JPS58869B2 - 微生物菌体破壊物の製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、−１００℃以下の温度で凍結された微生物菌
体（以下微生物菌体を単に菌体と記載する）の５〜２０
％（重量。

以下同じ）濃度の懸濁液を、−４０℃以下の温度で凍結
状態のまま微粉砕し、菌体を破壊し、製造することを特
徴とする菌体破壊物の効率的かつ工業的製造法に関する
。

本発明の目的は、工業的規模による効率的かつ連続的な
菌体破壊物の製造法を提供することにある。

本発明の他の目的は、菌体内蛋白質、酵素等を分離し、
医薬品として使用するための菌体破壊物を提供すること
にある。

更に、本発明の他の目的は、食料または飼料として利用
し得る菌体破壊物を提供することにある。

従来、菌体を破壊して細胞壁、細胞内顆粒、菌体内酵素
などを抽出することは古くから行なわれており、微生物
学、酵素学、生化学、医学、薬学、栄養学などの広い分
野の研究に実験室的に利用されている。

菌体破壊物の工業的生産は、従来主として酵素生産のた
めに行なわれている。

たとえば、グルコースオキシダーゼ、ユリカーゼ、グル
コースイソメラーゼなどで、菌体の破壊は自己消化によ
る方法、凍結融解の反復による氷結晶で細胞壁に損傷を
与える方法、超音波処理、フレンチプレス、乳鉢、ホモ
ジナイザー等を用いる方法に塩類溶液、緩衝液、表面活
性剤などの抽出剤を同時に作用させて抽出している。

これらの破壊処理は、酵素の抽出が細胞膜の透過性を喪
失させ、細胞内成分の漏出を初期目標としているので極
めて軽度な段階に留っている。

酵母菌体の自己消化物は、古くから調味料として市販さ
れているが、酵母菌体そのものは、食用、薬用、飼料用
として生産されている。

これらは破壊菌体になれば栄養価、消化率などについて
向上が認められるが、細胞壁が強固で十分破壊されない
ため、自己消化以外の方法では生産されていない。

菌体を凍結して破壊する工業的方法は、従来知られてい
ないが、実験室的規模では−２５〜−３５℃の温度で菌
体を凍結し、凍結物を加圧して菌体を破壊するＨｕｇｈ
ｅｓ ｐｒｅｓｓ、ｘ−ｐｒｅｓｓ及びこれらに構造、
原理の類似する装置が市販されている。

これらの装置は、５〜２５ｍ１の試料液を耐圧性円筒容
器に入れ、容器ごと−２５〜−３５℃に冷却し、試料を
凍結させた後、ピストンを円筒ホールに差し込み、落下
衝撃装置またはフライプレスにセットして鋭く加圧する
ことにより、試料を凍結状態で円筒本体に設けられた細
孔あるいは円筒接合面の細溝より圧出（通過）させて、
これにより菌体を破砕させる。

これらの装置による菌体破砕作用の機序に関して、Ｈｕ
ｇｈｅｓは破砕効果の大部分が、高圧下で引き起こされ
る凍結試料の圧縮及び再凍結の過程での、氷結晶の耐摩
作用によるものと推察している（Ｈｕｇｈｅｓ、Ｄ、Ｅ
、：“Ｔｈｅ Ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｓ”、Ｍｅｔｈｏｄ ｉ
ｎ ｍｉｃｒｏｂｉ−０１０ｇｙ、ｖｏｌ、 ５Ｂ、１
〜５４ページ、１９７１年、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ発行）。

また、ＥｄｅｂｏによるＸ−ｐｒｅｓｓに関する研究に
よれば、破砕作用として主に関与するものは、氷結晶の
形態が高圧下で変化することによって引き起こされると
している（Ｅｄｅｂｏ、Ｌ、：Ａｃｔａ Ｐｈａｔｈｏ
ｌｏｇｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏ−１ｏｇｉｃａ ５ｃａｎ
ｄｉｎａｖｉｃａ、５２巻、３００ページ、１９６１年
）。

このように従来の凍結した菌体の破壊方法は、高い温度
（−２５〜−３５℃）で凍結した菌体を加圧して破壊す
る極めて小規模なものであった。

最近、酵母等の菌体を液化冷媒ガスと接触させて凍結し
、ついで該凍結菌体を冷媒ガス雰囲気中で極低温下に粉
砕する方法が公開された（特開昭５３−２９９８３号）
。

この方法は、菌体内に存在する水分を凍結させて菌体を
破壊しようとするものであるが、後述するように本発明
者らの試験によれば菌体内水分の凍結のみでは菌体の破
壊率の低いことが判明した。

一方、凍結粉砕の技術は、すでに５０年以上も前に、そ
の方法の原理が研究され、１９６２年Ｈ０Ｂ、Ｗｉｓｔ
ｒｅｉｃｈらが香辛料について実施したのが食品への応
用の最初である。

その後広く食品工業において利用され（食品工業技術情
報、第１１巻、第５号、１〜１５ページ、１９７９年）
、各種食品あるいは食品原料の粉砕に利用されている。

この方法の利点は第一に常温で粉砕の困難な物質を容易
に粉砕できるので、ゴムタイヤ、アルミまたはプラスチ
ック容器等が処理されること、第二は常温下での粉砕に
おいて生じる発熱が防止されるため、熱変性されやすい
物質を粉砕できること、及び第三に冷媒として使用した
液体窒素が粉末の空げきを満たすため酸化が防止される
ばかりでなく、粉塵爆発の怖れも少なくなることである
。

凍結粉砕の唯一の欠点は、常温での粉砕よりコスト高に
なることであるが、この欠点は、付加価値の高い製品へ
の利用と前記の利点とによって相殺される場合もあると
いわれている。

そして、すでに食品については、常温で粉砕しにくいビ
ーナツツ、アーモンドのような豆類、せんい性食品、す
じ肉等が、また常温では温度上昇によって香気または成
分の変化が生じる各種スパイス類、香料、果汁等が、そ
して酸化されやすい成分を含む緑茶、紅茶、コーヒー、
海藻等が処理されている。

更に硬さ、水分含量が大きく異る部分からなっているた
め、常温では粉砕の困難な骨つき魚肉、えびまたはおき
あみ等、コストを吸収できる付加価値の高い製品である
漢方薬、生薬原料、胚芽、クロレラ等も処理されている
。

更に、従来廃棄されていたり商品価値のなくなったもの
の再利用として、牛、豚、魚等の骨、大豆、もみがら、
いか屑等が凍結粉砕によって新しい用途が見出されてい
る。

凍結粉砕装置としては、種々のものが市販されているが
、いずれも原料ホッパー、冷却装置、粉砕装置、冷却原
料の粉砕装置への供給装置、分級装置等から構成されて
いる。

まず、原料はホッパーに投入され、予めホッパーに供給
されている液体窒素中で凍結される。

次いでスクリュ一式供給機で粉砕機（ミル）に送られ、
所定の温度のもとて粉砕分級されたのち気化した窒素ガ
スで移送され、サイクロンで捕集されて、外部にとり出
される。

粉砕には、ハンマーミル、ボールミル、ピンミルのよう
な衝撃式ミルが多く用いられ、試料によってはジェット
ミル、摩砕機なども使用されている。

代表的な装置としてはリンレックスミル（商標。

細用鉄工所製）、クライオミル（商標。日本酸素及びタ
ーボ工業製）、コンプレックスミル（商標。

槙野産業及びアルピネ製）、アトマイザ一式ミル（不ニ
パウダル及び東洋酸素製）等がある。

以上のように、凍結粉砕装置は種々のものが市販され、
また被粉砕物質として食用に供する可視的な大きさのあ
らゆるものが処理されている。

本発明者らは、菌体破壊物の工業的規模による効率的か
つ連続的製造方法について研究を行ない、菌体を５〜２
０％の濃度で水又は生理食塩水等に懸濁した液を凍結し
、これを凍結状態で微粉砕することによって従来公知の
方法よりもすぐれた菌体破壊効果をもたらすという予想
し得ない事実を発見し、本発明を完成した。

本発明の方法は、５〜２０％の濃度の菌体の懸濁液を、
液体窒素、液体ヘリウム等の超低温液化ガスにより一１
００℃以下の温度に凍結し、凍結物を凍結状態で一４０
℃以下の温度で微粉砕し、細胞を破壊し、製造すること
を特徴とする微生物菌体破壊物の製造法である。

次に本発明の方法について詳述する。

本発明の方法において使用する菌体は、例えば乳酸菌、
ビフィズス菌、酵母、かび、放線菌等の有用な微生物で
あり、医薬品、食品または飼料工業の分野で広く用いら
れている公知のものである。

これらの菌体は、それぞれの菌体に適当した培養条件で
常法により培養される。

そして増殖した菌体を含有する培養液そのものまたは該
培養液から常法により菌体を分離し、５〜２０％の濃度
で水、生理食塩水等に懸濁した菌体の懸濁液、あるいは
公知の方法、例えば凍結乾燥法、噴霧乾燥法により乾燥
した菌体の粉末を５〜２０％の濃度で水、生理食塩水等
に懸濁した懸濁液を使用する。

懸濁液に含有される菌体は生菌体であっても死菌体であ
ってもよい。

また懸濁液中の菌体を予め公知の方法、例えばリゾチー
ム処理等、で処理し、菌体が破壊されやすい状態として
もよい。

いずれの種類の懸濁液を用いるかは、破壊された菌体の
利用目的によって適宜決定される。

例えば菌体内酵素を分離する場合には、培養液中の成分
が混入しないよう、培養液から菌体を分離し、集菌した
菌体を洗浄し、水に懸濁して用いる。

培養液から分離した菌体あるいは乾燥した菌体を使用す
る場合、菌体を５〜２０％、望ましくは５〜１０％の割
合で水、生理食塩水等に懸濁して用いる。

懸濁液を予備凍結して１ｃｍ３程度の大きさに荒砕きす
るかまたは超低温液化ガスを満たしたホッパーに直接懸
濁液を投入して懸濁液を凍結する。

超低温液化ガスとして、液体窒素、液体へりラム、液体
アルゴン、液体酸素または液体空気が用いられるが、費
用が安いこと及び酸化を防止することから液体窒素が特
に望ましい。

懸濁液は一１００℃以下の温度で凍結される。

−１００℃以下の温度で凍結することにより、懸濁液中
の菌体の脆弱化を促進すること、凍結した懸濁液の粉砕
時の昇温を少なくすること及び凍結した懸濁液のミルへ
の移動性を良好にする。

微粉砕は市販の装置、例えばリンレックスミル（商品名
。

細用鉄工所製。ＸＬ−０型）により行なわれる。

装置を超低温液化ガスにより予め一４０℃以下に冷却し
、凍結した懸濁液を供給し、微粉砕する。

粉砕する部分（ミル）は温度が上昇するので、供給する
超低温液化ガスの量を調整して、昇温を防止する必要が
ある。

ミルの温度が一４０℃を超えて上昇すれば、ミルに菌体
破壊物が付着すること及び菌体破壊物の装置内の移動が
妨げられることから望ましくない。

粉砕時の装置内の温度は、破壊する菌体の種類、出発物
質の菌体濃度、菌体の破壊程度、菌体破壊物の使用目的
によって異なるが、−４０〜−１２０℃が破壊効率等の
点から望ましい。

雪状に微粉砕された菌体破壊物は氷結晶とともに、装置
内で気化した超低温液化ガスの圧力で装置内を移動し、
分級器を経て受器に取り出される。

このようにして取り出された菌体破壊物を、必要に応じ
て再度破壊処理に付してもよい。

このようにして取り出された菌体破壊物を、直ちに凍結
乾燥して粉末にすることもできる。

またこの菌体破壊物を酵素、ビタミン等の有用物質の製
造に利用することもできる。

更にこの菌体破壊物を食品または飼料製造のための１成
分としてそのまま利用することもできる。

次に試験例を示して更に本発明の方法を詳述する。

試験１ パン酵母菌体の破壊 （１）試料 １）本発明の方法による試料：実施例１と同一の方法に
より製造した。

２）公知の方法による試料：実施例１と同一の方法によ
り調製したパン酵母菌体の懸濁液１００ｇを実験用超音
波発生装置（久保田製作所製。

２００Ｍ型）により、９ＫＨｚ、２００Ｗの出力で１５
℃の温度に保持して６０分間処理し、菌体を破壊した。

（２）試験方法 前記２種類の試料を顕微鏡で観察し、１視野中の全菌体
数に対する破壊された菌体数の百分率を算出し、２０視
野の平均値で菌体の破壊率を測定した。

前記２種類の試料の一部を２８，０ＯＯＧで４０分間遠
心分離し、上澄液を集め、上澄液１０ｍ１中の可溶性固
形分含量及び可溶性蛋白質含量を次の方法で測定した。

そして遠心分離前の試料１０ｍ１中の全固形分含量、及
び蛋白質含量に対する遠心分離上澄液１０ｍ１中の可溶
性固形分含量及び可溶性蛋白質含量の百分率を算出し、
それぞれの成分の上澄液への移行率を測定した。

遠心分離前の試料の全固形分含量及び上澄液の可溶性固
形分含量はそれぞれ１００℃±０．５℃における乾燥法
により、遠心分離前の試料の蛋白質含量及び上澄液の可
溶性蛋白質含量は、それぞれケールゾール法により測定
した。

（３）結果 試験結果は表１に示すとおりである。

表１から明らかなように、両試料の検鏡による菌体の破
壊率は同一であるにもかかわらず、上澄液への可溶性固
形分及び可溶性蛋白質の移行率は本発明の方法による試
料が従来法によるそれのそれぞれ約１．３３倍及び約１
．６８倍と高い値を示した。

この結果は、本発明の方法による菌体の破壊が従来法に
よるそれよりもより完全に行なわれていることを立証し
ている。

即ち、本発明の方法によれば、試料は液体窒素素により
超低温で凍結されるため、容易に菌体内凍結を引き起こ
し、菌体が脆弱化すると共に、凍結状態で共存する菌体
外の氷結晶が耐摩剤としての役割を演じることにより、
菌体のわずかな圧迫、衝撃により極めて容易に菌体が破
砕される。

試験２ 乳酸菌菌体破壊物からの酵素の抽出 （１）試料 ■）本発明の方法による試料：実施例２と同一の方法に
より製造した。

２）従来法による試料：実施例２と同一の方法により調
製したり、ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ菌体の懸濁液１５０ｇ
を５ｏｒｖａｌ−Ｒｉｂｉ ｒｅｆｒｉｇｅｒａ−ｔｅ
ｄ ｃｅｌｌ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｏｒ（Ｉｖａｎ
５ｏｒｖａ１ 社製０ＲＦ−１型）により２０，０００
ｐｓｉの圧力で８〜１．５℃の温度に保持して菌体を破
壊した。

（２）試験方法 前記２種類の試料を２８，０００ｇで４０分間遠心分離
し、上澄液を集め、上澄液中の β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ （菌体内酵素の１種
）量をＤａｈｌｇｖｉｓｔの方法（Ａｎａｌｙｔｉｃａ
ｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、７巻、１８〜２５ペー
ジ、１９６４年）により測定した。

そして３０℃において１分間に乳糖１マイクロモルを加
水分解するのに要する酵素量を１単位として表示した。

（３）結果 試験結果は表２に示すとおりである。

表２から明らかなように本発明の方法により製造された
菌体破壊物は、従来量も破壊効率が良好であるといわれ
ている前記の方法のそれとほぼ同等のβ−ｇａｌａｃｔ
ｏｓｉｄａｓｅ量を有し、菌体がより効果的に破壊され
て菌体内酵素が菌体外に取り出されている。

試験３ 各種菌体濃度における菌体の破壊 （１）試料 市販の新鮮なパン酵母（水分含量的３３％）、このパン
酵母を精製水に懸濁して菌体濃度を３゜５．２０，３０
、及び５０％に調整した６種の試料を各１５Ｋｇ調製し
た。

各試料を実施例１と同様の方法で処理し、菌体を破壊し
た。

（２）試験方法 菌体破壊処理した各試料について前記試験１と同様の方
法により菌体破壊率、可溶性固形分移行率及び可溶性蛋
白質移行率を測定し、菌体破壊の状態を試験した。

（３）結果 結果は表３に示すとおりである。

表３から明らかなように、懸濁液の菌体濃度が５〜２０
％、特に５％及び１０％、の範囲において可溶性固形分
移行率、可溶性蛋白質移行率及び破壊率が高く、菌体が
破壊されていることが認められる。

そして最も菌体が破壊されている５％の菌体濃度の測定
値と対照のそれとを比較すれば、前者は可溶性固形分移
行率において２．４５倍、可溶性蛋白質移行率において
２．８３倍、破壊率において３．１７倍である。

この試験結果から本発明において懸濁液の菌体濃度を５
〜２０％、望ましくは５〜１０％に調整することが必要
であることが判明した。

本発明の方法による効果は次のとおりである。

（１）菌体を効率よく容易に破壊することができる。

（２）粉砕時の発熱を超低温液化ガスの気化潜熱により
防止することができるので、変性する菌体構成物質、例
えば酵素等の生理活性物質を安定に回収することができ
る。

（３）超低温液化ガスとして液体窒素、液体ヘリウムを
用いるこにより、気化した気体が破壊菌体を覆い、処理
菌体の酸化を防止する。

（４）大量の菌体を連続的に破壊することが可能である
。

（５）従来、技術的にも経費的にも実現が極めて困難と
考えられていた飼料効率の高い酵母飼料の生産あるいは
微生物菌体内酵素の効果的な抽出が安価なランニングコ
ストで可能となる。

実施例１ 市販の新鮮なパン酵母（水分含量約３３％）１０ｋｇに
精製水２０ｋｇを加え、約１０％の酵母菌体を含有する
懸濁液３０ｋｇを調製した。

この懸濁液２０ｋｇをリンレックスミル（商標。

細用鉄工所製。

ＸＬ−ｏ型）により、次のようにして処理した。

液体窒素により装置内を予め一１００℃に冷却した。

次に液体窒素を満たしたホッパーに懸濁液を滴下し、粒
径約５〜１０ｍｍのペレット状に凍結した。

この凍結物を１分間に０．５ゆの割合で連続的に装置に
供給し、菌体を微粉砕した。

装置にはハンマーミルが装着され、ローターの周速は毎
秒１０９ｍであった。

約４０分間連続的に装置を運転し、雪状の凍結微粉状の
パン酵母菌体破壊物的１９．５ｋｙを得た。

得られた菌体破壊物を試験１と同様の方法で検鏡した結
果、菌体の約９０％が破壊されていた。

実施例２ 乳酸菌り、ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ８０１８）
を、酵母エキス、ペプトン、乳糖、塩類よりなる培地６
００１に接種し、３７℃で１８時間培養し、遠心分離し
て菌体を集め、精製水で菌体を洗浄し、のち生理食塩水
を加えて約１２％の菌体懸濁成約１０ｋｇを得た。

この懸濁液８ｋｇを一４０℃下の冷凍庫で凍結し、凍結
物を約１ＣＭ３の大きさに荒砕きし、１分間０．３ｋｇ
の割合で実施例１と同一の装置に供給し、以下実施例１
と同様の方法で菌体を破壊し、雪状の凍結微粉状の乳酸
菌菌体破壊物的７．８ｋｇを得た。

実施例３ ビフィドバクテリウム・ブレーベ（ＡＴＣＣ１５７００
）を、いずれも市販されている酵母エキス、カシトン、
肉エキス、システィン及び塩類からなる滅菌した液体培
地６００１に接種し、炭酸ガスを０．１ｖｖｍの割合で
通気しながら３７℃で１６時間培養した。

のち遠心分離して菌体を集め、精製水で洗浄し、精製水
を加えて菌体濃度約９％の懸濁成約１２ｋｇを得た。

この懸濁液１０ｋｇを直ちに一４０℃の冷凍庫内で凍結
し、凍結物を約ｌＣｍ２の大きさに荒砕きし、１分間０
．３ｋｇの割合で実施例１と同一の装置に供給し、以下
実施例１と同様の方法で菌体を破壊し、雪状の凍結微粉
状のビフィズス菌菌体破壊物的９．５ｋｇを得た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 微生物菌体に水又は生理食塩水を加えて該菌体濃度
   を５〜２０係（重量）に調整した懸濁液を、超低温液化
   ガスにより一１００℃以下の温度で凍結し、凍結物を一
   ４０℃以下の温度において凍結状態で微粉砕し、微生物
   菌体を破壊し、製造することを特徴とする微生物菌体破
   壊物の製造法。 ２ 超低温液化ガスが、液体窒素、液体ヘリウム、液体
   アルゴン、液体酸素または液体空気である特許請求の範
   囲第１項記載の微生物菌体破壊物の製造法。