JPS5886099A - ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフオスフエイトを補酵素とする各種脱水素酵素の基質量の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（以下
ＭＡＤと略記する）蓋たはニコチンアミドアデニンジヌ
クレオチドフォスフエイト（以下ＮＡＤＰと略記する）
を補酵素とする各種脱水素酵素と、還元型ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドｃ以下ＮＡＤＨ，と略記する
）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド
フォスフエイト（以下夏ムＤＰＨ，と略記する）を酸化
する酸化酵素（以下ＭＡＤ（Ｐ）Ｈｍ酸化酵素と略記す
る）を用いて、ｎＡｎｊたは１ｆＡＤＰの共存下で各種
脱水素酵素の基質量を測定する方法に関する。更に詳細
に述べれば、基質と各種脱水素酵素による反応の結果生
じた夏ＡＤＨ，またはＨＡＤ（Ｐ）Ｈｍを微生物由来の
ｗＡｎ（７）Ｈｉ酸化階素で酸化させ、その際の酸素消
費量を酵素電極で測定することにより、脱水素酵素の基
質量を測定する方法に関する。

食品、または血液中の乳酸、アルコール、リンゴ酸、コ
ハク醗、グルコースおよびグルタミン酬等の定量方法と
しては、試料液に脱水素酵素を作用させ、補酵素である
ＭＡＤまたはＮＡＤＰの還元型への変換量を、還元型補
酵素の３４０ｍｍにおける特異吸′収を利用して分光学
的に測定する方法が通常実施されている。し〜かしなか
も、このような分光学的方法では必然的に試料の着色お
よびＦＬ４！淘度が分析に影響をおよぼすところから、
脱色、遠心分離等の前処理が必要である。

前処理を必要としない電気化学的測定方法についても種
々検討がなされており、その一つどじてはＮＡＤ　系に
フラビンモノヌクレオチド（７ＭＮ）系を共役させて、
その際に生じる増化還元電位を利用した電池システムを
作製することで、ｌテンジオメトリツクに測定する方法
が知られているがこの方法は煩残で特異性がない（化学
工学第４０巻第３号１９７６年参照）。

本発明者らはかかる問題点を克服するために最近の分析
手法と、して使用されている酸素電極を組合せながら新
規分析法を検討してきた。その結果以下の発明を完成す
るに至った。

本発明の要点は次の如くである。

基質の脱水素酵素による脱水素反応は一般にアルカリ性
ｐＨで反応が進行し、ｐＨ７付近の中性領域では殆ど反
応が進行しない。他方、ＭＡＤ（Ｐ）Ｈａ酸化酵素は重
性ｐＨで活性が高＜、ｐＨ７以上ではｐＨ素活性はすみ
やかに失活する。・それ故これまでに、脱水素反応とｎ
１ｐ（ｐ）ａＪ化酵素を同一反応液中で進行させた報告
は見られない。

しかしながら、本発明者らは以下の新事実を見出して本
発明を完成したものである。

本発明はＮ＊：ｏ（ｐ）ＨＪＩ化酵素の安定ｐＨ領域の
限界に近いｐＨ７付近で、脱水素酵素とＮＡＤｃｐ）Ｈ
ｊｅ化酵倉を共存させた場合、基質と脱）素酵素の反応
で生成するＭＡＤ（Ｐ）Ｈ，がＨＡＤ（Ｐ）Ｈ，酸化酵
素ですみやかにＮＡＤに変換されるため、基質の脱水素
反応の速度が加速される。脱水素酵素壜独では殆ど反応
が進まない中性’ｐＨにおいても反応液中にＮＡＤ（Ｐ
）Ｈｍ酸化酵素が共存している場合には、すみやかに基
質の脱水素反応が進行するという現象を見出−したこと
によるものである。この結果ＨＡＤ（Ｐ）ＨｓＭ化酵素
の反応で消費された溶存酸素の減少を酸素電極等で測定
することにより脱水素酵素の基質醸の測定が可能となり
本発明を完成するに至った。

本発明に使用するＭＡＤ（Ｐ）Ｈｓｌｌ化酵素とはＮＡ
ＤＨｍまたはＮＡＤＰＨ意に酸素を供与してＮＡＤまた
はＮＡＤＰを生成する酵素であり、二種類の酵素が自然
界より見出されている。

その一つは、ＮＡＤＨ，またはＮＡＤＰＨ，に１分子の
酸素を与えそ、その結果ＭＡＤまたはＭＡＤνと過酸化
水素を生成する酵素である。この−素はエム・アイ・ド
ーリン〔アーカイ拳バイオケミカル・パイオフイージツ
クス第４６巻＠４８３頁（１９５３年）〕によりストレ
プトコッカス・ファエカリス（８ｔｒ＠ｐｔｏｃｏｃｏ
ｕｓ　ｆａ＠ｏａｌｉｇ）菌体中にその存在が知られて
いる。

他の一つは、ＮＡＤＨ，またはＮＡＤＰＨｄこ半分子の
酸素を与・え、その結果ＮＡＤまたはＮＡＤＰと水を生
成する酵素である。この酵素は福井によりラクトバチル
ス・プランタルム（Ｌａｏｔｏｂａｏｉｌｌｕｓｐｌａ
ｎｔａｒｕｍ　）　Ａ　１１菌体中に見出されている〔
福井、酵素化学シンポジウム、第１７集第１４５頁（１
９６２））。

本発明方法においては、反応液中のＮＡＤＨｍまたはＮ
ＡＤＰＨ重量に比例した酸素吸収が見られれば良いので
あるから、上記二種の酵素のいずれをも使用することが
できる。

詳細は実施例で述べるが、例えばエタノールを含む試料
にアルコール脱水素酵素（ｍｏｌ、１，１，１．　）を
ＮＡＤ共存下で作用させると次式の反応が進行する。

ＯＨＨｓ　ＯＨ＋　ＭＡＤ”−→ＯＨｓ　ＯＨＯ＋　Ｍ
ＡＤ）！　＋　１１’Ｖ　本酵素反応系に、’　ＩＩＡ
Ｄ（Ｐ）Ｈｚ酸化酵素を添加し、さらに酸素電極を組合
せるならば、次のようなエタノールの定置系が成立する
。すなわち生成するＮＡ　ＤＨｓはＮｊＬＤ（Ｐ）Ｈａ
酸化酵素によって酸化され、同時に酸素が定量的に消費
される。さらに、その消費酸は酸素電極によって定量的
に測定される。

俗存酸素の定量は、ｌテンジオメトリツクに測定するガ
ルバノ型電極およびアンペロメトリックに１（和定する
クラーク型電極のいずれをも用いてもよいが、応答の早
い点でクラーク型電極が優っている〇 本発明の骨子は以上の例示によって大略明らかであるが
、さらに詳細な実施例を掲げるに先だって分析に必要な
諸事項に関して本発明者等が採用したものの内の一例に
ついて記述する。

クラーク型電極は常法（アール・ダブリュー命ニスタブ
リック著「メソッド・インーエンザイモロジー」ニス・
ビー・コロヴイツク；エヌ拳オー・カブラン編集、アカ
デミツクプレス出版第１０巻、第４１頁１９６７年）に
従った０すなわち、ポリエチレン管中に白金電極と銀電
極を内蔵し、管中に空気が入らないように注意しながら
先端をポリエチレン膜で覆った。さらに両電極間をＩＭ
のＫＯＩ溶液でイオン架橋した。

本酸素電極を１０−容の反応槽中に挿入し、電極印加電
属を０．６ボルトとして、反応槽中の溶存酸素濃度を電
流値として測定した。なお、反応槽は外部からの空気の
侵入を防ぐため密閉型のものを用いた。

本発明に用いたＮＡＤ（Ｐ）ＨＩＭ化酵素はラクトバチ
ルス・ブランタルムＡ１１を培養し、福井の方法により
精製した。すなわち、ラクトバチルス拳グランタルムム
１１を乳酸菌用培地２ｔで３０’Ｃ，２４時間培養し、
集菌、洗浄したのち０．０２Ｍリン酸バッファー５０ｄ
に懸濁し１０ｒｏ、２０分間の紹音波処理を行なう。得
られる菌体破砕液を１５０００ＸＰ、６０分間遠心分離
して上ｄ液をＤＩＡＩ−セファデックスカラムクロマト
グラフィーを行なって得られるものを酵素液とした。

ＮＡＤ（Ｐ）Ｈｘ酸化酵素の活性測定は０．１ＭのＫＨ
ｓＰＯ。

０、２　ｄ　％　　ＮＡＤＩ（、溶液０．１　ｗｓｔ　
（０，１５ｐｒｎｏ１ｍ含有）、蒸留水３．０　ｍに酵
素液０゜１−を添加して２５℃で反応を行なった。３３
０ｍｍの吸光度の減少を分光光度計で測定し、３０秒間
で０．０１減少する場合を１＃素単位（ロ）とした。

アルコール脱水素酵素および乳酸脱水素酵素活性は、基
質に作用して、１分間に１μｍｏｌ・を酸化する酵素量
を１単位、（Ｕ）とした。

次に実施例−こより本発明を更番こ詳細に説明するＯ 実験例　１ 本発明方法を利用してエタノールの検量線を作成した。

オリエンタル酵母社製アルコール脱水素酵素をＱ、１Ｍ
トリスバッファ（ｐＨ７，０）に溶かし、濃度を５０Ｕ
／＋ｄとしたものを０．１　ｓｗＺ。

ＮＡＤの１００−ｖ／−溶液を０．１ｍ、福井の方法（
酵素化学シンポジウム第１７集、第１４５頁、１９６２
年）により、ラクトバチルス・プランタルム屋１１より
調製したａ＊ｐ（ｐ）Ｈｔｉｌｌ化酵素０．５−（１５
単位）、０．　ＯＩ　Ｍリン酸バッファー９．２−をク
ラーク型酸素電極を組込んだ密閉型反応槽（容ｔｌｏｓ
ｔＺ）に入れる。次いでそれぞれ０、０６　ｍｍｏｌｅ
、　０．２８　！Ｑｌ！１０１＠または０．５７　ｍ　
Ｗｌｌｏｉｓを含むエタノール溶液０．１−を添加して
、反応液中の酸素消費量を酸素電極で測定した。上記反
応は３０℃で行なった。得られた最終到達電流１（ｎＡ
）をプロットしたのか第１図である。

第１図より明らかな如く、エタノール量と最終到達電流
量との間には直線関係が成立した。

この結果、本発明方法を利用してエタノールの定量が可
能である。

実験例　２ 本発明方法を利用して乳酸の検量線を作成した。オリエ
ンタル酵母社製乳酸脱水素酵素を０．１Ｍトリスバッフ
ァー（ｐＨ７，０）に溶かし、濃度を４０Ｕ／−とした
ものを０．１　ｗｌ　１ＨＡＤの１００キ／−溶液を０
．１−１ＮムＤ（Ｐ）Ｈ茸醗化酵素０．５　ｄ　（１５
単位）、０．０１Ｍリン酸バッファー９．２−をクラー
ク型酸素電極を組込んだ密閉型反応槽（容量１０ｄ）に
入れる。次いで、それぞれ０、０１５　ｍｍｏｌ・、０
．０２１９　ｍｍｏｌｅ、　０．１１８ｍｍｏｌｅ、　
０．２３５１１１１１１０１６および０．４７０　ｍｍ
ｏｌｅを含む乳Ｐ溶液０．１−を添加して、反応液中の
酸素消費量を酸素電極で測定した。反応は３０℃で行な
った。得られた最終到達電流量（ｎＡ“）をプロットし
たのが第２図である。

第２図より明らかな如く、乳＠量と最終到達電流量との
間には直線関係が成立した。この結果、本発明方法を利
用して、乳酸の定置が可能である。

実施例　１ をクラーク型酸素電極を組込んだ密閉型反応槽（容量１
０ｄ）に入れる。次いで、コーンスチーブリ力−１００
μを添加して、反応液の溶存酸素減少量を測定した。反
応は３０℃で行なった。

最終到達電流域は７８７！ｌムであった。第２図の検量
線を用いて算出した乳ｌ！８度は１１．５ｖ／ｖ％であ
った。

フリートマン、コトニ、シャーファーの方法の改良法（
＊芸化学実験書、第３巻、第１３２５頁、産業図書に記
載；乳酸をＭｎ０ｍで酸化して生ずるアセトアルデハイ
ドを醸性亜硫酸ソーダで捕捉し、過剰の酸性亜硫酸ソー
ダをヨードで消去してから、重曹でアルカリ性となし、
アセトアルデハイドと酸性唾硫酸ソーダの結合を解き、
生ずる酸性亜硫酸ソーダをヨード液で滴定し、乳＃社を
求める）によって得た測定値は１１．３％であり、本発
明方法による測定値と良く一致した。

【図面の簡単な説明】

第１′＃Ａは本発明方法を利用したエタノール基質酸の
検量線を示すグラフであり、第２図は乳酸基質量の検量
線を示すグラフである。 特許出願人　冑？ｆＩＩＩＭ株式金社 −１ Ｑｌ　　　　　　０２　　　　　０．３　　　　０．４
　　　　０．５　　　　０．６１タノール〕然加量　（
ｍｍｏｌｅ） （自発）手続補正書 昭和５７匹−月２５日 特許庁長官島　１）春樹殿 事件との関係　　特許出願人 ′Ｐ％ｋｋｊ覧 に〜名称　　責酒造株式会社 ４、代理人 ６補正の内容 （１）明細書第３頁第１０行「焼残」を「煩雑」と訂正
する。 （２）同第４頁第１Ｏ行「ＮＡＤ」を「ＭＡＤ（Ｐ）　
Ｊと訂正する。 （３）同第５頁第１行「ＮＡＤＰＨ，Ｊをｒ　ＮＡＤＣ
Ｐ）Ｉｓ　Ｊと訂正する。 （４）同第８良第１８行「次に」の次に「実験例および
」を挿入する。 （５）同第９頁第６行「第１４５頁」をｒ１４５ＮＪと
訂正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、　ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＭＡＤ
   　）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォ
   スフエイト（ＮＡＤＰ　）を補酵素とする各種脱水素酵
   素と、還元型ニコチンアミドアゾニジジヌクレオチドま
   たは還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォ
   スフエイトを酸化する酸化酵素を用いて、１ｉＡＤまた
   は１ムＤＰの共存下で反応をさせることにより各種脱水
   素酵素の基質量を測定する方法。