JPS58997A - ビタミンｂ↓１↓２の検定法およびその検定用のラベル付き誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はビタミンＢ１１の検定法ならびにこの検定にお
いて有用であるビタミンＢ□の特定のラベル付誘導体に
関する。

ビタミンＢ、Ｃ以後簡略のため単にＢ、と呼ぶ）の古典
的な検定法は例えば茎、［鰭旦林を使う微生物学的検定
法である。この検定法は精確で信頼できるものとして広
く受は入れられているけれども、それは人手による技術
を含む比較的ゆつ〈ｐとした方法である＠近年になって
、もつと迅速なそして同様に信頼できる検定法を与える
という考えで、周知の競合的結合反応技術に基いた別の
方法を工夫するための試みがなされた。

競合的結合に基く検定法はラベル付き反応体すなわち容
易に同定でき、そして検定できる原子または基をもって
いる反広体を有利に使用する。普通に使われるラベルに
は放射性原子、螢光性の基および酵素性の基が含まれて
いる。Ｂ１．の競合的結合検定において放射性のラベル
付きＢ、誘導体を役立てるようにする様々の提案があっ
た。商業的に使われている１つの提案はＢ、、の化合故
において１℃Ｏを組み入れることを含む。これは複雑な
方法であり、そして生産される’Ｃｏ−Ｂ、、は高価で
ある。さらにまた生底物の比放射能は比較的に低く　（
２２０μＣ１／μｇ）、従ってこの”Ｃ０−Ｂ、、を使
う競合的結合検定は比較的長い計数時間（少くと４１分
間）を必要とする。低い活性と長時間の計数は非常に望
ましくない。

もう１つ別の方法はｌｌ５Ｉ−Ｂ、！誘導体を作ること
であった。米国特許、？　４，２０９，６１４号明細書
には、Ｂ□をグルタル酸無水物置導体（これはＢ１２の
糖の環を介して”ｔｔに結合する）と反応させ、そして
次にグルタル鐵無水物から誘導された置換基なよう素化
することによって前記の誘導体を作ることが記載されて
いる。

さらにまた″”Ｉ−Ｂ、、ＩＩ誘導体作る別の方法が米
国特許オ３，９８１，８６３号明細書に記載されている
◎この方法では、Ｂｌｆを先ず温和な加水分解にかけ、
主として（６１−異性体を含むモノカルボン酸の混合物
を生放する（ビタミンＢ１ｆｆ１の構造は才１図に示さ
れている。この混合物を次いでｐ−（アミノアルキル）
フェノールと反応させ、（遊離のカルボン酸基のｌりと
の反応を介して）　Ｂ、、酸中へ７エノール基を導入す
る。この混合した置換Ｂ１．誘導体を次にフェノール置
換基においてよう素化する。

この米ｗＡ４１１許は、そのようにして作った場合１１
ｓＩ−Ｂ、誘導体はこの混合物に対する抗体を使っての
Ｂｌｌのラジオインエノアツセイにおいて有用であるこ
とを教示している。

Ｂ□の競合的結合検定法においては、使用する結合性タ
ンパク質の性質が臨界的意義をもつほど重要性であるこ
とが最近明らか（：なった〔例えば、ＰＣＴ出願ＵＳ　
７９／１）０２１Ｇ　（国際会橢Ｗｏ　７９１００８８
０を参照されたい）６％（−１その使用が健筆から提案
されていた結合性タンパク質の中にはＢ、ｔに結合する
だけでなくコパラずン類似体にも結合するもののあるこ
とが発見された。例えばトランスフ２２２フ厘シよびＲ
タンパク質はＢ７．だけでなく人間の血清中Ｃ：存在す
るコパラ建ン類似体にも結合することが示された・この
特異性の欠除は検定結果に誤差をもたらす。使用すべき
最良の結合性タンパク質は内因子（１ｎｔｒｉｎｓｉｃ
　ｆａ＠ｔｏｒ　：以後ＩＰと略称する）である。なぜ
ならＩＰは人の血清中でＢ、の生理学的活性形に対して
高度に選択性があるからである。このことは今や一般に
認められて１／１６゜従ってＩＰと強く結合するラベル
付きＢ、、Ｉｌｌ導体が求められているのである。

米１ｉｉ特許矛３，９８１，８６３号ＨＡ細書に記載さ
れている１１＠　１−　Ｂ、　　誘導体の混合物につい
て本発明者は検討したが、この混合物はＩＦを利用する
Ｂ１ｍ検定における使用には適さないことがわかった。

その混合物は前記特許用ＩａＩＦに記載されているよう
に）この混合物に対する抗体を結合性タンパク質として
使う場合には適当であるが、しかしその代りにＩＰを結
合性タンパク質として使う場合にはその検定は精確では
ない、この混合物の様々の区分が、驚くべきことにはＩ
Ｐに対して着しく異った親和力をもっている仁とがその
理由であることを本発明者はさらに発見した。事実、本
発明者は、誘導体の中でモノカルボン酸−（山−異性体
誘導体が伽）−または（ｅ）−異性体誘導体よりもＩＦ
に対して著しく大きい親和力をもっていることを発見し
た。付貫すると、上記の発見は［ｏｌｈｏｕｓｅおよび
人１１＠ｎ（Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　６０　
、１３８１−１３９２　）による報文中ｇ二報告された
結果と一致している。なお、その報告はＢ□の検定に関
するものではなく、３ｍのモノカルボン酸のラビットお
よび人間のＩＰに対する次のようｆｋ１！和力を報告し
ている。

モノカルボン酸　　Ｋａ　Ｂ　、　、−Ｃ０ＯＨ異性体
異性体　　　　　　Ｋａジアノコバラミン（切　　　　
　　　　　　　　０．０００６（ｄ）　　　　　　　　
　　　　　０．３（ｍ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，
００４上記のＩｌｌ方力もちろん遊離酸に関するもので
あるが、しかし一般ｉ：同じオーダーの親和力がその誘
導体においても示されることを本発明者は見出した。

従って適当に放射性の２ベルを付けた（山−異性体の−
導一体が、ＩＦを使うＢ１ｆｆ１の検定で使用するのに
適していることを本発明者は見出したのである。

純粋かまたは少くとも実質的に（ｂｌ−または（＠）−
異性体誘導体を含まないラベル付き（２）−誘導体を使
用することは本発明の１つの重要な特徴であるが、それ
というのは（旬−または（・クー異性体誘導体が存在す
ると″不精確な結果が導かれるからである・精製したＢ
１．（山−酸異性体のラベル付きの誘導体は新規であり
、従って本発明の１つの目的は、Ｂ１．のモノカルボン
酸（ψ−異性体の２ベル付キ誘導体を提供することであ
る・なお該誘導体はラベル付きの基を（（Ｉ−カルボン
酸基に結合してもってお９、また蚊異性体または誘導体
はＢ、の他のモノカルボン酸異性体およびそれから作ら
れる誘導体を含まないものであるｅ 本発明の他の目的はＢ、の（山−モノカルボン酸異性体
以外の他のどのようなモノカルボン酸異性体またはそれ
から作られる誘導体も存在させずＣ：、試料とＩＦなら
びにＢｔｌの（ｄｌ−モノカルボン酸異性体のラベル付
き誘導体との競合的結合混合物を作ることから取る、試
料中の８１２の検定法を提供するものである０もしこの
検定法が煮沸工程（それは晋通じ行われることであるが
、必ずしも必要ではない：本発明者らの英国特許オ２，
０１１，０７０号明細書を見られたい）を含むならば、
煮沸工程が完了した後で初めてラベル付き（２）−異性
体を反応混合物に加えることが必要である。

（ｄ）−酸異性体のラベル付誘導体は、すでにラベルを
つけているかまたは後からラベルをつける仁とができる
基を、（ｄ）−酸基に更にカップリングすることによっ
て作る。

本発明によるＢ１．のゆ−異性体モノカルボン酸に対し
てカップリングするよう素置容体の好ましいものは次の
とおりである。

（１１−数構造式 １式中の８は炭素原５子１〜１８個をもつアルキレン基
である） で表わされるｐ−アンノア身キルフェノールＮｊばチラ
イン（米国特許オ３，９８１．８６３号Ｅ！４１ＩＢ書
参照）、（２）　　−数構造式 １式中のＲは炭素原子１〜１８４ｍをもつアルキル基で
ある） で表わされるチロシンのアルキルエステル４ＲＪＬばチ
ロシンメチルエステル、 （３）−数構造式 （式中の８は炭素原子１−１８個をもつアルキレン基で
ある） で表わされるアミノアルキルイミダゾール例えば・ヒス
タミン、 （４）−数構造式 （式中のＲは炭素原子１〜１８＠をもクアルキル基であ
る） で表わされるヒスチジンのアルキルエステル例工ばヒス
チジンメチルエステル・ 上記の（１）または（２）のよう素置容体を含む本発明
の誘導体は、米国特許？　３，９８１，８６３号明細書
に記載された方法によって作る〔ただしＢ□の（ｄｌ−
モノカルボン酸だけを単独で使う点で骸方法と異なるこ
とはもちろんである〕。仁の米国特許才３．９８１，８
６３号明細書の記載内容は参考として本明細書に含まれ
る一上記の（３）および（４）のよう素置容体をもつ本
発明の誘導体は以下の実施例中に記載の方法によって作
る・ ラベルは例えば１１′Ｉのような放射性原子であること
ができるか、または発螢光団または酵素あるいは他のラ
ベルであることもできる。螢光性ラベル付き異性体は例
えば実質的に（−一および（・）−異性体を含まないＢ
、１の（２）−異性体モノカルボン酸を発１１光団例え
ばフルオレセインチオカルバミルエチレンジアミンと反
応させることによって作ることができる。酵素ラベル付
き異性体は、例えば実質的に僧−および（・２−異性体
を含まないＢ、の（ｄ）−異性体モノカルボン酸を酵素
例えばＩ−ガラクトンダーゼと反応させＢｔｌの酵素ラ
ベル付き−邊体を作ることができる・この目的に使うこ
とがてきる他の普通５使われる酵素としてはホースラデ
イシ＆（Ｈ洋わさび）ペルオキシダーゼおよびアルカリ
性ホス７アダー（がある。

純粋な１φ−モノカルボン酸異性体を作るために、８１
１を先ず米国特許オ３，９８１，８６３号明細臀（Ｊ、
Ｃ。

Ｓ、　（１９５３）　、　３８４８〜３８６４も参照さ
れたい〕に記載されているようＣ二種かな酸性加水分解
にかける。

この結果、３種のモノカルボン酸すなわち（ｂＪ、（ｄ
Ｊおよび（・）異性体の混合物が生成する。代表的には
その混合物は（・）−異性体５０１Ｇ、（Ｍ−異性体２
５チおよび（ｄｌ−異性体２５％から成る。その（ｄ）
−異性体は次に山田等（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、
　、　２４７　、６２６６〜６２７０　）によって記載
された方法で他の異性体から分離する。こうして分離し
た各異性体の同定はＡ１１ｅｎら（Ｊ、　Ｃｌ１ｍ、　
Ｉｎｖｅｓｔ、　（１９７７）　Ｊｌ　、　１３８１〜
１３９２　）によって記載された方法を使い、ペーパー
クジマドグラフィによって実施することができる。

本発明を更に充分ｇ；説明するために以下に実施例を示
すが、仁れは本発明を限定するものではない。

実施例 モノカルボン酸の製造 個々の異性体は山田およびＨｏｇ＠ｎｋａｍｐ　（Ｊ、
　Ｂｉｏｌ　。

Ｃｈａｍ、　２４７　、６２６６〜６２７０　）の方法
によって作りそして精製する。各異性体の同定はペーパ
ークロマトグラフィ（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖ＠ｓｔ
、　６０　、１３８１〜１３９２　）によって行°う。

ヒスタイン複合体（ｃｏｎｊｕｇａｔ・）の製造前記カ
ルボン酸なインプチルーク′ＯＡ−ホルマート中間体経
由でビスタ２ンと複合体化する（！：ｒｌ−ａｎｇ＠ｒ
、　Ｂｏｒ＠ｅｋ　１ＢｅｉｓｅｒおよびＬｉｅｂ＠ｒ
ｍａｎ　、　Ｊ。

坦躬、９徂ジ、　２２８　、７１３　（１９５７）を参
照されたい〕。

この反応後、アセトンの添加によってコリノイドを沈さ
せ、その沈でんは水に再ｆＩ！ｉ解する。そして未反応
のカルボン酸はＤｏｗ＠ｘ　ＡＧＩ　−Ｘ、　　７　＊
　？−トの０．７ｘｌＯｍカラム上を通す仁とによって
除去する。未反応のヒスタミンはフェノール中へ抽出す
ることおよび水中へ逆抽出することによって除去する（
　Ｋｏｌｈｏｕｍ＠およびＡｌｌ＠ｎ　、　Ａｎａｌｙ
ｔ、　Ｂｉｏｅｈ＠ｍ。

８４　、４８６〜４９０　（１９７ｇ　）参照〕。最後
にフェノ−ｋ　ノｊ終痕跡は、濃水酸化アンモニウム溶
液チーを１０に調整することならびにＤｏｗ＠ｘ　ＡＧ
Ｉ　−Ｘ２ア竜テートの０．７　Ｘ　ＩＱｃ＠　　カラ
ム上を通すととじよって除去する。その溶液を酢酸で中
和しそして−ｚｏ”ｃで貯蔵する。

ヒスタミン複合体のよう素化 コバラインーヒスタ電ド複合体を２７　、７００の分子
吸光係数を使って３６１ｎｍで分光光度計で測定し、セ
して０・１モル／１９ん酸塩緩衝液（ｐＨ７，５）中で
５０μモル／　ｊｓ二希釈する。複合体溶液１０μｊ（
０，５ｍモル）をＮａ　′Ｉの２０ｔｉｊ　（２ｍｃｉ
、　Ｉｎモル）に加え、続いてりｐう建ンーＴ溶液（ｉ
ｆ／Ｊ）１０μ遥を加える。５分後、ビル亜硫酸ナトリ
ウム溶液（１，９ｆ／ｊ　）　１０μｊ　の添加によっ
て反応を停止する。未反応のよう化物はＤｏｗａｘ　Ａ
ＧＩ　−Ｘ、　　アセテ−）　５０　／＃ｊで回分処理
して除き、そして樹脂は水で洗う。よう素化生成物を、
ベンジルアルコール９ｔ／Ａを含む水中で１０ｏμｆ／
Ｊ（出発濃度に基づいて）の濃度に希釈し、セして４°
Ｃ〒貯蔵する。

上記のよう素化を８回別々に行ったところ、Ｉの組込み
は４１９１〜５５−の範囲にあって、１２Ｕ’０〜１６
００　Ｃｉ　／　ｆ　　の範囲にある比放射能を与えた
。

よう素化した複合体の結合性 よう素化した物質および〔ゝ’Ｃｏ）ジアノコバラミン
について、米国特許オ３．ｐｓｉ＠ｓａ号明細書に記載
されているように作った抗−Ｂ、ｆｆｉ血清の１０倍過
剰ならびに検定条件（下記参照）下でのＩＦの１０倍過
剰に対する結合能力を試験した。その結果を表１にまと
めた。この結果から、３つの異性体は皆米国特許オ３，
９８１，８６３号の＃４細書に記載の方法で作った抗体
といっしょに使うのｃ４適するが、ＩＦといっしょに使
うのに適しているのは１ｄＪ−異性体だけであることが
ゎかる・ 内因子ＩＦ（＜２１　Ｒ−タンパク質、Ｓｉｇｍａ　Ｃ
ｈ−ｅｍｉｃａｌｓ社製品）をほう酸塩緩衝液（５０ｍ
モルモルｐｌ　９．５．１１７１　Ｈ８Ａ含有）に溶郷
し１単位／ｍ　（２）濃度とした。トレーサーはジチオ
エリスリトール１１７１およびＫＣＮ　５０ｑ／ｉを含
有するほう酸塩緩衝液中にそれぞれ５０ｎｆ／ノに希釈
した。各検定管はシアノコバラ建ン標準液０．２ｗｇ、
）レーサー１−およびＩＰ　０．１−を含む。最高結合
はｌ−当りｌＯ単位の濃度でＩＦ　０．１　ｍＧを加え
ることによって測定した。非特異的結合はＩＰの代９に
緩衝液を加えることによって測定した。室温で１時間イ
ンキュベーションした後、アルブミンをコーチングした
木炭０．５ｐｆｆを加えた。１５００Ｇで１０分関連心
分離した後、上ゼみ液をチューブの中へ傾斜してと９そ
して計数した・Ｉｌｌからｉ／ＩｋＩｌｉＩｉ結合およ
び非特異的結合に対して補正した標準−−が才２図に示
されているが、その中で曲線人は（Ｃｏ）−ジアノコバ
ラミントレーサーに対するものでＴｏシ、そして−＠Ｂ
は（ＩＩＩＨ）シアノコバラ建ンｄ−Ｗ−ドヒスタミド
トレーサーに対するものである・本発明の検定方法（ニ
ジいては、結合性タンパク質が純！Ｆであることが好ま
しい。しかし結合性タンパク質としてＩＦとＲ−タンパ
ク質との混合物を使うこともでき、その混合物中ではＲ
−タンパク質が消化によりまた・はＲ−タンパク質の結
合部位を不活性化する８１１類似体によって不活性化さ
れてしまっているからである。

表　　　１ ラベル付きＢ１．（ヒスタ建ン複合体）の抗血清および
精製した内因子への結合

【図面の簡単な説明】

才１１はビタミンＢ１ｆｆ１の構造式を示す説明図であ
る。才２図は最縄結合および非特異的結合に対して表１
から補正を施した標準曲線を示す説明図でＴｏ９、曲線
ムは［”Ｃｏ）−ジアノコバラミントレーサーに対する
ものであり、そして曲線Ｂは〔１■Ｉ〕シアノコパラン
ンｄ−冒一ドヒスタミドトレーサーに対するものである
。また才２図の縦軸は正味の結合−を、そして横軸はコ
パラ虐ン濃度（１ろ）を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　ビタミンＢ□の（ｄＪ−モノカルボン酸異性
   体から調製し、（ψ−ｐルボンＩＩ基に結合したラベル
   付きの基を含み、そしてビタミンＢｔｚの他のモノカル
   ボン酸異性体およびそれらの誘導体を含まないことを特
   徴とする、同定ラベルを含み、そしてそれによってビタ
   ミンＢＨの競合的結合検定において使うことができ、そ
   してそのラベルの測定によって定量することができる、
   ビタミン１Ｂｔｔの誘導体０ （２）　　ラベル付きの基として放射性原子をもつ基を
   含む前項（１）に記載の誘導体。 （３）放射性原子として１■を含む前項（２）５二記載
   の誘導体・ （４）ビ）　−殻構造式 Ｃ式中のＲは炭素原子１〜１８＠をもつアル命しン基で
   ある） で表わされるｐ−ア之ノアルキルフェノール、例えばチ
   ラｉン、 （叫　−殻構造式 （式中の８は炭素原子１〜１８個をもつアルキル基であ
   る） で懺わされるチロシンのアルキルエステル１ＲｊＬばｆ
   　Ｅｌ　シンメチルエステル、 シｉ　　−ｍ構造式 Ｃ式中のＲは炭素原子１〜１８個をもリアルキレン基で
   ある） で表わされるア２ノアルキルイミダゾール例えばヒスタ
   ミンおよび に）一般構造式 Ｃ式中の８は炭素原子１〜１８個をもつアルキル基であ
   る）。 で表わされるヒスチジンのアルキルエステル例えばヒス
   チジンメチルエステル のうちの１つと（ｄ）−カルボン酸基とを結合し、そし
   て前記化合物■〜に）のうちの１つと前記（山−カルボ
   ン酸基との結合の前または後に前記化合物四〜に）のう
   ちの１つに′ｌを導入することによって形成したラベル
   付きの基を含む、前項（３）に記載の誘導体・ （５）　　ラベル付きの基として発螢光団から取る基を
   含む前項（１）ζ二記載の誘導体・ （６）　　（ｄ）−カルボン酸基とフルオレセインチオ
   カルバンルエチレンジアミンとを反応させることによっ
   て形成したラベル付きの基を含む前項（５）に記載の誘
   導体・ （７）　　ラベル付きの基として酵素を含む基を含む前
   項（１）に記載の誘導体。 ｆ８１　　（ｄｌ−カルボン酸基と！−ガラクチドース
   、西洋わさびペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスフ
   ァターゼとを反応させることによって形成したラベル付
   きの基を含む前項（〕）に記歌の誘導体。 （９）　　ビタミンＢｔｕを温和な酸性加水分解にかけ
   てビタミンＢ０のモノカルボン酸異性体の混合物を生成
   し、そして１ｄｌ−異性体を他の異性体から分離するこ
   とから成る、前項（１）に記載のビタミンＢ、ｆｉの誘
   導体の製法において、分離した（ｄ）−異性体を、その
   （ｄｌ−モノカルボン酸基を介して、（１）それ自体が
   ラベルである化合物または（■）ラベルを含む化合物と
   反応させるか、あるいは（ＩＩ後でラベルを結合するこ
   とができる化合物と反応させ続いてラベルをそれに結合
   させることを特徴とする、前記のビタきンｆｉ□の誘導
   体の製法。 ０１　　内因子およびビタにンＢ□のラベル付き誘導体
   と共に試料の競合的結合性混合物を生成し、そして結合
   したまたは遊離のラベルなｍｅ、それから試料中のどり
   ｔｙＢ、、を定置することから取る、液体試料中のビタ
   ミンＢ□の検定方法において、前項（１）〜（８）のい
   ずれか（二記載のビタミンＢＩＩのラベル付＊＊導体を
   使うことを特徴とする、前記のビタミンＢ、！の検定方
   法・ ０υ　試料を煮沸してその中に含まれる内因性のビタミ
   ンＢＨ結合性タンパク質を変性する予備工種を含む検定
   方法において、ラベル付きの誘導体を試料の澱沸後にそ
   の試料と混合する、前項ＯＩに記載の方法。 Ｉ　試料として人間の血清または人間の血漿を使う前項
   （ＩＩまたは（１１に記載の方法。