシド）ウロ
ネートと反応させ１６−オキソエストラジオール−１フ
ーアセテート−３−グルクロナイド−トリアセテートメ
チルエステル（ｍ）とする工程１ で示される６−オキソエストラジオー／Ｉ／−１７−ア
セテート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチル
エステルを酢酸ナトリウムの存在下１ｏ−カルボキシメ
チルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させ６−オキソエ
ストラジオール−１フーアセテート−３−グルクロナイ
ド−トリアセテートメチルエステル−６−（０−カルボ
キシメチル）オキシム（■）とする工程ＡＮ　ＯＣＨ，
ＣＯＯＨ で示される６−オキンエストラジオー＃−１７−アセテ
ート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
テル−６−（０−力ルボキシメチル）オキシムをＢＳＡ
と反応させ６−オキソエストラジオール−１フーアセテ
ート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
テル−Ｌ−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ
結合体（Ｖ）　　とする工程１ で示される６−オキソエストラ１ジオール−１７−アセ
テート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエ
ステル−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳ
Ａ　結合体（Ｖ）を部分的に加水分解する工程１以上の
イ）Ａ口）、ハ）に）の各工程を組合せることによって
製造されるものである。

次に本発明の実施例を示す。

実施例１゜ 化学構造式（ｎ）で示される市販の化合物、　６−オキ
ソエストラジオール−１フーア・化テート５００■をト
ルエン５＋＋Ｉｌに溶解し）炭酸カドミウム６００■を
加え１ケタール化装置にて脱水後１メチル（Ｌ　３＃４
−トリー〇−アセチルー１α−プロモー１−デオキシ−
Ｄ−グルコピラノシド）ウロネート１ｇを力ｐえて７２
時間還流する。次に反応液をろ過して）触媒をろ去し１
ろ液を濃縮後１シリカゲルカラムクロマトグラフイーに
付し）ベンゼン／酢酸エチル（４：１）溶出画分を濃縮
後−アセトンにより再結晶すると化合物（Ｉｎ）１３Ｑ
■が得られる。

化合物（ｍ）の分析値 ｍ−Ｐ、　　　１８９＠〜１９０′″ ［α］　　　−１８，５°　（Ｃ＝０．１０　、　ＣＨ
Ｃｂ）元素分析値 Ｃ：　６０．６９　、　Ｈ：　６．１９化学式Ｃ８８Ｈ
４Ｇ０１＠・十Ｈ，Ｏに対する計算値Ｃ：　　６０．６
４　　、Ｈ：　　６．３２ＨＭＲ（ＣＤＱｓ） ０．８４　　　　（３Ｈ，ｓ、ｌ８−ＣＨ，）２．０７
　　　　　（１２Ｈ，ｓ、１７　β−，２’−，３’−
，４’−０ＣＯＣＨ，）３、７４　　　（３Ｈ，ｓ、　
Ｃ００Ｃ鳥）４．０２　　　（ＩＨ，ｍ、５−Ｈ） ４．７２　　　（ＩＨ，ｍ、１７ａ−Ｈ）５．３０　　
　　　（４Ｈ，ｍ、１’−，２’−，３’−，４’−Ｈ
）７．２０　　　（ＩＨ，’ｂｒｓ、４−Ｈ）７．２５
　　　（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝＝８，２七、　２−Ｈ）７
．６０　　　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝＝８七、　１−Ｈ）化合
物（１１７）６２ｍｇをメタノール／酢酸エチル（５：
２）１４＋ｎ／！に溶解し、次に〇−カルボキシメチル
ヒドロキシルアミン塩酸塩１５３■と１０９６酢酸ナト
リウム１．５ｍＪを加え、３５℃で１２時間攪拌後）水
を加え、酢酸エチルで抽出する。有機層を水洗）乾燥後
１溶媒を留去する。残渣をエーテルよシ再結晶すると化
合物（■）５１■が得られる。

化合物（ＩＶ）の分析値 ｍ、ｐ、　　１８５〜１８８” ｔ。

〔α〕ゎ　＋６４．３　　（Ｃ：０．１１　、　Ｃ鳥Ｏ
Ｈ）元素分析値 Ｃ：　５６，９１　、　Ｈ：　５．９７　、　Ｎ　：　
１．８１化学式Ｃ■Ｈ４，０ＩｓＮ−Ｈ１ｏに対する計
算値Ｃ、５７，１４、Ｈ：’６．１６　、　Ｎ　：　１
．９ＣＨＭＲ（ＣＤ、ＯＤ　／ＣＤＣｌ５） ０、８４　　　（３Ｈ，ｓ、　１８−ＣＭ、　）２．０
６　　　　　（６Ｈ，ａ、１７−．２’−，３’−，４
’−０ＣＯＣＲ，）２、０８　　　　（６Ｈ，ｓ、１７
−．２’−，３’−，４’−０ＣＯＣＲ，）３、７４　
　　（３Ｈ，ｓ、　Ｃ００ＣＨ，）４．６９　　　（２
Ｈ，ａ、’＝ＮＯＣＨ，−）６．９８　　　（ＩＨ，ｄ
、Ｊ＝９．２七、　２−Ｈ）７．１６　　　（ＩＥ、ｄ
、、Ｔ：２七、　４−Ｉ（）７．５４　　　（ＩＨ，ｄ
、Ｊ：２七、４−Ｈ）化合物（■）４８■をジメチルポ
ルムアミド（以下ＤＭＦと略称す）１．５＋ｎ／に溶解
し）水冷下１　トリーｎ−フチｆｉｖ７　ミ７５０μお
よびインブチルクロロフォルメート１３黒を加え１３０
分後、ＢＳＡ　１２３■を含有する含水ＤＭＦアルカリ
溶液（Ｈｇｏ　／ＤＭＦ　／ＩＮ　ｋＯＨ＝３　ｍｌ　
７２．２　ｍｌ　／　０．１　ｍｌ）を加えｐＨ７，０
〜７．５に調整後、室温で１２時間攪拌する。反応液を
冷水で２４時間透析後〜凍結乾燥に付しへ化合物（Ｖ）
　１６６■を得た。

化合物（■）１６５ｍｇを水５０ｍ１に溶解後、　５Ｎ
Ｎａ　ＯＨを用いてｐＨ１２，０〜１２．５に調整し１
室温で４８時間攪拌後、冷水で２４時間透析する。次い
で凍結乾燥に付し１化合物（，１）１３１■を得た。

化合物（Ｉ）、即ち６−オキソエストラジオール−３−
グルクロナイド−６−（０−カルボキシメチル）オキシ
ム−ＢＳＡ結合体のＢＳＡ　１モル当シのノ・ブテン結
合−ｖ−／ｌ／数をＵＶ法にょシ求めたところ１３．０
モルであった。

実施例２゜ 抗体の作成（ウサギの免疫） 体重２．５〜３−０ｋｇの在来種白色ウサギ３羽に６−
オキソエストラジオール−３−グルクロナイド−６−（
０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体抗原を
以下の如く免疫した。

即ち〜抗原２■を滅菌生理食塩液０．５ｍｌに溶解させ
１これをフロイント・コンプリート・アジュバント０．
５コにてエマルジョンにし１このエマルジョンをウサギ
の肩甲部および足２１Ｌ数ケ所に皮下投与した。以後２
ケ月に渡って２週間毎に同様の投与を行った。最後の投
与（第５回目の投与）から１週間後に島このウサギの耳
静脈から１０ｍ１を採血し為これを３０００回転１１０
分間の遠心分離にかけ、得られた抗血清を一２０℃に保
存した。

使用時においては１該抗血清を解凍し、ＢＳＡｏ。

０６’％、牛−ｒ−ｆ　０７　！Ｊ　７０．　ｏｓ　％
　ヲ含ｔｒＯ−０５Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用
いてｌ：３０００の希釈率で希釈し１標準曲線を作成し
た。

測定操作 エストラジオール−３−グルクロナイドを含む試料にエ
ストラジオール−３−グルクロナイド−６，７−Ｈ（約
７５００　ｄｐｍ　）および抗血清０．２５−を添加し
、４℃で１時間装置する。次いで５０％硫安溶液０．２
５　ｍｌを添加し、４℃に２０分間放置後、　３０００
回転で１５分間遠心し）得られた上澄液０．２ｍｌをと
多−放射活性を計測する。

交叉反応性について ６−オキソエストラジオール−３−グルクビナイド−６
−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体で
免疫したウサギから得られた前述の抗血清の特異性を調
べるために３２種のステロイドを用、いて〜その交叉反
応性をエストラジオール−３−グルクロナイド−６，７
−Ｈの本抗血清への結合量を標準曲線より求めた結果を
第１表に示す。

第１表の交叉反応の欄における数値は１非標識エストラ
ジオール−３−グルクロナイドの５０９６阻止量を１０
０とし為これに対する各種ステロイドの読みの比率の逆
数を百分率で表示したものである。

第１　表：　抗エストラジオールー３−グルクロナイド
血清と特定ステロイ第１表の結果よシ１本発明の新規化
合物を利用した抗原による抗体を使用したもののエスト
ラジオール−３−グルクロナイドに対する特異性が１他
ののものに比較して１極めて高く）交叉反応が低く抑え
られていることが明シようである。

特許出願人 栄研化学株式会社 手枕補正書（自発） 昭和５６年１１月１ｒ７日 特許庁長官　島１）要衝　殿 １、事件の表示 昭和５６年特許出願第１６８８３４号 ２、発明の名称 ソクテイヨウコウ エストラジオール３　グルクロナイド測定用抗３、補正
をする者 事件との関係　本人 ４、補正の対象 明細書中「発明の詳細な説明」の欄 り、」正の内容 明細書第２０貞１１行目の［Ｂｉめ−ｍｌＪ億ｍｌ・・
・」を「Ｂ１ｏＣ１述、Ｊ、・・・」と補正する。

（２）　　明細書簡１１頁９行目の「・・・１０７５　
、　　・、・」を「・、・１０７５〜１０７９　、・・
・」と補正する。

（３）　　明細書簡１１頁１２行目の「・・・７８５．
１９７８年）・・・」を「・・・７８５〜７９０．１９
・・・」と補正する。

（４）　　明細書第１９頁７行目ノ「・・・（ＩＨ２ｍ
。

５−１（）Ｊを［−−−（ＩＨ，ｍ、　５’−Ｈ）　ｊ
と補正する。

（５）　　明細書第１９頁１０行目の「・・・　（ＩＨ
２ｈｒｓ、４−Ｈ）ｊを［・・・（ＩＨ１旨ｓ、４−Ｈ
）Ｊと補正する。

（６）　　明細書画２０頁１行目の「・・・を留去する
。桟道をエーテル・・・」を［・・・を留去ム／メタノ
ール／水：８０　／２０　／２．５　）に付後、残置を
エーテル・・・」と補正する。

（７）　　明細書第２０貞１２行目と１３行目の１２．
０６　　　（６Ｈ，ｓ、　１７−、２’−、３’＋、　
４’−０ＣＯＣＨｓ）２．０８　　　（６Ｈ，ｓ、１７
−．２’−，３’−，４’−０ＣＯＣＲ，）Ｊ（８）　
　明細書第２０貞１６行目の［・・・　（ＩＨ，ｄ。

Ｊ＝９，２七ｊ　２−Ｈ’）　ｊを「・・・（ＩＨ，ｄ
ｄ、　、Ｔ　：９．２七、２−Ｈ）、ｊと補正する。

（９）　　明細書第２０貞１７行目の［・・・　（ＩＨ
，ｄ。

Ｊ＝２進、４−Ｈ）ｊを［、・−、（ＩＨ，ｄ、、ｒ　
＝９七、１−Ｈ）ｊと補正する。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 で示される６−オキソエストラジオール−３−グルクロ
   ナイド−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−ＥＳ
   Ａ結合体（式中−ＮＨ−ＢＳＡは牛血清アルブミン残基
   を表わ゛し１Ｇは ＣＯＯ−Ｊ で示されるグルクロニル基を表わす。以下同様）から成
   るエストラジオール−３−グルクロナイド測定用抗原。 す で示される６−オキソエストラジオール−１フーアセテ
   ート　（ｎ）をメチル（２，３，４−）ジ−０−アセチ
   ル−１α−ブロモ−１−デオキシ−Ｄ−ゲルコピ２ノシ
   ド）ウロネートと反応させ１６−オキソエストラジオー
   ル−１フーアセテート−３−グルクロナイド−トリアセ
   テートメチルエステル（ｍ）とする工程、（式中Ｇ′は − ＣＯＯＣＨ。 で示されるグルクロニル基を表わす。以下同様）で示さ
   れる６−オキソエストラジオール−１フーアセテート−
   ３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエステル（
   ■１）を酢酸ナトリウムの存在下、ｏ−力ルボキシメチ
   ルヒドロキシルアミン塩酸塩と反応させ６−オキソエス
   トラジオール−１フーアセテート　３−グルクロナイド
   −トリアセテートメチルエステル−６−（０−カルボキ
   シメチル）オキシム（■）とする工程− ハ）化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−１フーアセテ
   ート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
   テル−６−（０−カルボキシメチル）オキシム（■）を
   牛血清アルブミン（以下ＢＳＡと略称す）と反応させ６
   −オキソエストラジオール−１フーアセテート−３−グ
   ルクロナイド−トリアセテートメチルエステル−６−（
   ０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ結合体（Ｖ）
   とする工程に ）化学構造式 で示される６−オキソエストラジオール−１フーアセテ
   ート−３−グルクロナイド−トリアセテートメチルエス
   テル−６−（０−カルボキシメチル）オキシム−ＢＳＡ
   結合体（Ｖ）を部分的に加水分解することをＮＯＣ鴇Ｃ
   ０ＮＨ−ＢＳＡ で示される６−オキソエストラジオール−３−グル、ク
   ロナイド−６−（〇−カルボキシメチル）オキシム−Ｂ
   ＳＡ結合体（Ｉ）の製造法。 （３）化学構造式 ％式％ で示される６−オキソエストラジオール−３−グルクロ
   ナイド−６−（０−力ルボキシメチル）オキシム−ＢＳ
   Ａ結合体（Ｉ）から成るエストラジオール−３−グルク
   ロナイドの免疫学的測定に使用する抗体作製用抗原。